Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительный анализ иммунологических особенностей хронических заболеваний бактериальной и вирусной природы и эффективности их иммунокоррекции

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

Сравнительный анализ иммунологических особенностей хронических заболеваний бактериальной и вирусной природы и эффективности их

иммунокоррекции

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, B.C. Ширинский

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, А.И. Аутеншлюс профессор

доктор медицинских наук А.П. Колесников

Ведущая организация: Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск)

Защита состоится » ^/^/-52005 г в/У часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01. при ГУ НИИЙ1СО РАМН

по адресу 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИКИ СО РАМН (630099, Новосибирск, ул Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан « jJ»C»Q7)J!^> 20051

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

О. Т. Кудаева

jooe-f ¿m549

W33

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи современной фармакотерапии в лечения острых заболеваний инфекционной этнологии, нерешенной медицинской проблемой остаются рецидивирующие и хронические инфекции бактериальной и вирусной природы. Таг инфицированносгь населения планеты вирусом простого герпеса, по данным эпидемиологических исследований, составляет 80 - 90%, а часто возникающие рецидивы инфекции, встречаются у 2 - 6 % людей [McKetma D.B., 2001, Вику лов Г X, 2003]. По данным ВОЗ, герпес, как причина смерти от вирусных заболеваний, стоит на втором месте после гриппа. В последнее десятилетие показано, что инфицированносгь вирусами семейства Herpes viridae ассоциирована с ускорением атерогенеза, повышенным риском ряда онкологических заболеваний, вторичного бесплодия, антифосфолипидного синдрома, ранним развитием болезней пожилого возраста Установлено, что эти вирусы могут активизировать транскрипцию генома ВИЧ и являются кофактором инфицирования и прогрессирования ВИЧ-инфекции [Miller R.L, 2002; Emmert DH, 2000; Хахалин Л.Н., 1997]. По прогнозам Всемирного банка информации, проблема герпесвирусных инфекций на ближайшее будущее определяется как «глобальная проблема человечества».

Проведенные в различных странах мира эпидемиологические исследования свидетельствуют также об устойчивом росте заболеваемости хроническими неспецифическими заболеваниями легких и, в частности, хроническим бронхитом [Barnes P.J., 2000; Hogg J.C., 2001] По данным GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), как причина смерти, занимает 4-е место после заболеваний сердца, рака и цереброваскулярной патологии. В США в настоящее время на фойе снижения смертности от сердечно-сосудистых и других заболеваний смертность от ХОБЛ неуклонно растет, как и обращаемость к врачам по поводу бронхолегочной патологии. Россия занимает 3-е место в мире по уровню смертности от болезней органов дыхания [Гусейнов Х.Ю., 2000].

Частые обострения простого герпеса (ПГ) и хронического бронхита (ХБ) являются, как правило, манифестацией иммунных нарушений в организме, транзиторных или более стойких, объединяемых понятием вторичного иммунодефицита (ВИД) [Новикова В.И. 1997, Чиркин В.В. 1999, Ширинский B.C. 1997]. Большое значение в возникновении вторичного иммунодефицита на фоне хронического инфекционного процесса придается нарушению баланса регулягорных и провоспалительных цитокинов. Данные литературы об изменении продукции цитокинов при этих заболеваниях многочисленны, но разноречивы и при ХБ касаются оценки преимущественно провоспалительных цитокинов [Barnes P.J.,2000; Chung K.F., 2001; Clemens D.L., 2000, Khair О.A, 1996]. Исследования медиаторов профиля Thl и 1Ъ2 при ХБ носят фрагментарный характер и не позволяют составить целостное представление о нарушении иммунорегуляции на системном уровне и во взаимосвязи с клиническими проявлениями заболевания. При ПГ наиболее изученным является интерфероиовый статус [Ellermafin-Eriksen S., 2005, Malmgaard L, 2003; Liu T, 2001; Малиновская В.В., 2000], связь других цитокинов с основными иммунологическими параметрами и клиническими проявлениями заболевания изучена недостаточно полно или трактуется неоднозначно.

Актуальность проблемы определяется также тем, что на сегодняшний день не существует методов лечения указанных заболеваний, позволяющих полностью элиминировать персистирующую инфекцию. Предполагается, что этиотропная терапия может быть успешной только при адекватной коррекции нарушенных иммунных функций и восстановлении контроля иммунной системы над патогеном. В свою очередь, важность проблемы целенаправленной иммунокоррекции диктует необходимость детального и всестороннего изучения молекулярных и клеточных механизмов развития иммунодефицитного состояния при хронической инфекция, как бактериальной, так и вирусной природы.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ , БИБЛИОТЕКА [ С.Петео&фГО

ОЭ W ш

Цель исследования.

Сравнить содержание провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов в сыворотке крови и функциональные свойства клеток иммунной системы у больных простым герпесом и хроническим бронхитом, имеющих лабораторные признаки иммунодепрессии, и оценить влияние комплексной терапии с включением иммуностимулирующих препаратов на клинико-иммунологические параметры у этих больных

Задачи исследования.

1. Изучить субпопуляционную структуру и функциональные свойства лимфоцитов и фагоцитирующих клеток периферической крови больных с частыми обострениями ХБ и ПГ

2. Определить содержание ряда провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов в сыворотке крови больных ХБ и ПГ.

3. Проанализировать взаимосвязь уровней цитокинов в сыворотке ПК с иммунологическими и клиническими характеристиками больных.

4. Оценить влияние терапии с включением иммуностимулирующих препаратов (полиоксидония у больных ХБ и виферона у больных ПГ) на цитокиновый профиль и другие показатели иммунного статуса в динамике лечения.

Научная новизна.

Установлено, что изменения в содержании и функциональных свойствах субпопуляций лимфоцитов и фагоцитирующих клеток у больных с частыми обострениями ПГ и ХБ носят характер иммуносупрессии на фоне повышения содержания провоспалительных и иммунорегуляторных медиаторов Впервые установлено, что изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови больных ПГ и ХБ имеют однонаправленный характер выявлено повышение содержания TNFa, IL-lß, IL-2, IFNy и IL-10, а уровни IL-4 в обеих группах и 1L-6 у больных герпесом значимо не меняются. Впервые показано, что угнетение эффекторных функций ГЗТ и фагоцитарной активности моноцитов у больных ХБ и ПГ наблюдается на фоне относительно низкого содержания IL-2. Установлено, что тяжесть клинических проявлений у больных герпесом ассоциирована с более низким содержанием в сыворотке крови IFNy и IL-4 и высоким уровнем 1L-10, а у больных ХБ - с повышенными концентрациями IL-lß, IL-6, IL-2, IFNy Показано, что у больных ХБ й герпесом в динамике терапии с применением иммуностимулирующих препаратов наряду с частичной нормализацией измененных показателей иммунного статуса происходит снижение концентраций провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и у большинства пролеченных пациентов повышается уровень ILIO. Выявленные изменения сопряжены с положительной динамикой клинических проявлений

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные данные позволяют предположить наличие общих механизмов нарушений цитокиновой регуляции иммунного ответа у больных с синдромом ВИД при персистирующей инфекции как бактериальной, так и вирусной природы, вызывающей сходные изменения уровней провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов Результаты работы дополняют представления об иммунных нарушениях у больных ХБ и ПГ с позиций цитокин-опосредованной регуляции иммунных реакций Полученные данные могут быть учтены при разработке методов цитокинотерапии хронических заболеваний инфекционно-воспалительной природы.

Положительное влияние на баланс цитокинов и динамику лабораторных признаков ВИД включения в комплексную терапию иммуностимулирующих препаратов позволяет рекомендовать использование полиоксидония у больных ХБ и виферона у больных герпесом при частых обострениях инфекционного процесса

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Изменения уровней цитокинов в сыворотке крови у больных с частыми обострениями хронического бронхита и простого герпеса характеризуются повышением концентраций провоспалительных и ТЫ цитокинов, более выраженным при ХБ, неизмененным уровнем 1Ь-4 и повышенным содержанием 1Ь-10, носят однонаправленный характер и сопровождаются снижением эффекторных функций клеток иммунной системы.

2. Изменения уровней провоспалительных цитокинов, содержания и функциональных параметров клеток иммунной системы у больных ХБ и герпесом частично обратимы после курсового использования иммуностимулирующих препаратов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на клинической конференции в ИКИ СО РАМН (Новосибирск 2002г); на Всероссийском иммунологическом форуме «Дои иммунологии в Санкт-Петербурге 2004», на научном симпозиуме "Цитокины Стволовая клетка. Иммунитет" (Новосибирск 2005 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ (из них 2 | оригинальные статьи в реферируемых научных журналах).

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 138 страницах печатного текста, включающего 12 рисунков и 14 таблиц. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 262 литературных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Характеристика обследованных.

Всего обследовано 110 человек Группу 1 составили 42 пациента с ХБ в период обострения' 17 мужчин и 25 женщин в возрасте 22 - 64 лет (средний возраст 44,6 лет). Диагноз ХБ ставился по рекомендациям ВОЗ. По клиническим вариантам ХБ, в соответствии с МКБ-10, выделялись 3 подгруппы' I 41 0 - простой хронический бронхит - 9 человек, I. 41.1 - слизисто-гнойный хронический бронхит - 20 человек, } 44. - обструктивный хронический бронхит - 13 человек.

В группе 2 обследовано 38 пациентов с рецидивирующим ПГ, 4 мужчин и 34 женщины в возрасте 21 - 49 лет (средний возраст 32,4 года), из них 13 человек с лабиальной локализацией высыпаний, 8 - с генитальным герпесом, 7 - с сочетанием лабиального и генигального, 10 - с \ орофациапьной локализацией

Диагноз герпетической инфекции основывался на патогномоничных клинических проявлениях заболевания, в случае генитальной локализации подтверждался ПЦР.

Для оценки тяжести заболевания были использованы стандартные критерии, ' характеризующие выраженность клинических симптомов в баллах, с учетом частоты ■

длительности обострений, характерных жалоб и данных физикального осмотра, поддающиеся количественному анализу и статистической обработке, описанные ранее [Сенником Ю А ,1994; Халдин А.А, 2003] Каждый симптом пациента оценивался отдельно в баллах от 0 до 3-4, и общий результат получался путем сложения.

Группе больных ХБ из 19 человек (рис 1) был назначен полиоксидоний внутримышечно по 6 мг через день в курсовой дозе 30 мг, 22 человека с рецидивирующим ПГ были пролечены вифероном (препарат, содержащий рекомбинантиый интерферон-а2Ь, а-токоферол и аскорбиновую кислоту) в свечах по 500000 ед. 2 раза в сутки в курсовой дозе 10 млн.ед

Рис. 1. Дизайн исследования

|Воцмы»ХВ Ошл. I JioeaaHH^ 1 Вадиме ПГМ ш. |

Ш^ФШМ^'ШФ'''^'1''"! " ^ j -г г~-1

^Ц^&СТ'К^^игд^ } * ¡Всепациеты [

[ j - ;_____

Ш/гив j |17 тужж \

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и оценка их пролифератнвной активности.

Выделение МНК из гепаринизированной венозной крови производилось по стандартной методике на градиенте плотности фиколла/урографина (р= 1,082 г/л) центрифугированием при 1500 оборотов/мин. в течение 40 минут (фиколл - Pharmacia Fine Chemicl, Швеция, и урографин - Schering, Германия) Собранные из интерфазы МНК трижды отмывались средой RPMI-1640 (Вектор, Россия) с 1% сыворотки AB(TV) в силиконированных пробирках Проводилась оценка спонтанной и стимулированной Кон A (Pharmacia, Sweden) в дозе 10 мкг/мл пролифератнвной активности МНК ПК, культивированных в полной среде RPMI 1640 при 37°С, 100% влажности и 5% СО2 Интенсивность пролиферации оценивали по включению в нуклеопротендные фракции клеток 3Н-тимидина, внесенного за 18 ч. до окончания 72-часовой инкубации в количестве 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности проб (в импульс/мин) производился в жидкостном сцинтилляционном ß-счетчике SL-30 (Intertechnic, Франция) Индекс пролиферации вычислялся как частное от деления стимулированной пролифератнвной активности на спонтанную, которые выражались как среднее арифметическое 5 дублей каждой пробы.

Определение субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток методом проточной иммуноцитометрии

проводилось на базе лаборатории клинической иммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) Исследования выполнялись в соответствии с описаниями, представленными в руководствах «Лимфоциты методы» (1990), «Monoclonal antibodies source book» и инструкциями производителей антител Использовались моноклональные антитела LT3 - CD3, LNK16 - CD16 и LT-DR - HLA-DR (Сорбент, Москва), меченные флюоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ), ICO-180 - CD20, ICO-86 - CD4 и ICO-31 - CD8 (МедБиоСпектр, Москва), меченные фикоэритрином (ФЭ) Для обработки результатов использовали программу CellQuest (Becton Dickinson, USA), используя параметры прямого (FSC), бокового (SSC) светорассеяния и канала флюоресценции 3 (FL-3)

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Функциональную активность гранулоцитов и моноцитов оценивали по показателю активности нейтрофилов (ПАН) и моноцитов (ЛАМ), отражающему интенсивность продукции перекиси водорода клетками, стимулированными латексом; а также, по Fc-фагоцитозу и экспрессии HLA-DR генов, определявшихся с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) Уровень экспрессии HLA-DR на моноцитах оценивали с помощью гистограммы, в которой устанавливали дополнительный маркер, разделяющий пик позитивных

6

клеток на высоко- h ниэкоэ кспресснрующие клетки, ориентируясь на средние данные, полученные при исследовании здоровых доноров.

Для исследования фагоцитоза использовали латекс, нагруженный гамма глобулином (Биопрепарат, Санкт-Петербург), меченный ФИТЦ Иммуноцитометрию проводили с использованием параметров светорассеяния для выделения областей моноцитов и гранулоцитов, из которых строили гистограммы по каналу флюоресценции FL-1 (ФИТЦ) да» определения процента светящихся клеток. Данные методы выполняли в соответствии с описаниями, представленными в инструкциях производителей антител.

Исследование продукции перекиси водорода фагоцитами проводили в 96-луночных планшетах для иммуноферментного анализа К лейкоцитам или МНК, добавляли по 50 мкл 0,3% латекса (опыт) или раствора Хенкса (контроль) Инкубировали клетки во влажной камере 20 минут при 37° С, добавляли по 25 мкл 0,1% ортофенилендиамнна и продолжали инкубацию еще в течение 1 часа После инкубации в лунки добавляли по 100 мкл 25% серной кислоты и учитывали оптическую плотность (ОП) с помощью ИФА-ридера Multiskan MS (Labsystems, Финляндия) в режиме с двумя фильтрами 492 и 620 им. Стимуляцию продукции перекиси водорода выражали как показатель активации нейтрофилов (ПАН) в пробах с лейкоцитами и Г показатель активации моноцитов (ПАМ) в пробах с мононуклеарами в виде частного от

деления ОП в опыте на ОП в контроле.

Определение показателя эффекторных функций ГЗТ.

Оценка функций Т-эффекторов ГЗТ производилось по интенсивности выработки ими факторов торможения миграции и распластывания лейкоцитов в ответ на стимуляцию митогеном Для этого лейкоциты, собранные из отстоявшейся гепаринизированной венозной крови, дважды отмывали от плазмы и культивировали в среде 199 с 10% инактивированной пу.тированной сывороткой AB(rV) группы, 2 шМ L-глютамина, 5 тМ Нерев-буфера и 40 мкг/мл генгамицина в круглодонных 96- луночных планшетах (100 тысяч клеток в лунке) 18 ч при 37°С, 100% влажности и 5% С02 В опыте 1 к клеткам добавляли ФГА-Р (Difco, США) в дозе, стимулирующей миграцию лейкоцитов (2,5 мкг/мл), а в опыте 2 - в дозе, активирующей Т-клетки, и, в результате, ингибирующей миграцию (25 мкг/мл). В контроле митоген не добавлялся. После окончания инкубации из лунок удалялись неприлипшие лейкоциты. Прилипшие к пластику лейкоциты снимали после 30-минутной инкубации с раствором Версена и подсчитывали в камере Горяева, после чего определяли индексы миграции (ИМ) - число клеток в опыте 1/число клеток в контроле, ингибиции миграции (ИИМ) - число клеток в опыте 2/число клеток в контроле, и получали показатель эффекторных функций (ПЭФ) как частное от , деления числа клеток в опыте 1 на число клеток в опыте 2 [Лозовой В.П. 1990].

Электрохемилюминесцентный метод определения цитокинов.

Определялось количественное содержание молекул IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFo и г IFNy в сыворотке крови методом электрохемилюминесценции с использованием прибора

"Origen Analyser" фирмы IGEN (США), и реагентов, приготовленных согласно протоколам производителя Blackburn G F 1991 Сущность метода описана в статье сотрудников нашего института, адаптировавших его для количественного определения цитокинов в различных средах [Крысов С В. 2000].

Для построения калибровочных кривых были использованы человеческие рекомбинантные цигокины IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, TNFa (R&D System, UK), IFNy (Thomae-Biberach/Riss, Germany), IL-10 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), разведенные в человеческой сыворотке (Rockland, Великобритания). Вторичные стандарты рекомбинантных IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa и IFNy были получении из Национального института биологических стандартов и контролей (NIBSC, England).

Статистическая обработка резульгатов производилась при помощи программы Statistica 6 0 (StatSoft Inc, США) Данные по абсолютному и относительному количеству клеток, близкие к нормальному распределению, сравнивались с помощью t-критерия; для остальных показателей использовались непараметрические критерии Mann-Whitney (U-тест) и Колмогорова-Смирнова Достоверность динамики показателей оценивалась с помощью парного

теста ДУЛсохоп'а. Дня выявления корреляционных связей применялся коэффициент ранговой корреляции вреашшп'а Различия в частотных показателях определялись с помощью двустороннего точного метода Фишера

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Субпопуляционная структура и функциональные показатели клеток иммунной системы.

Поскольку ПГ и ХБ являются этиопатогенегически различными хроническими инфекционными заболеваниями, в группах обследованных больных были обнаружены различия по ряду параметров ИС (рис.2).

У больных ХБ было выявлено статистически значимое снижение показателей Яс-опосредованного фагоцитоза моноцитов и гранулоцитов, наиболее выраженное при слизисто-гнойном ХБ; снижение показателей микробоцидной активности фагоцитирующих клеток (ПАН и ПАМ) и функций эффекторов ГЗТ (повышение ИИМ), максимально выраженное у больных обструктивным ХБ; а также снижение миграционной способности лейкоцитов (ИМ) При сравнении клинических вариантов ХБ обращало на себя внимание то, что различия с группой здоровых лиц максимально были выражены у больных слизисто-гнойным ХБ, в частности, наблюдалось наибольшее угнетение фагоцитоза. Обструктивный ХБ характеризовался более высокими показателями фагоцитоза, но экспрессия НЬА-ОЯ на моноцитах была самой низкой, Т-эффекторы ГЗТ были угнетены в наибольшей степени В целом, у больных с обострением ХБ выявленные нарушения в ИС касались, главным образом, снижения функциональной активности нейтрофилов, моноцитарно-макрофагального звена и эффекторов ГЗТ

Рис. 2. Средние значения некоторых показателей ИС больных ХБ и ПГ в сравнении СО здоровыми. (* - р<0,05 в сравнении со здоровыми)

05 0

1 50 1 47Г~~

1

ит

ш

Фагоцитоз моноцитов

ПЭФ

Установлено, что у больных ПГ достоверно увеличено содержание €04+ Т-клеток и соотношение С04/С08 по сравнению с группой доноров, хотя абсолютное содержание лимфоцитов несколько ниже, чем у здоровых Показано снижение Рс-зависимого фагоцитоза гранулоцитов, снижение экспрессии НЬЛ-РЯ антигенов на моноцитах ПК, снижение

показателя эффекторных функций ГЗТ, как за счет уменьшения индекса миграции, так и за счет снижения выработки лимфоцитами факторов торможения миграции и распластывания; а также некоторое повышение уровня ЦИК.

Наиболее часто у больных ПГ имели место нарушения функций эффекторов ГЗТ, у половины больных ПГ был снижен уровень экспрессии НЬА-Ш1 на моноцитах Снижение способности к продукции перекисей чаще наблюдалось в моноцитах ПК.

По субпопуляционному составу Т-клеток больные герпесом отличались от больных ХБ значительным преобладанием относительного количества С04+ лимфоцитов и, соответственно, более высоким ИРИ У больных ХБ отмечалось относительное увеличение пула СЭ8+ клеток при остающемся нормальным соотношении С04/СР8.

Фагоцитоз гранулоцитов был угнетен в обеих группах, причем у больных ХБ также была снижена микробоцидная активность нейтрофилов, и аналогичные нарушения функций наблюдались в моноцитарном звене Что касается антигенпрезентирующей способности моноцитов, то, судя по уровню экспрессии молекул НЬА-ОЯ, у больных ХБ она не страдала, а у пациентов с ПГ была существенно снижена

Для каждого пациента состояние иммунодепрессии характеризовалось индивидуальным набором измененных лабораторных показателей, сопоставимых с нарушениями в иммунном статусе, описанными в литературе для данных категорий больных [Сенникова Ю.А., 1994; Коваленко ВЛ, 1998; Малышева О А, 2000; Алкеева АБ, 1992; Ширинский ВС, 1999; Халдин А А, 2003].

Таким образом, выявленные изменения в иммунограммах у обследованных больных с хроническими часто обостряющимися инфекциями характеризовались преимущественно снижением функциональной активности Т-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток.

Пролиферативная активность МНК ПК.

У больных ПГ спонтанная пролиферация оказалась снижена почти в два раза по сравнению с таковой у доноров Тем не менее, на стимуляцию Т-клеточным митогеном конкавалином А клетки больных отвечали в два раза сильнее, чем МНК здоровых люден.

Спонтанная пролиферативная активность МНК больных ХБ статистически значимо была выше, чем у доноров и больных ПГ, в основном, за счет подгруппы ХОБ, как следует из таблицы 1 В то же время, на стимуляцию КонА наиболее интенсивный ответ был получен у больных слизисто-гнойным бронхитом, и рассчитанный у них индекс стимуляции пролиферации определил достоверное превышение нормального уровня этого показателя в общей группе больных ХБ Самый высокий индекс стимуляции пролиферации МНК установлен у больных ПГ

Таблица 1. Сравнение показателей пролиферативной активности МНК ПК здоровых и больных ПГ и ХБ.

Показатели пролиферативной активности (Имп/мин) Здоровые п=15 Больные ПГ п=14 Больные ХБ п=17

Спонтанной 1273,2 ± 285,6 729,35 ± 172,6™ 1444,17 ± 375,87 ** Ч

Стимулированной КонА 34553,7 ± 3344,6 39357,71 ± 4406,5 " 31392,12 ± 3547,53

Индекс стимуляции пролиферации 37,05 ±4,77 70,9 ±11,39*** 41,19 ±6,90 * <

Различия показателей больных и здоровых * - р < 0,05 , **- р < 0,01, *** - р < 0,001 Различия при сравнении груш больных между собой' <- р < 0,05

Таким образом, больные ХБ и ПГ отличались разнонаправленными изменениями спонтанной пролиферативной активности МНК и различной интенсивностью реагирования Т-

клеток на митоген Поскольку пролиферативный ответ митоген-стимулированных кутьтур отражает способность лимфоцитов к продукции необходимого для активации и пролиферации комплекс цитокинов и экспрессии цитокиновых рецепторов, выявленные изменения можно расценивать как низкую способность клеток больных герпесом, в отличие от больных ХБ, отвечать на эндогенные активационные сигналы, несмотря на их избыток (высокая концентрация IL-2) Стимуляция экспрессии рецепторов к IL-2 Т-митогеном [Кетлинский С А, 1992] приводит к резкому повышению пролиферативного ответа Обнаруженную у больных ПГ обратную корреляцию Кон А-стимулированной пролиферативной активности МНК с содержанием IL-2 и IFNy (R«=-0,84, р=0,0006) можно связать как с компенсаторным повышением уровня IL-2 при вероятных нарушениях его рецепции, так и с антипролиферативным эффектом IFNy

Цитокины в сыворотке ПК больных ХБ и ПГ.

Содержание в сыворотке крови больных ХБ (таблица 2) провоспалительных цитокинов (IL-lp, IL-6, TNFa) значительно превышало их уровни у здоровых людей Особенно это касалось содержания IL-ip, которое у больных, в среднем, было выше на два порядка Уровни цитокинов, продуцируемых лимфоцитами Thl типа, также были значительно повышены у больных, в особенности, IL-2. Наиболее выраженные отличия от показателей здоровых яюдей наблюдались в подгруппе больных слизисто-гнойным ХБ Статистически значимых различий содержания IL-4 не было обнаружено, а количество IL-10 было несколько выше, особенно, у больных ХОБ.

Таблица 2. Содержание цитокинов в сыворотке ПК больных ХБ и ПГ. MecUmin - ™*>

Цитокины в пкг/мл Здоровые n = 30 больные ХБ n = 19 больные ПГ n = 22

TNFa 29,76 ±4,8 20,2(12,2 - 65,5) 383,5 ± 95,7 336,9(0-1851,2) 240,97 ± 80,12 * < 132,04 (0-1338,60)

IL-1P 15,20 ±3,2 7,6(0,46-92,7) 1480,8 ± 675,4 * 173,5(0 - 8801,9) 515,22 ±200,69 * < 104,00 (0 - 3021,00)

IL-6 10,14 ±1,89 5,7(0-59,6) 78,9 ±41,3 10,2(0 - 782,6) 41,29 ±16,74 < 0 (0 - 224,10)

IL-2 13,34 ±3,3 5,8(0-108,9) 1795,7 ± 686,6 * 88,3(0 - 8977,5) 646,65 ±310,41 * < 18,30 (0 - 4867,00)

IFNT 12,66 ±2,99 0 (0-93,6) 583,6 ±341,1 34,8(4,4 - 4643,7) 131,70 ±62,56 * < 14 90 (0 - 899,40)

IL-4 30,75 ± 9,89 9,5(0-119) 29,82 ± 9,9 8,0(0-137) 31,47 ±23,20 0 (0 - 417,90)

IL-10 40,9 ± 9,32 14,3(0-199,1) 167,6 ± 49,8 82,4(0-610.5) 227,99 ±100,27 * 54,80 (0-1927,70)

Различия при сравнении групп больных между собой <-р<0,05 * - достоверное превышение показателей доноров

Обнаруженные нами высокие концентрации провоспалительных цитокинов свидетельствуют о значительной активности воспалительного процесса при обострении ХБ и его проявлениях на системном уровне, что полностью согласуется с литературными данными [Reid Р Т, 2003; Boer W.I, 2002] В мокроте и БАЛЖ рядом исследователей обнаруживались высокие уровни EL-8, JL-6, IL-lp и TNFa [Chung К F., 2001; Pesci А, 1998; Комлев А Д, 2002] Именно повышение TNFa встречалось у большинства обследованных нами больных, независимо от клинического варианта ХБ. Индукция TNFa - самый ранний этап в афферентной фазе ТЫ- опосредованного иммунитета- он индуцирует продукцию макрофагами IL-12, который способствует дифференцировке Т-клеток в тип 1 [Toews GB, 2001] В литературе встречаются указания на то, что ХБ можно отнести к Thl-опосредованным хроническим воспалительным заболеваниям легких [Muro S. 2001]. Среди периферических

С04+лимфоцитов больных ХОБЛ обнаруживалось повышенное число IFNy-продуцирукяцих клеток и сниженное число IL-4 -продуцирующих [Majori М., 1999; Qvarfordt 1,1998] Инициировать смещение баланса цитокинов в сторону Thl при бронхите, по-видимому, может респираторная вирусная инфекция, особенно часто рецидивирующая [Яковлева Н В, 1999]

При исследовании цитокинового статуса больных ПГ (таблица 2) было выявлено, что из провоспалительных цитокинов наибольшего увеличения достигало содержание в сыворотке крови IL-lß, существенно повышен был уровень TNFot , а концентрация IL-6 по средним величинам достоверно не изменялась Содержание цитокинов профиля Thl (IL-2 и IFNy) также было значительно повышено В 5 раз выше нормы оказался уровень IL-10, а содержание IL-4 не превышало значений, характерных для здоровых людей

По данным литературы, реактивация герпес-вирусов в ганглиях тройничного нерва и антигенемия коррелируют с повышением уровня цитокинов, в том числе IFN-y, IL-6 и IL-10, TNF-a, что свидетельствует о вовлеченности каскада цитокинов в патогенез реактивации латентных герпес-вирусных инфекций [Haiford W.P., 1996; Викулов Г.Х., 2003]. В ряде публикаций описано повышение уровней провоспалительных цитокинов при герпетической инфекции [Gosselm J , 1992, Oshima М., 2001].

Важнейшую роль в противовирусном иммунитете играют цитокины, продуцируемые Thl, в особенности, IFNy При обострениях инфекции и в периоды ремиссии он обнаруживается в повышенных количествах как локально [Haiford W Р, 1996, Stumpf Т, 2001; Cunningham A.L, 2001], так и в ПК [Алексеев В.Н, 1996; Малиновская В.В., 1994], а также, внутриклеточно в CD4+ лимфоцитах [Шуршалина А В, 2001] Частые рецидивы ГИ наблюдаются на фоне снижения способности МНК к продукции IFN-y [McKenna D.,2001].JIo данным А А. Халдина [1995] уровень сывороточного интерферона у больных во время рецидива был ниже, чем в ремиссии, но оставался в 2 раза превышающим донорский В нашем исследовании прослеживается та же тенденция сывороточный уровень IFN-y, в целом, значительно повышен, но ниже у больных со свежими высыпаниями Сведений о IL-2 при герпесе в литературе немного Сообщалось как о снижении его содержания в сыворотке ПК у больных рецидивирующим герпесом [Zhang М, 2003], так и о продукции этого цитокина в значительных количествах культивируемыми лимфоцитами в ответ на стимуляцию антигенами вируса [Cannack М , 1996]

При сравнении цитокинового статуса больных ХБ и ПГ между собой обращает на себя внимание то, что изменения, выявленные при этих заболеваниях, носили однонаправленный характер Статистически значимые различия касались лишь степени повышения уровней определяемых цитокинов Так у больных ХБ провоспалительных и Th 1 -продуцируемых медиаторов в сыворотке содержалось значительно больше, чем у больных ПГ Цитокины Th 2 типа определялись в обеих группах больных в сходных количествах средний уровень IL-4 оставался в пределах нормы, a IL-10 - был повышен.

Повышенные уровни цитокинов выявлялись не у всех больных' некоторые из них имели концентрации отдельных цитокинов в пределах референтных значений На рисунке 3 показано соотношение частот обнаружения повышенных уровней цитокинов в сыворотке крови у больных ХБ и ПГ У подавляющего большинства пациентов с ХБ обнаруживалось повышение сывороточных уровней TNFa и IL-lß, более чем у половины - повышение Thl-цитокинов (IL-2 и IFNy) У большинства пациентов с ПГ также были повышены концентрации TNFa и IL-lß, более чем у половины - IL-2 У больных бронхитом чаще, чем при ПГ наблюдалось системное повышение содержания TNFa, IL-lß, IL-6, IL-2, и IFNy Примерно у половины всех пациентов определялся высокий уровень IL-10

Рис. 3. Частота выявления повышенных концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХЬ и ПГ.

TNFalpha IL-1beta IL-в IL-2 IFNgamma IL 4 IL-10

*- p=0,028 при сравнении с помощью двухстороннего точного критерия Фишера.

Таким образом, у больных с хроническими часто рецидивирующими инфекциями, как вирусной, так и преимущественно бактериальной природы, было выявлено системное повышение уровней провоспалительных цитокинов и смещение баланса иммунорегуляторных цитокинов в сторону преобладания медиаторов Thl лимфоцитов Наибольшей выраженностью этих изменений отличались больные ХБ. Пациенты обеих групп чаще имели неизмененный уровнь IL-4 и повышенный - IL-10.

Такая ситуация, когда у больных с клиническими и лабораторными признаками иммунодепрессии наблюдается системное повышение, причем значительное, содержания провоспалительных цитокинов и Thl медиаторов, которое должно приводить к усилению всех видов иммунного ответа, на первый взгляд, кажется парадоксальной Напрашивается вывод о том, что клетки больных с длительно персистирующей инфекцией утрачивают способность адекватно реагировать на цитокиновые сигналы Возможно, это отчасти объясняется резко сниженной экспрессией соответствующих рецепторов В литературе встречаются данные о снижении экспрессии маркеров активации на клетках таких больных: у пациентов с HSV-инфекцией на Т-лимфоцитах периферической крови экспрессия активационных молекул CD69, CD71 и CD25 значительно снижена по сравнению со здоровыми [Liu Z, 1999]; при обострении обструктивного ХБ - CD25, HLA-DR [Nevzorova VA, 2003] В тоже время уровень растворимого IL-2R у больных рецидивирующим герпесом был существенно выше, как в фазу обострения, так и в ремиссии заболевания [Zhang М., 2003].

Уровни цитокинов и клинико-иммуно логические особенности больных ХБ и ПГ.

Поскольку, по частоте встречаемости нарушений в иммунном статусе ведущее место в обеих группах обследованных занимало снижение ПЭФ ГЗТ (58,6% у больных ХБ и 57% у больных ПГ), нам представлялось целесообразным оценить содержание цитокинов в сыворотке крови больных в зависимости от этого параметра.

На рисунке 4 показано содержание цитокинов у больных со сниженной и нормальной функцией эффекторов ГЗТ.

Рис. 4. Содержание цитокинов в сыворотке крови у больных в зависимости от величины ПЭФ. * - р=0,005 по Maim-Whitney

Больные ХБ

Больные ПГ

Полученные результаты свидетельствуют о том, что угнетению реакций ГЗТ сопутствуют более низкие уровни цитокинов, особенно, 1Ь-2 У больных ПГ со сниженным ПЭФ был более чем в 20 раз ниже средний уровень 1Ь-2, в 4 раза ниже - ПТ*1у, почти в 5 раз - 1Ь-1р. При герпесе величина ПЭФ имела прямую корреляционную связь с сывороточными уровнями ТЫ цитокинов, чего не отмечалось у больных ХБ Снижение митоген-сгимулированной активности ГЗТ-эффекторов указывает на наличие клеточной иммуносупрессии [Кожевников В С., 2002]

О влиянии уровня цитокинов на активность Рс-опосредованного фагоцитоза моноцитов можно судить по результатам сравнения содержания цитокинов у больных с чрезмерно выраженным и резко угнетенным фагоцитозом, как это наблюдалось в группе больных ХБ (хотя по средним значениям активность фагоцитирующих клеток была снижена) При значительно сниженном (менее 30%) фагоцитозе содержание 1Ь-2 было в 25,5 раз ниже, чем при повышенном (более 80%)

Моноциты крови и альвеолярные макрофаги спонтанно не экспрессируют рецепторы к 1Ь-2 Их появление может быть индуцировано при активации этих клепок ЛПС и/или ИТОу. Стимулированные макрофаги экспрессируют около 100 высокоаффинных рецепторов к 1Ь-2 на клетку и отвечают на действие этого цитокина усилением антигенпрезентирующей способности, цитотоксической активности, увеличением продукции Н2О2 Таким образом, П.-2 может выступать в роли одного из макрофагактивирующих факторов [НоНег ,1987] и его

высокий уровень у больных с персистирующей бактериальной инфекцией представляется патогенетически целесообразным.

Цитокиновый статус больных оценивался также в зависимости от клинических особенностей изучаемых заболеваний.

Так как группа больных ХБ была неоднородной, небольшие различия выявлялись при разных клинических вариантах ХБ Самый высокий уровень провоспалительных и ТЫ цитокинов наблюдался при слизисто-гнойном бронхите, при простом бронхите определялось самое низкое содержание ТЬ2 цитокинов и 1ЕЫу, обструктивный бронхит отличался небольшим, по сравнению с другими, повышением провоспалительных цитокинов (для [Цр р<0,05), относительно низким уровнем ТЫ цитокинов и И.-4 при наиболее повышенном 1Ь-10 Были обнаружены некоторые особенности цитокинового статуса в зависимости от давности заболевания ХБ. Так, у больных со стажем болезни менее 5 лет сывороточные уровни провоспалительных цитокинов оказались намного ниже, особенно Т№а и 11.-6 (р<0,05) Ниже было и содержание 1Ь-2, ПТ^у и ГЦ 0, а уровень 1Ь-4 оказался несколько выше, чем у больных с давностью заболевания более 5 лет Относительное число С08+ лимфоцитов у них было меньше.

У больных ХБ тяжесть клинических проявлений бронхита имела прямую корреляционную связь с уровнями 1Ь-2, 1Шу, 1Ир, 11,-6. Высокий уровень ТШчх прямо коррелировал с индексом миграции лейкоцитов и сопровождался соответственно высокими концентрациями 1Ь-6, 1Ь-2, и ЕТОу. Содружественно повышенные уровни 11,-2 и ШИу были сопряжены с повышением ПАМ, высоким содержанием ТОТа и 1Ь-6. Содержание 11,-10 у больных ХОБ прямо коррелировало с активностью Рс-опосредованного фагоцитоза моноцитов (К,=0,81, р=0,04) В связи с чем, можно предположить, что значительное количество в сыворотке крови ИуЮ у этих больных имеет моноцигарно-макрофагальное происхождение В литературе есть данные о том, что альвеолярные макрофаги курящих больных ХОБЛ продуцируют большие количества 1Ь-10 и ЮТа [1лт в , 2000]

У больных ПГ при анализе средних величин содержания цитокинов в зависимости от локализации очагов поражения, стадии процесса, частоты рецидивирования и давности заболевания статистически значимых различий не было обнаружено Обращало на себя внимание распределение частот повышенных уровней цитокинов среди больных со свежими герпетическими высыпаниями и больных, имеющих на момент обследования лишь резидуальные явления на месте высыпаний Как показано на рисунке 5. наиболее часто у пациентов со свежими высыпаниями определялись высокие уровни ТЫРа и 1Ир, а 11,-6 повышался позднее.

Рисунок 5. Частота выявления повышенных уровней цитокинов в сыворотке крови у больных ПГ на разных стадиях обострения заболевания.

Достоверность различий * - р<0,1, ** - р<0,05, при сравнении с помощью двухстороннего точного критерия Фишера.

Примечательно, что ни у одного больного в начальной стадии появления пузырьков не было зарегистрировано повышения содержания IFNy, зато в 2 раза чаще встречалось увеличение концентрации 1-4. Частота повышения уровней ÏL-2 и IL-10 не зависела от стадии развития кожных проявлений, оно наблюдалось почти у половины всех больных ПГ

Тяжесть клинических проявлений у больных ПГ статистически значимо коррелировала с уровнями цитокинов Th2-профиля, причем, разнонаправленно С содержанием IL-10 связь степени тяжести заболевания была прямая средней силы, а от количества IL-4 наблюдалась обратная зависимость, в частности, более низким был уровень IL-4 у больных с непрерывно рецидивирующим герпесом и у длительно болеющих Т.е., складывается впечатление, что чем больше "диапазон" диссоциации Th2 цитокинового профиля (ниже IL-4 и выше IL-10), тем тяжелее течет заболевание

Считается, что преобладание Th2 типа иммунного ответа ассоциировано с неблагоприятным течением вирусных инфекций, в том числе, ПГ [Muraille Е, 1998; NakajiamaH, 2000] У больных ПГ нами не было обнаружено существенного изменения содержания IL-4 по сравнению с донорами ни по средним, ни по частотным показателям, что согласуется с данными литературы [Mikloska Z., 1998; Шуршалина А.В, 2001]. Возможно, объяснение факта обратной корреляции тяжести ПГ и содержания IL-4 кроется в существовании альтернативного сплайсинга генов цитокинов, в частности, IL-4. Обнаружена изоформа IL-4S2, являющаяся антагонистом полноразмерной молекулы IL-4 и выполняющая регуляторную роль ограничителя функций этого цитокина [Сенников C.B., 2001]. Применявшиеся нами монокпональные антитела к IL-4 фиксировали обе изоформы

Что касается IL-10, по данным литературы, его уровень чаще оказывается повышенным локально в очагах поражения вирусом [Halford W, 1996, Шуршалина АВ, 2001], он продуцируется лимфоцитами и кератиноциггамн, особенно активно у больных с частыми обострениями ПГ [McKenna D.B, 2001].

Динамика иммунологических показателей у больных ХБ и ПГ в ходе терапии, включающей иммуностимулирующие препараты.

Больные с обострением ХБ, помимо антибактериальной, бронхолитической и симптоматической терапии, получали полиоксидоний

Клинически состояние больных на фоне лечения значительно улучшалось уменьшались одышка, кашель, количество и гнойность мокроты, слабость, нормализовывалась температура При анализе изменений в иммунном статусе больных выяснилось, что нормализация изначально измененных показателей ИС не всегда сопутствовала клиническому улучшению Высокая и средняя эффективность лечения была отмечена у 88% пациентов (низкая у 12%), в то время как иммунологические показатели нормализовались только у 24% больных, у 53% -параметры ИС улучшились, но не достигли нормы, а у 23% - не изменились или ухудшились.

В динамике лечения отмечено статистически значимое увеличение ПАН, снижение спонтанной пролиферации МНК, увеличение индекса стимуляции пролиферации МНК Выявлено снижение содержания IL-4 и тенденция к повышению уровней IL- 6 и IL-2 (рис. 6) При анализе частот изменений сывороточных уровней цитокинов у пролеченных больных ХБ (рис 7) обнаружилось, что у большинства пациентов произошло снижение концентраций IL-lp, TNFa и IL-4, более чем у половины больных повысилось содержание IL-10 и снизились уровни цитокинов ТЫ типа.

Виферон наряду с противовирусными препаратами получали больных с обострением рецидивирующего ПГ Высокая клиническая эффективность лечения зарегистрирована в 82% случаев, средняя в 18% случаев При этом нормализация измененных иммунологических показателей наступила у 56% больных, частично нормализовались параметры иммунограммы у 31%, а у 12% больных остались без положительных изменений.

В динамике лечения отмечается статистически значимое увеличение миграционной активности нейтрофилов, усиление HLA- DR экспрессии на моноцитах ПК, снижение индекса КонА -стимулированной пролиферации МНК.

Как видно иа рис.6, достоверно снижался уровень 1Ь-1р и уменьшалось содержание других провоспалительных цятокинов, уровень ЕЬ-Ю имея тенденцию к повышению

Рис. 6. Динамика содержания цнтокинов в сыворотке ПК больных после курса иммуностимулирующей

терапии • р<0,05 по парному тесту ЧЫсохоо'а

Такая же направленность изменений цитокинового профиля под влиянием терапии видна на рис 7, показывающем с какой частотой происходило повышение, либо снижение сывороточных уровней цэтокинов у пролеченных больных ПГ

В динамике терапии с применением иммуностимулирующих препаратов у больных ХБ и ПГ наблюдалась тенденция к снижению уровней провоспалительных цнтокинов, особенно для Ш-1, концентрации цнтокинов ТЫ практически не менялись или несколько снижались, снизился в среднем исходно нормальный уровень 1Ь-4, а 1Ь-10 при герпесе несколько повысился.

Рис. 7. Частота изменения уровней цитокянов в сыворотке крови у больных в динамике терапии.

В % больных со снизившимся уровнем щггокина

ХБ ■ „ , г __ПГ

■ % больных с повысившимся уровнем пнгокинв

Таким образом, у больных с вторичной иммунной недостаточностью, проявляющейся частыми рецидивами хронической бактериальной и вирусной инфекции, терапия с включением разных иммуностимулирующих препаратов привела к сходным изменениям изначально

сходных уровней цитокннов У больных обеих групп произошло снижение значительно превышавших норму концентраций провоспалительных цитокинов, особенно, IL-1, и у большинства пролеченных пациентов повысился уровень IL-10.

Такая картина может свидетельствовать об общности механизмов регуляции иммунного ответа при хронических инфекциях различной природы на уровне цитокиновой сети.

Цитокиновая регуляция межклеточных взаимодействий является ключевым моментом в обеспечении контроля иммунной системы над течением длительно персистирующей инфекции, и поэтому требует дальнейшего детального изучения.

ВЫВОДЫ

1 У пациентов с обострением ХБ выявлено угнетение функций фагоцитирующих клеток, максимально выраженное при гнойном бронхите, и снижение активности эффекторов ГЗТ; у больных герпесом обнаружено увеличение относительного содержания CD4+ клеток и повышение ИР И, а также снижение активности эффекторов ГЗТ и спонтанной пролиферативной активности МНК, что соответствует в обеих группах больных признакам иммунодепрессии

2. У больных ХБ и ПГ выявляются однонаправленные изменения концентраций провоспалительных, ТЫ и Th2 цитокинов в сыворотке крови по сравнению со здоровыми, при этом у больных ХБ содержание провоспалительных и ТЫ цитокинов значительно выше, чем в группе больных ПГ, что свидетельствует о существовании общих механизмов нарушений иммунорегуляции и различиях в степени их выраженности при этих заболеваниях

3. У больных ХБ в сыворотке крови повышены уровни провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6 и TNFa), максимально при слизисто-гнойном бронхите; увеличение содержания JL-2 и IFNy наиболее выражено при необструктивных формах ХБ, а содержания IL-10, преимущественно, при обструктивном бронхите; обнаруженные изменения спепра цитокинов отражают их зависимость от клинических вариантов болезни

4 У больных герпесом содержание цитокинов в сыворотке крови характеризуется повышением концентраций IL-ip, TNFa, IL-2, относительно низким содержанием IL-4 и существенно повышенным уровнем IL-10. Увеличение содержания IFNy, выявленное в группе больных ПГ, не наблюдается в начальной фазе высыпаний, что обосновывает целесообразность заместительной терапии препаратами интерферона ПГ в стадии обострения.

5 Тяжесть клинических проявлений у больных герпесом ассоциирована с более низким содержанием в сыворотке крови IFNy и IL-4 и высоким уровнем IL-10, а у больных ХБ - с повышенными концентрациями IL-ip, IL-6 и Thl цитокинов (IL-2, IFNy), что отражает влияние баланса Thl/Th2 медиаторов на течение этих заболеваний.

6 Терапия с включением иммуностимулирующих препаратов у большинства больных обеих групп приводит к клиническому эффекту, который ассоциирован с частичной нормализацией измененных показателей иммунного статуса и снижением концентраций провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, что свидетельствует об обратимости иммунных нарушений в динамике лечения.

Практические рекомендации

Больным с частыми обострениями хронических инфекционно-воспалительных

заболеваний показано включение в комплексную терапию иммуностимулирующих препаратов Проведенное исследование позволяет рекомендовать курсовое использование полиоксидония у больных ХБ и виферона у больных герпесом в фазу обострения инфекционного процесса

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соловьева НЮ., Сенникова Ю.А., Гришина ЛВ, Сенников С.В, Ширинский B.C. Сывороточные уровни иммунорегуляторных медиаторов у больных с синдромом вторичного

иммунодефицита в динамике иммуиоактивной терапии. //Медицинская иммунология, 2004, T.6.N3-5, С. 338.

2. Соловьева Н.Ю., Сенникова Ю.А., Гришина JI.B., Сенников С В, Ширинский В С, Козлов В. А. Баланс цитокинов сыворотки крови и некоторые показатели иммунного статуса у больных хроническим бронхитом и рецидивирующей герпетической инфекцией. Влияние иммуиоактивной терапии. // Медицинская иммунология 2003, т 5, № 3-4, с.461

3. Соловьева Н.Ю., Сенникова Ю.А, Гришина Л.В., Сенников С В, Ширинский В С Продукция цитокинов у больных ВИД в динамике иммуиоактивной терапии //Аллергология и иммунология т.1, №2 2000г Тезисы докладов 3 съезда иммунологов и аллергологов СНГ стр 34.

4. Соловьева Н Ю., Сенникова Ю А., Гришина Л В, Старостина Н М, Кожевников В С , Сенников С.В., Ширинский В.С Баланс цитокинов и изменения в иммунном статусе у больных хроническим бронхитом // Аллергология и иммунология 2003, т. 4, № 1, с. 5-11

5. Соловьева Н.Ю , Сенникова Ю А., Гришина Л В., Старостина Н М., Сенников С В., Ширинский В С. Провоспалительные и иммунорегуляторные цитокины у больных с синдромом вторичного иммунодефицита при рецидивирующей герпетической инфекции // Медицинская иммунология 2003, т5, №5-6, стр. 583-590.

6. Соловьева Н.Ю., Сенникова Ю А., Гришина Л.В., Старостина Н.М., Сенников С В, Ширинский B.C. Изменения сывороточных уровней провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов у больных с синдромом вторичного иммунодефицита в динамике иммуиоактивной терапии // Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН Под ред В И Коненкова Новосибирск, 2003., с 197-200

7. Соловьева Н Ю, Сенникова Ю А, Гришина Л В , Старостина Н М, Сенников С В, Ширинский B.C. Некоторые иммунологические показатели у больных с хронической вирусной и бактериальной инфекцией в динамике иммуиоактивной терапии // Материалы 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. Новосибирск 2000г., стр. 124

8. Соловьева Н.Ю., Сенникова Ю.А, Гришина Л В, Старостина Н.М., Ширинский В.С Цитокиновый профиль у больных с различными вариантами синдрома ВИД // II Съезд иммунологов России, Сочи, 1999 Russian J. of Immunology, 1999, V.4, Suppl.l, P.188

9. Соловьева Н.Ю., Тешукова A.B, Старостина H.M., Ширинский B.C. Применение иммуностимулирующего препарата полиоксидоний при хроническом бронхите II Съезд иммунологов России, Сочи, 1999 Russian J of Immunology, 1999, V.4, Suppl.l, P. 244

10 SckMcva N.Y, Semtova JA, Gndhna LV, SoiAov S.V, Shmnsky VS. Cytokines and some immunologic parametrs in patients with different variants of SID in the dynamics of immuno active therapy // Third Joint Meeting of ICS/ ISICR Cytokine 2000, vl 1, Spesial issue, p. 191. 11. Sctyjeia N.Y, Sarifawa JA, Grisbma LV, SenAw S.V, Sbeh&y VS. Cytokines and some immunologic parametrs in patients with different variants of SID in the dynamics of immunoactive therapy. //Sixth International Symposium on Biological Reactive Intermediates. Chemical and biological mechanisms in susceptibility to and prevention of environmental diseases Paris.France. 2000. P.49.

Подписано к печати 25.10.2005 формат - 60x84 - 1 печатный лист

Бумага: офсетная Печать: Duplo DP-43S Тираж- 100 экз. Номер заказа № 456 Типография ООО '"Югус" г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

»? 1-41

РНБ Русский фонд

2006-4 18733

Актуальность проблемы.

Несмотря на успехи современной фармакотерапии а лечении острых заболеваний инфекционной этиологии, нерешенной медицинской проблемой остаются рецидивирующие и хронические инфекции бактериальной и вирусной природы. Так нпфиинрованность населения планеты вирусом простою герпеса, по данным '-зпндсмнологнчсских исследований, составляет SO - W/o, а часто возникающие рещщивы инфекции, встречаются у 2 - 6 % людей [6, 150). По данным ВОЗ. герпес, как причина смерти от вирусных заболеваний, стоит на втором месте после гриппа. В последнее десятилетие покатано, что инфицнровзнноеть вирусами семейства Herpesvimlae ассоциирована с ускорением атсрогенси, повышенным риском ряда онкологических заболеваний, вторичного бесплодия> знтифосфолнпидного еннлрома. ранним развитием болезней пожилого возрасти. Установлено, что эти вирусы могут активизировать транскрипцию генома ВИЧ и являются кофактором инфицирования и прогресснровання ВИЧ-ннфсшии [37, 98, 156], По прогнозам Всемирного банка информации, проблема герпес вирус них инфекций на ближайшее будущее определяется как «глобальная проблема человечества».

Проведенные в различных странах мира эпидемиологические исследования свидетельствуют также об устойчивом росте заболеваемости хроническими нееиеиифнческнмн заболеваниями легких н, в частности, хроническим бронхитом [66, 119]. По данным GOLD {Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) хроническая обструктнвная болезнь легких (ХОБЛ), как причина смерти, занимает 4-е место после заболеваний сердца, рока и цереброваскулярной патологии. В США в настоящее время на фоне снижения смертности от сердечно-сосудистых и других заболеваний смертность от ХОБЛ неуклонно растет, как и обращаемость к врачам пи поводу брокхолегочнон патологии. Россия занимает 3-е место в мире по уровню смертности от болезней органов дыхания (i 1, 41, 222],

Частые обострения простого герпеса (ПГ) и хронического бронхита (ХБ) являются, как правило, манифестацией иммунных нарушений в организме, I ран шторных нли более стойких, объединяемых понятием вторичного иммунодефицита (ВИД) [38, 53, 57]. Большое значение в возникновении вторичного иммунодефицита на фоне хронического инфекционного процесса придается нарушению баланса регуляторных н провоспалительных цитокинов. Данные литературы об изменении продукции цитокинов при этих заболеваниях многочисленны, но разноречивы и при XI» касаются оценки преимущественно провоепалитеяьных цитокинов [66, 85, 86, 131], Исследования медиаторов профиля Thl н Th2 при ХБ носят фрагментарный характер и не позволяют составить целостное представление о нарушении нммунорегуляции на системном уровне и во взаимосвязи с клиническими проявлениями заболевания. При ПГ наиболее изученным является нитерфероновый статус [26t 96, 140, 146], связь других иитокннов с основными иммунологическими параметрами и клиническими проявлениями заболевания изучена недостаточно полно или трактуется неоднозначно.

Актуальность проблемы определяется также тем, что на сегодняшний день не существует методов лечения указанных заболеваний, позволяющих полностью элиминировать персистнрующую инфекцию. Предполагается, что этиотроиная терапия может быть успешной только при адекватной коррекции нарушенных иммунных функций н восстановлении контроля иммунной системы над паточном, В свою очередь, важность проблемы целенаправленной нммунокоррекцин диктует необходимость детального и всестороннего изучения молекулярных и клеточных механизмов развития нммунодефнцнтного состояния при хронической кнфекцнн, как бактериальной, так к вирусной природы.

Цель исследования.

Сравнить содержание ироаоспал тельных и им мунарегуляторных ци токи нов в сыворотке крови и функциональные свойства клеток иммунной системы у оолышх простым герпесом и хроническим бронхитом, имеющих лабораторные признаки нммунодспрсссин. и опсиить влияние комплексной терапии с включением иммуностимулирующих препаратов на климико-иммунолошческие параметры у этих больных. Ззлачн исследован ни:

1, Изучить субпопуляцнонную структуру н функциональные свойства лимфоцитов и фагоцитирующих клеток периферической кровн больных с частыми обострениями ХБ н ПГ.

2. Определить содержание ряда прошепапн тельных и нммунорегуляториых цнтокино* в сыворотке кровн больных ХБ и ПГ.

3. Проанализировать взаимосвязь уровней цктокннов в сыворотке ПК с иммунологическими и клиническими характеристиками больных,

4, Оценить влияние терапии с включением иммуностимулирующих препаратов (полиокендоння у больных ХБ н виферона у больных ПГ) на иитокнновый профиль и другие показатели иммунного статуса в динамике лечения.

Научнан новизна.

Установлено, что изменения в содержании и функциональных свойствах субпопуляций лимфоцитов и фагоцитирующих клеток у больных с частыми обострениями ПГ и ХБ носят характер нммуносупрессни на фоне повышения содержания провоспалнтельных и нммунорегуляториых медиаторов. Впервые установлено, что изменения концентраций цигокинов в сыворотке крови больных ПГ и ХБ имеют однонаправленный характер: выявлено повышение содержания TNFa, IL-IJi, tL-2. IFNy и EL-10, а уровни IL-4 а обеих группах и 11,-6 у больных герпесом значимо не меняются. Впервые покачано, что угнетение эффекторных функций ГЗТ и фагоцитарной активности моноцитов у больных ХБ и III' наблюдается на фоне оIносителию низкого содержания IL-2. Установлено, что тяжесть клинических проявлений у больных герпесом ассоциирована с более низким содержанием в сыворотке крови tFNy и tL-4 и высоким уровнем 1L-I0. а у больных ХБ с повышенными концентрациями IL-lfJ, IL-6, IL-2. tFNy. Показано, что у больных ХБ н герпесом в динамике терапии с применением иммуностимулирующих препаратов наряду с частичной нормализацией измененных показателей иммунного статуса происходит снижение концентраций провоепалнтельных цнтпкинов в сыворотке крови и у большинства пролеченных пациентов повышается уровень 1L- 10. Выявленные изменения сопряжены с положительной динамикой клинических проявлений.

Теоретическая и практическая значимость работ ы.

Полученные данные позволяют предположить наличие общих механизмов нарушений iштокнновой регуляции иммунного ответа у больных с синдромом ВИД при персистирующей инфекции как бактериальной, так и вирусной природы. вызывающей схолиые изменения уровней провосналнтельных н нммунорегуляторных цнтскннов. Результаты работы дополняют представления об иммунных нарушениях у больных ХБ н ПГ с позиций цито кн н -о посредоаанно П регуляции иммунных реакций. Полученные данные могут быть учтены при разработке методов »Ht оки но терапии хронических заболеваний инфекцнонно-воспалительной природы [ояажительнье влияние на баланс цаюкиион и динамику лабораторных признаков ВИД включения в комплексную терапию иммуностимулирующих препаратов позволяет рекомендовать использован ни' полнокендоиня у больных Х£ и виферона у больных герпесом при частых обострениях инфекционного процесса.

Основные положения, мыиоснмые на jam игу.

1. Изменения уровнем цитокинов в сыворотке крови у больных с частыми оболрошимк хронического бронхита и простого герпеса характеризуются повышением концентраций пронос иалнгельных и ТЫ цнншшоа, более выраженным при ХБ, неизмененным уровнем IL-4 н повышенным содержанием 1L-1D. носят однонаправленный характер и сопровождаются снижением эффекторных функций клеток иммунной системы,

2. Изменения уровней нровоспалнтельных цитокинов, содержания и функциональных параметром клеток иммунной системы у бальных ХБ и герпесом частично обратимы после курсового использования иммуностимулирующих препаратов.

Анробанни работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на клинической конференции в ИКИ СО РАМИ. (Новосибирск 2002г.); на Всероссийском иммунологическом форуме «Дин иммунологии в Санкт-Петербурге 2004», на научном симпозиуме "Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет" (Новосибирск 2005 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных робот (из них 2 оригинальные статьи в реферируемых научных журналах)

Объем н структура работы.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов н выводов. Материал изложен на 137 страницах печатного текста, включающего 12 рисунков и 14 таблиц. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 235 литературных источника.

ВЫВОДЫ.

I В группе пациентов с обострением ХБ выявлено угнетем не функций фагоцитирующих клеток, максимально выраженное при гнойном бронхите, и снижение активности эффекторов ГЗТ; у больных герпесом обнаружено увеличение относительного содержания CD4+ клеток и повышение ПРИ, а также снижение активности эффекторов ГЗТ н спонтанной пролнфератнвной активности МНК. что соответствует в обеих группах больных признакам нммунодепрессин.

2. V больных ХБ и ПГ* выявляются однонаправленные изменения концентраций нровоспалнтсльимх, Thl и Th2 цнтокннов в сыворотке крови по сравнению со здоровыми, при этом у больных ХБ содержание провоспалитсльных и ТЫ цнтокннов значительно выше, чем в группе больных ПГ, что свидетельствует о существовании общих механизмов нарушении нммунорегуляцнн и различиях в степени их выраженности при этих заболеваниях.

3. В сыворотке крови больных ХБ повышены уровни провоспалитсльных цнтокннов (JL-ip, IL-6 и TNFa), максимально при елнзисто-гнойном бронхите: увеличение содержания IL-2 и IFNy наиболее выражено при необструктивиых формах ХБ, а содержания IL-10, преимущественно, при обструктивном бронхите; обнаруженные изменения спектра цнтокиноа отражают их зависимость от клинических вариантов болезни.

4. У больных герпесом содержание цнтокннов в сыворотке крови характеризуется повышен нем концентраций IL-lp, TNFa, IL-2, относительно низким содержанием II.-4 и существенно повышенным уровнем IL-I0; увеличение содержания IFNy, выявленное в группе больных ПГ. не наблюдается в начальной фазе высыпаний, «по обосновывает целесообразность заместительной терапии препаратами интерферона в о алии обострения 11Г,

5. Тяжести этнических проявлений у больных герпесом ассоциирована с более низким содержанием в сыворотке крови IFNy и 11,-4 н высоким уровнем П.-10, а у больных ХБ - с повышенными концентрациями IL-lp, IL-6 и ТЫ цитокинов (IL-2, IFNy), что отражает влияние баланса Thl/Th2 медиаторов на течение зтих -заболеваний.

6. Терапия с включением иммуностимулирующих препаратов у большинства больных обеих tpynn приводит к клиническому эффекту, который ассоциирован с частичной нормализацией измененных показателей иммунного статуса и снижением концентраций провоспалнтельных цитокинов в сыворотке крови, что свидетельствует об обратимости иммунных нарушении а динамике лечения.

П ра ктнчес кие рс ко мен д а ним

Больным с частыми обострениями хронических ннфекцнонно-воспалительных заболеваний показано включение в комплексную терапию иммуностимулирующих препаратов Проведенное исследование позволяет рекомендовать курсовое использование полиокендоння у больных ХБ и вифероиа у больных герпесом в фазу обострения инфекционного процесса, У пациентов с частичным улучшением лабораторных показателей ИС представляется целесообразным продолжение курсов лечения указанными препаратами н в стадии ремиссии заболевания.

Блаюдарносгн.

Автор выражает глубочайшую признательность всем сотрудникам лаборатории клинической нммунофармакологин ИКИ СО РАМН во главе со своим руководителем дмн. B.C. Шири неким за неоценимые помощь и поддержку; сотрудникам лаборатории клинической иммунологии и лично д м.и. В-С- Кожевникову за данные об иммунном статусе обследованных больных; руководителю отделения иммунологии кле.н Н.М. Старостиной; д.м.н. С-В. Сснникову га помощь в определении содержании цнтокинон и подробное обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии; С В. Крысову, Д-Х. Курамшину, А-Н Снлкову. Л В. Гришиной и А-П. Хабаровой,