Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительное изучение иммунорегуляторных свойств альфа2-макроглобулинов человека и мыши

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации Российский государственный медицинский университет

Р Г 5 О Д На правах рукописи

- 5 /'¡¿и :Г.

ЛЫКОВА Ольга Федоровна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОРЕГУЛЯТОРШК СВОЙСТВ АЛЬФАг-МАКРОГлОБУЛШОВ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Центральной научно-исследователь* лаборатории Новокузнецкого государственного института усове] 'стЕования врачей

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профес< академик РАЕН А. Н. ЧЕРЕДЕЕВ

-« '

. Научные консультанты - доктор медицинских наук а К ГОР.

доктор биологических наук Е А. 3(

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук М.А.СТ1

доктор медицинских наук В. Ф. СЕ1

Ведущее учреждение - Институт иммунологии МЗ РФ

Зашла состоится ___"_ 1924 года в_чг

на заседании специализированного совета Д.034.14.Об -г Российском государственном медицинском университете (117£ г. Мэсква, ул. Островитянова, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в' библиотеке Российск государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "_"_1894 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого *

совета, к. м. н.,. доцент Т. Е. КУЗНЕЕОЕА

ОБДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Среди обилия протеазных ингибиторов особое место занимает «¿-мачроглобулин. Открытый в начале 60-х годов, этот белок сочетает универсальность действия на протеиназы всех классов, уникальную структуру молекулы и своеобразный механизм ингиби-рующего эффекта, а также обладает выраженными иммунорегулятор-нкми свойствами (Нечпач D., Vischer Т., 1988; DeSt-=fano А., Hoffman м., !991). Особый интерес представляют данные о взаимодействии макроглобулина с различными цитоккнами -(Cenias S.L.e. а., 1991; Ja^s К.е.а., 1992; Hall S.W. е.а., 1992). В последнее время цитокины рассматриваются как потенциальные кандидаты для включения в комплексное лечение различных инфекционных заболеваний, злокачественных опухолей, артритов, дегенеративных заболеваний нервной системы, а та'же для коррекции деятельности иммунной системы (Вядро М.М., 1990; Parkinson D., 1989; Thorbecke G.J. е.а., 1991). В связи с этим становятся перспективными исследования по разработке методов, снижающих или усиливающих эффекты цитокинов. В этом отношении определенный интерес может представлять МГ, который благодаря высокой реактивности обладает способностью связывать различные цитокины, может ингибировать их высвобождение, а также способен воздействовать на опосредуемые цитокинами фазы иммунй'ых реакций (Jabíes К., 1990). Механизмы взаимодействия № с цитокинами остаются до конца не выясненными. Не установлено, могут ли цитокины способствовать конфермационной перестройке МГ, и может ли ингибитор модулировать эффекты цитокинов. До сих пор кет единой точки зрения и на механизм регуляции функций иммунной системы со стороны «2-макроглобулина.

Изучение иммунорегуляторных свойств белка невозможно без получения его з свободном от примесей виде и натлвной форме. Разработка методов выделения МГ из различных биологических материалов и его очистка по-прежнему является актуальной задачей, решение которой откроет новые возможности в использовании данного белка в клинике.

Не менее важно исследование аналогов человеческого- MP у животных. Б частности, детальное изучение структуры и функций

«s>-макроглобулина мыши поможет создать адекватны« модели физиологических и патологических процессов на этих животных, ведь именно мыши являются одним иа самых распространенных объектов в иммунологических эксперимента'.. Но несмотря на это. мышиный аналог МГ поучен крайне недостаточно. Особенно это касается tro иммунорегуляторних функций и, ь том числе, взаимодействия

с цитокинэми.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось установление возможных механизмов образования комплексов цитокинов с альФ'С-макроглсбу-линачн человека и мыки и обоснование гипотезы об иммунерегуля-торной роли указанных МГ.

F-: задачи работы входило; 1 Разработать спссоОы получения различных Форм а£-макроглобу-линов человека и мжи.

2. Провести сравнительное исследование состава, структуры я Функций изучаемых беДКОВ.

3. Оценить особенности биосинтеза МГ в культурах иммунокомпи-тентных клеток.

4. Установить механизмы образования комплексов >.С' с различными цнтокинами (интерлейкннами, интерфероном:; и чакторглс; некроза опухоли).

5. Оценить влияние и его комплексов с Фактором нормализации трансформированных фибробластов на культуру L-клеток.

Научная новизна

Впервые проведено сопоставление иммунерегулл горных свойств р.1&гичодздхся по структуре !.'Г человека и мк._и. Уст:ею: ленэ, что оба белка характеризуются как сходством, тог. и различиями в изучаемых свойствах. Они способны обратимо присоедини .г различные шпокины, в частности, интерлейкнны, интерф.ероны и Факторы некроза опухоли. Показанэ, что №Р мыли реагирует с цитзкннамп иначе, чем мг человека. Впервые показано, что комплексы токин в обои/ случаях образуются за счет водородных евлзей. Способность присоединять циюкины вавиог.т от ул кон^ермацн-

онного состояния. Впервые установлено, что МГ образует комплексы .с цитокином. обладаю®!« активкоситыо фактора нормализации трансформированных фибрсбластоз, и модулирует его эффекты In vitro. Эта модуляция выражается в стимуляции миграции L-клеток под воздействием комплекса МГ-ФН и в снижении уровня трансмембранного потенциала фибробластов, отражающего степень дифферен-цировки, с дальнейшим повышением его в последующ« поколениях L-клеток. Впервые обнаружено, что в реакциях с белками плазмы крови основными аффинантами являются иммуноглобулины и альбумин.

Практическая значимость работы

Практическая ценность работы состоит в разработке высокопроизводительных технологий получения МГ человека и ».алии, а также создания тест-систем для определения их концентраций в различных биологических жидкостях. Разработаны различные методы детекции образования комплексов № со многими аффинантами. Предложен оригинальный комплекс, позволяющий устанавливать природу связей МГ с аффинантами. Определены нормативные значения концентраций № в организме человека. Разработан способ выявления фактора, вызывающего нормализации трансформированных фибробластов, из супернатангов лимфоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При реакции с белками плазмы крози основными аффиналтами МГ человека и мыши являются иммуноглобулины и альбумин.

2. № человека и мыши способны образрвывать комплексы с природными и рекомбикантными цитокинами, такими как интерлей-кины-13 и -2, «о- и r-интэрфероны и эсферон, факторы некроза опухоли-« и -в.

3. Комплексы МГ-цитокин образуются за счет связей некова-лентной природы.

4. Способность МГ человека и мыши к присоединению различных абфинантов зависит от конформации их молекул.

5. Несмотря на структурные стличня, МГ человека и »леи обладают сходными иммунорегуляторам: свойствами.

Апробация работы и публикации

Полученные результаты доложрны на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), У1I Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, 1992), на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии ( Алма-Ата, 1992), на XI! Международном симпозиуме по медицинской химии (Базель, 1992).

Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого Совета Новскузнецкого ордена Трудового Красного Знамени института усовершенствования врачей (31 мая 1994 г.).

По теме диссертации опубликовано 1? печатных работ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит и: следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, библиографические указатели. Работа изложена на 131 странице машинописного текста и иллюстрирована 8 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 165 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе применялась пулированная сыворотка (плазма) крови доноров, лиофнлиэированная плазма, а также сыворотка крови мышей. Моьонуклеарные клетки выделяли из гешринисированной Еексзной крови стандартным методом по Водит А. (1968). Кроме того, объектами исследования были мышикие фибробласты. трансформированной линии Ьдгэ.

Выделение лимфошша с активностью фактора нормализации трансформированных фибробластов (ОН).

Монснуклеарные клетки человека и спленоциты мышей культи' вировали в бессывороточной среде 199 в концентрации Зх10б клеток/мл в течение 24 и 36 ч при 37 С. Клетки отделяли центрифугированием, кондиционированные среды подвергали очистке при помощи ионноебмечной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, элюируя

белок ступенчатым градиентом 0,2-0,5 М хлорида натрия в 50 мМ трис-(оксиметиламинометан)-фосфатном буфере, pH 7,4.

Методы исследования влияния КГ и его комплексов с ФН на культуру L-клеток

Внесение лимфоцктарных факторов и МГ в культуру' L-клеток • производили через 24 ч после засева путем замени полозкны культурачьной на исследуемый образец. Через 72 ч после засева определяли уровень трансмембргнного потенциал (ТШ) фиброб-ластоз, а также изменение их пролнфератиьной активности и миграционной способности. Tf.il клеток измеряли с помощь;: флуоресцентных зондов: аниона - ^ачилинокафталин-Э-сульфонат-натркя (АНС) и катиона - 4- (п-диметиламинсстирил)-1-метилпиридин1:й (ДСМ). Интенсивность флуоресценции измеряли в единичных клетках с участка цитоплазм 1,5 кв. мкм. с помочь» люминесць-нтно-го микроскопа. Результаты вьиэакали в виде отнесения средних интенсивностей Флуоресценции г дек/ Рлнс.

Для определения продифоративней активности L-клеток использовали модифицированный метод введения в £НК пролифернрух-ших кг.е\ол двойной радиоизотолней метки (Епифанова Терс-

ких В.В., Полуновский В.А., 1933).

Способность фибропластов к миграции учитывали _.с помощью скринингового теста клет:чнс'1 миграции из микрокрекультур in vitro iСуслси А.П., Головин А.П., 19£9).

Метсл.и анализа структуру, физ::ко-хи.г,?;еск:--ч свойств и ингкэиругацей активности !.(ГМ и М'Ч

a.v.hkci-'.-.c^cthd.':": анализ белка определили на азтскагическсм акиноклелотаом анализаторе LC-t00i ("Bictrcnic", Германия). Содержание спадов: у. кислот оценивали резорцинов^ игтодс;,; (Svenr.orholn L., 1975). ¡ссличественного сгредел-;::::я гексоз испольгсвали ачтронсвый метод (Trevelyan W.R., Harrison Т.П., 1952), Сод? рлакие аминссачаров определяли модифицирование:: методикой Моргала-Зльсона с Rcr.dl C.J...M. е.а., 1955), фук^зы -методом Лга-г ( Diahe L. е.a,, 1943).

Внутренние тпеэфпры ь-«влаги титреваннем 5,С'-,-;"ГИО-

- & -

бис(2-нитро)бензойной кислотой (Зоигир-Лепзеп Ь. е.а., 1980). Общее содержание белка в препаратах оценивали по методу Цжг1 0.(1951).

Молекулярную массу Селкоп определял!: гель-хроматографией па поперечно-сшитой агарозе, а такле электрофорезом в градиенте пор полиакриламидного геля. Для установления молекулярной массы субъединиц белки предварительно кипятили с меркаптоэта-кслом в присутствии додецклсульфата натрия. Изоэлектрофокуси-ровачие проводили в соответствии с рекомендациями фирмы "Ц\В".

Для определения антитрипсиновой активности МГ использовали метод ЗаНо А.. 31посйага Н. (1885). Способность МГ гащивать связанные с ним прстепназы от ингиОирующего действия соевого ингибитора трипсина оценивали по методу 6ап.гоЬ Р. (1965).В качестве субстратов для трипсина использовали азока-зеин и .Ч-бензоил-ОЬ-аргинин-паранитроанилид.

Иммунохимические методы

Для получения моноспецифических сштисывэроток против МГ иммунизировали кроликоЕ, вводя антиген внутрикожно с неполным адгювантом 'Фрейда. Аффинно-очищенные антитела получали посредством аффинной хроматографии на агарозных сорбентах с иммобилизованными антигенами. Качество антител оценивали с поморю методов имм'.'иодиффузии и перекрестного электрофореза. Для определения концентрации белков использовали 'ракитный иммуно-злектрофорез. Изучение реакций МГ с различными а!фкнантами осуществляли методами ракетного иммуноэлектроЬореза с проме.ху-течнь'м гелем. Применяли также адсорбцию антигена 1п гг.Ни.

Для определения концентрации »С в суг.ернатантах культивируемых мононуклеарах использовали твердофазный иммуноф^рмент-ный метод (УоПег А., 1976), используя ..ганоспецифические антитела против МГ, истощенные эмбрионагмюй телячьей сывороткой. Коньюгать антител с пероксидазой из хр^на получали периодатккм методом Макале Р., 1974; Тои55еп Р., 1084).

Реакции МГ с цитскинамк исследовали в условиях дот- л вестерн-блоттинга, окрашивая антигены частица»'« коллоидного колота с последуем усилением окраски серебром. В рэйоте использовали рекомбннантные человеческие цитожны: интерлейкин-Г:

и интерлейкин-lß, осг- и ir-интерфероны, эсферой, фактора некроза опухоли-« и -о.

Культивирование клеток

Культивирование мононуклеарных клеток осуществляли в планшетах для иммунологических исследований в среде Игла-МЕМ (НПО "Вектор", Новосибирск) с добавлением 2мМ L-глютамина, 20 ММ HEPES-буфера (Reanal), 50 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл пенициллина и 20% инактивирозанной сыворотки крупного рогатого скота.

Поддерживание линии L-клеток осуществлялось пассированием в среде 199, содержащей 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. При необходимости L-клетки снимали с поверхност;: стекла 0,25% раствором трипсина, который затем инактивировали полной средой.

Статистическая обработка полученных данных производилась на персональном компьютере фирмы Hewlett-Packard (США) с помогаю -пакета прикладных программ этой же фирмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Я ИХ ОЕСУЯДЕНИЕ

Выделение и очистка МГ человека и мыши

Разработаны методы выделения и очистки МГМ и МГЧ с помогал различных типов ИДК-агароз (4 и 6% ИДК-агарозы, длиннос-пейсерные и короткоспейсерные), позволяющие получать препараты МГ с сохранением большей части их биологической активности, свободные от примесей и с достаточно большим выходом конечного продукта (1,1 г и" 1 л сырья). Наиболее оптимальней признана следующая схема выделения MI' человека:

плазма (сыворотка) кроЕИ - осаждение П5? 6000 ( сульфатом аммония; - хроматография на ИДК-агарозе - гель-фильтрация. V" мыаи выделяли по той же схеме, но с добавлением еще одного этапа - псевдолигандной хрематографки на голубой аг apose-.

Применяя те или иные их медифжации, исто пелучя.-ь iff с

заданными свойствами согласно задачам дальнейших исследований. Мы можем получить как нативный белок, сохраняющий антипротеаз-ную активность, так и модифицированный, обладающий свойствами иммуномодулятора. К таким результатам приводит, например, замена ПЭГ 6000 сульфатом аммония в процессе осаждения белка.

Основные физико-химические свойства МГ человека и мыши

Получение препаратов МГ человека и миги в чистом виде позволило определить состав и структуру молекул этих белков. Проведенные исследования показали, что исследуемые макроглобулины являются гликспротоинами, обладающими одинаковой молекулярной массой - 7Е0 кД, сходной электрофоретической подвижностью и характеризуются частичной антигенной идентичностью.

Изучаемые белки в целом имеют сходный аминокислотный состав, хотя и обладают небольшими индивидуальными отличиями. Аминокислотный состав макроглобулинов довольно оригинален. Он характеризуется малым количеством серусодержащих аминокислот и триптофана и повышенным содержанием кислых аминокислот. Эти данные хороко согласуются с результатами исследований других авторов (Sottrup- jenssen L. е.а., 1984; Sa-ifi О. е. а. ,1985).

Аналогичные черты сходства наблюддотся и при сопоставлении углеводного состава исследуемых мачроглобулинов. Доминантными компонентами углеводной части- МГ являются гексозы и ацетиламиносахара, минорными - фуксза и сиаюьые кислоты.

Белкозо-углеводный состав позволяет отнести к кислым белкам, что соответствует данными изофокусировачия. Изоэлект-рические точки МГ человегса и мьши несколько различаются, поскольку несколько различен и состав белков, но, впрочем, такке достаточно близки.

Исследуете белки в нативном вид г обладают активностью ингибиторов протеиназ. Они связывают широкий спектр иротеоли-тических ферментов, но не взаимодействуют с нуклеазачи и гиа-луронидазой. Аффинитет к иротеазам у МГ человека и И' мши не одинакоз. В целом, активность № человека в два раза вида,-ингибируювдй способности МГ мыши. Такое расхождение можно объяснить только различием в структуре моле^л, так как по другим физико-химическим свойствам они практически идентичны. Дейс-

- и -

твительно,' данные зонального электорфореза в градиенте пор по-лиакриламидного геля показали, что МГ человека и мьши имеют различную структуру молекул. Альфаг-макроглобулин человека представляет собой тетрамер, образованный 4 идентичными или почти идентичными субъединицами с молекулярной массой 180 кД. Мономеры, соединяясь попарно дисульфидными связями, образуют димеры, имеющие молекулярную массу 360 кД. Л-меры, в"свою очередь, соединяются некоЕалентно, формируя молекулу ингибитора. В образовании тетрамора МГ, как показа-ш проведенные ■ исследования, принимают участие ионы двухвалентных металлов, в частности, цинка.

Несколько иную структуру имеет «2-макроглобулин мыши. Он, как и МГ человека, состоит из двух димеров с молекулярной массой 360 кД, соединенных некозалентно, но димерй образованы но двумя, а четырьмя субъединицами каждый. Эти субъединицы не идентичны. Две из них имеют молекулярную массу 150 кД, а две других - 35 кД. Еольаая и малая субъединицы соединяются между собой дисульфидными связями. Гаким образом, молекула МГ мыли имеет дополнительные -S-S-связл, отсутствующие у МГ человека, которые и придают ей большую жесткость.

Оба макроглобулина при взаимодействии с протеиназачи и первичными аминами претерпевают конформационные превращения с формированием более плогной структуры, что подтверждается увеличением их электрофоретической подвихноста в палиакрилаикдксм геле, а татае изменением изозлектрических точек. Белки при этсм, как показали проведенные исследования, зкспрессирумт 4 тнолевых з.гира на молекулу МГ. Следовательно, Í/ÍT* человека и мыта имеют равное количество мест связывания протеиназ или метиламина, енжгние онтилротеазней а-стит-нссти макроглобулина мьпи молю объяснить только структур!!-.:ми оссйеннос-.я;:;! данного бел;са. Очевидно, б этсм случае доступ к зенгм прпмачки окатывается стерически затруднен. Структурные особенности молекулы МГ !&-и приводят и к снижению экранирования связанного с ингибитором фермента от действия соегого ингибитора трипсина едеоо по сравнению с .'.С1 человека.

7ак::м сбсазги, ингибир/ющие харгкт -рнстккя макроглобул;:-нов определяются исключительно отрчтаурей ::х (.олс-кул. Игм:-нс-ни*> кенфермацпи МГ пол действием кзгая-г*0о агентов, напри^'ф.

сульфата аммония или метиламина, приводят к резкому снижению, вплоть до отмены, антипротеазнсй активности ингибиторов. На реакции же с лектиками, а так же специфическими и протпвоугле-еодпыми антителами конформация молег/лы МГ не влияет. Это связано с тем, что во взаимодействиях с данными реагентами участвуют поверхностные участки молекулы ингибитора - углеводкые или антигенные группы,- которые не затрагивает модификация.

Пропускание сыворотки человека и мыши через колонку с иммобилизованными МГ с последующим электрофорезом в ПААГ (5-Х%) Фракций, злюированных с колонки, показало, что МГ связывает различные белки сыворотки (плазмы) крови. Методами иммунодиф-фузии установлено, что основными аффинантами являются иммуноглобулины класса Q и альбумин, причем связывающая способность МГ человека выше, чем № мыши. Если учесть, что альбумин является переносчиком различных низкомолекулярных веществ, в том числе гормонов, липидов, ионов металлов, а также медикаментозных веществ, то его взаимодействие с МГ lri vivo может существенно повлиять на перераспределение в организме указанных аф-финантов. Немаловажные последствия может иметь и связываний макроглобулином иммуноглобулинов сыворотки крови. Не исключено, что он может транспортировать их к определенным i -леткам, а такжэ регулировать количество свободных антител в организме, удаляя их избыток при аутоиммунных процессах.

Сравнительный анализ иммунорэгуляторных свойств МГ человека и мыли

Проведенные исследования показали, что МГ человека.и мыии в условиях дот- и вестерн-блоттинга способны связывать различные цитокины: интерлейкины-Ю и -2, «2- и r-интерфероны и зс-фероч, факторы некроза опухоли а и а. Взаимодействие МГ' с цл-токинами во многом определяется конформационным состоянием молекулы МГ, а также эависит и от природы цитскина. Так, МГ человека, модифицированный метиламином, в условиях дот-блоттинга не связывается с ИЛ-Ю, в то Бремя как нативный белок и МГ, модифицированный плазммном, взаимодействуют с ним. Очевидно, при формировании более плотной структуры МГ под воздействием метиламина возникают стерические препятствия для образования

связей с указанным цитокином (рис.1).

С ИЛ-2, напротив, нативный ингибитор не взаимодействует. Оптимальные условия для реакция связывания с данным цитокином создаются только после пространственной модификации молекулы МГ.

МГ мыши взаимодействует с интер; ч:л соверхенно иначе. Образование комплекса с ИЛ-Ю стлюиится возможным только после информационной перестройки, происходящей под влиянием метиламина (рис.2). Для взаимодействия же с ИЛ-2 подобная перестройка не нужна, и любая модификация отменяет взаимодействие с цитокином, создавая стерические препятствия.

Рис.1. Взаимодействие различных форм МГ человека с ИЛ-Ю в условиях дот-блоттинга. Пояснения: А1-3 •- контрольные лунки; Б1, В1 - нативный МГ; Б2-3, В2-3 - комплекс МГ-метиламин.

Рис.2. Взаимодействие различных форм МГ мыши с ИЛ-Ю в условиях дот-блоттинга.

Пояснения: 1А. 2А - контроль; 1Е, 2Б - МГ-метиламин; 1В, 2В -МГ-плазмин; 1Г, 2Г - нативный №.

А_ б . _ Б_Г

Определяющая роль конформационного состояния молекулы МГ наблюдается и в реакциях с другими цитокиками, наименее выражена она лишь с ИФ и эсфероном.

Проведенные исследования продемонстрировали, что дачсе длительная обработка МГ человека и мши вышеназванными цитоки-начи не вызывает расцепления внутренних тиолоеых групп м£1крог-лоСулинов, которое наблюдается при взаимодействии с протеина-эами и первичными амимнами. Следовательно, механизм связывания цмтокинов МГ отличается от связывания протеинаа.

На примере ИФ-аг ш попытались детально разобраться в механизме связывания макроглобулином цитокинов (рис.3). Для этого блоты инкубировали с МГ в присутствии реагентов, способных оказать влияние на комплекссобразование. Результаты исследования показали, что б связывании не участвуют углеводные компоненты молекулы МГ и ионы металла, поскольку реакция связывания наблюдалась в присутствии конканавалина А и ЭДТА. Лолумолекули КГ, образованные под воздействием двухвалентных ионов кадмия и 4 М мочевины, не теряют способности к связыванию цитскина. Денатурация же молекулы КГ под воздействием температуры полностью отменяет взаимодействие с УЛ>. Очевидно, в нативной ыо-

¿0* 40'

зг-

13.

у?

V:

Г/''

Г1'Г • I

Л

к

1

Г •.

Рн-.З. Взаимодействие с МГ человека з условиях иммуиоб-

лэттинга.

катявпы;: .'.Г. 3 -гре-

Полсненпя: 1 - маркеры молекулярной м^ссы, ?.Г с 4 \1 мочевиной, 4 - МГ с ЭДТА, 5 - денатурировании вачнем КГ, 6 - КГ в присутствии иоксз кадмия, У - КГ с ксккана-галиьом А, 8 - комплекс КГ-метиламин, 9 - после ;:ккуйац;;;;

с КГ обработаны додецилсулъфатсм натрия.

лекуле ингибитора имеются особые участки связывания, пространственно соответствующие молекуле цитокина. Нарушение третичной и вторичной структуры МГ приводит к исчезновению этих сайтов и делает невозможным образование комплекса с молекулой цитокина. Диссоциация комплекса МГ-ИФ в присутствии додецил-сульфата натрия свидетельствует о нековалентном характере связывания белков. Скорее всего, главную роль в образовании комплекса с цитокином играют водородные связи.

Влияние МГ и комплексов МГ-цитокин с активностью фактора нормализации (4>Н) на культуру трансформированных фибробластов.

Результаты наших исследований показали, что МГ человека и шии способны связывать продуцируемый Т-лимфоцитами цитогаш с активностью фактора нормализации трансформированных фибробластов. Супернатанты культур МНК пропускали через колонку с иммобилизованным ча ВгСМ-агарозе МГ. Белок, связавшийся с МГ злюи-ровали глицин-НСЬбуфером, рН 2,8. Полученная фракция повышала уровень ТМП I-клеток на 60,38±18,72%. Фргищия, не связавшаяся с МГ, на 33,52+2,40% понижала ТМП фибробластов. Методом зонального электрофореза в полиакрилашдном геле фракции, связавшейся с МГ, определена молекулярная масса цитокина, обладающего эффектом нормализации: она составляет 6-8 кД. Сами М11 в концентрации 2-200 нг/мл не оказывали влияния на дифференци-роьку, пролиферацию и миграцию [.-клеток, но значительно угнетали индуцируемую С'Н феиотипическую нормализацию трансформированных Фибробластов. Однако наблюдаемый эффект не был стабильным: последующие поколения Ь-клеток экспрессировали нормализованный фенотип (рис.5). Проведенные исследования показали, что модулирующее действие МГ на указанный цнтокин ни ограничивается ингибированием эффекта нормализации. Под влиянием МГ цито-кин приобретает и совершенно новые свойства, не характерные для него, - способность к стимуляции миграции фибробластоз (рис.6).

Результаты исследований показали, что в супе-рнатантах культивируемых мононуклеаров мужчин и ноберемепних женщин он-

аао

о

3 4 5 6

Рис.5. Влияние № и комплекса МГ-ФН на уровень трансмембранного потенциаяа Ь-клеток.

Пояснения: 1 - контроль. 2-е среде присутствует ФН, 3 - в среде содержится ФН и № (2 нг/мл), 4 - ФК и МГ (8нг/мл) 5 - МГ (2 -200 нг/мл), 6 - последующие поколения Ь-клеток (в среде отсутствуют ОН и МГ).

п::с.6. Влияние МГ и комплекса Ь!Г-ФН на миграцию L-клеток. Пояснения: 1 - контроль, 2 - в среде присутствует МГ, 3 - в среде присутствует ФН, 4 - (.Г и ФН.

отделяется МГ, г. количестве от 20 дс 300 нг/мл. МНК ..¡уу.чпн и жс-ндик характеризуются примерно одинаковым уровнем продукции МГ. В обоих случаях максимальный уровень биосинтеза МГ ка£л:о-да.-.ся на 5 cvtku культивирования МКК.

Содержание МР в сыворотке крови здоровых доноров, по на-данным, составляет 2,78±0,18 г/л и не зависит от пола об-

следуемых. Сопоставление содержания iff в сыворотке периферической крови и в супернатантах культур моноцитов позволяет сделать вывод о том, что мононуклеарные клетки не могут являться основным источником синтеза МГ в организме. Основная роль в создании и поддержании плазменного пула макроглобулина, как и других сывороточных белков, принадлежит клеткам печени (Munck-Petersen G. е.а., 1985, 1988).

Полученные нами данные значительно расширяют сложившееся в науке представление о биологической роли МГ. Учитывая приведенные вызе факты, можно предположить, что MP, синтезируемый мононуклеарными клетками, выполняет иммунорегуляторные функции. Свое иммуномодулирующее действие МГ может осуществлять через различные механизмы. С одной стороны, являясь ингибитором протеиназ широкого спектра действия, он играет определенную роль в поддержании необходимого уровня протеолитических процессов в микроокружении иммунокомпетентных клеток, от которого зависит их функциональное состояние. Например, МГ способен подавлять цитотоксическое действие макрофагов и естественных киллеров, ингибируя выделяемые ими протеиназы (Jonson W., Somers S.D., Adcms D.O., 1984). Кроме того, указанные комплексы способны стимулировать синтез иммуноглобулинов в периферических мононуклеаоных клетках и подавлять пролиферацию иммунокомпетентных клеток (Mannhalter J.W. е.а., 1986; Мальцева Н.В., 1900).

С другой cTGDoiib!. обладая способностью к образованию комплексов с цитокинами, МГ может связывать их и транспортировать к различным клеткам иммунной системы. Такое взаимодействие может происходить на мембране мононуклеарной »слетки, синтезирующей цитокины. Возможность подобного взаимодействия иммобилизованных цитокинов и МГ показана нами в условиях блот-тинга, ач такке Webb D. j. и соавт. (1992), проводившими реакцию связывания цитокинов иммобилизованными в полистироловом плац-шет'1 формами (.(Г. Образованный комплекс выделяется в кровяное русло. Комплекс цитокина с нативкым МГ мохет циркулировать та.! продолжительное гремя. Некова,-¡ситное связывание цитокина ингибитором придает обратимый характер комплексу и делает возможным вытеснение i/нтокина гомологичным рецептором. Цптокин, связанный натиьной формой ингиоигора, будет полностью сохранять

свою биологическую активность, поскольку стерически защищен молекулой МГ от разрушающего действия протеиназ.

Взаимодействие МГ с протеиназой изменяет и его взаимоотношения с цитокинами. Специфичность протеиназы обусловливает особенности ограниченного протеолиза в молекуле ингибитора и, как следствие, изменение ого ¡«¡¡формации строго определенным образом. Последнее определяет специфичность избирательного взаимодействия комплекса с тем или иным цитокином.

Комплекс цитокина с модифицированным протеазой № становится доступнь'м для рецептор-опосредоганного эндоцитоза. Циркулирующий активированный МГ, связанный с цитокинами, быстро удаляется гепатоцитами, имеющими рецепторы к нему . Время его циркуляции в кров:; исчисляется минутами. Кроме того, для цитокина, связанного с комплексом МГ-фермент, но исключена возможность деградации под воздействием протеиназы. Таким образом, макроглобулин может способствовать злимииации из кровяного русла избытка цитокинов и тем самим предотвращать их вредные системные или локальные эффекты in vivo.

Можно предположить, что КС1, благодаря способности связывать цитокины и транспортировать их к различным клеткам, обеспечивает своего рода информационную связь кач внутри иммунной систеш, raj; и между клепки иммунной и клетками других систем г организме. Так, проведенные нами исследования показали, что МГ является посредником, через который иммунная система молот регулировать дифференцировку клеток соединительной ткани. Свое регулирующее Елияние иммунная система может оказывать и на другие ткачи, клетки которых имеют рецепторы к МГ пли цп-токинам.

Молекула мзкрэглобудина, обладая способностью быстро изменять конфермааио при взаимодействия с крэтеаогии к в соответствии с згой ^информацией обрззошзать разлоткые коуллгкеи с шпокииами, может определять направленность вэодей'тв;« сг,я-г-аваегося с ней цитокина и влиять на его распределение ь организме, поскольку пространство распределения цвто;аша, свя-гт-'ного с МГ, ограничивается пространством распределена/, переносчика. Связывание ингибитором цитокпнов :.;ожет приводить и к пзмскокя» их действия. По зтпм причинам взгсмсдейстьк? ыажрег-лобу-тика о цитог-шами, а также с другим:: транспортиру-»«*»« Б'--

ществами представляет интерес с физиологической, патологической, фармакологической и клинической точек зрения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенные автором способы очистки МГ могут быть использованы в работе биотехнологических предприятий. Анатити-ческие тест-системы, позволяющие определять уровень МГ з сыворотке крови и различных биологических жидкостях, могут применяться для диагностики ряда заболеваний в клинической практике. Комплексы МГ с цитокинами могут использоваться в качестве терапевтического средства при лечении инфекционных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний. Трансформированные формы препарата могут использоваться для удаления из циркуляции в организме избытка иммунологически активных молекул. Вы-сокоочииенный нативный МГ может применяться для купирования протеолиза г.ри деструктивных процессах,

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы получения различных форм «г- мак-роглобулиноЕ человека и мыии: нативкых, обладающих свойствами ингибиторов протеиназ, и модифицированных, обладаниях кммуко-регуляторными свойствами.

2. «2-макроглобулины человека и мыии являются сывороточными белками, характеризующимися частичной антигенной идентичностью, сходными Физико-химическими свойствами и обладающий ачтипротеазнок активностью.

3. МГ человека представляэ: собой тетрамер, з котором две субъединицы посредством дисульфидных связей образуют димер, а два димера, соединяясь нековалентно,- тетра!.1ер. Молекула МГ мыши состоит из 8 неравноценных субъединиц и характеризуется наличием дополнительной дисульфидной связи, что придает ей большую жестокость и Еызывает снижение ингибирующей активности по отношению к протеиназач.

4. МГ человека и мыши связывают различные белки сыьорот'ш крови. Основными аффинантами являются иммуноглобулины и альбумин.

5. МГ человека я мыши взаимодействуют с рекомби.чантными цитокинами - интерлейкинами lß и 2, факторами некроза опухо-ли-а и -2, «2* и Т- интерферонами, зсферсном, а также с фактором нормализации трансформированных фибробластов, секреткруе-мым Т-лимфоцитами.

6. Связывание макроглобулинами цитокинов зависит от кон-формационного состояния молекулы ингибитора и носит нексва-лентный характер. Главную'роль в образовании комплекса МР-ци-токин играют водородные связи.

7. МГ не влияет на характеристики культуры трансформированных фибробластов линии L929. но модифицирует действие фактора нормализации на указанную культуру клеток.

8. Мононуклеаркые клетки периферической крови человека синтезируют MP. Уровень секреции зависит от сроков культивирования.

Э. МГ человека и мыши, обладая сходными физико-химическими свойствами, являются акцепторами пирокого круга цитокинов, что позволяет км участвовать в регуляции функций иммунной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение с(2-макроглобулина человека и его аналогов у животных ( в соавт. с Зориным H.A., Зайцевой C.B., Чириковой Т.С.)// ЖЭЕиФ. - 1990. - N 1. - С.3-8.

2. Комплексное выделение макроглобулннов из ретроплацен-тарной сыЕсротки и определение их концентраций в сыворотке доноров С б соавт. с Зориным H.A., Набиным С.Г., Зориной P.M., Мальцевой Н.В., БелогорлоЕой Т.е., Чириковой Т.С.)// Гематол. и трачсфузиол. - 1990. - N 5. - С. 31-33.

3. Проблемы эволюции семейства макроглобулинов человека и -тавотных ( в соавт. с Зориным H.A., Жабкным С.Г., Еелогорловой Т.И., Чириковой Т.С.)// КЭЗиФ. - 1992. - Т.28, N 4. - С.441-446.

4. Значение макроглобулннов в развитии послеродовых воспалительных процессов ( в соавт. с Гориным B.C., Мальцевой Н.В., Зориным H.A.. У-абиным С.Г., Зсркной P.M. )//Тез. дскл. Мехдукар. симпоз. по аллергологии и клин, иммунол. - Алма-Ата, 1992. - Т.2. - С.85.

5. Хммунорегуляторные свойства макроглобулннов ( в ссавт.

с Зориным И. А., Зориной P.M., Мальцевой II. В.. Жаб иным С.Г.. Горлиной U.K., Гориным B.C.)// Тез. докл. Мелдунар. симпоо. по аллергологии и клин, иммунол. - Алмг*-Ата, 1992. - Т.С. - С. 129.

5. Значение ыакроглобулиноь в иммунологии репродукции ( и соавт. с Гсриним B.C., Зориной P.M., Мальцевой Н.В., Жабиным С.Г.. Зориным Н.А.. Чириковой Т.С.)// Тез. докл. 1 еьезд иммунологов России. - Новосибирск, 1092. - С. 11?.

?. Возможная роль макроглобулинов в развитии злокачественных опухолей ( в соавт. с Верхбицким Г.В.. Мингалеъым 1!.В., Зориным К.А., Жабиным С.Г., Митрофановым Н.А., Гориным B.C.)// Тез. докл. 1 съезд иммунологов России. - Новосибирск, 1992. -С.319.

8. Лимфокин с активностью фактора нормализации трансформированных фибробластлов: его взаимодействие с макроглобулином ( в соавт. с Стоиансом И.Я., Горлиной Н.К., Оринской З.П., Зориными.А., Козловым И.Г., Чередеевым А.Н.)// Тео. ДС1СЛ. 1 съезд иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - С.-159.

9. Рлилние воспалительной реакции на распределение <*i-макроглобулина и асосциироь:ишого с беременностью «i-гли-копротеина в орган.::;ме крыс ( в соавт. с Зориным Н.А., 1>ло-горловой Т.И., Чириковой Т.О., Кра^киной Н.А.)// П.чт.физиол. - 1992. - N.3. - С.21-22.

10. Physicccherical and biological properties of macrcjlo-bulln-proteiase ar;d serln-protelas'j complexes ( with Dhabin 2.Q., lor in l.'.A.)// XII Int. Clrpos. on 1 Medical Chemistry: Abstracts. - Ba::el, 1992. - P. 201.

It. Studios en physiological role and regulation of mac-гс(т1оЬч11Г|3 their analo-juos in animals ( with Ch.-ibin S.Q.,

ZorinN.A., aorinV.C., Maltseva N.V.)// XII Int. Simpos. cn Medical Ci.enustry: Abstracts. - ¡?:eel, 1092. - P.310.

12. Еелки пл:1зми и сыворотки крови донорол ( з соавт. с Жабиным С.Г., Зориным Н.А., Зориной P.M.. Гсриним B.C., Еело-гордовей Т.е., Чириковой Т.С., Крокаккной Н.А.)// Клин. лаб. диагн. - 1992. - N 9-10. - С. 13-15.

13. Lymphokine with the activity of ncrnaiisation transferred fibroblasts factor: Its interaction with ccs-macroglobi-iiri ( with Stonans I.J., Gorlina il.K., Orlnska Z.P., Kozlov

«

r>r> _

I.G., Zorin N.A., Cheredeev A.N.)// 8-th Int. Congr. of Immunology: Abstracts. - Budapest, 1992. - P.231.

14. Itrmunoregulatory properties of macroglobuliris ( with Shabln 2.G., Gorin V.5., Maltseva N.V., Zorina R.M.. Zorln N.A., Gorlina N.K.)// 8-th. Int. Congr. of Immunology: Abstracts. - Budapest, 1932. - P.576.

15. The potential role of macroglobulins on cancer ( with Gorin V.S., Vernbitsky G.V., Mingalev N.V., Zorin N.A.)// 8-th Congr. of Immunology. - Budapest, 1992. - P.423.

16. Изучение структурных особенностей комплексов макрогло-булпнов с плазмином ( в соавт. с Жабиным С.Г., Зориным Н.А., Гориным B.C.)// Вопр. мед. хим. - 1993. - Т.30. N 4. - С. 53-56.

17. Кммунохимическое изучение взаимодействия макроглобулинов с лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами ( в соавт. с Жабиным С.Г., Зориным Н.А., Мальцевой Н.В., Гориным B.C.)// Иммунология. - 1993. - N 6. - С. 20-21.