Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунорегуляторная роль макроглобулинов в злокачественном процессе

Актуальность темы

В настоящее время не вызывает сомнения, что прогрессия злокачественной болезни сопровождается угнетением иммунного ответа на опухоль, которое приводит к ослаблению лизиса опухолевых клеток естественными киллерами и цитотоксическими эффекторными макрофагами/лимфоцитами. Неэффективность противоопухолевого иммунитета может быть связана с нарушением экспрессии на злокачественных клетках молекул МНС I класса и костимулирующих молекул В7-1 и В7-2, необходимых для индукции цитотоксических Т- клеток, с синтезом блокирующих антител, а также с активацией супрессорных клеток, на роль которых могут претендовать ТЬ2-лимфоциты как антагонисты Thl-клеток. Сами опухолевые клетки продуцируют большие количества иммуносупрессорных молекул, таких как простагландин Е2, интерлейкин-10 и трансформирующие факторы роста (TGF) а и ß, которые, блокируя биосинтез обеих субъединиц IL-12 на уровне транскрипции (Sutterwala F.S. & Mosser D.M., 1999), ингибируют зависимое от этого цитокина развитие противоопухолевых Thl-клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров (Stern A.S. е.а., 1996).

Малигнизированные клетки секретируют и макроглобулины, связывающие иммуноактивные цитокины и протеазы, способные разрушать опухолевые клетки. Показано, что количество макроглобулинов в плазме крови онкологических больных часто существенно превосходит физиологические концентрации и коррелирует с развитием заболевания (Maxwell Anderson J., 1979; Berg 0.& Hemmingsen L., 1979; Fabris C. e.a., 1986). Возможно, макроглобулины являются ключевым фактором в создании опухо8 лями благоприятного для их развития микроокружения, потому что эти белки могут супрессировать активность естественных киллеров in vitro (Мельников О.Ф. и соавт., 1989; Petersen С.М. е.а., 1989), а в комплексе с протеазами угнетают антиген- и митоген-индуцированную пролиферацию периферических мононуклеарных клеток, разрушая IL-2 за счет остаточной протеолитической активности включенного в молекулу ингибитора фермента (Borth W.& Teodorescu М., 1986; Mannhalter J.W. e.a., 1986). Наряду с протеолизом одних цитокинов, попадающих в "ловушку" макроглобулин-протеазных комплексов, макроглобулины могут изменять биоактивность других, образуя с ними разнообразные связи. Показано, что конформационно активированный а2-макроглобулин человека (МГ) образует комплекс с TGF-ß и практически нейтрализует его иммуносупрессорные свойства (Feige J.J. e.a., 1996; Schulz M.W. e.a., 1996; Harthun N.L. e.a., 1998), направленные, например, на подавление литической активности естественных киллеров и лимфокин-активированных клеток против опухолевых клеток-мишеней К562 и DM6 и угнетение образования HLA-A*0201 -рестриктированых опухоль-реактивных цитотоксических Т-лймфоцитов in vitro (Harthun N.L. e.a., 1998). Другие цитокины, подобно IL-6 и IL-8, напротив, в комплексе с МГ становятся резистентными к воздействию протеаз и сохраняют свои биологические свойства, хотя в свободном виде легко разрушаются ими (Matsuda Т. е.а., 1989; Kurdowska А. е.а., 1997). Функционирование макроглобулинов как селективных нейтрализаторов цитокинов, которые проявляют иммуностимулирующие либо -супрессорные эффекты, указывает на неоднозначное участие их в иммунных механизмах злокачественного роста. Видимо, эта двойственность обязана способности макроглобулинов дифференцированно регулировать биоактивность цитокинов, что может 9 быть обусловлено взаимодействиями последних с разными формами молекул этих антипротеолитиков - нативными или модифицированными, -прочностью (обратимостью) макроглобулин-цитокиновых комплексов, которая зависит от типа лиганд-рецепторной связи и может быть разной даже для изоформ одного и того же цитокина (Koch К е.а., 1991; James К. е.а., 1992; Webb D.J. е.а., 1996). Изучение и использование комплексов макроглобулинов с иммуноактивными цитокинами, влияющими на опухолевый рост, является перспективной задачей для онкоиммунологии, решение которой позволит не только лучше понимать иммунные механизмы регуляции злокачественных процессов, но и управлять ими.

Известно, что результаты любых исследований, проведенных in vitro, не всегда подтверждаются in vivo, где взаимоотношения между клетками, в частности, злокачественными и иммунной системы, усложнены. Изучение связей между опухолями, иммунной системой и семейством макроглобулинов, объединяющим иммунорегуляторные белки, in vivo актуально, тем более, что до сих пор не выявлено закономерностей в количественных изменениях макроглобулинов в организме при опухолевой прогрессии - по разным оценкам, концентрации их в сыворотке крови больных различными видами рака могут повышаться (Wojtukiewicz M.Z. е.а., 1992; Teng H. е.а., 1994; Gaillard М.С. е.а., 1995) или снижаться (Zietek Z. е.а., 1997; Kanoh Y. е.а., 1997). К тому же макроглобулины обнаружены и в других жидкостях и тканях организма, где они контролируют местные протеоли-тические реакции. Предполагается, что в норме тканевые макроглобулины представляют собой экстраваскулярные пулы этих высокомолекулярных белков, которые продуцируются и утилизируются преимущественно локально (К.Н.Веремеенко и др., 1988, Н.А.Зорин и др., 1992, Tiggelman A.M. е.а., 1996). Тканевые макроглобулины не оценены не только при патологи

10 ческих, но и при физиологических условиях. Не исключено, что тканевые макроглобулины участвуют в создании локальной и системной иммуносу-прессорной активности, которую обеспечивает любая злокачественная опухоль, нарушая гомеостаз практически всех органов. Одновременное количественное исследование циркулирующего, тканевых и внутриопухо-левого пулов представителей семейства макроглобулинов в организме на различных этапах малигнизации, - ее прогрессии и регрессии, - а также исследование взаимодействия указанных белков с клетками иммунной системы и опухолей, изучение их комплексов с цитокинами будут способствовать пониманию опосредованных макроглобулинами иммунных механизмов злокачественного роста и разработке на этой основе эффективных методов повышения противоопухолевой резистентности организма.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы явилось выяснение роли макроглобулинов в развитии опухолевого процесса, основанное на изучении взаимодействия макроглобулинов с клетками иммунной системы и злокачественной опухоли, иммуноактивными цитокинами, влияющими на опухолевый рост, и исследовании распределения макроглобулинов в организме-опухоленосителе в условиях спонтанного, ускоренного и угнетенного роста опухоли in vivo (на модели карциномы Уокера 256).

В связи с поставленной целью были определены следующие задачи

11

1. изучить способность иативных и модифицированных макроглобулинов регулировать спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток иммунной системы in vitro;

2. исследовать влияние макроглобулинов и антител к ним на пролиферацию клеток карциномы Уокера 256 in vitro;

3. оценить распределение макроглобулинов среди мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) и клеток карциномы Уокера 256;

4. исследовать связывание макроглобулинов с цитокинами (интерфе-ронами, факторами некроза опухолей);

5. изучить сывороточные, тканевые и внутриопухолевые уровни макроглобулинов и распределение макроглобулинов среди МНК в динамике спонтанного роста карциномы Уокера 256 у крыс;

6. исследовать влияние парентерального введения препарата макроглобулина на рост опухоли и сывороточные, тканевые и внутриопухолевые уровни макроглобулинов у безопухолевых крыс и крыс с карциномой Уокера 256;

7. изучить сывороточные, тканевые и внутриопухолевые уровни макроглобулинов у крыс со стимулированным и заторможенным экзогенными факторами ростом карциномы Уокера 256.

Научная новизна

В настоящей работе впервые установлено, как эффекты высокоочи-щенных препаратов модифицированных форм макроглобулинов человека - аг-макроглобулина (МГ) и ассоциированного с беременностью а2-гликопротеина (АБГ) - в качестве регуляторов пролиферации клеток иммунной системы in vitro зависят от их внеклеточного количества - при фи

12 зиологических концентрациях белки не влияют на спонтанную пролифера-тивную активность МНК человека, а превышение их в несколько раз ведет к появлению и дозо-зависимому нарастанию супрессии. В стимулированных митогенами культурах МНК ингибиторный эффект обоих макроглобулинов также дозо-зависим, но более выражен, т.к. наблюдается при физиологических концентрациях белков, превышение которых ведет к нивелированию митогенного сигнала и более значительной супрессии по сравнению со спонтанными культурами. Установлено, что АБГ является более мощным супрессором, чем МГ, т.к. при равных концентрациях он оказывает ингибирующий эффект, превосходящий наблюдаемый у МГ более чем в 10 раз.

Впервые показано, что нативный, как и модифицированный метиламином, МГ образует нековалентные обратимые комплексы с молекулами рекомбинантных цитокинов - ИФа2, ФНОа и ФНО(3. Связывание не изменяет конформацию нативного макроглобулина и зависит от сохранности вторичной и третичной структур макроглобулина, т.к. нарушается после его тепловой денатурации.

Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что макроглобулины могут быть ростовыми факторами для карциномы Уокера 256, т.к. нативный МГ в физиологических концентрациях стимулирует, а антитела к макроглобулинам крыс - a i-макроглобулину (МГ1), а2-макроглобулину (МГ2) и ассоциированному с беременностью аг гликопротеину (АБГ1) - ингибируют пролиферацию ее клеток, культивируемых в бессывороточной среде in vitro.

Впервые макроглобулины крыс идентифицированы на поверхностных мембранах клеток карциномы Уокера 256. Обнаружено, что количество АБГ1+- клеток в опухоли больше, чем МГ1+- клеток и МГ2+- клеток, и

13 по мере роста карциномы количество АБГ1+-клеток увеличивается с 20% на 8 сутки до 70% на 21 сутки опухолевого развития. Найдено, что распределение макроглобулинов среди МНК крыс интактных и носителей карциномы Уокера 256 отличается от такового для опухолевых клеток, т.к. среди МНК доминируют МГ1+-клетки. Исследовано количественное соотношение макроглобулин-несущих МНК в динамике спонтанного роста карциномы Уокера 256 и показано, что с возникновением опухолевого зачатка в организме крыс (на 2 сутки после трансплантации опухолевых клеток) наблюдается резкое уменьшение в периферической крови доли мононукле-арных клеток, несущих на поверхности макроглобулины, а ее восстановление происходит на более поздних этапах опухолевого роста.

Впервые исследовано количественное распределение в организме интактных крыс МГ1, МГ2 и АБГ1 и изучены количественные изменения циркуляторного, тканевых и внутриопухолевого их пулов при спонтанном росте карциномы Уокера 256 в течение 17 суток у крыс. Установлено, что исследуемые уровни МГ1 почти не изменяются при росте карциномы Уокера 256, а тканевые и сывороточные уровни МГ2 и АБГ1 увеличиваются, но с разной динамикой. Так, концентрация МГ2 в сыворотке крови значительно повышается с появлением опухоли, достигая плато к 10 суткам ее развития, а в тканях белок определяется у всех животных-опухоленосителей только на 10 сутки. АБГ1 выявляется в тканях уже на 2 сутки, и его концентрация растет в сыворотке крови с опухолевой прогрессией, так что максимальные количества его в сыворотке и тканях обнаруживаются на 17 сутки наблюдений.

Впервые найдено, что длительное внутримышечное введение препарата нативного МГ крысам с сформировавшейся карциномой Уокера 256 приводит к усилению инвазивного роста этой опухоли и увеличению сывороточных и тканевых уровней МГ2 и АБГ1.

14

Впервые исследовано влияние длительного внутримышечного введения препаратов конканавалина А (КонА) и полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) крысам интактным и с карциномой Уокера 256, а также препарата интерферона-а (ИФа) и инъекции препарата фактора некроза опухоли-а совместно с ПАФ (ФНОа+ПАФ) крысам с карциномой Уокера 256 на рост опухоли и сывороточные, тканевые и внутриопухолевые уровни МГ1, МГ2 и АБГ1. Установлено, что введение крысам КонА или ПАФ приводит к существенному увеличению циркулирующих, тканевых и внутриопухо-левых концентраций макроглобулинов, преимущественно МГ2 и АБГ1, а у крыс-опухоленосителей - и к усилению инвазивного и экспансивного роста опухоли. Введение ФНОа+ПАФ или ИФа, напротив, тормозит экспансивный и инвазивный рост карциномы Уокера 256 и снижает исследуемые уровни макроглобулинов до физиологических значений.

Таким образом, впервые получена полная характеристика количественных изменений циркулирующего, внутриопухолевого и тканевых пулов трех макроглобулинов крыс при спонтанном, стимулированном и угнетенном росте карциномы Уокера 256 и изучены некоторые аспекты взаимодействия макроглобулинов с клетками исследуемой опухоли и иммунной системы человека и крыс.

Практическая значимость работы

Разработаны методы получения нативной и модифицированных форм макроглобулинов человека, методы выделения двух макроглобулинов крыс - МГ1 и МГ2. Предложены методы приготовления антисывороток к МГ1, МГ2 и АБГ1 и оценки содержания МГ1, МГ2 и АБГ1 в сыворотке крови и различных тканях организма крыс, получены нормативные

15 показатели их сывороточных и тканевых концентраций, которые могут применяться при использовании экспериментальных моделей различных патологических процессов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Макроглобулины являются иммунорегуляторными белками, способными подавлять пролиферацию лимфоцитов, причем эффективность их анти-пролиферативного действия зависит от концентрации и конформационно-го состояния их молекул, пролиферативной активности клеток-мишеней и различна у разных макроглобулинов.

2. Макроглобулины относятся к ауто- и паракринным факторам роста карциномы Уокера 256 у крыс, т.к. присутствуют на поверхности ее клеток, в физиологических дозах стимулируют их пролиферацию in vitro и при многократном введении in vivo усиливают инвазивный рост опухоли, а антитела к макроглобулинам ингибируют пролиферацию опухолевых клеток in vitro.

3. При спонтанном и стимулированном росте карциномы Уокера 256 сывороточные и тканевые концентрации макроглобулинов прогрессивно увеличиваются, существенно превышая физиологические уровни, а при индуцированном торможении опухолевого развития - снижаются до физиологических в сыворотке крови и тканях, что причисляет макроглобулины к ассоциированным со злокачественным ростом белкам.

16

Апробация работы и публикации

Полученные результаты доложены на 1-ом Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 15-17 ноября 1989 г.), 4-ом Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунология репродукции" (Киев, 24 - 26 октября 1990г.), XVIII съезде международного общества онкобиоло-гов и медиков (ISOBM) "Oncodevelopmental proteins and clinical application" (Москва, 23 - 27 сентября 1990 г.), 6-ом съезде европейской ассоциации гинекологов и акушеров (Москва, 5-8 июня 1991 г.), 1-ом съезде иммунологов России (Новосибирск, 23 - 25 июня 1992 г.), 8-ом международном конгрессе иммунологов (Будапешт, 23 - 28 августа 1992 г.), международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 28 сентября - 1 октября 1992г.), XII международном симпозиуме по медицинской химии (Bazel, 13-17 сентября 1992 г.), международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 19-23 октября 1993 г.), XXIV съезде ISOBM "The Interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology" (San Diego, California, USA, 17-22 ноября 1996 г.), XXY съезде ISOBM "From Basic Cancer Research to Clinical Application" (Montreux, Switzerland, 19-24 сентября 1997 г.), XXYI съезде ISOBM "From Tumor Biology to Clinical Oncology" (Umea, Sweden, 30 августа - 4 сентября 1998 г.), XXYII съезде ISOBM "From Tumor Biology to Clinical Oncology" (Kyoto, Japan, 31 октября - 4 ноября 1999 г.), XXVIII съезде ISOBM "Tumor Markers and Translational Cancer Research" (Munich, Germany, 8-13 сентября 2000 г.).

17

По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы. Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Новокузнецкого института усовершенствования врачей.

18

ВЫВОДЫ

1. Модифицированные макроглобулины человека - а2-макроглобулин (МГ) и ассоциированный с беременностью ос2-гликопротеин (АБГ), - не проявляющие антипротеолитических свойств, являются иммуносупрессорами, подавляющими спонтанную и митоген-стимулированную пролифератив-ную активность периферических мононуклеарных клеток (МНК) человека in vitro, в то время как нативные протеаз-связывающие макроглобулины не обладают ингибирующим эффектом. Антипролиферативное действие МГ и АБГ дозо-зависимо, в спонтанных культурах МНК наблюдается при концентрациях обоих белков больше физиологических в несколько раз, а в ми-тоген-стимулированных культурах МНК - и при физиологических концентрациях, превышение которых ведет к нивелированию митогенного сигнала. АБГ проявляет себя как более мощный супрессор, чем МГ, поскольку при равных концентрациях он оказывает ингибирующий эффект, превосходящий наблюдаемый у МГ более чем в 10 раз.

2. Лимфоциты являются транспортерами макроглобулинов в организме, поскольку на 36±2% МНК человека присутствуют МГ и/или АБГ, а у крыс 66±8% МНК имеет на поверхности ai-макроглобулин (МГ1), 39±7% МНК - МГ2 и 32+11% МНК - АБГ1. МНК крыс с поверхностными макроглобулинами принимают участие в злокачественном процессе, т.к. при формировании карциномы Уокера 256 у крыс на 2 сутки после трансплантации опухолевых клеток наблюдается снижение доли МГ2+-МНК до 9,4+1,21%, а АБГ1+-МНК - до 2,8±0,37%.

3. Макроглобулины крыс - МГ2 и АБГ1 - принадлежат к ассоциированным со злокачественным ростом белкам, потому что, не обнаруживаясь в нормальных тканях интактных крыс, появляются в них при образовании карциномы Уокера 256 и количественно возрастают при спонтанной или стимулированной КонА или ПАФ прогрессии опухоли и уменьшаются при ее

168 угнетенном ИФа или ФНОа+ПАФ росте, причем прослеживается положительная достоверная корреляционная связь между исследуемыми тканевыми концентрациями этих макроглобулинов и размерами опухолей животных с усиленным и заторможенным ростом карциномы Уокера 256.

4. Отличающаяся динамика сывороточных, тканевых и внутриопухолевых концентраций различных макроглобулинов при спонтанном развитии в течение 17 суток карциномы Уокера 256 у крыс - стабильность показателей МГ1, рост таковых у МГ2 до Платовых значений к 10 суткам и быстрое появление (на 2 сутки) в тканях АБГ1 и увеличение указанных концентраций этого белка до максимума на 17 сутки, - а также присутствие АБГ1 на большем количестве клеток (39,7±7,24%) карциномы Уокера 256 по сравнению с МГ1 (7,25±2,55%) и МГ2 (1,22±0,46%) выделяют АБГ1 из трех исследуемых макроглобулинов крыс как неспецифического опухолевого маркера карциномы Уокера 256.

5. Увеличение уровней макроглобулинов в тканях крыс-опухоленосителей выше физиологических значений ведет к развитию тканевой иммуносу-прессорной активности, которая проявляется в дозо-зависимом угнетении пролиферативной активности крысиных спленоцитов in vitro при их культивировании с экстрактами печени, селезенки и опухолей крыс с карциномой Уокера 256.

6. Макроглобулины способствуют злокачественному росту, т.к. нативный МГ в физиологической концентрации стимулирует, а антитела к МГ1, МГ2 и АБГ1 угнетают пролиферативную активность культивируемых in vitro клеток карциномы Уокера 256, к тому же введение нативного МГ крысам с карциномой Уокера 256 усиливает инвазию опухоли in vivo.

7. Нативная и модифицированная формы МГ реагируют с рекомбинантными молекулами ИФа2, ФНОа и ФНО0, образуя нековалентную обратимую связь. Соединяясь с нативными молекулами МГ, цитокины не модифицируют их, т.е. не активируют регуляторную функцию макроглобулинов.

169

8. Макроглобулины представляют собой ассоциированные с опухолевым ростом белки, обладающие регуляторными свойствами и участвующие в злокачественном процессе как иммуносупрессоры и ростовые факторы опухолевых клеток на модели карциномы Уокера 256.

170

6. б.Заключение

Проведенные нами эксперименты показали, что развитие перевиваемой злокачественной опухоли в организме крыс сопровождается значительным увеличением количества макроглобулинов как в крови, так и в тканях. Чем более интенсивен рост опухоли, тем больше макроглобулинов накапливается в организме и, особенно, в тканях, пограничных к опухоли и лимфоидных органах. Нормальное распределение макроглобулинов в организме нарушается. Это происходит, видимо, не только за счет активации их локального биосинтеза, неодинаковой в различных тканях, но и из-за экстравазации этих белков, которая происходит в очагах воспаления в результате повышения проницаемости кровеносных сосудов. Следствием концентрирования исследуемых белков в лимфоидных органах может быть угнетение противоопухолевого иммунного ответа, т.к. макроглобулины способны эффективно подавлять пролиферацию лимфоцитов. Иммуносупрессорная активность различных членов семейства макроглобулинов отличается по степени выраженности. Наиболее сильным иммуносупрессором является макроглобулин, практически отсутствующий в нормальных физиологических условиях, но наиболее сильно количественно возрастающий параллельно росту опухоли. Это ассоциированный с беременностью а ] -гликопротеин, являющийся гомологом ассоциированного с беременностью аг-гликопротеина человека. Именно этот белок находится на большинстве злокачественных клеток и определяется на лимфоцитах. Зафиксировано присутствие и других макроглобулинов на малигнизированных клетках и лимфоцитах. На первые они воздействуют как стимулирующие факторы, на вторые - как ингибиторы активации.

Макроглобулины образуют комплексы с цитокинами - интерфероном-а и фактором некроза опухоли-а - ингибирующими опухолевый рост. Угнете

145 ние роста опухоли цитокинами приводит к нормализации тканевых уровней и распределения макроглобулинов в организме.

Таким образом, представленные сведения характеризуют макроглобулины как активных участников злокачественного процесса, способствующих ему, с одной стороны, как иммуносупрессоры, а, с другой, как ростовые факторы опухолевых клеток.

146 Глава 7.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Прогрессивное развитие злокачественных опухолей происходит на фоне нарушений в надзорной функции иммунной системы, заключающейся в своевременном распознавании и уничтожении возникающих в организме злокачественно перерожденных клеток. Естественная киллерная активность лимфоцитов периферической крови больных раком снижена по сравнению со здоровыми донорами, ослаблен пролиферативный ответ периферических мононук-леаров на митогены (А.М.Малыгин и соавт., 1992; Е.К.Олейник, И.Е.Бахлаев, 1992). Ингибирующие факторы находятся в сыворотке крови больных раком, т.к. показано, что она угнетает пролиферативный ответ лимфоцитов здоровых доноров, снижая синтез в них 1Ь-2 (И.В.Южалина и соавт., 1992). Этими факторами могут быть плазменные белки - макроглобулины. Нами было исследовано влияние нативных и модифицированных макроглобулинов человека на пролиферативную активность периферических мононуклеаров здоровых доноров. В экспериментах применяли полученные в нашей лаборатории высо-коочищенные препараты двух макроглобулинов человека (МГ и АБГ), модифицированных в процессе выделения из плазмы крови доноров сульфатом аммония и вследствие этого лишенных антипротеазной активности, в отличие от приготовленного препарата нативного, протеаз-связывающего МГ. Как известно, модификация макроглобулинов протеазами и аминами приводит к аналогичной структурной перестройке их молекул и необходима для их преобразования в активные формы, способные воздействовать на клетки-мишени. Использование большого интервала концентраций модифицированных ионами аммония макроглобулинов позволило выявить супрессорное воздействие МГ и АБГ на пролиферативную активность периферических МНК и его зависимость от внеклеточной концентрации исследуемых белков, в то время как нативный МГ был для клеток практически индифферентен.

147

Представляло интерес проанализировать соотношение выявленного ан-типролиферативного эффекта исследуемых белков с их физиологическими концентрациями. Известно, что при нормальных физиологических условиях циркулирующий пул макроглобулинов представлен, в основном, их нативны-ми молекулами, а концентрация модифицированных молекул, экспрессирую-щих рецептор-распознающие детерминанты, очень мала. По разным оценкам, в нормальной свежевыделенной плазме находится 40-90 мкг/мл (1,9-4% от общего количества МГ) [Marynen Р. е.а., 1984] или 14,2 ± 9,8 мкг/мл (Zucker S. е.а., 1991), а при усреднении, около 50 мкг/мл МГ-протеиназных комплексов. В наших экспериментах при дозах белков 24-190 мкг/мл МГ, т.е. практически физиологических для находящихся в крови модифицированных молекул белка и превышающих их в 2-4 раза, не наблюдалось достоверных изменений в синтезе ДНК в спонтанных культурах МНК. Дозо-зависимое угнетение спонтанной пролиферативной активности клеток проявлялось, начиная с дозы МГ, равной 375 мкг/мл, что больше нормы примерно в 7,5 раз. Ингибирующий пролиферацию лимфоцитов эффект АБГ в спонтанных культурах МНК обнаруживался при гораздо меньшей концентрации, равной 9 мкг/мл. Физиологические концентрации модифицированного АБГ в сыворотке крови неизвестны. Но если принять за основу данные для МГ (около 3%), то они составляют примерно 0,03-1,2 мкг/мл. В таком случае, угнетение спонтанной пролиферации МНК АБГ наблюдалось, начиная с концентрации этого белка выше максимальной физиологической, также как и МГ, в 7,5 раз. Ингибирующие эффекты АБГ и МГ в спонтанных культурах МНК прямо зависели от пролиферативной активности МНК в контроле, что указывает на циклирующие клетки как мишени для макроглобулинов.

Такая же зависимость степени ингибиции от пролиферативной активности клеток определялась и в митоген-стимулированных культурах. Но анти-пролиферативные свойства обоих белков проявлялись, начиная с концентраций макроглобулинов, намного меньших по сравнению с таковыми в спонтан

148 ных культурах, - при 24 мкг/мл МГ и 1,2 мкг/мл АБГ, т.е. практически физиологических. А последующее увеличение концентраций обоих макроглобулинов приводило к нивелированию митогенного сигнала и более глубокой депрессии синтеза ДНК, чем в спонтанных культурах, что указывает на повышение чувствительности активированных МНК к ингибирующему действию белков. На основании полученных данных можно полагать, что в организме макроглобулины угнетают пролиферацию лимфоцитов при физиологических концентрациях в условиях активации этих клеток и/или при концентрациях, превышающих физиологические уровни в несколько раз, т.е. локальное присутствие большого количества макроглобулинов является негативным фактором для лимфоцитов, вступающих в цикл.

Механизм ингибиторного эффекта модифицированного аммонием макроглобулина не связан с его влиянием на активность 1Ь-2, что доказано для его конформационного аналога, метиламин-обработанного МГ, в отличие от комплекса МГ с протеиназой, разрушающего этот интерлейкин (Нагйшп Ы.Ь. е.а., 1998). Показано, что моноамин-активированный МГ может быть тиро-зинкиназным ингибитором, связывающим тирозинкиназу В (ЧгкВ) и ингиби-рующим ее активированное внешними факторами аутофосфорилирование (Ни У.С). е.а., 1998). Белок также блокирует фосфорилирование по тирозину фос-фолипазы Су1 и внеклеточной протеинкиназы (ЕКК)-1, которые являются ключевыми ферментами, участвующими в переносе сигнала, зависимого от 1гкВ. Моноамин-активированный МГ ингибирует также фосфорилирование по тирозину активированной 1хкС. Авторы показали, что нативный МГ почти не влияет или оказывает незначительный ингибирующий эффект на фосфорилирование обеих тирозинкиназ, а ингибиторный эффект моноамин-активированного белка зависит от типа сигнала, поступающего в клетку, т.е. он является специфичным. Так, активированный серотонином крысиный МГ2, непосредственно связываясь с 1хкА и блокируя ее, отменяет опосредуемый ею перенос сигнала от фактора роста нервов и генную экспрессию в нейронах

149

Lee P.G. & Коо P.H., 1999). Возможно, оба макроглобулина, МГ и АБГ, функционируют как тирозинкиназные ингибиторы и в лимфоидных клетках. Многими исследователями считается, что мишенями для макроглобулинов среди клеток иммунной системы являются моноциты/макрофаги, на которых обнаружены эндоцитозные и сигнальные рецепторы. Наши данные указывают, что к числу мишеней и транспортеров макроглобулинов относятся и лимфоциты, т.к. среди выделенных нами в градиенте плотности фиколла-верографина периферических МНК разных доноров до 60% клеток (в среднем около 30%) имели на поверхностной мембране МГ и/или АБГ. Обнаруженная реэкспрессия макроглобулинов на поверхности лимфоцитов после удаления их трипсином и присутствие АБГ в цитоплазме В-клеток (Thomson A.W. е.а., 1980; Hörne C.H.W, е.а., 1983) указывают на способность лимфоцитов к продукции макроглобулинов.

Иммунорегуляторная активность макроглобулинов, несомненно, связана с их свойством образовывать комплексы с цитокинами. Показано, что среди плазменных белков МГ является преимущественным акцептором многих цитокинов in vitro и in vivo (James К., 1990; LaMarre J. е.a., 1991; Crookston K.P. е.a., 1993). В дополнение имеющихся сведений нами установлено взаимодействие рекомбинантных ИФос2, ФНО-а и ФНО-ß с нативным и модифицированным метиламином МГ. Связывание исследуемых цитокинов с нативным МГ не изменяло конформацию его молекул, поскольку сульфгидрильные группы, образующиеся при структурной трансформации белка, не были выявлены. Обнаружилось, что реагенты, способные оказать влияние на комплексо-образование (мочевина, ионы кадмия, лектин и ЭДТА), не разрушали комплекс МГ с ИФа2. Достаточно стабильный комплекс не образовывался, только когда МГ денатурировали нагреванием, т.е. к исчезновению участков связывания может привести лишь нарушение вторичной и третичной структур МГ. Но под воздействием додецилсульфата натрия, разрушающего гидрофобные связи в невосстанавливающих условиях, комплексы также диссоциировали.

150

Следовательно, их формирование происходит за счет обратимых нековалент-ных взаимодействий. Это указывает на сохранение биоактивности комплекси-рованного ИФосг- Исследуемые цитокины являются факторами, влияющими на опухолевый рост, и применяются в терапии опухолей (В.П.Шичкин, 1998). По-видимому, при использовании их препаратов, а также и других цитокинов, в клинике нужно учитывать их способность образовывать комплексы с макроглобулинами. Потенциальная роль макроглобулинов как транспортеров цитокинов в организме привлекает внимание исследователей. Цитокины, комплек-сированные с активированным МГ, скорее всего, быстро деградируют в организме, поскольку скорость утилизации рецептор-распознаваемого МГ чрезвычайно велика. Именно поэтому предлагается блокировать в таких комплексах участки связывания с клеточными рецепторами (LaMarre J., 1991). Использование же сконструированных комплексов цитокинов с нативным МГ, не распознаваемым эндоцитозным рецептором, поможет увеличить длительность пребывания цитокина в циркуляции и тем самым избежать необходимости введения больших доз цитокина.

При исследовании влияния макроглобулинов на злокачественные клетки нами было установлено, что в бессывороточных культурах клеток карциномы Уокера 256 in-vitro препараты нативного МГ, также как и модифицированного, введенные в концентрациях 125-1400 мкг/мл, усиливали синтез ДНК, а антитела к макроглобулинам крыс - угнетали. На возможное участие МГ в опухолевой прогрессии как фактора роста указывают Asplin I.R. и соавт. (2000), обнаружившие повышение экспрессии сигнальных рецепторов, опосредующих активирующие сигналы макроглобулинов, на быстрее реагирующих на ростовые стимулы высокозлокачественных клонах по сравнению с медленно растущими. Возможно, клетки такой быстро развивающейся опухоли, как карцинома Уокера 256, экспрессируют рецепторы к макроглобулинам, причем не только эндоцитозные (LPR/MG2), которые обнаруживаются на многих типах малигнизированных клеток, включая клетки астроцитом

151

Businaro R. e.a., 1997), базальноклеточных карцином (Arkona C.& Wiederanders В., 1996), гепатом (Warshawsky I. e.a., 1996), но и сигнальные рецепторы, показанные, например, на клетках гепатомы крысы (Richards C.D. e.a., 1996) и карциномы человека (Asplin I.R. e.a., 2000). Выявленный нами стимулирующий эффект нативного белка, по-видимому, возникает вследствие активации его молекул эндогенными протеазами, которые опухолевые клетки способны секретировать при культивировании in vitro (Seregni Е., 1996).

Синтез ДНК в бессывороточных культурах клеток карциномы Уокера 256 угнетался после добавления к ним антисывороток против макроглобулинов крыс, что свидетельствует об участии в размножении раковых клеток и эндогенных молекул макроглобулинов, которые могут синтезироваться опухолевыми клетками. Эндогенные молекулы МГ1, МГ2 и АБГ1 были нами обнаружены на поверхности различного числа клеток Уокера 256, выделенных из опухолей в разные сроки после перевивок. Оказалось, что клетки с поверхностным АБГ1 всегда присутствовали в большем количестве в опухолевой популяции, чем клетки с другими макроглобулинами, причем было замечено увеличение относительного количества АБГ1+-клеток с 20% на 8 день до 70%> к 21 суткам развития опухоли. Что касается других макроглобулинов, то в большие сроки опухолевого роста клетки с МГ2 могли вообще отсутствовать, а число МГ1+-клеток часто было меньше, чем при формировании опухоли. Этот факт указывает, что в карциноме Уокера 256 существует субпопуляци-онная структура опухолевой популяции, связанная с мембранными макроглобулинами, более выраженная в начале опухолевого развития. Фенотипическая или генотипическая гетерогенность опухолей на ранних стадиях злокачественного роста является необходимым условием для прогрессии малигнизации, т.к. создается материал для естественного отбора клеток, наиболее приспособленных к автономному развитию и резистентных к иммунной защите организма (В.С.Шапот, 1980). Этой концепции может в какой-то степени соответствовать развитие карциномы Уокера 256. Так, в 7-дневной опухоли при

152 сутствуют три морфологически отличающиеся субпопуляции клеток, митоти-ческая активность опухоли в зоне роста максимальна. По мере прогресса ми-тотическая активность опухолевой ткани снижается, причем количество клеток переходного типа значительно уменьшается. Две другие субпопуляции опухолевых клеток морфологически не изменяются при дальнейшем опухолевом развитии. При этом эпителиоидные клетки составляют большую часть злокачественной ткани, вступая в многочисленные митозы, а небольшое количество миоидных клеток не проявляет заметной митотической активности и, возможно, выполняет вспомогательные функции. Уменьшение «фенотипи-ческой гетерогенности» популяции опухолевых клеток карциномы Уокера 256 в ходе ее прогрессивного роста протекало параллельно увеличению количества клеток с поверхностным АБГ1 до 70% на поздних этапах развития карциномы Уокера 256. Вполне вероятно, что поверхностная экспрессия АБГ1 (и его гетерологичных аналогов у других видов) является признаком злокачественных клонов, которые способны к созданию действенной локальной имму-носупрессии. Возможно, два других макроглобулина не обеспечивают достаточную эффективность такого механизма вследствие их не столь мощных им-муносупрессорных свойств. Нами впервые был проведен сравнительный анализ степени выраженности супрессорных свойств различных макроглобулинов на модели влияния модифицированных МГ и АБГ на митоген-стимулированную пролиферативную активность МНК человека in vitro. Су-прессорный эффект АБГ оказался значительно превосходящим таковой у МГ. Это может быть связано с уже доказанным (Moestrup S.K. е.а., 1987) более высоким аффинитетом модифицированного АБГ к клеточным рецепторам. Поскольку рецептор-распознающее место у АБГ идентично таковому у МГ, можно предполагать, что критическим для более аффинного связывания АБГ с клеточными рецепторами является относительно небольшой размер молекулы этого димерного белка, что может обусловливать его большую пространственную доступность для клеточных рецепторов. АБГ1 является моно

153 мерным аналогом АБГ, также как МГ1 и МГ2 - аналоги МГ, в соответствии с ранее проведенными исследованиями, которые показали полную антигенную идентичность молекул МГ2 и МГ, АБГ1 и АБГ и частичную - МГ1 и МГ (Н.А.Зорин, 1991; Saito А. & Sinohara Н., 1985). Более того, было обнаружено, что метиламин-обработанные МГ и МГ1 связываются с одинаковым аффинитетом к одним и тем же клеточным рецепторам, причем рецептор-распознающий участок находится у обоих белков между 1319 и 1474 аминокислотными остатками С-терминального домена (Nielsen K.L. е.а., 1995). Выявленная гомология позволяет экстраполировать данные об особенностях ре-гуляторных свойств макроглобулинов человека на макроглобулины крысы. Следовательно, можно сделать предположение, что иммуносупрессорные свойства АБГ1 наиболее выражены среди всех исследуемых представителей семейства макроглобулинов крысы. Анализ корреляции между количествами клеток карциномы Уокера 256, имеющих на поверхности тот или иной макроглобулин, и соответствующими сывороточными концентрациями этих макроглобулинов выявил положительную связь только для АБГ1. Это указывает на способность данного белка, находящегося в циркуляции, вследствие относительно небольшой молекулярной массы более легко преодолевать сосудистый барьер в опухолевой ткани и, пополняя внутриопухолевый пул, после модификации лигандами связываться с рецепторами на мембранах опухолевых клеток, которые, по-видимому, обладают более высоким аффинитетом к этому белку по сравнению с другими макроглобулинами. Об усилении проницаемости кровеносных сосудов для высокомолекулярных белков в злокачественных тканях сообщают Maeda Н. и соавт. (1996). Возможно, оно связано с присутствием в большинстве злокачественных опухолей тучных клеток, которые влияют на проницаемость микроциркуляторного русла опухолевой ткани, секретируя вазоактивные амины при своей активации. Участие гистамина в повышении проницаемости капилляров, пропускающих во вневаскулярное пространство альбумин, IgG и МГ, при воспалительной реакции отмечено

154

8е§Ьауе М.С. и соавт. (1996). Таким образом, кроме самих опухолевых клеток, имеющих на поверхности АБГ1 и являющихся его потенциальными продуцентами, дополнительным источником внутриопухолевого АБГ1 может быть циркулирующий пул этого белка, молекулы которого пропускаются проницаемыми при раке стенками сосудов. Кроме этого, АБГ1, как и другие макроглобулины, привносится в опухоль лимфо-плазмоцитами и макрофагами. Эти клетки обнаруживались уже на 2 день в лейкоцитарном вале вокруг формирующегося опухолевого зачатка, в то время как в периферической крови доля макроглобулин-несущих МНК резко снижалась, что указывает на происходящую эмиграцию макроглобулин-несущих МНК в зону опухолевого роста. Мононуклеары крови, несущие макроглобулины, инфильтрируя опухоль, могут усиливать локальную иммуносупрессорную активность. Таким образом, разнообразие источников внутриопухолевого пула макроглобулинов и присутствие в опухоли большого количества активирующих макроглобулины аффинантов,- протеаз, гликоаминов (В.Б.Винницкий и соавт., 1990), - делает весьма устойчивой возникающую систему поддержания внутриопухолевой иммуносупрессорной активности. Такая активность была нами выявлена при культивировании спленоцитов крыс в присутствие экстрактов опухолей, взятых у крыс с 7 и 10-дневной карциномой Уокера 256.

Полученные данные объясняют, почему инфильтрация злокачественных опухолей лимфоцитами и макрофагами не является защитным фактором организма, а, наоборот, способствует опухолевой прогрессии (Б.Т.Билынский и соавт., 1991). Мононуклеары, поступающие в опухолевую ткань из кровотока и несущие на себе макроглобулины, пополняют локальный пул этих иммуно-супрессорных молекул, которые могут вести себя и как стимуляторы пролиферации злокачественных клеток. Сосредоточение лимфоидных и макрофа-гальных инфильтратов в опухолевой ткани в местах наибольшего количества опухолевых клеток, находящихся в состоянии митоза (Б.Т.Билынский и соавт., 1991), подтверждает последнее.

155

Появившийся в организме опухолевый зачаток, обеспечивая локальную иммуносупрессорную активность в зоне своего экспансивного и инвазивного роста, влияет на функции всех органов и систем, нарушая их гомеостаз. Так возникает новое свойство, специфическое и обязательное для любой злокачественной опухоли, - системное действие на организм (B.C. Шапот, 1980). Одним из его проявлений, по нашим данным, служит существенный сдвиг в метаболизме макроглобулинов. У крыс с 17-дневной карциномой Уокера 256 он выражается в увеличении сывороточных концентраций АБГ1 и МГ2 в 60 и 150 раз соответственно по сравнению с нормой, и появлении существенных их уровней, не определяемых у здоровых животных, во всех исследуемых тканях. Это указывает на тотальное усиление биосинтеза макроглобулинов в пораженном раком организме. О корреляции между локальными уровнями мышиного МГ2 с ростом опухоли Эрлиха в течение 10 суток в брюшной полости сообщают Isaac L. и соавт. (1999). Количество МГ2 в перитонеальной жидкости вырастало в 3,5 раз через 10 дней после перевивки опухолевых клеток. В наших экспериментах с карциномой Уокера 256 выявилось, что к 10-17 дням после трансплантации ее клеток крысам концентрация МГ2 в сыворотке крови достигает максимума, увеличиваясь в 150-200 раз по сравнению с нормой. Изучение нами динамики уровней тканевых макроглобулинов по мере развития в течение 17 дней карциномы Уокера 256 показало, что существуют особенности в их метаболизме. Раннее появление (уже на 2 день развития опухоли) в нормальных тканях АБГ1 и резкий рост его уровней на поздних сроках опухолевого роста при накоплении значительной массы злокачественной ткани сопровождался сохранением тканевых концентраций МГ1 и более поздним появлением в тканях (на 10 сутки) МГ2. Выявленные корреляционные связи дают возможность полагать, что при опухолевом росте в организме крыс наряду с активизацией биосинтеза макроглобулинов в различных тканях наблюдается усиленная диффузия этих белков из микроциркуляторного русла в па

156 ренхиму органов и пограничную с опухолью соединительную ткань вследствие нарушения гистогематических барьеров.

В экстракте опухоли определялись все три изучаемых макроглобулина, но с ее развитием значительно повышались внутриопухолевые концентрации только двух из них - МГ2 и АБГ1. Внутриопухолевый МГ2, выявленный в небольшом количестве в сформировавшейся к 7 дню карциноме у 1 из 5 обследованных опухоль-несущих крыс, определялся у всех животных на 10 и 17 сутки роста опухоли, причем количество его было практически одинаковым в опухоли, сердце, печени, легком, тимусе и селезенке (р>0,05). Повышение внутриопухолевой концентрации МГ2 на 10 день, видимо, обязано увеличению сывороточного уровня этого макроглобулина, т.к. количество МГ2+-опухолевых клеток не увеличивается с опухолевой прогрессией. АБГ1 появился в опухоли, как и в других тканях, уже на 2 день, но существенно увеличился количественно только к 17 дню. Поскольку при росте карциномы Уоке-ра 256 в опухолевой ткани прогрессивно увеличивается субпопуляция АБГ1+-клеток, можно полагать, что увеличение внутриопухолевого пула этого белка связано и с его эндогенной продукцией.

Отличающаяся динамика циркулирующих и тканевых уровней разных макроглобулинов дает возможность предполагать, что доля участия каждого из них в опухолевой прогрессии разная. Возможно, АБГ1 играет главную роль не только в локальных, но и в системных процессах, связанных с опухолевым ростом.

Появление МГ2 и АБГ1 в различных тканях, отдаленных от пораженного раком участка может быть связано с увеличением в них протеолитической активности (К.Н.Веремеенко и соавт., 1988; Ап^ие! 1.А. е.а., 1998). Оно должно способствовать созданию "иммунологически привилегированных" областей в органах за счет локальной иммуносупрессорной активности макроглобулинов. Нами было обнаружено, что экстракты печени крыс-опухоленосителей, в отличие от интактных крыс, подавляют пролиферацию

157 крысиных спленоцитов. Полученная отрицательная корреляционная связь между степенью подавления пролиферации клеток и концентрациями АБГ1 и МГ2 в тестируемых экстрактах печени указывает на участие этих белков в ин-гибиторном эффекте.

Тканевые макроглобулины могут быть фактором, поддерживающим инвазию злокачественных клеток. Imamura F. и соавт. (1991), обнаружив, что для инвазии опухолевыми клетками клеточного монослоя in vitro требуется некий сывороточный фактор, предполагают наличие такого фактора в других жидкостях тела. Источниками тканевых пулов макроглобулинов способны стать различные клетки - элементы основных или стромальных тканей органов, а также клетки иммунной системы, появляющиеся в них вследствие инфильтрации из микроциркуляторного русла.

В развивающейся опухоли содержание всех трех исследуемых белков находилось на уровне других тканей либо превышало их, что находится в противоречии с приведенными в монографии К.Н.Веремеенко и соавт. (1988) сведениями, указывающими на снижение содержания ингибиторов протеиназ в злокачественных опухолях по сравнению с соответствующими нормальными тканями, в связи с чем предпринимались попытки использовать естественные и синтетические ингибиторы протеиназ для торможения злокачественного роста экспериментальных опухолей. Наше исследование влияния экзогенного МГ и антител к макроглобулинам на рост карциномы Уокера 256 in vivo и in vitro показало, что макроглобулины являются факторами, сопровождающими развитие злокачественного процесса и способствующими ему. Поэтому применение макроглобулинов как ингибиторов активированных протеолити-ческих процессов с целью торможения роста злокачественных опухолей было бы неоправданным.

Увеличение пула макроглобулинов в организме крыс за счет длительного внутримышечного введения препарата макроглобулина человека на ранних стадиях злокачественного роста (с 8-го дня после трансплантации опухолевых

158 клеток) интенсифицировало инвазивное прорастание опухолевыми клетками пограничной к опухоли передней брюшной стенки, что свидетельствует об усилении злокачественности опухоли по сравнению с контролем. При этом наблюдалось повышение тканевых и циркулирующих уровней эндогенных макроглобулинов и перераспределение макроглобулинов в опухоли и пограничной ткани брюшины - относительное увеличение концентраций всех макроглобулинов в брюшине, как в пограничной ее части, так и в отдаленной, хотя в самом опухолевом узле просматривалась склонность к их уменьшению. Большее увеличение уровней двух макроглобулинов - МГ2 и АБГ1 - по сравнению с контрольными опухоленосителями происходило в отдаленной части брюшины, где опухолевых клеток замечено не было. Локальным источником макроглобулинов в дистальной части брюшины могут быть инфильтрировавшие сюда лимфо-макрофагальные элементы. Но лимфо-макрофагальная инфильтрация наблюдалась и в пограничной части брюшины, где уровни макроглобулинов повышались меньше, хотя присутствовали инфильтрированные опухолевые клетки, которые способны как секретировать, так и поглощать макроглобулины. По-видимому, значительный рост уровней макроглобулинов в отдаленной брюшине происходит благодаря сниженной утилизации и накоплению их активированных форм, возможно, из-за происходящего снижения экспрессии эндоцитозных (LPR/MG2) рецепторов к макроглобулинам на клетках-мишенях вследствие их деградации под влиянием эндогенных цито-кинов, подобно тому, что происходит, например, в астроглиальных клетках человека при длительной инкубации их с ИФу (Businaro R. е.а., 1997). Сходное перераспределение макроглобулинов в брюшине обнаруживалось во всех наблюдаемых случаях стимулированной прогрессии опухоли - после введения Кон А и ПАФ.

Содержание макроглобулинов в организме экспериментальных животных после парентерального введения им митогенных лектинов ранее не изучалось. В наших экспериментах анализ распределения макроглобулинов у ин

159 тактных крыс после внутримышечного многократного введения им КонА был необходим в качестве контрольного для исследования такового у крыс-опухоленосителей. Оказалось, что КонА является фактором, вызывающим увеличение циркулирующих и тканевых концентраций всех исследуемых макроглобулинов у контрольных безопухолевых крыс. Рост уровня МГ1 в сыворотке крови, легких и брюшине, а также повсеместное увеличение уровней МГ2 и АБГ1, которое было однотипным для этих двух белков, отражает способность КонА индуцировать синтез макроглобулинов в различных тканях in vivo.

Аналогичное введение КонА опухоленосителям приводило к усилению прогрессирования карциномы, выразившемуся в усиленной инвазии опухолевых масс в дистальную часть брюшины. Чувствительность клеток карциномы Уокера 256 к КонА была показана в наших экспериментах in vitro, в которых культивируемые клетки интенсифицировали в 2-3 раза синтез ДНК в присутствии 4 мкг/мл КонА. На основании этого можно предполагать, что стимулирующий эффект КонА in vivo обусловлен в какой-то степени его прямым ми-тогенным действием на опухолевые клетки, имеющие специфические рецепторы. Рецепторы к лектинам обнаружены на опухолевых клетках различной природы. В карциномах рецепторы к КонА находятся на внешних мембранах 60-80% опухолевых клеток (А.Д.Луцик и соавт., 1989). Кроме того, установлено, что чувствительность опухолевых клеток к макрофагальному киллингу обусловлена экспрессией лектиндоступных карбогидразных сайтов на поверхности опухолевых клеток. Закрытые КонА углеводные участки поверхности опухолевых клеток не распознаются фагоцитарной системой (Б.Т.Билынский и соавт., 1991), что также может определять стимуляцию роста опухоли в условиях обработки ее этим лектином in vivo. Для МГ2 и АБГ1 было характерно значительное увеличение концентраций во всех тканях крыс-опухоленосителей после введения им КонА, но особенно выражено оно было в тканях селезенки и тимуса. Повышение уровней макроглобулинов в тимусе,

160 возможно, ответственно за снижение контролируемой тимусом активности NK-клеток и IL-2. Одним из механизмов противотимусного эффекта макроглобулинов может быть, как предполагают Mocchegiani Е. и соавт. (1999), эффективная конкуренция повышенного количества МГ в циркуляции у больных раком с цинк-зависимым тимусным гормоном, тимулином, за ионы цинка, важность которых для продукции IL-2 периферическими МНК больных цервикальной карциномой установлена in vitro. Следствием этой конкуренции является снижение уровня тимулина в плазме крови, наблюдаемое у обследуемых больных, а также угнетение NK-активности и продукции IL-2 и увеличение уровня растворимой формы IL-2-рецептора. Авторы полагают, что МГ, который успешно конкурирует с тимулином за цинк вследствие более высокого аффинитета, играет ключевую роль в снижении иммунитета при раке и введение больным физиологической формы цинка способно восстановить сниженную иммунную эффективность центральных и периферических органов иммунной системы.

В дистальной части брюшины опухоленосителей, которым вводили КонА, где обнаруживались инвазирующие атипичные клетки, был отмечен наибольший прирост количества МГ2 и АБГ1 по сравнению с самой опухолью и пограничной частью. Перераспределение относительного количества этих двух белков в дистальную часть брюшины по сравнению с самой опухолью и пограничной брюшиной может быть причиной и/или следствием интенсивной инвазии опухолевой массы.

Многократное введение ПАФ наиболее значительно по сравнению с КонА стимулировало рост опухоли - объем опухолевого узла увеличился почти в два раза. Возможно, у этих крыс развивалось так называемое состояние толерантности, которое выражается в усилении роста опухоли вследствие ингибиции продукции эндогенного ФНО повторяющимися инъекциями бактериального липополисахарида (С.А.Кетлинский и соавт., 1992). У крыс отмечалось глобальное увеличение тканевых и циркулирующих концентраций

161 всех макроглобулинов, но особенно существенно, МГ2 и АБГ1, по сравнению с контрольными опухоленосителями и безопухолевыми крысами, получившими такой же курс инъекций ПАФ. У последних обнаружено увеличение количества макроглобулинов в сыворотке и тканях, что свидетельствует об активации их биосинтеза, вызванной ПАФ, и подтверждается данными Isaac L. и соавт. (1999) о повышении уровней мышиного аг-макроглобулина в плазме крови через 24 час (на 18,6%) и 48 час (на 27,9%) после инъекции животным БЦЖ. Уровни МГ2 и АБГ1 в сыворотке и тканях опухоль-несущих крыс после введения ПАФ были максимальными по сравнению с контрольными опухоленосителями и безопухолевыми крысами, получившими такой же курс инъекций ПАФ, что свидетельствует об аддитивном эффекте ПАФ и опухоли на биосинтез макроглобулинов. Распределение макроглобулинов между опухолью и пограничной тканью брюшины претерпевало такие же изменения, как при интенсификации роста опухоли другими факторами, - наблюдалось накопление макроглобулинов в интактной части брюшины, где атипичных клеток еще не было, но присутствовала лейкоцитарная инфильтрация ткани.

Таким образом, спонтанный инвазивный, экспансивный и метастатический рост опухолевой ткани в организме крыс и стимулированный под действием экзогенных факторов приводит к глобальным повышениям тканевых и сывороточных уровней двух макроглобулинов - МГ2 и АБГ1, т.е. они являются ассоциированными со злокачественным ростом макроглобулинами.

Инъекция ФНОа+ПАФ крысам-опухоленосителям привела к существенному ослаблению роста опухоли (на 75%) и появлению признаков регрессии опухолевой ткани. В основе полученного результата может лежать цито-литический эффект депонированного за счет ПАФ экзогенного ФНОа и/или индукция биосинтеза эндогенного ФНО препаратом ПАФ. Эти животные могли быть классической моделью индуцированного распада злокачественой опухоли (Carswell A.A., 1975), вызванного эндогенным ФНО, синтез которого

162 стимулируется после одной инъекции БЦЖ. У этих крыс наблюдалось резкое тотальное снижение тканевых и циркулирующих концентраций МГ2 и АБГ, в том числе, в опухоли и брюшине, в обеих исследуемых частях которой не было отмечено инвазирующих атипичных клеток, в отличие от контрольных опухоленосителей. В интактной части брюшины исчез МГ2 и обнаруживались лишь следовые количества АБГ1, что хорошо сотносится с другими результатами. Похожие данные были получены с использованием препарата интерфе-рона-а, многократное введение которого приводило к торможению роста опухолевого узла на 65%. Возможно, антибластомное действие ИФа опосредуется также эндогенным ФНО. Эффект индукции синтеза эндогенного ФНО и повышения его уровня в крови подтвержден у некоторых онкологических больных, лечение которых проводилось рекомбинантным интерфероном-у (Aulitzky W.E. е.а., 1991). Уровни МГ2 и АБГ1 в сыворотке крови и тканях крыс после введения цитокина понижались до физиологических значений.

В нашей работе представлены модели усиления и торможения роста карциномы Уокера 256 крыс под влиянием различных факторов. БЦЖ является неспецифическим иммуностимулятором, вызывающим усиление клеточных и гуморальных реакций, на основании чего используется вплоть до настоящего времени в качестве иммунотерапевтического средства при лечении онкобольных. Однако его использование не всегда приводит к положительным результатам (Mclllmurray M.B. е.а., 1977; Hauschieid А.& Sterry W., 1992). Механизм стимуляции прогресса опухоли под действием БЦЖ неизвестен. Выявлена лишь его связь с местом введения, дозой и стадией онкопроцесса на момент обработки БЦЖ на перевиваемых опухолях, установлен факт одновременной стимуляции роста метастазов при регрессии первичного узла (Baldwin R.W. е.а., 1973; Mathe G., 1975; Piessens W.F. е.а., 1977). В наших экспериментах использованный аналог БЦЖ - полный адъювант Фрейнда, являющийся мощным индуктором клеточного и гуморального иммунитета у экспериментальных животных (Azuma I. е.а., 1976), при многократном введе

163 нии значительно усиливал экспансивный рост карциномы Уокера 256 по сравнению с контролем, параллельно чему наблюдалось увеличение тканевых и циркулирующих уровней макроглобулинов. Такой же параллелизм наблюдался под влиянием митогенного лектина - КонА. При торможении опухоли под влиянием интерферона-а или однократной прививки ФНОос+ПАФ наблюдалось тотальное снижение уровней макроглобулинов. Более того, нами была обнаружена положительная достоверная корреляционная связь у животных со стимулированным и угнетенным ростом карциномы Уокера 256 между размерами опухолей и всеми определяемыми тканевыми уровнями МГ2 и АБГ1 и сывороточным содержанием МГ2, что также свидетельствует об ассоциации этих белков с развитием опухолевого процесса. Наши исследования показали супрессорные свойства плазменных макроглобулинов по отношению к пролиферации клеток иммунной системы, которые проявляются при кон-формационной модификации белков и особенно сильны при концентрациях, значительно превышающих физиологические, т.е. таких, которые могут быть достигнуты локально в местах скопления молекул макроглобулинов и достаточного количества их модификаторов, от которых зависит экспрессия имму-носупрессорных свойств макроглобулинов. Эти условия присутствуют в нормальных тканях организма-опухоленосителя, в которых увеличивается проте-олитическая активность и появляются большие количества макроглобулинов, но особенно они должны быть выражены в опухолевой ткани, которая сама секретирует протеазы и макроглобулины. Супрессируя естественный киллинг, пролиферацию лимфоцитов, макроглобулины создают "иммунологические привилегии" для размножения опухолевых клеток. Сами макроглобулины могут проявлять свойства ростовых факторов для атипичных клеток. Поэтому присутствие в опухоли ЛПМИ, как клеток, несущих на поверхности макроглобулины и пополняющих внутриопухолевой пул этих регуляторных белков, может способствовать опухолевой прогрессии. Это предположение находится в соответствии с наблюдениями стимуляции опухолевого роста in vitro внут

164 риопухолевыми макрофагами, выделенными из индуцированной фибросарко-мы. Они продуцируют фактор, стимулирующий рост опухолевых клеток в 510 раз (Hamburger A.W. е.а.,1986, цит. по Б.Т.Билынскому и соавт., 1991). Кроме того, моноциты периферической крови больных раком ответственны за снижение пролиферативной активности периферических МНК, продуцируя меньше ИЛ-1, чем в нормальных условиях (Н.В.Яковлева и соавт., 1992), что также может быть связано с негативным действием макроглобулинов. В связи с этим концепция о роли лимфоплазмоцитарной и макрофагальной инфильтрации злокачественных опухолей как неблагоприятного прогностического фактора, сопутствующего усилению степени злокачественности, о заинтересованности опухоли в ЛПМИ, индуцирующей ее вследствие своей секреторной активности (Б.Т.Билынский и соавт., 1991), находит подтверждение с позиции поставки мононуклеарными клетками в опухоль дополнительного количества макроглобулинов как иммуносупрессорных и опухоль-стимулирующих белков.

Имммуносупрессорная активность создается и в пограничных к опухоли тканях, где она, соответственно, может быть связана с макроглобулинами, продуцируемыми инвазирующими брюшину атипичными клетками и/или лейкоцитарными инфильтратами. Наши данные позволяют считать, что распределение макроглобулинов между опухолью и окружающей ее тканью связано с интенсивностью опухолевой прогрессии. Так, при усиленном развитии карциномы Уокера 256 у всех животных наблюдалось перераспределение относительного количества макроглобулинов, особенно, АБГ1, между опухолью, пограничной и дистальной частями брюшины в сторону увеличения в дистальной части, в которой опухолевой инвазии еще не обнаруживалось.

Биосинтез тканевых и внутриопухолевых пулов макроглобулинов, вероятно, запускается продуцируемыми опухолью растворимыми факторами. Так, эффект усиления продукции антипротеолитиков, в том числе, макроглобулинов, был обнаружен при добавлении к культурам клеток гепатомы человека и

165 гепатоцитов крыс и мышей кондиционированной среды от культивируемых клеток карцином (Ваитапп Н. е.а., 1984). Этими факторами, скорее всего, являются определенные цитокины, которые продуцируются опухолевыми клетками. Показано, что клетки некоторых линий гепатом крысы, активированные бактериальным липополисахаридами, синтезируют ИЛ-6, который утилизируется как аутокринный индуктор экспрессии гена острофазовых белков, приводящей к увеличению мРНК для МГ2 в опухолевых клетках (Ва££е1 в. е.а., 1991).

Синтезирующиеся в тканях дополнительные макроглобулины, активирующиеся при усиленной локальной протеолитической нагрузке, сами способны индуцировать биосинтез цитокинов в клетках-мишенях и активацию цитокинзависимых реакций. Цитокины, поступающие в кровь из тканей, возможно, связываются с нативными плазменными макроглобулинами и, сохраняя свои биологические свойства, циркулируют в организме до встречи со специфическими рецепторами, которые смещают нековалентно связанные цитокины с поверхности макроглобулина. Таким образом эти белки могут поставлять в опухоль значительное количество цитокинов, способных активировать ее рост, обеспечивая дополнительные сигналы для пролиферации опухолевых клеток. Возможно, благодаря тому, что одни цитокины (как тромбо-цитарный фактор роста, ИЛ-6, фактор роста фибробластов) связываются преимущественно с нативными молекулами макроглобулинов, а другие (как ИЛ-1(3, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, трансформирующий фактор роста) - с активированными формами, подлежащими утилизации через рецепторы к макроглобулинам, в опухолевой ткани создается определенное соотношение стимулирующих размножение опухолевых клеток и разрушающих их цитокинов. Нарушение его под действием экзогенных факторов приводит либо к усилению прогрессии опухоли (например, под влиянием ПАФ, КонА) либо к торможению (интерфероны, факторы некроза опухолей). Способность последних обратимо взаимодействовать с макроглобулином, находящимся в нативной или активи

166 рованной форме, что было показано в наших экспериментах, указывает на участие белка в доставке в опухоль цитокинов, ее разрушающих. Изучение баланса различных макроглобулин-цитокиновых комплексов в организме при прогрессе или регрессе опухоли, а не только, как предлагается (В.П.Шичкин, 1998), цитокинового профиля опухолей, возможно, является ключом для понимания закономерностей опухолевого роста и возможности эффективного влияния на него. С другой стороны, использование знаний о связывании цитокинов с макроглобулинами позволит применять препараты МГ для терапии других цитокин-опосредованных заболеваний (ЬаМагге ]. е.а., 1991).

Таким образом, индукция синтеза макроглобулинов при малигнизациях как антипротеолитиков, способных сберечь здоровые ткани от протеолитиче-ского разрушения опухолевыми клетками и инвазии опухолей, и регуляторов иммунных реакций, направленных на уничтожение малигнизированных клеток, имеет обратную, негативную сторону для организма опухоленосителя, которая может проявляться в создании при высоких концентрациях этих белков системной иммуносупрессии. Вполне вероятно, что именно так "происходит переключение программы функционирования иммунной системы, направленной на отторжение "чужого" от "своего" на программу "охраны чужого в своем" (Н.В.Васильев, 1982).

Все вышеизложенное обосновывает крайне важную роль макроглобулинов как фактора, принимающего участие в формировании глобального механизма защиты опухолевых клеток, который обусловливает состояние "иммунной толерантности" организма к злокачественной опухоли. Поэтому всемерное снижение повышенных уровней макроглобулинов в организме, пораженном злокачественной болезнью, будет способствовать преодолению "иммунной толерантности" к опухоли и сопутствовать успехам в его излечении.

167