Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Макроглобулины

Изучение механизмов взаимодействия различных звеньев иммунной системы между собой, а также с иными системами организма всегда являлось ведущим направлением иммунологии. Открытие ряда различных цитокинов и рецепторов клеток позволили сформулировать основы представлений о механизмах регуляции функций системы иммунитета. Однако, известные факты недостаточно полно характеризуют механизмы весьма многообразных реакций. Не вызывает сомнения, что межклеточные взаимодействия осуществляются не только в прямом контакте, но и через растворимые трансфер-факторы, способные оказывать как непосредственное влияние, так и переносить биологически активные продукты.

В последние годы внимание иммунологов все больше привлекают белки семейства макроглобулинов, которые наделяются способностью к регуляции едва ли не всех функций иммунной системы.

Наиболее изученным среди макроглобулинов считается альфа-2-макроглобулин (МГ), как один из самых сильных ингибиторов протеи-наз в организме человека (Веремеенко К.Н.,1988). Однако, по мнению ряда авторов (Petersen С.М.,1993; Yarovinsky Т.О е.а, 2000), МГ принимает активное участие и в регуляции иммунного ответа. Комплекс МГ-трипсин способен ингибировать вызваную митогенами пролиферацию лимфоцитов (Hubbard W.J.,1978), а комплекс МГ-плазмин усиливать биосинтез иммуноглобулинов мононуклеарными клетками (Мусатов М.И. и соавт., 1994). Выделенный белок связывается с патогенными микроорганизмами и вирусами и осуществляет их презентацию периферическим макрофагам, принимает участие в реакциях кооперации иммунокомпетентных клеток и является переносчиком многих цито7 кинов (Jacobsson К. е.а., 1997; Osada T. е.а.,1988; Chu С.Т., Pizzo S.V., 1993; Яровинский Т.О и соат.,2001; James К., е.а., 1990, 1992; Phillips D.J., е.а.,1997).

Об иммунорегуляторных свойствах другого макроглобулина - ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (а-2- PAG) сообщается в работах Stimson W.H. (1976), Svendsen P. (1978), Tomson A.W., Hörne C.H.W. (1980), Hörne C.H.W. e.a.(1982-1983). По их мнению, a-2- PAG способен угнетать митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов, блокировать действие туберкулина при внутрикожном введении и продлять сроки неотторжения антигенно несовместимых трансплантатов у мышей. Его иммунорегуляторные свойства связывают с блокированием главного комплекса гистосовместимости.

Ассоциированный с беременностью протеин А (РАРР-А) как регулятор иммунной системы изучен крайне недостаточно. Bischof P., Meisser А. (1989) сообщили об угнетении белком пролиферации мононуклеа-ров.

Необходимо отметить, что все вышеперечисленные сведения отличаются большой противоречивостью, разрозненностью данных и отсутствием сравнительных исследований. На наш взгляд, главной причиной этому является отсутствие методов выделения данных белков, позволяющих получать их с сохраненными свойствами и свободными от примесей других сывороточных белков.

Целью данной работы было сравнительное изучение иммунорегуляторных свойств белков семейства макроглобулинов при нормальных и патологических состояниях. 8

В задачи работы входило:

1. Разработать методы индивидуального и совместного получения макроглобулинов, обеспечивающих высокий выход целевого продукта с сохранением его природных свойств;

2. Провести сопоставления физико-химических свойств и структуры различных макроглобулинов;

3. Оценить влияние нативных и модифицированных макроглобулинов на иммунологические реакции;

4. Разработать методы определения в биологических жидкостях организма макроглобулинов и их комплексов с различными белками;

5. Определить концентрации макроглобулинов и их комплексов с ^О в биологических жидкостях у небеременных и беременных женщин;

6. Установить диагностическое и прогностическое значение макроглобулинов при раке молочной железы;

7. Обосновать представление о роли макроглобулинов в регуляции функций иммунной системы.

Научная новизна.

Разработаны превосходящие по эффективности известные аналоги методы выделения макроглобулинов, а также метод комплексного поэтапного выделения всех трех белков из плазмы крови. Проведенные сравнительные исследования показали наличие высокой гомологичнос-ти в строении и физико-химических свойствах исследуемых белков, а также их идентичность нативным, циркулирующим в крови макроглобулинам. Разработаны модификации иммунохимических методов, позволившие выявить различную степень аффинитета макроглобулинов к другим соединениям: ферментам, половым гормонам, лектинам, цито-кинам и иммуноглобулинам. Установлено, что связывание рекомби9 нантных цитокинов с макроглобулинами зависит от конформационного состояния последних. Модифицированный метод иммуноферментного анализа позволил выявить циркулирующие в крови специфические иммунные комплексы, состоящие из макроглобулинов и иммуноглобулина G. Показано, что мононуклеарные клетки человека способны к биосинтезу макроглобулинов in vitro, а половые гормоны не оказывают влияния на данный синтез. Впервые продемонстрирован ряд иммуномодули-рующих эффектов модифицированных макроглобулинов на мононуклеарные клетки человека и отсутствие таковых у нативных белков. Показано, что модифицированный метиламином МГ и, в большей степени, а-2- PAG стимулируют биосинтез иммуноглобулинов G и М и, в то же время дозозависимо угнетают пролиферацию митоген-стимулиро-ванных мононуклерных клеток. Самым слабым иммуномодулятором в реакциях in vitro оказался РАРР-А. Выявлены различия в распределении рецепторов макроглобулинов на поверхности иммунокомпетентных клеток. Показано, что из всех изучаемых белков а-2- PAG имеет большее количество рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов. Впервые определены концентрации всех макроглобулинов в моче, амниотичес-кой жидкости, молоке и пуповинной сыворотке. Полученные результаты подтвердили предположение о происхождении РАРР-А из репродуктивных органов и тканей мочевыводящих путей у небеременных женщин, а также продемонстрировали возможность биосинтеза макроглобулинов клетками амниона, молочной железы и в минимальных концентрациях организмом плода. Изучены закономерности динамики концентраций макроглобулинов и их комплексов с иммуноглобулином G в сыворотке крови при неосложненной беременности. Впервые показано, что количество циркулирующих комплексов IgG с макроглобулинами, а также их динамика при беременности различаются. Концентра

10 ция комплексов, состоящих из и РАРР-А была максимальной и снижалась в течение беременности. И напротив, содержание комплексов с МГ и а-2-РАО повышалось во Н-Ш триместрах беременности. Показано, что в отличие от физиологической беременности развитие патологического пролиферативного процесса у женщин (рак молочной железы) сопровождается иными изменениями концентраций в крови макроглобулинов и их комплексов с 1§0. Полученные результаты позволили выявить определенные закономерности в динамике их концентраций при развитии онкологического процесса у женщин и доказать, что а-2-РАО является не только белком беременности, но и достаточно чувствительным маркером рака молочной железы. Проведенное исследование позволило расширить представления об участии и роли макроглобулинов в иммунорегуляторных реакциях у человека в норме и при патологии.

Практическая ценность.

Разработаные высокопроизводительные способы выделения натив-ных и модифицированных макроглобулинов могут быть использованы не только в научно-исследовательских лабораториях, но и в производственных масштабах для получения перспективных лекарственных средств. Разработанные модификации методов иммуноаффинофореза могут быть использованы в изучении реакций макроглобулинов, а также любых других сывороточных белков с различными соединениями. Ан-тигенспецифический метод определения иммунных комплексов можно использовать для выявления иммунных комплексов, состоящих из других сывороточных белков и имммуноглобулинов. Предложен выбор методов определения концентраций МГ в различных биологических жидкостях. Разработаны нормативные показатели содержания макроглобулинов и их комплексов с в крови и биологических жидкостях у

11 здоровых женщин и при нормально протекающей беременности, которые можно использовать в изучении различных заболеваний и осложнений беременности. Предложены способы прогноза течения рака молочной железы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование жесткого анионообменника и негативной аффинной хроматографии с другими сывороточными белками позволяет выделять высокоочищенные макроглобулины с сохранением свойств натив-ных белков;

2. Модифицированные макроглобулины обладают иммунорегуля-торными свойствами в реакциях in vitro: стимуляция биосинтеза иммуноглобулинов, угнетение митоген-индуцированной стимуляции клеток, взаимодействие с лектинами, половыми гормонами, цитокинами и иммуноглобулинами G, А, М;

3. Макроглобулины образуют циркулирующие в крови иммунные комплексы с IgG и принимают участие в механизмах вынашивания плода и развития рака.

12