Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Структурно-функциональные параллели иммунологических свойств макроглобулинов человека и животных

зз - - т

Академия медицинских наук СССР Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова

На правах рукописи

ЗОРИН Николай Алексеевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПАРАЛЛЕЛИ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МАКРОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1992

/

Работа выполнена в Новокузнецком государственном институте усовершенствования врачей.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. Г. Галактионов; доктор биологических наук, профессор А. А. Михайлова; доктор медицинских наук М. А. Стенина.

Ведущая организация — институт клинической иммунологии Сибирского отделения АМН СССР.

Защита диссертации состоится « » 199 г.

в часов на заседании специализированного Совета

Д 001.38.01 при научно-исследовательском институте вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова АМН СССР по адресу: 103064, Москва, пер. Мечникова, дом 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке иауч-но-исследовательского института вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова АМН СССР.

Автореферат разослан « » 199 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета, кандидат медицинских

наук Н. Г. КУДРЯВЦЕВА.

lit*«

ОБИТАЯ ХАРШЬРИСПНА PABOTli Актуальность исследования

Одним из главнейших постулатов сосременнсЯ тшунологии яв-лпотся представления о существовании слояной сети взаимоотношений иоаду различии,« звспьтаи тз/унноИ систеиа. Особая роль н регуляции этих взаимоотношении принадлежит цитотшам, которые |.:о'ко рассматривать как сигнал, адресуете друг другу различными составляющие клеточного звена иммунитета (Петров и ссавт., 1975; Ковальчук и Черэдееэ, 1984; Чзредеев, I99Ö). В свою оче-зодь, цитокины вступают в ыногообразн!,!э контакты с белками яид-iiix срзд органивиа, вносящими этим путец свой вклад в регуляцию ¡ункций упомянутой системы. Таким белком является ajib^ag-MaKpo-•лобулин (1.!Г), образующий комплекса с интерлейкинаш I, 2 и 6 Ja.'noa , 1390), известный ранее как неспеци^ческиЯ ингибитор [ротеинвз (Вэрзмеешсо и соавт., 1988). Ецз большими потенциями I регуляции активности иммунной системы наделяется ассоциированный с береяенностьа алы^-гликопротэин (АБГ), последователь-ость аминокислот которого на 68,? совпадает с аналогичными пока-атзлями МГ ( Saad и соавт., IS85). Поэтому оба белка рассматри-автся как структурные и функциональные гомологи. Сходен с ними э структуре и функциям ассоциированный с беременностью протеин (РЛРР-А), обладающий рядом пммуиорегуляторних свойств ( Sino-ilcli I 1990). Каяется уже есть все условия для выделения трех

»званных беякоь в отдельное семейство мадроглобулинов, но это-

о

г препятствует ряд обстоятельств. В частности, Бысокая степень юдства мешает их очистке от примесей друг друга, вследствие го многие индивидуальные свойства этих белков'в действитель-сти отсбраяаат их групповые характеристики. С другой стороны,

получение свободных от примесей белков не всегда позволяет решить не ыенее важную проблему - добиться сохранения исходных функциональных характеристик. Следовательно, решение этой двуодиной задачи дает ключ ко всему остальному - детальному игучени» структуры и функций ИГ, АБГ и РАРР-Д, а также возможности суждения на ос* нове полученных данных о достаточности оснований для выделения их в отдельное семейство какрсглобулинов. ,

Многие из вышеуказанных белков обнаружены в организма различных животных. Однако, говорить о том, что указанные белки животных аналогичны соответствующим белкам человека, явно прездевро-кенно. У большей части животных в организме имеется 2-3 белка, сходных по свойствам с МГ человека. Предполагается( что роль второго (¿Г у человека выполняет АБГ ( sand • 1985). С другой стороны,

у грызунов, noinaio 2 МГ, обнаружен относительно низкомолекулирный )

белок, антигенно идентичный АБГ человека ( Hau, Forstmann ( 1984). Свойства же белков яивотных, сходных с РАРР-А человека, пока практически не изучались ( sinoolch , 1986). Здесь мы сталкиваемся с той же проблемой - отсутствием надежных способов получения соответствующих белков животных или, хотя бы, моноспецифических антисывороток против них. Лишь после этого возникнет возможность изучения их состава, структуры, функций и реакций антигенной идентичности. Решение отой проблемы позволит оценить влияние эволюционного процесса на становление структурных и функциональных характеристик указанных белков, а также дает возможность решить вопрос о целесообразности отнесения их к единому, эволюционно оформленному семейстгу макроглобулинов. С другой стороны, возникнет возможность создавать адекватные кодели патологических процессов, в том числе и сопряженных с нарушение« функционирования иммунной системы, используя для этих целей предполагаемые аналоги МГ, АБГ и PAPP-l

ловека.

Но менее ваяной общебиологической проблемой является уста-вление (функций каждого из белков, обладающих сходными свойства, источников их в организме и механизмов, регулирующих биосин-9 данных антигенов. Это особенно необходимо для понимания их 1И в организма и значения взаимоотношений с различными звенья-имцунной системы.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилась иммунохииичэская идентифика-выделение, сравнительное изучение состав?, структуры и функ-альфа2-макроглобулина, ассоциированного с беремеююстьв аль--гликопротеина, а такле ассоциированного о беременностью про-на А и их предполагаемых аналогов, возникших в процессе эволп-от низших еивотных до человека. В задачи работы входило: Разработать способы очистки изучаемых белков из биоматериалов различного происхождения, позволяющие достигнуть высокого вывода целевого продукта, полного удаления примесей и сохранения «сходного уровня функциональной активности. 1зучить состав и структуру свободных от примесей белков. 1олучить моноспеци$ически9 антисыворотки против ИГ, АБГ и 'АРР-Л, а также их аналогов, пригодные для создания диагностиков, позволшцих исследовать свойства данных белков на осно-¡в иммунохииических методоо

!селедоват^, реакции изучаемых белков о лектинами, гормонами и рочими аффшанташ.

ровести анализ ингибирующих свойств белков по отношению к ротеиназам и установить механизм ингибирования.

6. Выяснить влияние белков на клеточное и гуморальное звено системы иммунитета.

7. Оценить их биосинтез в культурах мононуклеарных клеток и рол! стероидных половых гормонов как стимуляторов.

8. Установить влияние беременности, гормональной стимуляции, острого воспаления и рака на распределение изучаемых белков в организме крыс. ,

9. Исследовать эволюцию антигенных детерминант исследуемых белков от низших животных до человека.

10. Обосновать представления об эволюционно сформировавшемся семействе ыакроглобулинов и его роли в организме.

I

Положения, выносимые на защиту

1. Представители семейства макроглобулинов иыеат унитарную

I

структуру и состоят из 1-4 идентичных субъединиц. Исключение из этого правила составляют "острофазовые" МР животных, у которых основной структурообразующий компонент состоит' из двух субъединиц, различающихся по молекулярной массе. Аналоги АБГ человека у грызунов представлены единственной субъединицей. Сам АБГ представляет собой динар идентичных субъединиц, связанный ыеяцепо-чечнкы дисульфидным мостиком. В более сложных молекулах КГ два указанных димзра образуют нативную тетрамернуп молекулу белка за счет связей нековалентной природы.

2. Все представители семейства макроглобулинов в нативном состоянии являются неспецефическжш ингибиторами протеиназ, не обладающими существенным аффинитетом к мембранам имцунокомпетент-ных клеток. При присоединении ферментов или иных аффянантов изучаемые белки приобретают способность вступать в контакт с опрэ-дглгншля компонентами мембран различных клеток.

3. Присоединение комплекса макроглобулин-аффинант к иммуно-петентнда клеткам дозозависимо снижает ответ на пролифератив-

стимулы, одновременно активируя биосинтез иммуноглобулинов в ьтурах периферических мононуклеарных клеток. Иммунорегулятор-потенции убивают а ряду АБГ, МГ и РАРР-А.

4. Наиболее древним представителем семейства макроглобулинов яется КГ, который ужа на ранних стадиях эволюции (у ракообраз-, моллюсков и червей) может быть представлен в организме 1-2 игенно различными белками. Аналоги АБГ и РАРР-А удается обна-ить лишь в организме млекопитавщих. {¿Г человека и животных на х этапах эволвции сохраняют высокую степень' антигенной иден-ности, причем парные антигенно различные ЫГ животных частично игенно идентичны единственному КГ человека. Представители АБГ (1РР-Л в процесса эволюции претерпели значительно большую диф-энцировку антигенных детерминант.

5. У практически здоровых мужчин и неберемзшшх женщин еызэ-мянутые функции реализуются преимущественно за счет МГ, т.к. зинтез двух других белков в их организме невелик. При беремзн-ги и злокачественных новообразованиях наращивание антипротеаз-э и ш.мунорег'ляторного потенциала происходит путем последова-ьной активации биосинтеэя АБГ и РАРР-А.

Научная новизна

В результат^ проведенной работы в организме человека "и мО

-¡ых идентифицированы представители семейства макроглобулинов, работани в&окоэффзктлвние способы их получения из различных материалов, а также созданы иммунодиагностикумы на основе мо-.зцифических антисыворотоц против указанных белков. Изучены {изико-химические свойства, состав и структура, а также реак-

г

ции о различными аф|{инантами. Показано, что все представители семейства макроглобулинов являются ингибиторами протеолитичеоких ферментов. Механизм ингибироваиия состоит в образовании комплексов протеиназа-ингибитор на основе "ловушвчной" модели, детально обоснованной ранее для МГ. При образовании комплексов с а<{франтами изучаемые белки приобретают более компактную конформацию, экспрессируют внутренние тиоловые в^иры и способность прикрепляться к мембранам различных клеток, в том числе и икмуйокомпетентных клеток. Впервые описаны мембранные рецепторы макроглобулинов у периферических мононуклеарных клеток крови и стрептококков. Натив-ные накроглобулины практически не обладают иммунорегуляторными свойствами, но приобретают их при вышеописанной конформационной перестройке. Эти свойства проявляются в супрессии спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации мононуклеаров, а также в активации биосинтеза иммуноглобулинов в культурах указанных клеток. Выраженность данных свойств убывает в ряду АБГ, ИГ и РАРР-А. Установлено, что исследуемые белки продуцируются:в культурах мононуклеарных клеток, .а стероидные половые гормоны не относятся к прямым индукторам их биосинтеза. Экспериментальное воспаление способствует увеличению концентраций аналсГЬов АБГ и МГ человека в сыворотке крови крыс за счет снижения их содержания в тканях. При беременности и введении эстрадиола концентрация анаяового АБГ возрастает как в сыворотке крови, так и в тканях, тогда как для МГ ято явление выражено в меньшей степени. Саркома Плисса способ-струет исчерпанию тканевого пула МГ на фоне резного прироста содержания АБГ. По результатам реакций антигенной идентичности установлено, что аналоги МГ имеются в организме рыб, ракообразных, ч"ргей, насекомых, птиц и млекопитающих. У большей части животных

гГцар;,-жено деа структурно и антигенно различных МГ. Аналоги АБГ и

с

ГАГГ-А найдены лишь в организме млекопитающих. Даны теоретические

и экспериментальные обоснования эволюции белков семейства макроглобулинов и их биологической роли в организме.

Практическая значимость

Разработаны оригинальные способы получения изучаемых белков животных и человека из различных биоматериалов. Получены моноспецифические антисыворотки против данных белков. Синтезированы сорбенты на основе иммобилизованных белков, пригодные для получения аффинно очищенных моновалентных антител. Аффинно очищенные антитела использованы для конструирования диагностикумов для твердофазного иммуноферментного анализа и иммуно-блоттинга. Разработан новый способ твердофазного иммуноферментного анализа для определения концентраций РАРР-А, основанный на присоединении исследуемого белка к слою гепарина, иммобилизованного на полистироловой матрице. Оценена информативность иммунохимических методов определения концентраций исследуемых белков в различных биоматериалах. Апробирована значимость их в качестве маркеров воспаления, беременности и рака на примере крыс. Установлены нормативные значения концентраций изучаемых белков в сыворотке крови мужчин, небеременных и беременных женщин, а также рожениц и родильниц.

Внрдрен :е в практику

Результаты работы внедрены в практику кафедр акушерства и Гинекологии и клинической лабораторной диагностики Новокузнецкого ГйДУВа, Кемеровского медицинс^го института, 11нститута клинической иммунологии СО АШ СССР, Института хирургии ВОЗ СО АМН СССР » Киевского НИИ педиатрии, акушерства и гинекологии.

Получено положительное решение по заявке на иммунофериентный способ определения концентраций ассоциированного с беременностью протеина А (№ 4675094/30-14 от 12.10.90).

Работа выполнена в рамках Государственной программы 05907 "Разработали внедрить в практику методы и средства диагностики и коррекции внутренней среды организма".

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии", Алма-Ата, 1981, на Всесоюзном симпозиуме "Аффинная хроматография в медицине", Иосква, 1986, на III Всесоюзном симпозиума с международным участием "Иммунология репродукции", Киев, 1987, на 1У Всесоюзном съезде патофизиологов, Кишинев, 1989, на ХУ Всесоюзном съезде акукеров-гинекологов, Москва, 1989, на Первом Всесоюзном иммунологическом.съезде, Сочи, 1969, на 1У Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Иммунология репродукции", Киев, 1990, на ХУП международном конгрессе ИСОЕМ, Москва, 1990, на У1 конгрессе Европейской ассоциации акушеров и гинекологсо, Москва, 1991.

Публикации

По тепе диссертации опубликовано 34 работы, получено одно положительное решение по заявке на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введении, обзора литературы, материале;? и методов исследования, 6 глав результатов собственных наблю-д'ч.'1, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Она и.-'леж-'ни на йЗО стреницах машинописи и иллюстрирована 51 табли-:!■■'", а так^о 61 рисунком. Библиографический указатель включает 3'С ггточников.

СОДЕРНАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили образцы крови 123 мужчин, 98 збереиенных и 833 беременных женщин, а также 33 роженицы и 66 ро-ильниц. В работе использовано также 747 белых крыс, 1580 белых ьшей, 312 морских свинок, 25 собак, 8 лошадей, 13 коров, 20 овец II кроликов, 16 кур, 16 окуней, II серебряных карасей, 15 особей потвы, 120 дождевых червей, 2000 личинок комара-дергуна и 500 зобей рачка-гамаруса.

Асептический воспалительный процесс у крыс вызывали внутри-ьшечныы введением терпентина. Срок беременности у грызунов оправляли по образованию у самок вагинальной пробки. Стимулирующее эйствие эстрогенов оценивали путем введения крысам 17-бета-зст-адиола. Для инокуляции лимфосаркоьш Плисса опухолевые клетки водили в лимфоузлы шеи животных.

Методы получения макроглобулинов

Для получения изучаемых белков в нативнон состоянии к плазме рови добавляли ингибиторы протеиназ: фенилметилсульфонол фторид Э,005Ы), трасилол (0,001511) и соевый ингибитор трипсина 5 мнг/мл). Затеи использовали комплексную схему последовательно-о выделения РЛРР-А, АБГ и МГ (Зорин и соавт., 1991), основанную а сочетании методов очистки РАРР-А ( Slnosioh и соавт., 1982) и ВГ ( Sand и соавт., 1985). Первоначально удаляли плазниноген {финной хроматографией на колонке лизин-агарозы. Затеи элват мешивали с равным объемом 0,05Ы трис-буфера, рН 7,С, содегжаще-о 0,1% тритона Х-100 и 0,45М хлорида натрия. Раствор пропускали зрез колонку гепарин-агарозы. При этом РАРР-А фиксировался на

колонке и элгаировался указанным бустером, без детергента, но с увеличением концентрации хлорида натрия до IM. Окончательная очистка РАРР-А от примесей достигалась негативной аффинной хроматографией на колонке агарозы с иммобилизованными кроличьими антителами против белков сыворотки крови мужчин. Продукт, не связанный гепарин-агарозой осаждали полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 в диапазоне концентраций от 6 до 16%. Конечный осадок диализовали против 0,02М (фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего IM хлорида натрия. Для отделения АБГ от МГ использовали цинк-хе-лотную аффинную хроматографию на иминодиуксуснокислой агарозе. При элоции нисходящим градиентом рН (от 7,0 до 5,0) оба белка хорошо отделяются друг от друга. Окончательная очистка АБГ достигается использованием вышеописанного варианта негативной аффинной хроматографии, а МГ - негативной аффинной хроматографией на ко-

I

лонке агарозы с иммобилизованными антителами против АБГ. Для получения трансформированных конформационно форм данных белков при-мэняли осаждение сульфатом аммония, добавление Первичных аминов и протеиназ.

Вышеизложенная общая схема применялась для получения макроглобулинов из материалов животного происхождения. Для разделения птрныг МГ животных применяли цинк (никель)-хелатную хроматографию на иминодиуксуснокислой агарозе или анионообменную хромато-П

Методы изучения состава и структуры белков

Аминокислотный состав белков определяли на автоматическом ••ЧПН0КИСЛ01Н0М анализатору Biotronic LC-5001 В составе их уг-•"•!■'(,-ли.;< компонентов определяли концентрации моносахаридов, фу-\' и, (тшосагаров и сиаловых кислот.

с

М;декулнрн;,'п массу бзлков и их субъединиц оценивали при по-

ющи гель-хроматографии. Для этих же целей использовали зональный лектрофорез в пластинах полиакриламидного геля. В этом случав рименяли градиент пор полиакрилашдного геля (4-40%), а также Срабатывали образцы белка додецилсульфатои натрия и 2-меркалто-танолом по Лзымли. Этот же метод применяли для обнаружения кон-ормационной перестройки под действием первичных аминов и протеи-аз. Изоэлектрическую точку белков устанавливали при помощи изо-лектрофокусирования в гелях, содержащих градиенты рН, созданные иолитаци и борат-полиолаци. 4

Ингибирую^ие свойства белков по отношению к протеолитичес-т ферментам исследовали по блокированию лизиса хроногенных бел-зв-субстратов и синтетических низкоыолекулярных субстратов, {спрессую внутренних тиоловых эфиров под действием протеиназ и ;рвичшх ашнов изучали путем титрования суль.фгидрильных групп ¡лков 5,5-дитио-бис(2-нитро)бензойной кислотой,

Имяунохичические методы анализа

Для получения моноспецифических антисывороток животных роликов, баранов и морских свинок) внутрикокно иммунизировали всью высокоочи_,енного антигена и неполного адьюванта Фрейнда ксельсен и соавт., 1977). Аффинно очищенные антитела получали зитивной аффинной хроматографией на колонках агарозы с иммоби-зованными высокоочкщенными антигенами.

Для определ ния -концентраций изучаемы* белков сравнивали зрешавщие способности радиальной ишунодиффузии, кинетической мунонефеломе'трии, ракетного иымуноэлектрофореза и иммунофер-тгого анализа. В последнем случае конъюгаты высокоочишенная эоксидаза хрена/аффшно очищенные антитела получали периодат-л методом. Для определения концентраций РАРР-А использовали

разработанный наш способ, основанный на присоединении белка на •'слой гепарина, обладающего*« нему высоким аффинитетом и селектив-НОСТЫ). 1

Аффинитет изучавших белков к лектинам, протеиказам, стород-миа половым гормонам, иммуноглобулинам и иным аффянантаи определяли при поксщи ракетного (перекрестного) июуноэлект'рефореза с промежуточным гелей (Сьандсги, 1977). Дял этих цепей использовали также различные варианты тандем-перекрестного, ракатно-линвй-иого и иных разновидностей количественного имчуноэлектрофорети-ческого анализа (Аксольсен, Крепль и Еееке, 1977). Относительную подвижность научаемых белков исследовали методом зонального электрофореза в агарозном геле и методом кикро-инмуноэлектрофореза по Шейдиггеру. К;л!упопрецппитати окралнвали аммдо-черным ЮБ, кума-и бриллиантовым синим, Суданом черным, прирошшом, роакти-вом ВиДОи и смсты для обнаружения ферментной актншюоти.

Длг. белков, не поддающихся очлетко, молекулярную пассу и изоточку пьходили при сочзтанли электрофореза в полиакрилсмидноы геда или иэоалектрофокусироаашш с перекрестным иымуноэлоктро^:'-реаом (Зорин и соавт., 1950). реакции макроглобулинов с предполагаемой рац«иторами в состава ¡¡легок бактерий или клетоя крови устаныишвали при п01:0,1;; Вестерно-шедуноблотпшга, а таи-е дот-блоттинга на нитроцеллюлоз? (Тсанг,-Ворс,'19С0).

Гчакции антигенной иденомности оцогаьали котодои ик.^но-диффуоии (стандартна: н "к!'».др.1гк-гя" схс:?а), а такяе |дол»нпшх Еаричятов. колнчйствагшого и::;згнс?ягк?ро$ороза.

1!:«'^ио.".сгич1;с;:5!2 кэтедч «

Влияние изучгаих белчое на клеточное звено нкцуинтота изучили при пгк: ,ч спэнтшоП ¿.игогсн-шщуцироиашюй П] оля^р^щ,;, перн^рг.чссьг.к усиоц)т.левг№Д клеток (йатт, К!37). Э^ц ¡:ле.г.м

полученные на стандартном градиенте фикол-верографина, доводили цо конечного содержания 2x10® клеток/ил и культивировали в минимальной среде Нг^а, содержащей 0,00211 глутаыина, 0,02М ГЭНЕЕ-бу-фера, 50 м;«г/мл стрептомицина, 100 Е/мл пенициллина и ZO% инакти-пироаанноЯ эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводили е 96-луночних полнстироловых планшетах с добавлением пито • гьнов (фятогенагглютинина или иитогена леконоса) или без него. Крона того, в лунки добавляли нсследуешз белки (нативные или трансформированные) до конечных концентраций 0,016-3,00 мг/мл. За 4 часа до прекращения культивирования вносили по I ыкКи (ме-тил-э1^)-тимид!!на. По окончании культивирования клетки количественно переносили на кипроновыз фильтры, отмывали и помещали ьо флакона с толуоловым "сцинтиллятороа. Радиоактивность измеряли на компьютерном комплексе "Еа^а-2".

Действие изучаемых белков на гуморальное звено иммунитета исследовали на основе биосинтеза тмуноглобулинов в культурах упомянутых клеток. Предварительно клетки инкубировали с уяазанны-I.!,! ¿елками, отшвали от них, а затеи культивировали. В суперна-тантзх культур определяй! концентрацию иммуноглобулинов пр.1 помощи твердофазного иниунофериентного метода. Аналогичным образом оценивали биосинтез макроглобулиноэ в культурах означенных клеток.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональных компьютерах с помощью стандартных пакетов програка статистическсП обработки.

РШЛЬТЛШ ¡1 ИХ ОБСУДДЕШК

Структурно-функциональные характеристики 'Л', АЕГ ч РАРР-И человека

Предложенная ньми схеца последовательной очистки изучаешь белков позволила добиться кх высокого вихспа, знтш?ель::0Й сте^

пени чистоты и сохранения исходного уровня функциональных характеристик. В частности, выход МГ, АБГ и РАРР-А из I литра нативной плазмы крови беременных женщин достигает соответственно 1,2 г (405?) 0,1 г (255?) и 0,07 г (30?). В полученных препаратах на обнаружено каких-либо примесей иных белков. Одновременно они инги-бируют активность проте-олитических ферментов в соотношении не менее I Ы/Ы. Все методы очистки этих белков, известные из литературы, уступают предложенному нами не менее, чем по,одному из отих параметров. Кроме того, вышеописанный метод позволяет наладить крупномасштабное производство макроглобулинов, тогда как большая часть иных методов позволяет получать их в значительно меньших количествах. :

Состав и структурно-функциональные характеристики исслеруе-мых белков представлены в табл.1.

• Таблица I

Состав и структурно-функциональные характеристики Ш\ АБГ и РАРРТА человека

\ 15Г ! I РАРР-А

1/2 цистин • * г/ 1,60 1,60 • 2,46

Аспарпгин (аспарагинован кислота) 10,05 9,81 10,33

Треонин 4,86 6,66 5,18

Серии 5,60 9,14 7,31

Путомин (глутаминовэя кислота) 10,93 10,69 11,24

Пролип 4,33 6,06 в 9,67

Глипин 10,85 7,28 7,30

10,50 6,30 5,84

Пплин 7,24 8,08 6,16

нгн 2,24 1,19 1,24

( иг АБГ [ РАРР-А

)лейцин 5,28 3,96 5,38

(цин 6,83 7,88 7,27

зонин' 2,48 3,79 3,22

«лаланин 6,47 3,76 3,86

з'тидин 2,68 .4,06 5,48

зин 6,31 6,38 4,27

танин 3,23 ' ч2,83 3,79

штофан 0,60 * 0,59 0

:оозы 6,2 6,8 10,04

{созаыины 1.9 1.7 0,8

1л0вы8 кислоты 2,0 2,1 3,4

«за 0,3 0,3 0,4

10 к 89,6% 89,1% 85,0%

веводц 10,4% 10,9* 15,0%

теда 0 0 0

<леотиды 0 0 0

пекулярная пасса;

гзль -хроматография- 720 кД 360 кД 820 кД

гель-электрофорез . 720 кД 360 кД 820 кД

гвль-хро атографмя в 360 кД 360. иД 400 кД

присутствии ионов кадмия

гель-электрофорез с ДСН, 360 кД 360 кД 400 кД

но без 2-меркаптоэтанола (

то яа с З-с-фнапгоэтанолоы ' ' 180 кД 180 «Д 205 кД

то из после трипсинизации 85 цД 85 кД 8. иД

у лектрическая'точка 4,75 4,80 4,60

! 1 КГ | АБГ \ РАРР-А

Влияние метиламина и протеиназ на + - +

электрофоретическую подвижность

Количество внутренних тиоэфиров 4 2 4

Реакции с аффлнантами:

эстрон + +4- ++

холестерин - - - ■

тестостерон + - -

прогестерон - - -

трипсин +++ +++ +4+

тромбин + ++'+ +++

плазмин + +4 4- +++

«лсстридиопвптидаза А ++ ++ ++

тестикулярнал гиалуронидаза - - -

рибонуклеаза А - - -

конханавалин А +++ +4 + +++

лектпн арахиса - - -

фитогекагглэтитш +++ +++ +++

лектин сои - - ' -

лентнн проростков пшэннцы - - -

лектин бобовника анагпдролистого + + +

Ипгибирование активности протеиназ +4 + + 4 + +44

Пнгибировыше активности РНК,,., и * с1о _

ЯШ " пз е*

Ингибирование активности - - -

.'¡■П'идрогеназ

Пс^сичшн: - - отсутствие ракцпи, +++ - какск кальная рс2к1!ип

Из её данных следует, что аминокислотный состав изучаемых wob ьесьыа сходен. Это неудивительно, т;к. аминокислотная пос-;овательность субъединиц ИГ и АБГ совпадает на 6£$ ( запй и авт., 1985). Кроыэ того, наш показано, что молекулярная масса FP-A превосходит этот показатель для ЫГ преимущественно за счет лыаэй гликозилированности. Структура де молекул исследуемых бел в практически идентична. Так, основным структурообразующим эле-итом является субъединица о молекулярной массой 180 кД (!1Г и Г) или 205 кД (РАРР-А). Две субъединицы образуют димер при по-ци межцепочечных дисульфидных связей, т.к. димеры распадаются субъединиц лишь после восстановления 2-меркаптоэтанолом, С их позиций АБГ представляет собой именно такой димер идентич-х субъединиц. ЫГ и РАРР-А имеют ещё более сложное строение - их «но рассматривать как димеры димеров, т.е. тетрамеры идентичных бъединиц. Каждый димер связан меяду собой нековалентно, т.к. я разрушения тетрамера достаточно обработки мочевиной или до-¡¡илсульфатсм натрия. Есть основания считать, что тетрамерные руктуры стабилизируется ионами металлов. В пользу этого свиде-льствует высокий аффинитет данных белков к хелирующим соединены типа иминодиуксрснокислсй агарозы, наличие металлов в их ставэ и распаданиэ на димевд в присутствии ионов кадмия.

Ссгз три белка обладают высоким аффинитетом к протеиназам, из и другим ферментам. Они способны ингибировать широкий круг отеолитичзских формантов, таких как плазмин, тромбин, трипсин, мотрипог.н, оластазу гранулоци>ов, клсстридиопептидазу А (кол-геназу), суб^ллизнн, папаш и др. Следовательно, их модно рас-атривать как неспецифнческие ингибиторы протеинаэ. По сов, ;мен-u ' редставлениям )«Г человека связывавт протеиназы на основе овущечной" модели (Веремеенко и соавт., 1968). В этой случае

9

г

фермент лизирует пептидную цепочку - участок "приманки" и проваливается в "лов.\*шку" - полость внутри каждой из субъединиц, где прочно фиксируется. При этом связанный фермент утрачивает лизи-рующие свойства по отношению к белкам, но сохраняет Их в отношении низкомолекулярных синтетических субстратов. Следует указать, что в этом случае фермент становится недоступен для относительнс низкомолекулярных ингибиторов, таких как соевый ингибитор трипе? на. Па основании указанных свойств предлагается не рассматривать КГ в качестве истинного ингибитора протеиназ, а выделить в Отдо; ную группу пространственных ограничителей - рестрикторов.

Нами показано, что механизму "ловушечной" модели отвечают ингибирувщие свойства всех трех исследуемых белков.' Это дполни-тельно доказывается и совершенно независимыми катодами. В частности, после реакции с первичными аминами и протеиназами увеличу вается подвижность {.1Г н РАРР-Д в полиакрилакидном геле, хотя их истинная молекулярная касса при образовании комплексов возрастает. Кроне того, в каждой субъединицэ высвобождается по внутренне му тиоловому эфиру, которые в нативном белке не выявляется при

титровании сульфгидрилышх. групп реактивом Эллмана. Следователь-« *

но, тетрамерниз белки при указанных реакциях конформационно уплотняются с экспрессией структур, скрытых внутри нативных молек} У АБГ, являющегося динаром, наблюдается лишь экспрессия внутренних тиоловнх эфмров. Считается, что конформационно уплотненные мол?кулц НГ приобретает русокий аффинитет к мзыбраиам различных клеток, где имеются соотготствующие рецепторы, и имеют,, перяод пс "уекпедсния из снсте:<ы кровообращения не сбыиэ 2-3 илнут. Такие репепторн известны пока лишь на мембранах гепатоцитов, фиброблас гев и гг'нгцптов-кгрс^'гов. Нами показано, что нативные кэлакуль :тг п.'г^х?' ^ белков по у-.тут присоединяться к ке!!бр£нал перифеуч-

веских моионуклеарных клеток крови. Однако, после трансформирующего воздействия вестерно-бЗюттинг позволяет обнаружить в составе имбран белки 1 обладающие аффинитетом к макроглобулинаа. Интерес-10, что для КГ, АБГ и РАРР-А Тшептся индивидуальные белки-аффинан-гы. По-видимому, они и являются рецепторами для прикрепления тран-зформированных макроглобулинов и их наличие необходимо для элими-1ации указанных белков из плазмы крови. Во всякой случае, наши результаты позволяют объяснить.причину поступления 1С?? комплекса iT-трипоин в клетки крови (aiiemann и соавт., 1^88). С другой зтороны, предполагаемые рецепторы на поверхности, клеток крови яв-ю отличаются от рецепторов гепатоцитов и фибробластов, за которые комплексы ИГ и АБГ с протеиназаыи могут конкурировать ; Jfeldman , .М-вао , 1986). Таким образом, нативкыа ИГ, АБГ и 'АРР-А, циркулирующие в составе плазмы крови, отражают преимуще-зтвенно резерв ингибиторов протеиназ, а также иных аффинантов, тогда как эти же белки, конформационно перестроенные при реакции з различными аффинантами, бистро выводятся из системы кровообращения, присоединяясь к мембранам различных- клеток. Естественно 1редполагать, что именно таким образом организм освобождается от (збытка протеиназ (Веремеенко и "соавт., 1988). Однако, не исклю-

шно, что именно таким путем может осуществляться гуморальная ре' ч

?уляция функций различию клеток, в том числе и иммунокомпетентных.

Провэдениоо исследование показало Еиоокую гомологию состава, ¡труктурм и ряда функций всех трзх изучаемых белков. Ранее говорилось лишь гомологичности КГ а АБГ ( и соавт,, J9S5), Те-1ерь яэ появлюсь основания утверждать о наличии в ррггнизмо чз-юЕэяа группы из езнза, чем кз трзх белков, которые целесоИразно тмэновать в дальнейшем макроглобулинами.

Иммунологические свойства МГ, АБГ и РЛРР-А человека

Для суждения о возможных иммунорегуляторшх свойствах изучаемых белков необходимо установить их содержание в организма, поскольку имеющиеся в литературе данные по этому вопросу достаточно разноречивы. Причины разночтений кроются как в несопоставимости методических подходов, так и'отсутствии диагностикумов, пригодных для изучения малых концентраций макроглобулинов. Нам удалось провести это исследование на основе идентичных аналитических систем.

Концентрация МГ в сыворотка крови мужчин и шбеременных женщин достаточно существенны и почти.идентичны: 1,61+0,10 и 1,79+0,14 г/л. Содержание же АБГ в сыворотке крови кенщки (0,021+0,004 г/л) значительно выше, чем у мужчин (0,009+0,003 г/л). Концентрации РАРР-А в сыворотке крови минимальны, но у женщин (0,032+0,04 мкг/л) они вновь выше, чем у цужчии (0,020+ 0,004 мкг/л). При беременности концентрация 13* возрастает в 1,5 рапа в течение первого триместра, а затем остается на относительно стабильном уровне до родов. Увеличение концентраций АБГ и PAFP-A при беременности идет значительно интенсивнее. Так, содержание АБГ в енворотко крови достигает к началу III триместра I г/л, затем стабилизируется, а перед родами снижается на 20л. Концентрация РАРР-А нарастает до 33-35 недели беременности (до (¡,2 г/л), о затем несколько снижается. После родов уровень изу-чкгих белков нормализуется ь течение 5-8 недель. Проделанная р; бот", показала, что у щщян и небероконных яенщин концентрация КГ пн-читнльно превосходит общее содержание АБГ и РАР^-А. Следо-импмю, для. реализация равнопэншх по масштабу ш.я.унорегулятор-»■.:« г'нкциП ДЕТ и РАРР-А должны бить в десятки раз более мощнцми

.•••>-. hi игдуляюргки, чз!1 Я". В противном случае ИГ следуот пряэ-

t

ь'..! tv-»i.>iiiLw агентом в этом семзйства бзлков длл

«уячин и неберемгншх яенщин.

Второй вопрос, который было необходимо решить до непосредст-зенного анализа иымунорегуляторных свойств макроглобулинов - это 1роблеыа биосинтеза самих исследуемых белков в идаунокомпетентных слетках, а также выявить факторы, влияющие на их биосинтез. На ¡егодня отсутствие надежных иимунодиагностикумов не позволяло од-юзначно ответить на этот вопрос, особенно в отношении АВГ и РАРР-А 1ри помощи культуральной техники и твердофазного иммуноферментно-'о анализа нам удалось выяснить, что периферические мононуклеар-[ыэ клетки крови могут синтезировать все три белка. При этом кон-(ентрация ЦТ и РАРР-А в супернатантах культур 'клеток крови муж-шн и небеременных женщин достаточно существенна (30-150 нг/мл), 'огда как в случае АБГ она не превышает 3-10 нг/мл. Существенных ¡азличий, в" зависимости от пола обследуемых, не было выявлено, [ри беременности способность мононуклеаров синтезировать макрог'ло-¡улины хорошо согласуется с динамикой их концентраций в сыворотке :рови. Гак, максимальный биосинтез КГ (свишэ 200 нг/мл) наблюдает-я в I триместре, АБГ (более 10 нг/мл) - во втором, а РАРР-А (бо-ее 100 нг/мл) - в III триместре беременности. Следовательно, био-интез макроглоб;'линов в клетках крови в определенной мера может пределять увеличение их концентрации в плазма крлви при беремен-ooTÜ.'

До настоящего времзни определйющим является мнение о стиыу-ирущсм действи" эстрогенов на биосинте ^акроглобуяинов. Действи-

ч" , <

ельно, при приеме эстрогенов концентрации макроглобулинов, осо-енно АЕГ, в пКазмэ кроги возрастают и в определенных условиях осткгаат величин, характерных для беременности (Митрофанов и саь.., IS90). Однако, нам удалось показать, что природные стерои-нпз пологие гормоны (эстрон, эстрадиол, эстрнол, прогестерон и астсстзрон) в физиологических и избыточных дозах не оказывают

влияния на биосинтез макроглобулинов в культурах периферических мононуклеаррых клеток крови мужчин, а также небереиенных женщин. Аналогичные данные получены по отношении к синтезу КГ и' у беременных. Однако, биосинтез АБГ достоверно возрастал под действием изучаемых гормонов во II триместре (свыше 30 нг/цл), а РАРР-А - в III триместре беременности (более 150 нг/мл). Следовательно,, стероид-.

ные половые гормоны не следует рассматривать в качестве прямых стимуляторов биосинтеза макроглобулинов. Скорее всего, клетки крови должны быть подготовлены для восприятия эстрогенов как стимуляторов, подобно тому, как это происходит при беременности. Сле-,,. довательно, проблема стимуляции биосинтеза макроглобулинов в организме представляется более сложной, чем она казалась до нодав-него времени.

Нативные п{юпараты иакроглобулинов практически нэ влияют на спонтанную или штоген-индуциров&нную пролиферации моноцуклоаров (рис.1).

Г;

( •

Ä«

M.L

Рис Л. Прол^ерчтнгнуй стсот ионспуклеагоз на С ГА б прлгутетЕ;;«;

в

гстиспого (!,:Гн) к модифицированного (IT) алЦа.,-кадроглсбулинз."

Слнрко, при трансформации они приобретает варалсеншэ кмууносуп-ггссискк- cicüsvbs, особенно по отноизниз к Т-ли>:{оцнтги. При®

этом подавляется как спонтанная так и индуцированная митогенами пролиферация мононуклеаров (рис.2).

со 80 13

в <

3 3 I

та/тя НО'

ь

I

'Ä.

1.

foü йаЗ ЙЙЭ Зй

I j* м» . im т-жм в-ы |

Ряс.2. Влияние IT и АБГ на спонтанную (А) и индуцированную

митогенсм лако.чоса (Б) пролиферации мононуклеаров (Mi), а также Т- я В-лимфоцитов

Отчетливо зсгзтно, что пролиферация Т-лимфоцитов подавляется в значительно большей степспи, чем у В-клсток. Следует сразу жя уточнить, что способность l'i отвечать на пролиферативный стимул достаточно индивидуальна. У мужчин она dleiq, чем у небореиенннх яенщин, пре?осходлщ:!х по этой способности беременных. При берэ-"-.пжости пролифэративнчЯ ответ ГЛ наксииалси во II триместре и • tcttnn#unn з III тржгстрз, т.о. ответ Щ на пролифвратизмый стимул обратно прспорционмон кснцентрации АБГ в сыворотко крови, нп нэ согласуйся с д::и£м:коЗ концентраций !Г и РАРР-А. Визсизлоден-нсз морзао согласуется-со способностью изучаем« белков угнптать

ГЛ. Тал, к2луисаупрссо:ц;п:Л сффскт 'Т н^-.бспуз гмра-:ic:; у i:jCep:::s;.iax zsizgat st 2 2 ч ¿-зрсьюшюсти, тогл* кяк

для ЛГ-Г ото :;ар:ктср!;о в I—II трпг:зстр::х, а для РЛРГ-Л - во пто-ро" пс.-ог::т бэрп-саиссп. Нулю уиозать, что о III тримэолро бо-р;;::тюз7Л, гсогд! споссб:;ссуь отгеччть на стимулmcra г![.<.;:-,< р,-ц.'.' сто.г? v.vr.o v.:'.упссуиресси пчсз доЯстеи"

к

дуемых белков. •

Особое значение имеет доза макроглобулинов, необходимая для отчетливого обнаружения супрессии..Наиболее мощным иммуносупрес-сантом проявил себя АБГ, который подавляет пролиферацию Ш начиная с концентрации 2-5 нкг/ыл, для МГ пороговая доза значительно выше (более 25 мкг/мл), а для РАРР-А достигает еще больших значений (до 100 мкг/мл). Следует сказать, что пороговая доза супрессо-ров возрастает в ряду: мужчины, небереыенныа и беременные женщины. Здесь мы видим прямую взаимосвязь с концентрацией (суммарной) цак-роглобулинов в плазме крови, которая возрастает в том же ряду. Исходя из вышеизложенного, легко установить, что основным супрес-

г

сором этой группы белков у мужчин и небеременных женщин является ИГ, т.к. маловероятно, что большая часть циркулирующего АБГ находится в трансформированной форме. Следовательно, иммуносупрессив-ные сьойства АБГ и ¡РАРР-А вне беременности могут реализовываться только локально при их накоплении до пороговых доз. Во время беременности наращивание супрессорного потенциала несомненно реализуется за счет биосинтеза. АБГ и РАРР-А, поскольку биосиниз МГ достигает максимума в I триместра.

Учитывая высокий аффинитет макроглобулинов к митогешшм лек-тинам, ш предположили,'что связывание ыитогена и ыоает быть причиной недостаточной проли^аративной стимуляции. В параллельных серия« опытов ш провели преинкубацио JJC с митогенаци, а лищь еатем ьвелк в реакции макрогло(5 улицы, Оказалось, рта в этом случае и прц одновременной ипсуба^ци лзктинов о ыакроглобулинами результа-тц практически' идзнтични?\Тш:им образом, изучаемые белки способны оказывав вырагенное вл:;шше на клеточное звено иммунитета.

Хьр; терно и влияние ыакрогЬобулинов на гуморальное звено («щунитега (рис.З).

Рнс.З. Влилниэ !Т и АЕГ на секрецию иммуноглобулинов мононуклеаряии

Отчетливо видю, что оба белка стимулируют секрецию т.ауноглобу-линов в культурах !"{. Однако, как и в случае с пролиферацией ПС, решающее яначенио имеет источник культивируем« клеток. В частности, спонтзши:!! биосинтез 13М у всех обследуемых вполнч сопоставим, а секреция х^а существенно различается. Имеет суцастиеп-ноо значение и конформация изучаемых белков, поскольку лигаь тргип формфОЕакицз фор:.:и 1!Г и АБГ способны увеличивать секрецию антител. В то яэ время, РАБР-А, независимо от его конформчции, но влияет на биосинтез т<муноглсбулинов.

Наиболее ксц.чым индуктором внтителсгенеяп являете! /чТ, существенно превосходп-чЯ по ото;«у показателя При зте:' I п г большей степени влияет на продукцию , чец 1еа. У ион цин способность отвечать на действие АБГ сим газом почти идентична, за исшточогяси II трг?.'зстра бергмекности. ;Г усилагчст про ДУХШ'Л ккмуног.'.олулвиов П ."ого К.1".сса в бО.Н-Я:;Г| с7«1!< »11 у Н'ч'г-; '!-1»-3!'к!1х, чем у 6>>г»!,3|:ш1х "с!г;ч1|. В пл01к} уеи.тася'с^кр'иин» 1,'/1

оба белка довольно сходны, за исключением.I и III триместров беременности, когда стимулирующие свойства у АБГ более существенно виракены.

Стимуляция продукции иммуноглобулинов в культурах Ш прямо-пропорциональна, концентрации макроглобулинов, введенных в культур ральную среду. Интересно, что пороговая доза МГ (0,2-0,3 ыг/ыл) может считаться ({иэиологической для воех обследованных. Она аналогична и для АБГ, но такие концентрации этого белка в плазме кро ви наблюдаются лидь при беременности.

Проведанное нами исследование подтвердило представления о существенной роли макроглобулинов в регуляции активности 1шиунног1 системы. Однако, наши предшественники использовали для.этих целей плохо очищенные от примесей препараты макроглобулинов и не учиты" вали их конформацию. Тем не менее, полученные данные свидетельств ьуют о многообразном и практически всестороннем влиянии на оистеА му иммунитета. Нативные МГ, АБГ и РАРР-А контролируют все реакций ревизующиеся через протеолиз, например, систему комплемента. Oid способна связывать и транспортировать лимфокины, в частности, иня терлейкины. Свойства трансформированных макроглобулинов.излоаени вше. Кроме того, известно, что АБГ продляет сроки приживления af* тигенно несовместимых трансплантатов, блокирует подвижность макрб фагов и функции фагоцитов ( Hiaobopb. , 1990). Удаление его из алазмы крови беременных $енцин на 80? снижает её иклуносупресоив-ниа свойства ( et-*ascri, i960). Нами недавно установлено, что мак роглоОудшш ыогу? связываться с балкам;! i зкбран стафилококков других бактерий (Зорин и роавт., 1990). Не исключало, что такни путем иог.ат идти презентация бактериальных антигенов иг;.уиокомпе-tsuvjusi клеткам. В то ко вреця, иг^юрэгуй.яторшз свойству улу-г чаа1ых ослков далзко нз равноценны. Наиболее моцнца из них яг;ля-1Лои АБГ, не его свойства вна беременности могут реалязошиаться

лишь локально, но не на уровне всего организма. Иммунорегулятор-ные свойства РАРР-А судя по всему имеют значение лишь во второй половине беременности. В остальных случаях главным иммуномодуля-торсм семейства макроглобулинов является КГ.

Аналоги макроглобу^инов человека у животных

Вышеописанная схема (фракционирования плазмы крови была применена наки и для зыделения аналоговых белков из биоматериалов животного происхождения. Однако, в дальнейшем её пришлось несколько изменить применительно к решаемы)! задачам. Сходные с FAPP-A человека удалось получить лишь из плазмы крови беременных санок млекопитающих. При использовании цинк-хелатной аффинной хро-катографии хорошо разделялись парные КГ больней части животных, но из аналоги АБГ. Последние не были полусны в члетом вида и их свойства оценивались на основе шлмунохимичзского анализа.

Белки, сходные с № человека были найдены во всех биоматериалах животного происхождения. У многих кивотпых найден« по два таких белка. По одаоь^ представителя НГ было лнвь у кшей, морских свинок, довдевого червя, рачки-гатларуса к кенара-дергуна. Все выделенные КГ животных имели сходную относительную молекулярную массу - около 720-730 кД (рис.4). D присутствии додешмсульфзта натрия, но без восстановления 2-изркаптозтанолог4, IT йивотнух распадаются на дакерц равноЛ молекулярной массы. Аналогичное лпленио происходит при гвль-хрематограф'ш в присутстг;;и мечаынл ;;лп ионор кадкия. Однако, посла восстановления 2-м<>рягптсптг:иолои удается обнаружить определенна различия в структура пар;;;;;; IT. Один из них, подобно LT человека, состоит из 4 ид(.-нтпч!п;х субгодинип с .вдлекулярмс»". кассой около ICO кД. В друге... ;;рс«-с mío." субгздаиици обнаружены пол.!пеитидш:з ц-лш с К':.лс::уллр!!нш иг/.- ";;

в V т в

I 1. ' " 11

Рис: .4. Электрофорез макроглобулинов в полиакриламидном голе с додоцилсульфатом натрия

Пи1инснии: 1-7 - маркеры молекулярной массы (в кД) - I - ферри-тин (440), 2 - ИГ человека (160), 3 - фосфорилаза Б (94), 4| - бычий сивороточний альбумин (67), б - оваль-Оуыин (45), 6 - соевый ингибитор трипсина (23), 7 -цитохром С (14); Ь!Г: 8, 12 - серебряного карася, 9, 13 - дождевого червя, 10, 14 - рачвд гаыаруса, II, 16 - комара-дергуна. Материал 1-И восстановлен 2-меркаптоатаноло^, а |2-15 - без такой обработки.

околи и '3& кД, образующиеся за счет разрыва дасульфидной свд-зи и ¡шиОолее крупной субьедшища. Различия в состава парных иак-ри'ЛоОулпнив при атом миуиыалыш. "

МГ яивог>"ис являются гликопротеинада, 9,5-11,9,2 углеводов. Г.остьв углеводного компонента типич^л - моносахариды (глюкоза, ииинщш, галактоза), аминосахара, фукоза и сиаловце кислоты, очлношений и^яду ними довольно (сходни, независимо от структуры. Изо гички МГ животных укладывается в диапазона рН от 4,4 до 4,9.

ИГ животных однозначно проявгяют свойства ингибиторов про-теиназ, однако парный МГ, отличный по структуре от МГ человека, обладает почти вдвое меньшей ингибирующей активностьо. Реакции обоих типов МГ с ферменташ: полностью согласится с положениями о "ловушечноП" модели. Захваченный в "ловушку" фермент лишается протеиназных свойств, но сохраняет эстеразные, т.е. способность расцеплять низгсомолекулярныз синтетические субстраты. Кроме того,

"ловуска" зшцищаат захваченный энзим от ингибируюцего действия »

соевого ингибитора трипсина. Аффинитет КГ животных к протеиназям варьирует от I до 2 М/Н. '

Присоединение протеиназ или первичных а»жнов приводит к экспрессии А внутренних ти'олъпых эмиров на молекулу белка, т.е. по одно?,у тиоэ^иру на гмядуп "ловушку". Факт конформационного уплотнения молекул 1Т подтверждается уЕвличениги злектро<}оретичеекой подвижности трансфзрмлровгннкх белков в почиакриламиднсм геле. Аналогично '¿Г человека псе пивотних являются неспецифмескич:! ингибиторами протеиназ и по широте спектра присоединяемых <{ормен-тов практически нэ различается.

3 сыворотке крови или гзколккфо большей, чссти животных оба типа парных представлены з практически равноценных количествах, У жлгл и морской свинки имеется единственний ¡.Г, отличный по структуре от !Т человека. У крас не гарный 'Г, аналогичный челопачес-ксну, интенсивно синтезируется лишь при беременности или остром вослолан:«. У птиц и рыб оба типа !.Т циркулируют разд^лын: структурно аналогичный IX чело пика - в крови, а структурно отлшпмЯ -в белке яиц или икрз. Таким образе», ИГ г'ипопчгх «о и«,;г".м согпч-даят с !Т '¡елс.вха по соотлгу, структуре и сео.'<?|т<~ст/'м ропкп-П с прстеолотмчсскет'Я ф»р«2нтч:з1. Однако, ото "ч-э гч .".й<:т дс<л

удалось решить с помощью иымунохимического анализа (рис.5),

гп . о <У~

oQ j ■Уь оЬ

I. . ...„ £ . .

I iCL& са£> QX>

Рис.Ь. Реакции антигенной идентичности макроглобудинов человека и животных

Пояснения; кроличья антисыворотка против белков сыворотки крови -I - крысы, 2 - барана, 3 - лошади, 4 - против ИГ человека, б - мыши, б - морской свинки. В центральных лунках Ш1: а - человека, б - крщсы, в - мыши, г - морской свинку, д - коровы, е г лошади, к - белка куриного яйца,'з - икры окуня, и - икры плотвы.

Опасалось, что большая часть ЫГ нивотных в большей или меньшей степени антигешю идентична с ИТ человека. С другой стороны, ан-тигенно неидентичныэ парные Ж1 животных зачастую демонстрируют реакции антигенной идентичности с 1!Г человека, Эволюциокно древние группы.кивотных - ракообразные, рыбц - слабо, но практически одинаково реагируют с антисыворотками против всех иных кивотных, Вероятно, эти наиболее дрерние представители МГ, отражают наиболее статичные р эволюционном плане черти строения антигенных детерминант и цолекул изучаемых белков, И'» дальнейшие этапах эволюции наблюдается определенна^ диЭДеронциацущ антигенной идентичное IU, Наиболее высокий уровень её прослеживается в группах; мышь-крыса, «орова-лошадь-овца, рыбы и т.д. Между 1!Г животных, принад-леяа-ции к различным семействам, антигенные различия, как правило,

возрастают. Наиболее же резки они между парными МГ внутри отдельных видов. С другой стороны, МГ животных и человека не дают реакций антигенной идентшшости с АБГ, РАРР-А и иными белками плазмы крови. Все это дает основания считать ЦТ одним из древнейших и эволюционно консервативных белков животного мира.

Аналоги АБГ били обнаружены нами в организма млекопитающих, но не найдены у других животных. Высокий уровень антигенной идентичности характерен для АБГ человека, копытных и собак, но значительно более слабый для АБГ человека и грызунов. Следовательно эволюционная дифференциация АБГ зашла значительно дальше, чем у МГ. Искомые аналоги были обнаружены нами в небольших количествах у небеременннх самок и значительно больших - при беременности. Следовательно, и у животных изучаемый белок ассоциирован с беременностью.

Молекулярная масса АБГ собак и копытных составляет около 360 кД, а у грызунов она вдвое ниже. При электрофорезе в полиак-рмамиднсм гело с додецилсульф-атса натрия, но без меркаптозтанола молекулярная масса аналогов АБГ не изменяется. Не влияет на неё и гель-хрсматографмя в присутствии ионов магния. Восстановление 2-меркаптоэтпнолом высвобождает"идентичные по массе субъединицы молекул АБГ копытных и собак, но не влияет на молекулы АБГ грызунов. Следовательно, первые построены идентично молекулам АБГ человека, т.е. представляют собой тикера идентичных субъэдиниц связанные дисульфидными связями, а вторые представляет собой отдельные субъединицы белка. Все АБГ грызунов проявляют спредеяонт'Я аффинитет к иммобилизованным протеиназан, но не реагирую:' с тести иулпрноЗ пшлурснидазоП или рибонуклеазоП. Это дзот основания отнести аналоги АБГ к неспецифическнм ангкСиторам протейная, спя-зукцик ферменты на основе "ловуаечноП" «одели.

Белки, сходные с РАРР-А, удалось ролучить лишь из плазмы |ц.иьи беременных саьок млекопитающих. Уровень антигенной идентич-Hiuüii их и РАРР-А чаловека весьма невелик. Перекрестные реакции .удалось обнаружить лишь при сочетании иммунодиф{узии с икиунофер-Luüii'HUM анализом, да и то лишь при использовании ьффшшо о чищен-пил антител, меченных коллоидным золотом, с усилением четкости нрецииититов ионами серебра. Следовательно, аналоги РАРР-А отно-ciriiiH к белкам с высокой дифференциацией антигенных характеристик.

Относительна« молекулярная масса аналогов РАРР-А та же, что и у РАРР-А человека - около В00 кД. Ыолекулы белков представляет

' Л I

оооий татрамарц идентичных субъединиц, где мономеры связаны з динара д^оульфиднымн связями, а два димера образуют тетраыер за счет оииаьй нсковалентной природы. Возможное участие ионов натаяно- . стабилцзации^гетрамерних молекул подтверждается результатами 1-е;il-хроматографии с ионами кадмия, который разлагает белки до ц1Ы'.|.оь. Ьса изучаемы« белки проявляют активность неопецифических mu'iion'1'сров протеиназ, функционирующих на основа "ловушечной" ио-,цзл|'. Кик н аналоги АБГ, аналоги РАРР-А демонстрируют свойства Облиои, ассоциированных q беременностью.

11ридели|шая работа позволила установить, что в организме жи-ьо1 пил имеется белки, аналогичные по составу, структуре, фушшио-iiüiii-iiuM свойствам и антигенной идентичности ИГ, АБГ и РАРР-А че-лошки. Однако, дл(1 более детальной проверки аналогичности их функций Оил проведен ряд акспориментоц на* красах.

Влияние беременности, острого воспаления, стероидных

половых гормонов и саркомы Плисса на распределение МГ i: ЛБГ в организме ярче

R качестве обтерта работы били избрпни самки кшс, поскольку у самцов наличие аналога АБГ в орпнивме но удалось обнаружит' .

У нсбрремешшх самок f,íT относительно равномерно распределен в тканях, хотя его насколько боляще в легких, матке и лимфоузлах кйиечника. Нппротив, АБГ удалось обнаружить лит.ь в системе кровообращения, легких, катке, яичниках и почках. Беременность рнзы-пгпт почти двухкратной увеличение концентрации МГ в синоргткн кро -ва, i такяе достоверное снижение его содержания п почках, селезенки и лимфоузлах. Для ЛБГ rse характерен резкий прирост содерхп-ння почти во всех тисчих, не говоря уде о емчоротке крови. Особенно г.начительно возрастает концентрация АБГ в мптке и почкпх ( п 6-8 рчз), л тока о п сыпоротко крови (в 7,5 раз). Белок удчмтсм обнаружить де.-»« а тех тканях, где у непременных крыс его и« удп-рзяось обнаружить.

Для изучения действия стероидных пояорчх гормонов ирмспм вцутржаюглго г годами 17ч5ота-ястр8диол из расчета 100 мкт*/ IG0 г r.uooro сога. Спустя I, 3 и 7 суток после введения гормона жнеипмх декяннтирорпли под ojtip-nsi ипркозои. Иихо'пшп гпргонв приводила к спустскениг) тканевого пула f.T и увеличении i*ro коч-ц£НТ'р5Ц!1и В Cl'BOpOTPO крови. Через сутки особенно речи:-' ' H.'t'MH» концентрация 'Г маблгздолось в легких, пятко и янчннклх, ü ■!'.-! и iy нг-блидениЯ конце итрятя !.Т и сыворотке крови ^pctjt-mw я onywawixe тег.:: ;r'vo пула усугубляч-сь до ir¡ сд «ы. u ir ,»ч>м. Следует укагить, что зтот процесс прякт."1"с!'м не :»ятрпгг< ¡-ч •;«•• гп-г;;г;:у, лиг'суоли и к^ччнак. По-иид;'1-.у/, :¡ с,' '¡>':i '., ¡'

Г.'.у тиэиогпх пули !1Г, един из котсрык '¡tP-<4' г. о'.-т.-чтЛ :<¡- - г..-"Ч'>-

щения, а второй - с лимфоидными тканями. Высокая молекулярная масса препятствует переносу ЫГ из одного тканевого пула в другой, вследствие чего элиминирующее действие эс.традиола не затрагивает лимфатический пул. Через сутки после инъекции гормона концентрация АБГ в организме крыс повсеместно возрастает, подобно тому, как это происходит при беременности. Отличие состоит в значительно меньшем росте его содержания в матке, чем при беременности. В последующий период концентрация белка постепенно снижается, но остается к концу наблюдений достаточно высокой в печени, почках и сыворотке крови. Следовательно, эстрадиол способен резко и быстро повысить содержание АБГ в организма крыс, что несомненно связано с активацией биосинтеза этого белка.

Острое воспаление, вызванное внутри.мыиечным введением терпентина, также вызывает опустошение тканевых пулов Ь!Г. Первоначально оно затрагивает лишь отдельные органы, а к концу наблюдений приобретает тотальный характер. Из тканей белок поступает в кровеносную систему, где его концентрация удваивается. Аналогичные, но ещё более глубокие изменения происходят с АБГ. На завершающем этапе наблюдений белок удается обнаружить лишь в система кровообращения, тогда как тканевой пул полностью расходуется. Подобные изменения нельзя трактовать иначе как расходование ингибиторов на элиминацию протеиназ, выделяющихся из очага воспаления. Запасы АБГ в организме невелики, поэтому его тканевой пул исчерпывается в первую ^чередь,- тогда как запасы МГ лишь существенно сокращаются.

Наиболее существенны изменения концентраций исследуемых белков при саркоме Плисса (табл.2). В этом случае истощение тканевого' пули ИГ лиходит особенно далеко, а его содержание в сыворотка кроъи сниашотсп. Напротив, концентрация АБГ в организме достига-I маьоныалыю известных нам величин. Отчетливо прослеживается

Таблица 2

Распределение МГ.и АБГ в организме крыс при саркоме Плисса

-----и-

МГ АБГ

1 коми ' контроль саркома контроль саркома

Легкие 7,17+0,21 1,70+0,33 13,8+3,5 568,0+47,9

Печень 1,99+0,48 0,63+0,31 нет 177,0+50,2

Лимфоузлы 5,34+1,73 1,34+0,43 нет 206,7+47,0

Селезенка 2,55+0,53 0,58+0,21 нет 62,0+23,0

Здоровая ткань - 0,20+0,06 - 177,0+39,0

Пограничная зона - 0,23+0,06 - 127,8+58,1

Опухоль - 0,49+0,08 - 113,6+28,7

Сыворотка крови 2,87+0,45 2,03+0,47 20,1+6,5 519,0+76,4

Пояснения: для МГ концентрация выражена в мг/г ткани или г/л, а для АБГ - в Е/г и Е/мл, где 100 Е - содержание белка в сыворотке крови беременных крыс.

накопление МГ в опухоли, а АБГ - в контактирующих с ной морфологически интактных тканях.

ВОЗ!,ЮЖНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СЕМЕЙСТВА МАКРОГЛСБУЛИНСВ

Результаты данной работы свидетельствуют о высоком уровне сходства всех изучаемых белков по состэпу, структуре и выполняемым функциям. Насколько же целесообразно это дублирование с точки прения биологической целесообразности? Скорее всего, в нормальных ус.топиял для реализации известных нам функций достаточно одного МГ или дп.уу парных ¡¿Г у кипотны!'. При беременности него уже ш'но недостаточно как с полиций регуляции гоиеостг.'П, т->к и кучунобиел^гичсскаг мчимс.тнсхеииЯ а оксти»? ы;-т\>-пя'н:гнт'.-г.~г::.

Активация биосинтеза АБГ и РАРР-А с этих познай вполне адекатна для нормализации возникающих процессов дискоординации. Это подтверждается возникновением спонтанных выкидышей у женщин с низкими концентрациями данных белков в плазме крови. Такое развитие событий приводит к достоянному наращиванию антипротеиназного и имму-норегуляторного потенциала в плазме крови беременных женщин, продолжающемуся ' почти до момента родов. Реологические свойства крови вряд ли могут быть существенно изменены, поэтому указанный потенциал наращивается меньшими количествами белков, но они обладают значительно большим иммунорегуляторным потенциалом, чем 1!Г. Этим фактором и является АБГ, при достижении которым максимального уровня биосинтеза возрастает роль наиболее слабого регулятора -РАРР-А. Следовательно, наличие трех белков со сходными функциями необходимо для придания иммунобиологическим реакциям в организме большей стабильности и адекватному реагированию на изменения интенсивности этих реакций.

В свете результатов работы проблема иммунобиологии беременности тесно смыкается с проблемой злокачественных новообразований Не касаясь причин возникновения злокачественных новообразований, можно .полагать, что здесь реализуются механизмы, сходные с теки, что имеют место при беременности, но они уже направлены на защиту растущих опухолей. Общеизвестно, что этот процесс приводит к разрушению тканей, контактирующих с опухолями. В удалении продуктов распада, в том числе протеиназ, принимают участие и изучаемые нами белки. В процессе связывания аффинантов они трансформируются и приобретают способность присоединяться к имцунокомпетентным клеткам. В результате развивается мощная супрессия, нарастающая пропорцп надьно увеличению мессЬ опухоли. В итоге возможности биосинтеза ЫГ в организме становятся недостаточными для удаления про-

дуктов распада и для поддержания антипротеазного потенциала активируется биосинтез АБГ. Это подтверждается увеличением концентрации ЛБГ в сыворотке крови больных с практически всеми известными разновидностями злокачественных опухолей (Зорин, Зорина, 1988), которое эквивалентно росту ма*сы опухоли. Полученные данные позволяют предполагать, что такое усиление антипротеазного потенциала лишь усугубляет ситуацию, т.к. иммуносупрессивная активность АБГ значительно выше, чем у КГ. Пример такого переключения наблюдается при саркоме Плисса, когда организм животного буквально переполняется АБГ.

Известные на сегодняшний день данные о семействе макроглобулинов свидетельствуют о том, что оно возникло с появлением у жи-вотннх системы крог.о-линфообращения, т.е. глубокой древности. Есть основания полагать, что АБГ и РАРР-А появились лишь у млекопитающих путем трансформации генов, кодирующих биосинтез МГ. В пользу этого свидетельствует высокая степень сходства состава, структуры и функций всех трех основных его представителей. Возможно, это отражает более высокую степень адаптации млекопитающих к меняющимся условиям окружающей среды. Во всяком случае, семейство макроглобулинов играет значимую роль в современной биологии, и особенно - в иммунологии, где изучение его свойств, по сути дела, только начинается. Проделанная работа, естественно, не мотет ответить с исчерпывающей полнотой на все вопросы об иммунобиологической роли семейства иакроглсбулинов, но дает основания полагать, что дальнейшее изучение представителей этого уникального семейства белков позволит получить новые приоритетнее дсститтнил в области биологии, иммунологии, медицины, ветеринарии и многих иных специальностей.

выводы

1. Альф^-макроглобулин (МП, ассоциированный с беременностью протеин А (РАРР-А) и ассоциированный с беременностью альфа£-гликопротеин являются гликопротеинами плазмы крови человека > относительными молекулярными массами около 720, 820 и 360 кД. Первые два представляют собой тетрамеры, а АБГ - димер идентичных субъединиц, где две субъединицы образуют димер с помощью ковалентных связей, а два димера - тетрамер путем формиро вания связей нековалентной природы.

2. Все три белка относятся к неспецифическим ингибиторам протео-литических ферментов. Связанные ферменты лишаются активности протеиназ, но сохраняют способность к расщеплению низкомолеку лярных синтетических субстратов. При образовании комплексов с протеиназами 1|Г и РАРР-А приобретают более компактную структу ру, что выражается в увеличении электрофоретической подвижное ти в полиакриламидном геле. У всех трех белков при связывании протеиназ наблюдается экспрессия внутренних тиоловлх эфиров (по одному тиоэфиру на субъединицу). Сходные эффекты наблюдаются при реакции белков с первичными аминами или после ос ал; до ния сульфатом аммония.

3. Комплексы вышеуказанных ингибиторов с протеиназами или р первичными аминами приобретают способность связываться с белками рецептораь« на поверхности периферических мононуклеарных клеток, Каждый б. *ок иь;еет строго индивидуальный рецептор.

*1. Цативные ИГ, АБГ и РА^Р-А не проявляет имцунорегуляторных свой ств. Трансформированные белки обнаруживают иммуносуппрессивн^ю икти' юсть по отношению к сцонтанной или митоген-индуцирован-ной пролиферации лимфоцитов. Способность лимфоцитов отвечать

на пролиферативный стимул коррелирует с концентрацией исследуемых белков в плазме крови. Наиболее мощным супрессором является АБГ, активность которого проявляется при концентрации 1-2 мкг/мл, а самым слабым - РАРР-А, блокирующая активность которого соответствует концентрациям, характерным для второй половины беременности. На гуморальное звено иммунитета АБГ и МГ влияют путем стимуляции продукции иммуноглобулинов в культурах мононуклеарных клеток, причем, активность первого в качестве индуктора антителогенеза значительно выше, чем у второго. РАРР-А на влияет на биосинтез иммуноглобулинов.

б. Изучаемые белки способны реагировать с соответствующими специфическими рецепторами различных стрептококков. Все три белка имеют специфические поверхностные рецепторы у данных микроога-низмов.

6. В культурах периферических мононуклеарных клеток синтезируются ИГ, РАРР-А и АБГ. Биосинтез последнего проявляется в минимальной степени. Эстрогены активируют биосинтез АБГ в нульту-рах мононуклеаров беременных женщин, но не влияют на него в культурах этих клеток от мудчин и небеременных жонщии.

7. В организме животных обнаружено два аналога ЫГ чнловека, сходных с ним по углеводному составу и молекулярной массе. Один из них структурно идентичен МГ человека, а второй отличается наличием дополнительной дисульфид,той связи, вследствие чего его молекула состоит из 8 субъединиц. Кроме того, этот белок имоет меньшую ингибирующую активность по отношению к протеинаэпи. У человека, мыши, морской свинки, дождевого червя, рачкп-гампру-са и комара-дергуна обнаружено по одному представителю ЫГ, тогда как у других животных они представлен!) гомологичной пя[«й ингибиторов протеиназ, У крыс биосинтез бплкп, сходного с КГ

человека, ограничен и активируется при острей воспалительной реакции.

8. Аналоги АЕГ человека обнаружены лишь в плазме крови млекопитающих, У грызунов они представляют собой гликопротеины с относительной молекулярной массой около 180 кД, а у собак к копытных соответствуют димерам этих субъединиц. Они проявляют свойства ингибиторов протеиназ, причем аналоги АБГ у грызунов имеют самую слабую антипротеазную активность.

9. Белки со свойствами, аналогичными РАРР-А человека, выделены из плазмы крови беременных самок млекопитающих. Структура и свойства этих белков сходны с РАРР-А человека, у.е. они являются тетрамерами идентичных субъединнц, содсрхат около IE$ углеводов и обладают активностью ингибиторов протеиназ.

10. Острое воспаление, вызванное внутримышечным введением терпентина, вызывает Увеличение концентраций в плазма крови крыс аналогов МГ и АБГ за счет снижения их концентраций в тканевых депо. Наиболее быстро истощается тканевой пул аналога АБГ, тогда как для Ы1 характерно лишь определенное снижение его содержания в тканях. Напротив, при саркома Плисса исчерпывается тканевой пул ИГ на фоне накопления в организме аналога АБГ.

11. При беременности у крыс концентрация МГ в тканях снижается на фоне увеличения уровня этого белка в плазме крови. Содержание же аналога АБГ возрастает как в крови, так и в тканях. При внутримышечном введении эстрадиола неберемзнным самкам крыс вышеуказанные процесс?^ углубляются.

12. Сходство структуры и функций АБГ и РАРР-А человека и ни-вотны.. позволяет выделить эти белки в единое, эволюционно сформированное семейство макроглобулинов,

Список работ по теме диссертация

1. Сравнительный анализ содержания альф^-гликопротеина, связанного с беременность»), в сыворотке крови доноров (в соавт. с Р.М.Зориной) // Вопр.мед.химии. - 1381. - № 2. - С.229-232.

2. Сравнительный перекрестный иммуноэлектрофорез (в соавт. с Р.М.Зориной) // Лаб.дело. - 1981. - № 9. - С.555-557.

3. Сравнительный перекрестный аффиноиммунозлектрофорез (в соавт. с К.В.Фомиченко) // Иммунология. - 1982. - № 5. - С.84-86.

4. Иммунозлектрофоретический анализ рецепторов к лектинам в сывороточных иммуноглобулинах человека // ШЭИ. - 1983. - № 6. -С. 98-99.

5. Одновременное иглмунохимическое определение концентраций альфа2-гликопротеина, связанного с беременностью и трофобласти-ческого бета|-глобул!ша (в соавт. с Р.М.Зориной) // Лаб.дело. -1983. - № 7. - С.45-47.

6. Высокочувствительные варианты количественного иммунозлек-трофореза // Лаб.дело. - 1983. - № 10. - С.40-43.

7. Взаимодействие белков плазмы крови человека с гликоз-аминогликанами // Вопр.мед.химии. - 1983. '- № 5'. - С.41-43.

8. Белки беременности при неосложненЯоы течении гестацион-ного процесса и резус-конфликте (в соавт. с Р.М.Зориной, И.Е. Роткиной) // Акуш. и гинекол. - 1984. - $ 3. - С.35-37.

9. Иммунозлектрофоретический анализ реакций между гепарином и белками беременности (в соавт. с Р.II.Зориной) // Вопр.кед.химии. - 1984. - № 4. - С.26-28.

10. Обнаружение феномена связывания белков беременности с иммуноглобулинами иимунохимическиыи методами (в соавт. с Р.И.Зориной, И.Н.Голоеистикоеым, 0.А.Андреевой, Н.К.Горлиной, С.К.Кри-гсноссЕим) // ¡'„-^гунолегия. - ¡905. - Р 2. - С.82-83.

11. Взаимодействие белков беременности с фиЛгемагглютини-ном II и конканаввлином А (в ооавт. о С.К.Кривоносовым, Н К.Ионо вой, А.А.Терентьевны, Ю.С.Татариновым) // БЭБиИ. - 1985. - 1 5. С.ЬбВ-571.

12. Биоспецифический электрофорез - новый метод изучения гликозаминогликанов (в соавт. о С.А.Себелевой) // Вопр.мед.химии.

2. - С.134-137.

13. Ассоциированный с беременностью альфа2~гликопротеин и ь1о значение в репродуктивной функции (в соавт. с Р.И.Зориной,

B.С.Гориным) // Акуш. и гинекол. - 1986. - № 6. - С.6-9.

14. Конкурентное ингибирование углеводами реакций между фитогемагглютинином Р и гликопротеинами плазмы крови (в соавт. с

C.К.Кривоносовым, Н.К.Ионовой, Т.И.Решетовой, А.Д.Ефимовым) // Вопр.мед.химии. - 1986. - » 6. - С.96-98.

16. Иммунохимич^ский анализ "рецепторов" к локтинам в струк туре тро({областичвского бета^гликопротеина и ассоциированного с беременностью аль^а^-гликопротеина (в соавт. с С.К.Кривоносовым, Н.К.Ионовой, Т.Ю.Погореловой, С.С.Татариновым) // Онтогенез. -19н7. - » 6. - С.394-398.

16.' Иммунохимическое взаимодействие белков беременности че-лоьака с иммуноглобулинами животных (в соавт. с И.Н.Головис^ико-выы, С.К.Кривоносовым, Р.М.Зориной, Н.К.Ионовой, Ю.С.Татариновым) // Иимунология. - 1987. - ^ 6. - С.79-80.

17. Парадоксальные реакции сульфатировышых гликозаминогли-киноь с белками сыворотки «рови человека // Вопр.мед.химии. -1988. - » 3. - С.78-81.

18. Комплексный анал^а углеводных компонентов ассоциированной и би|.гианностьи аль^а^-гликопротеина // Вопр.мед.линии. -19ь8. - » Ь. - С.53-5&.

19. Неспепи^ический маркер рака - ассоциированный с беременностью аотф.^-гликопротеин // Вопр. онкологии. - 1988. -4 5.-С.651-655.

20. Ассоциированный с берег-'-жностью протеин А (в совет, с С.Г.Яабиным) // Акута, и гинекол. - 1988. - » 10. - С.7-9.

21. Изучение альй^-макроглюбулина человека и его аналогов у животных (в соавт. с Т.И.Белогорловой, С.В.Зайцевой, Т.С.Чири-ковой, О.Ф.Лыковой) // КЭБиФ. - 1990. - № 1. - С.2-5.

22. ИммуноЗер'снтнкй метод определения концентрации ассоциированного с беременностью протеина А (в соавт. с С.Г.Кабиннм, Н.В.Мальцевой) // Лаб.дело. - 1989. - № 12. - С.52-54.

23. Б?лки беременности у ьеберемонных, беременных, рокениц и родильнин (в соавт. с В.С.Горишм, Р.Н.Зориной, Н.А.1!ятрофано-пнм, С.Г.Набин™, О.Б.Дубленниковки, Н.В Ляльцепой) // А куш. и :инекол. - 1990. - № 3. - С.65-67.

24. Изменение аотф^-цакроглобулинов в процессе эволюции

:в солпт. с С.Г.Нпбиньм, Т.С.ЧириковоЯ) // КЭБиФ. - 1990. - № 3. ■ С.221-225.

25. Иммуноэлектрофоретическая идентификация белков, разде-енкых методами зонального иммунозлектрофореза и изоэлектричес-ого фокусирования (в соавт. с С.Г.Жабиным, С.В.Зайцевой) // опр.мед.химии. - 1990. - № 2. - С.Э1-93.

26. Комплексное выделение какроглобулинов из ретрсплацентг.р-эй сыворотки крови и определение их концентраций в енворотге зови доноров (в соавт. с С.Г.Жабиньы, Р.И.Зориной, Н.В.Вальце->й, Т.И.БелогорловсЯ, О.Ф.Лыковой, Т.С.ЧириковоЯ) // Геиатол. трансфузиол. - 1990. - № 5. - С.31-33.

27. Выявление белков клеточной стенки стрептококков, сбртзуп-х комплексы с кэкроглсбулинаки челогска (в тле?, с С.V

ним) // М1ЭИ. - 1990. -JfB. - C.9-II.

«

28. Имыуноферментный метод определения ассоциированного с переменностью алы|а2-гликопротеина (в соавт. с П.В.!,'альцевоД, Р.Ы.Зориной, О.Г.Кабиным, В.С.Гориным) // Лаб.дело. - 19Э0. -№ II. - С.Ь5-57.

29. Распределение алы^-макроглобулина, ассоциированных с беременностью протеина А и альфа^-гликопротсина в плаценте человека (в соавт. с В,А.Рыковым, А.К.Арефьевой, В.С.Гориным, С.Г. Кабины,ч) // Арх.гистол. - 1990. - » 10. - С.74-76.

30. Белки острой фазы в диагностике гнойно-септических заболеваний после кесарева сечения (в соавт. с В.С.Гориным, Р.Н.Зориной, НЛ'.Потехиной, И.Н.Головистиковш) // Совет, медицина. -1990. - № И. - С. 105-109.

31. Влиянии стероидных половых гормонов на биосинтез &nb4ug-ыакриглобулина и ассоциированного'с беременностью альфа2~глико-протеина в культурах периферических монснуклеарных клеток (в соаьт. с 11.В.Пальцевой, M.Зориной, Б,С,Гориным) // Цитологии.

- 1991, - К- 2. - С.80-84.

32. Сравнительная оценка использования им^нотурбидимзтр'.ш и клинической практике (в соавт. с С.Г.Набщшы) // Лаб.дело. 1»9G. - ï> 6.; - С. 17-20.

33. Сравнительное изучение иымуносупрессивных свойств ассоциированных с беременностью протеина А н алы^-гликопротеица, а также алы^-макрогдобул^на (в соавт, с И.ВД|альцевой, В.С.Гориным, С.Г.Кабиным) // Акуг.1. и гинецрл. - 1991. - № 5. - С.27-30.

34. Сравнительное научение альфа£-м^ сроглобулина и ассоциированных с беременностью адЦа2-гликопротеина и протеина А как возможных аналогов (в соавт. с С.Г.Жабиным, Т.И.Белсгорловой, C.B. Арлипои^й) // Вопр.мед.химии. - 1991. - № 3. - С.48-50.

1 ЛОТ КМК, г. 3. O-JfCJmp.M?