Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительное изучение иммунорегуляторных свойств альфа2-макроглибулинов человека и мыши

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской 1>едерадаи Российский государственный медицинский университет

На правах рукописи

ЛЫКОВА Ольга Федоровна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОРЕГУЛЯГОРНЬК СВОЙСТВ АЛЬФА2-МАКРОГЛОБУЛИКОВ ЧЕЛОВЕКА И шш

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ ■ диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Центральной научно-исследователь! лаборатории Новокугнецкого государственного института усове] ' ствования врачей •

Научный руководитель - доктор медицинских наук, професс академик РАЕН А. Н. ЧЕРЕДЕЕВ

Научные консультанты - доктор медицинских наук Я К. ГО?;

доктор биологических наук Н. А. ЗС

Официальные оппоненты - "доктор медицинских наук И. А. СТЕ

доктор медицинских наук В. Ф. СЕЬ

Ведущее учреждение - Институт иммунологии МЗ РФ

Зашита состоится "__"_1934 года в_ча

на заседании специализированного совета Д. 034.14.06 • п Российском государственном медицинском университете (1178 г. Москва, ух Островитянова, д. 1)

/

I

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке Российск государственного медицинского университета

Автореферат разослан _;_ 1994 г.

Ученый секретарь спешалквировакного Ученого совета, к м. н.доцент

Г. Е. КУЗНЕЦОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Среди обилия протеазных ингибиторов особое место занимает ti2-макроглобулин. Открытый в начате 60-х годов, этот белок сочетает универсальность действия на протеиназы всех классов, уникальную структуру молекулы и своеобразный механизм икгиби-рующего эффекта, а также обладает выраженными иммунорегулятор-ными свойствами (Henman D., VischerT., 1988; DeStefano А., Hoffman М., 1991). Особый интерес представляют данные о взаимодействии макроглобулина с различными цитокинами .(Gonias S.L.e. а., 1991; Jam?s К.е.а., 1992; Hall S.W. е.а., 1992). В последнее время цитокины рассматриваются как потенциальные кандидаты для включения в комплексное лечение различных инфекционных заболеваний, злокачественных опухолей, артритов, дегенеративных заболеваний нераной системы, а та;-же для коррекции деятельности иммунной системы (Вядро М.М., 1990; Parkinson D., 1989; Thorbecke G.J. е.а. , 1991). В связи с этим становятся перспективными исследования по разработке методов, снижающих или усиливающих эффекты цитокинов. В этом отношении определенный интерес может представлять МГ, который благодаря высокой реактивности обладает способностью связывать различные цитокины, может ингибировагь их высвобождение, а также способен воздействовать на опосредуемые цитокинами фазы иммунных реакций (James К., 1990). Механизмы взаимодействия № с цитокинами остаются до конца не выясненными. Не установлено, могут ли цитокины способствовать конформационкой перестройке МГ, к может ли ингибитор модулировать эффекты цитокинов. До сих пор нет единой точки зрения и на механизм регуляции функций иммунной системы со стороны ао-макроглобулина.

Изучение им.мунорегуляторных свойств белка невозможно без получения его в свободном от примесей виде и нативной форме. Разработка методов выделения MP из различных биологических материалов и его очистка по-прежнему является актуальной задачей, решение которой откроет новые возможности в использовании данного белка в клинике.

Не менее важно исследование аналогов человеческого- МГ у животных. В частности, детальное изучение структуры и функций

аг-макроглобулина шш поможет создать адекватные модели физиологических и патологических процессов на этрт хиьотних, водь именно мыши являются одним из сама* распространенных обгектои в иммунологических экспериментах. Но несмотря на это. шлаиний аналог МГ научен крайне недостаточно. Особенно это касается его иммунорегуляторных функций и, в том числе, взаимодействии с цитокинами.

Цель и задгми исследования

Целью настоящей работы явилось установление возможных ме-хачн.-д'ов обрааоьакия комплексои цитокшюв с мь^'С-макроглсбу-линаыи человека и миси и обоснование гипотезы оО иммунерегулл-торной ролл указанных МГ.

г задачи работы входило: 1 Разработать способу получения различных ¿орм 1X2-макроглобулинов человека и mikh.

2. Провести сравнительное исследование состава, структуры и Функций изучаемых бе:.ков.

3. Оценить особенности биосинтеза КГ ь культурах иммунокомг.«-те.чтних клеток.

4. Установить мехаипами образования котик, ксов ХГ с р:йлпчн!;ми цитокинлми (и:»гердейк-;нлми, интер^-ронам:; и Сактор;^и нек-posa опухоли).

5. Оценить влияние МГ и ого комплексов с фактором нормализации трансформированных ФиСробластов на культуру 1-кл---тск.

Научная ноиньна

Впервые проьедено сопоставление иммунорегулятор.чкх с юнеть р.13ЛИЧГЙЭД!ХСЯ ПО структур« !.{Р Ч&ЯОЬеКа К Устано'Ле.ЧЭ, что оба белка характеризуются как сходством, так и различи».!« в изучаемых свойствах. Они способа« обратимо присоедини л рае-лач-ние Ш1Т0КИЧЫ, в частности, антердейккни, инте;Ферони и (иктерц некроза опухоли. Показано, что iff маги реагирует с циюлииами иначе, чем МГ человека. Впервые показано, что комплексы МГ-"!;;-токин в обоих случаях образуются за счет водородных сьизей." Способность ).г присоединять цитокины заьисг.т от их конСсрмоци-

онного состояния. Впервые установлено, что ,МГ образует комплексы .с цитокином, обладающим актиьноситью фактора нормализации трансформировачных фибробластов, и модулирует его эффекты in vitro. Эта модуляция выражается в стимуляции миграции L-клеток под воздействием комплекса МГ-ФН и в снижении уровня трансмембранного потенциала фибробластов, отражающего степень дифферен-цировки, с дальнейшим повыаением его в последующих поколениях клеток. Впервые обнаружено, что в реакциях с белками плазмы крови основными аффкнзнтами являются иммуноглобулины и альбумин.

Практическая значимость работы

Практическая ценность работы состоит в разработке высокопроизводительных технологий получения МГ человека и мыли, а также создания тест-систем для определения их концентраций в различных биологических жидкостях. Разработаны различные методы детекции образования комплексов МГ со многими аффикантами. Предложен оригинальный комплекс, позволяющий устанавливать природу связей КГ с аффиаантачи. Определены нормативные ьначе-ния ко.чцентраг.1ш MP в организме человека. Разработан способ выявления фактора, вызывающего нормализацию трансформированных фибробластов, из супернатантов лимфоцитов.

Основные положения, вынос иже на зевдту

1. При реакции с белками плазмы крози основными аффинан-тами МГ человека й мыии являются иммуноглобулины и альбумин.

2. МГ человека я мши способны обрагрвывагь комплексы с природными п рекокбинангньми цэтокинами, такими как интергей-кипы-Ю л -2, <*2~ и r-иятерфероны и зсферон, факторы некроза опухоли-« и -0.

3. Комплексы МГ-цитокин обратуатоя за счет связей некова-лентной природы.

4. Способность № человека и кыш к присоединению различных а^инантов зависит от конфорьации 'лх молекул.

5. Несмотря на структурные < глич ¡я, МГ человека и кьси обладают сходными нммуяорегу.-ято; даж свойствами.

Апробация работы и публикации

Полученные результаты доложены на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), YII Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, 1992), на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии ( Алма-Ата, 1992), ка XII Международном симпозиуме по медицинской химии (Базель, 1992).

Апробаций диссертации состоялась на заседании Ученого Совета Ковокузнецкого ордена Трудового Красного Знамени' института усовериенствования врачей (31 мая 19S4 г.).

По теме диссертация опубликовано 17 печатных работ.

' Объем и структура работы

Диссертация состоит иг следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, библиографические указатели. Работа изложена на 131 странице мааинописно-го текста и иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Библиографический указатель включает 165 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 'ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе применялась пулированназ сыворотка (плазма) крови доноров, лиофллизирова!:нач плазма, а также сыворотка крови мышей. Мононуклеарные клетки ььшеляли из гепаринизироваиной венозной крови ст&чдартным методом по Bojum А. (1968). Кроме того, объектами исследования были мышинае фибробласты. трансформированной линии L.929.

Выделение димфокина с активностью фактора нормализации трансформированных фибробластов (ФН).

Мононуклеарные клетки человека и спленоциты мышей кудьти-' вировали в бессывороточной среде 199 в концентрации ЗхЮ6 клеток/мл в течение 24 и 36 ч при 37 С. Клетки отделяли центрифугированием, кондиционированные среды подвергали очистке при помощи ионносЗмечной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, злюируя

белок ступенчатым градиентом 0,2-0,5 М хлорида натрия в 50 мМ трис-(оксиметилзминометан)-фосфатном буфере, рН 7,4.

Методы исследования влияния МГ и его комплексов с ФН на культуру L-клеток

Внесение лимфоцитарных факторов и МГ в культуру' L-клеток производили через 24 ч после засева путем замени половины культуральной на исследуемый образец. Через 72 ч после засева определяли уровень грансмембранного потенциалу (ТШ) фиброб-ластоз, а также изменение их пролифератиьной активности и миграционной способности. ТМЛ клеток иьмеряли с помоги флуоресцентных зондов: аниона - Ьанилш.'окзфталин-в-сульфонат-натрия (АНС) и катиона - 4-(п-дкметмашмсстирил)-1-метиллирядинг:й (ДСМ). Интенсивность флуоресценция измеряли в единичных клетках с участка цитоплазмы 1,5 кв. мкм. с помощью люминесцентного микроскопа. Результаты выра?кади б виде отношения средних интенсивчоитей флуоресценции г'дсм/ Галс-

Для определения продиферативнсй активности L-клеток использовали модифицированный метод введения в ДНК пролиферирую-дах raevo/c двойной радиоизотопной метки (Епифанова Е.Й., Те-рс-к::х В.В., Лодунозский В.А., 1933).

Способность фибробластсв к миграции учитывали с помочью скринингового теста клет-',чноч миграции из ьакрскрокультур :п vitro (Суслоу А.П., Головин А.П., IOCS).

Методы гшазиса структуры, физика-химкчгсккх сгоЗств и . кнгкдируж&й актшнсстп f-TM и йГЧ

Льинсхислотк*'* анализ белка определяли на автоматическом «шеклелоягсм анализаторе LC-6C01 ("Blotrente". Гс-рмглия). Содержание свалеп-'х кислот оценивали реворщжэим сото до:,; (Svennorhola L., 1375). Для кслк';естье:::;ого огред^ння г*ксоз исяользсвс.г.1 аитронсЕьш метод (Trevelyan W.R., Harrison F.S., -195С), Содс.-рхачйе аминосачгхоь спределнли йссифицирсв&кнс.и ма-тодикой у,органа-?льсона ( Rcr.dl C.J..M. е.a., IOCS'), фукозы -методой ¿to* i Diane I. е.а., 19-18).

В::угренки? тногфари кявгяги тятро£йл:;ем Б.Б'-дитпо-

Сис(2-натро)бензойной кислотой (Sottrup-Jensen L. е.a., 1980). Общее содержание бедка в препаратах оценивали по методу Lowrí 0.(1951).

Молекулярную массу белкой определяли гель-хроматографией па поперечно-сшитой агарозе, а также электрофорезом в градиенте пор полкакриламидного геля. Для установления молекулярной массь субъединиц белки предварительно кипятили с меркаптоэуа-кслом в присутствии додецилсульфата натрия. Изоэлекгрофокуси-рование проводили в соответствии с рекомендациями фирмы "LKB".

Для определения антитрипсиновой активности МГ использовали иэтод Salto A., Sinochara Н. (1885). ОпосоОность МГ запищать связанные с ним протеннззы от ингибирующего действия сое-зого ингибитора трипсина оценивали по методу Ganrot Р. (1965).В качестве субстратов для трипсина использовали азока-зеин и М-Сензоил-01.-аргинин-пзранитроачилид.

Йммуиохимические методы

Для получения моноспецифических глтисыворогок против МГ иммунизировали кроликоЕ, вводя антиген внутрикожно с неполным адгювантом Фрейда. Аффинно-очищенные антитела получали посредством аффинной лроматогрзфии на агаровных сорбентах с иммобилизованными антигенами. Качество антител оценивали с помочь» методов иммуиэдиффузии и перекоестного злектрс^орева. Для определения концентрации белков использовали "ракетный иммуио-электрофорез. Изучение реакций Nif с различными аффинактами осуществляли методами ракетного им.\<уноэлектр»Ьорега с промежуточным геле». Применял» тыже адсорбцию антигена in situ.

Для определений концентрации i>!T в супернатантах культивируемых мононуклеарах использовали твердофазный иммуноферменг-нкй .метод (Voller А., 1976), используя монослецифические антитела претив МГ, истощенные эмбриональной телячьей сывороткой. Коньюгать антител с пероксидазой из хрена получаль периодатным методом (Hakane Р., 1974; Tjuisen Р., 1984).

Реакции М? о цитегашами исследовали в условиях дот- и вестерн-Сжтгтаяга, окрааквая антигены частицами коллоидного золота с последующи усилением окраски серебром. tí работе использовали рекомб/кантные человеческие цитотш: интерлейким-2

и интерлейкин-lß, atz- и т-интерфероны, эсферон, фактора некроза опухоли-« и -ß.

Культивирование клеток

Культивирование молонуклеарнш клеток осуществляли в планшетах для иммунологических исследований в среде Йгла-МЕМ (НПО "Вектор", Новосибирск) с добавлением 2мМ L-глгатамина, 20 ММ HEPES-буфера (Reanal), 50 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл пенициллина и Z0X. инактивкрозаиной »коротки крупного рогатого скота.

Поддерживание линии L-клеток осуществлялось пассированием в среде 199, содержащей 10Z инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. При необходимости L-клетки снимали с поверхности стекла О, 25Z раствором трипсина, который затем ияакгивировали полной средой.

Статистическая обработка полученных данных производилась на персональном компьютере фирмы Hewlett-Packard (США) с помощью пакета прикладных программ этой же фирмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЯХ ОБСУВДЕНИЕ

Выделение и очистка МГ человека и шли

Разработаны методы выделения л очистки МГМ и МГЧ с по-мопзяо различных типов ВДК-агароз (4 и 62 ИДК-агарозы, дликкос-пейсер.чые и короткоспейсерные), позволяющие получать препараты № с сохранение.'.* большей части их биологической активности, свободные от примесей и с достаточно бо."ьпим выходом конечного продукта (1,1 г и." 1 л сыр;.я). Наиболее оптимальней признана следующая схема выделения MI' человека:

плазма (сыьорогка) крови - осааденае ПЭГ бОСО ' сульфатом гшо:т; - хроматография на/JJK-агарозе - г ель-фильтр-алия. МГ мыли выделяли по той же схеме, ю с добавлением ес;е едкого ггапа - псовдолигакдной хроматографии на голубой агарозе.

Применяя те кхч ирые их модификация, мюто получи;:, М? с

заданными свойствами согласно задачам дальнейших исследований. Мы можем получить как нативний белок, сохраняющий антипротеаз-ную активность, так и модифицированный, обладающий свойствами иммуномодулятора. К таким результатам приводит, например, замена ПЭГ 6000 сульфатом аммония в процессе осаждения белка.

Основные физика-химические свойства MP человека и мыши

Получение препаратов МГ человека и мыши в чистом виде позволило определить состав и структуру молекул этих белков. Проведенные исследования показали, что исследуемые макроглобу-лкны являются гдикспротеинами, обладавши одинаковой молекулярной массой - 720 кД, сходной электрофореткческой подвижностью и характеризуются частичной антигенной идентичностью.

Изучаемые белки в целом имеют сходный аминокислотный состав, хотя и обладают небольшими индивидуальными отличиями. Аминокислотный состав мачроглобулиноз довольно оригинален. Он характеризуется малым количеством серусодержащих аминокислот и триптофана и повышенным содержанием кислых аминокислот. Эти данные яорооо согласуются с результатами исследований других авторов (Sottrup-Jenssen L. е.а., 1984; Sand о.о.а.,1985).

Аналогичные черты сходства наблюдаются и при сопоставлении углеводного состава исследуемых .макроглобулинов. Доминантными компонентами углеводной части- iff являются гексозы и ацетиламиносгхара, минорными - Фукеза и скгловые кислоты.

Еслкозо-углеводшй состав позволяет отнести !,1Г к кислым белкам, что соответствует данными изофокусирования. Изоэлект-рические точки МГ человека и мыта несколько различаются, поскольку несколько различен и состав белков, но, впрочем, также достаточно близки.

Исследуемые белки в нативном в ид г обладают активностью ингибиторов протеиназ. Они связывают широкий спектр протеоли-тичесжих ферментов, но не взаимодействуют с нуклеазамл и гиа-луронидазой. Аффинитет к протеазам у МГ человека и (Я' мыаи не одинаков. Б целом, активность МГ человека в два раза выш. икгибируювдй способности МГ мыши. Такое расхождение можно объяснить только различием в структуре молекул, так как по другим физико-химическим свойствам они практически идентичны. Дейс-

твительно,'данные зонального электорфореза в градиенте пор по-лиакриламидного геля показали, что МГ человека и мыши имеют различную структуру молекул. Альфаг-макроглобулин человека представляет собой тетрамер, образованный 4 идентичными или почти идентичными субъединицами с молекулярной массой 180 к/1. Мономеры, соединяясь попарно дисульфидкыми связями, образуют димеры, имеющие молекулярную массу 360 кД. Димеры, в"свою очередь, соединяются кеков?лентно, формируя молекулу ингибитора. В образовании тетрамера №. как показали проведенные■ исследования, принимают участие ионы двухвалентных металлов, в частности, цинка.

Несколько иную структуру имеет с<2-макроглобулин мыши. Он, как л МГ человека, состоит из двух димеров с молекулярной массой 360 кД, соединенная нековэлентно, но димерй образованы не двумя, а четырьмя субъединицами кахдый. Эти субъединицы не идентичны. Две из них имеют молекулярную массу 150 кД, а две других - 35 пЛ. Вольная и малая субьедкиицм соединяются между собой дисульф'дзними связями. Таким образом, молекула МГ ьыпги имеет дополнительные -S-5-связи, отсутствуй:? у № человека, которые и придают ей большую жесткость.

Оба макроглобулина при взаимодействии с протеиназами и первичными аминами претерпевают конформзционные превращения с формированием более плотной структуры, что подтверждается увеличением их злектрофоретической подвижности в полиакриламидном геле, а также изменением изоэлектрических точек. Белки при этом, как показали проведенные исследования, репрессируют 4 тиолорых эфира на молекулу МГ. Следовательно, № человека и мыпи имеют равное количество мест связывания протеилаз или метиламина, и сннж?ние онтипротеазной активности макроглобулина мьта можно обменить только структурними особенностями дачного белю. Очевидно, в этом случае доступ к зонам примам!« оказывается стеркчески затруднен. Структурные особенности молекулы !.{Г мьга приводят и к снижении экранирования связанного с ингибитором фермента от действия соевого ангибигорз трипсина вдвое по сравнению с МГ человека.

Таким об сазом, ингибпрутсда характеристики махр:, глобулинов определяются искдадагм»:® структурой :./. молекул. Изменение кт-н^рма^гл !<Г под дейст^ех какхх- либо агентов, например.

сульфата аммония или метиламина, приводят к резкому снижению, вплоть до отмены, актипротеазнсй активности ингибиторов. На реакции хе с лектиками, а так же специфическими и противоугле-водпьш антителами информация молекулы МГ не влияет. Это связано с тем, что во взаимодействиях с данными реагентами участвуют поверхностные участки молекулы ингибитора - углеводные или ангигенныз группы,- которые не затрагивает модификация.

Пропускание сыворотки человека и мьпки через колонку с иммобилизованными МГ с последующим электрофорезом в ПААГ (5-30%) фракций, элюированных с колонки, показало, что МГ связывает различные белки сыворотки (плазмы) крови. Методами иммунодиф-фузии установлено, что основньши аффинантами являются иммуноглобулины класса G и атьбумин, причем связывающая способность МГ человека выше, чем № миеш. Если учесть, что альбумин является переносчиком различных низкомолегулярных веществ, в том числе гормонов, липидов, ионов металлов, а также медикаментозных веществ, то его взаимодействие с МГ ín vivo может существенно повлиять на перераспределение в организме указанных аф-фииантов. Немаловажные последствия мохет иметь и связывание макроглобулином иммуноглобулинов сыворотки крови. Не исключено, что он мохет транспортировать их к определенным меткам, а также регулировать количество свободных антител в организме, удаляя их избыток при аутоиммунных процессах.

Сравнительный анализ иммунорегуляторных свойств МГ человека и шпи

Проведенные исследования показали, что МГ человека.« мши в условиях г.от- и вестерн-блоттинга способны связывать различные цитокииы: интерлейкины-1В и -2, аг- и r-интерфероны и эс-фероч, факторы некроза опухоли «ив. Взаимодействие МГ с цл-токинами во многом определяется конформационным состоянием молекулы МГ, а также зависит и от природы цитскина. Так, МГ человека, модифицированный метиламином, в условиях дот-блоттинга не связывается с ИЛ-10, в то время как нативный белок и МГ, модифицированный плазмшом, взаимодействуют с ним. Очевидно, прк формировании более плотной структуры МГ под воздействием метиламина возникают сгерические препятствия для образования

связей с указанным цитокином (рис.1).

С ИЛ-2, напротив, нативный ингибитор не взаимодействует. Оптимальные условия для реакции связывания с данным цитокином создаются только после пространственной модификации молекулы Ш\

МГ мыши взаимодействует с интер;; ди совершенно иначе. Образование комплекса с ИЛ-10 столпится возможным только после информационной перестройки, происходящей под влиянием метиламина (рис.2). Для взаимодействия же с ИЛ-2 подобная перестройка не нужна, и любая модификация отменяет взаимодействие с цитокином, создавая стерические препятствия.

«6-О-01

Рис.1. Взаимодействие различных ферм МГ человека с ИЛ-13 в условиях дог-блоттинга. Пояснения: А1-3 -- контрольные лунки; Б1, В1 - нативный МГ; Б2-3, В2-3 - комплекс МГ-метиламин.

А 6 5 Г

Рис.2. Взаимодействие различных форм МГ мыли с ИЛ-10 в

дот-блоттинга. Пояснения: 1А, 2А - контроль; 1Б. 2Б - МГ-метиламин; МГ-плазмин; 1Г, 2Г - нативный МГ.

условиях 1В, 2В -

Определяющая роль конформационного состояния молекулы МГ наблюдается и в реакциях с другими цитокиками, наименее выражена она лишь с ИФ и зсфэроком.

Проведенные исследования продемонстрировали, что да^е длительная обработка МГ человека и мыши вышеназванными цитокиками не вызывает расщепления внутренних тиоловых групп макроглобулинов, которое наблюдается при взаимодействии с протеина-зами и первичными амимнами. Следовательно, механизм связывания цмтокинов мг отличается от связывания протеиназ.

На примере ИФ-«2 мы попытались детально разобраться в механизме связывания макроглобулином цитокинов (рис.3). Для этого блоты инкубировали с МГ в присутствии реагентов, способных оказать влияние на комалексообразование. Результаты исследования показали, что в связывании не участвуют углеводные компоненты молекулы № и ионы металла, поскольку реакция связывания наблюдалась в присутствии конканавалина А и ЭДТА. Полумолекулы МГ, образованные под воздействием двухвалентных ионов кадмия и 4 М мочевины, не теряют способности к связыванию цитоккна. Денатурация же молекулы ИГ под воздействием температура полностью отменяет взаимодействие с Ш>. Очевидно, в нативной мо-

¿'с-

УУ

ь1

и

и '!'

и

с.

И

ч

I

Рш.З. Взаимодействие иг-К* с КС человека в условиях иммуноб-лоттикга.

Пояснения: 1 - маркеры молекулярной массы, 2 - натив.чый МГ, 3 -1С с 4 М мочевиной, 4 - МГ с ЭДТА, 5 - денатурированный нагреванием МГ, -6 - МГ в присутствии иоков ¡-.адмия, 7 - МГ с кокк^па-кяиьзм А, 8 - вокплекс МГ-ыетихамкн, 9 - бл^а: после инкубации, с МГ обработаны додецг-гсульфагоы натрия.

лекуле ингибитора имеются особые участки связывания, пространственно соответствующие молекуле цнтокина. Нарушение третичной и вторичной структуры МГ приводит к исчезновению этих сайтов и делает невозможным образование комплекса с молекулой цитокина. Диссоциация комплекса МГ-ИФ в присутствии додецил-сульфата натрия свидетельствует о нековалентном характере связывания белков. Скорее всего, главную роль в образовании комплекса с цитокином играют водородные связи.

Влияние МР и комплексов МГ-цитокин с активностью фактора нормализации (ФН) на культуру трансформированных фибробластов.

Результаты наших исследований показали, что № человека и миш способны связывать продуцируемый Т-лимфоцитами цитокин с активностью фактора нормализации трансформированных фибробластов. Супернатанты культур МНК пропускали через колонку с иммобилизованным на ВгСН-агарозе КГ. Белок, связавшийся с МГ злидировали глицин-НС 1-буфером, рН 2,8. Полученная фракция повывала уровень ТМП ¡--клеток на 60,38±18,72£. Фракция, не связавшаяся с МР, на 33.52i2.40Z поникала ТМП фибробластов. Методом зонального электрофореза в полиакршилидном геле фракции, связавшейся с МГ, определена молекулярная масса цитскмна, обладающего эффектом нормализации: она составляет 6-8 кД. Сами МГ в концентрации 2-200 иг/мл не оказывали влияния на дифференци-ровку, пролиферацию и миграцию ¡.-клеток, но значительно угнетали индуцируемую ФН фенотипическую кормализадао трансформированных фибробластов. Однако наблюдаемый эЛфегст не был стабильным: последующие поколения Ь-клеток экспрессировали нормализованный фенотип (рис.5). Проведенные исследования показали, что модулирующее действие (Л1 на укапанный цитокин ни ограничивается ингибированием эффекта нормализации. Под влиянием МГ цито-кин приобретает и совершенно новые свойства, не характерные для него, - способность к стимуляции миграции фибробластов (рис.6).

Результаты исследований показали, что в супернатантах культивируемых моионуклеаров мужчин и небеременных женщин оп-

Рис.5. Влияние МГ и комплекса МГ-ФН на уровень трансмембранного потенциала Ь-клеток.

Пояснения: 1 - контроль. 2-е среде присутствует ФН, 3 - в среде содержится ФН и МГ (2 нг/мл), 4 - ФН и МГ (8нг/мл), 5 - Ш1 (2 -200 нг/мл), 6 - последующие поколения Ь-клеток (в среде отсутствует ФН и МГ).

%

"кс.6. Влияние .МГ и комплекса МГ-ФН на миграцию Ь-клеток. Пояснения: 1 ■• контроль, 2 - в среде присутствует МГ, 3 - в среде присутствует ФН» 4 - МГ и ФН.

отделяется МГ, г, количестве от 10 до 300 нг/мл. ШК .иудаин и жекаик характеризуются примерно одинаковым уровнем продукции МГ. В сбо;сс случаях максимальный уровень биосинтеза МГ наСлю-далгя на 5 сутки культивирования МКК.

Содержали-; МГ в сыворотке крови здоровых доноров, по на-данккм, составляет 2,78±0,13 г/д и не зависит от пола об-

следуемых. Сопоставление содержания МГ в сыворотке периферической крови и в супернагантах культур моноцитов позволяет сделать вывод о том, что мононуклеарные клетки не могут являться основным источником синтеза МГ в организме. Основная роль в создании и поддержании плазменного пула макроглобулина, как и других сывороточных белков, принадлежит клеткам печени (Munck-Petersen G. е.а., 1985, 1988).

Полученные нами данные значительно расширяют сложившееся в науке представление о биологической роли МГ. Учитывая приведенные выше факты, можно предположить, что МГ, синтезируемый мононуклеариыми клетками, выполняет иммунорегуляторные Функции. Свое иммуномодулирующее действие МГ может осуществлять через различные механизмы. С одной стороны, являясь ингибитором протеиназ широкого спектра действия, он играет определенную роль в поддержании необходимого уровня протеодитических процессов в микроокрулении иммунокомпегеятных клеток, от которого зависит их функциональное состояние. Например, МГ способен подавлять цитотоксическое действие макрофагов и естественных киллеров, ингибируя выделяемые ими протеиназы (Jonscn W., So,Tiers S.D., Adams D.O., 1984). Кроме того, указанные комплексы способны стимулировать синтез иммуноглобулинов в периферических мо.чонуклеаоных клетках и подаьлять пролиферацию иммуно-кшпетеятшх кзьток (Mannhalter J.W. е.а.. 1986; Мальцева Н.В., 1990).

С другой ctgdoüu, обладая способностью к сбрггзованию комплексов с цитокинами, МГ может связывать их и транспортировать к различном клеткам иммунной системы. Такое Еваимодейс-твк" мохет происходить на мембране мононуглеарной клетки, синтезирующей цитокины. Возможность подобного взаимодействия иммобилизованных дитокнпов и МГ показана нами в условиях блег-тинга, а такда Webb D.J. и соовт. (1092), проводившими реакцию связывания цитокпнов иммобилизованными ь полнетиролойом план-ыето формой МГ. Образованный комплекс иыделяется в кровяное русло. Комплекс цитокина с нативным МГ может циркулировать там продолжительное время. Нековалеитное связывание цитокина ингибитором придает обратимый характер комплексу и делает возможным вытеснение цитокина гомологичным рецептором. Цитокин, связанный с «ативной 'ормой ингибитора, будет полностью сохранять

свою биологическую активность, поскольку стерически защищен молекулой МГ от разрушающего действия протеиназ.

Взаимодействие МГ с протенназой изменяет и его взаимоотношения с цитокииами. Специфичность протеиназы обусловливает особенности ограниченного протеолиза в молекуле ингибитора и, как следствие, изменение его ко (¡формации строго определенным образом. Последнее определяет специфичность избирательного взаимодействия комплекса с тем или иным цитокиксм.

Комплекс цитокина с модифицированным протеазой МГ становится доступном для рецептор-опосредованного эндоцитоза. Циркулируют«! гисттироваипш МГ, связанный с цитокинами, бистро удаляется гепатоцитамя, икоовдти рецепторы к чему . Время его циркуляции в крови исчисляется минутами. .Кроме того, для цито-кнна, связанного с комплексом №-фермент, не исключена возможность деградации под воздействием протеиназы. Таким образом, иакроглобудин может способствовать элиминации из кровяного русла избытка циток/шов и тем са«ым предотвращать их вредные системные или локальные эффекты in vivo.

Можно предположить, что МГ, благодаря способности связывать цитскипы и транспортировать их к различным клеткам, обеспечивает своего рода информационную связь как внутри иммунной системы, так и мехду клетками иммунной и клетка,;и других систем р организме. Так, проведенные нами исследования показали, что КГ является посредником, через который иммунная система молет регулировать дифференцировку метек соединительной ткани. Свое регулирующее влияние иммунная система мехет оказывать и на другие ткани, клетки которых имеют рецепторы к í.CP или цн~ то кипам.

Молекула качрогл&Оулика, обладая способностью быстро иг-иегшъ конфермацию при взаимодействии с нрзтеагами и в соответствии с згой кокформацией образовывать разхгг-гкие кагшкен с цитокинаки, может определять направленное^ воздействия сш;-загкегося с ней цитокина и .влиять на его распределение в организме, поскольку пространство распределения щгтекикз, съп-га-'кого с МГ, ограничивается пространство!,: распределен.''.;: пере-поочлгл. Связывание ингибитором цитокинез мохет приводить и к нзме.чекнх; ул действия. По этим причинам взаимодействие макрег-лсбуднка с цитог-инши, a raraw с другими транспортируемыми ое-

ществами представляет интерес с физиологической, патологической. фармакологической и клинической точек зрения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенные автором способы очистки МГ могут быть использованы в работе биотехнологических предприятий. Аналитические тест-системы, позволяющие определять уровень МГ в сыворотке крови и различных биологических жидкостях, могут применяться для диагностики ряда заболеваний в клинической практике. Комплексы МГ с цитскиначи могут использоваться в качестве терапевтического средства при лечении инфекционных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний. Трансформированные формы препарата могут использоваться для удаления из циркуляции в организме избытка кммунологкчес.си активных молекул. Ва-сокоочлщенный нативный МГ может применяться для купирования протеолиза при деструктивных процессах,

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы получения различных форм «2- макроглобулинов человека и мыши: нативных, обладаю'дих свойствами ингибиторов протеиназ, и модифицированных, обладамздх иммуно-регуляторными свойствами.

2. «2-макроглобулины человека и мыши являются сывороточными белками, характеризующимися частичной антигенной идентичностью, сходными физико-химическими свойствами и обладаюздми антипротеазной активностью.

3. МГ человека представляет собой тетрамер, в котором две субъединицы посредством дисульфидных связей образуют димер, а два димера, соединяясь нековалентно,- тетрамер. Молекула МГ мыши состоит из 8 неравноценных субъединиц и характеризуется наличием дополнительной дисульфидной связи, что придает ей большую жестокость и вызывает снижение ингибирующей активности по отношению к протеиназам.

4. МГ человека и шши связывают различные белки сыьорот'.ск крови. Основными аффинантами являются иммуноглобулины и альбумин.

5. KIT человека и мыни взаимодействуют с рекомбинонткыми щггокхнам'и - иитерлейкянами Iß и 2, факторами некроза опухо-ли-ct и -3, dz- л г- интерферонами, эсферсном, а также с факторов нормализации трансформированных фибробластов, секреткруе-мкм Т-лимфоцитами.

6. Связывание макроглобулинами цигокинов зависит от кон-формационного состояния молекулы ингибитора и носит некова-лентный характер. Главную роль в образовании комплекса МГ-ци-токин играют водородные связи.

?. МГ i;e влияет на характеристики культуры трансформированных фкбробластоз линии Ьдгз. но модифицирует действие фактора нормализации на указанную культуру клеток.

8. Мононуклеаркые клетки периферической крови человека синтезируют МГ'. Уровень секреции зависит ст сроков культивировании.

Э. МГ человека и мыши, обладая сходными физико-химическими свойствами, являются акцепторами пироксго круга цитскинов, что позволяет им участвовать в регуляции функций иммунной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение «2-макроглобулкна человека и его аналогов у животных ( в соавт. с Зориным H.A., Зайцевой C.B., Чириковой Т.С.)// НЗЕиФ.' - 1990. - N 1. - С.3-8.

2. Комплексное выделение какроглобудинов из ретроплацен-тарной сыворотки и определение их концентраций в сыворотке до-нороз ( в соазт. с Зориным H.A., Набкным С.Г., Зориной P.M., Мзльцевой Н.В., Белогорловой Т.е., Чириковой Т.С.)// Гематол. и трачсфузиол. - 1990. - N 5. - С.31-33.

3. Проблемы эволюции семейства макроглобулинов человека и животных ( в соавт. с SopnHia.i H.A., Жабиным С.Р., Белогорловой Т.К., Чириковой Т.С.)// ЖЭЗиФ. - 1992. - Т.28, N 4. - С.441-446.

4. Значение макроглобулинов в развитии г.ослерэдовыл воспалительных процессов ( в соавт. с Гориным B.C., Мальцевой Н.В.. Зориным H.A.. Хабиным С.Г., Зориной P.M.)//Тез. докл. Мехдукар. симпоз. по аллергологии к клин, пммунол. - Алма-Ата, 1992. - Т.2. - С.85.

5. ;1мму.чорегуляторные свойства макрогдобулинов ( в соавт.

с Зоршшм И. А.. Зориной P.M., Мальцевой 1!. В., Жаб и ним С.Г.. Горлшюй U.K., Горинии B.C.)// Тез. докл. Мелдунар. снмпоа. по аллергологии и клин, иммунол. - Алма-Ата, 1092. - Т.2. - С. 129.

6. Значение макроглобулинов в иммунологии репродукции ( в соавт. с Гориным b.c.. Зориной P.M., Миль ценой И.В., Жабиним С.Г.. Зоршшм H.A., Чириковой Т.С.)// Т>.-э. докл. 1 сгоод иммунологов Россия. - Новосибирск, 1 OOS. - С.117.

7. Возможная роль макроглобулинов u развитии улокачеет-венных опухолей ( ь соавт. п Иерхбииким Г.В., Мингалошм 1!.В., Зориным H.A., Жабиным С.Г., Митрофановым H.A., Гориным B.C.)// Тез. докл. 1 съезд иммунологов России. - Новосибирск. 1002. -С.010.

8. Лимфокин с активностью Фактора нормализации трансформированных (щОроСластлоа: его взаимодействие с «¿-мачроглобу-ли!!см ( в соаьт. с Стонансом И.Я., Горлиной U.K., Оринской З.П.. ЗоринккН. А., ^ Комовым И.Г.. Чередеешм А.Н.)// Теп. докл. 1 съезд иммунологов России. - Новосибирск, 1002. - C.-l!j9.

9. Рлиянис- воспалительной реакции на распределение ^-макроглобулина и ассоциированного с беременностью <<1-гли-копротс-ина в орган.;:;м-? крыс ( в соавт. с Зориным H.A., Бело-горловой Т.Я., Чириковой Т.С., Краш'киной H.A.)// Пат.фиоиол. - 1992. - N.3. - С.21-22.

10. Physicochemca! arid biological properties of iraoroslo-bulin-proteinic arid cerln-proteiaix- complexes ( with fbabin 3.0., Zorlri U.A.)// XII int. Girpos. on 1 Medical Chemistry: Abstracts. - Ba;:e2, 1002. - P. 201.

11. Studies cr. physiological ro!e and rc-ijuli't Ion of mac-rujlobullns aad their analogues in animals ( with Ctribin 3.Q., Zorln H.A. , GorinV.S. , Maltseva U.V.)// XI! Int.. Slnpos. on Medi :ai CV;.nisiry: Abstracts. - Easel, 1002. - P. 310.

12. Волга плаамы и сыворотки крови донороа ( з соавт. с ;Чабиним С.Г., Зориным H.A., Зориной P.M.. Гсрпным П.С. , Бело-горловой Т.е., Чир иконой Т.е., Кр*&а<;шсй H.A.)// Клин. лаб. диагн. - 1002. - И 0-10. - С. 13-15.

13. Lymphogne with.the activity of normalisation transformed fibroblasts factor: Its interaction «Ith «2-macroglobi-lin ( with Stcnans I.J., Gorllna M.:;., Crinska Z.P., Kozlov

I.G.. Zorin N.A., Cheredeev A.N.)// 8-th Int. Congr. of Irrmu-nolocy: Abstracts. - Budapest, 1992. - P.231.

14. Irnnunoregulatory properties of macroglobuliris ( with Shabin 5.G., Goriri V.S., Maltseva N. V., ZorinaR.M.. Zorln N.A., Gorlina N.K.)// 8-th. Int. Congr. of Immunology: Abstracts. - Budapest, 1992. - P.576.

15. The potential role of macroglobulins on cancer ( with Gorin V.S., Vercbitsky G.V., Mingalev N.V., Zorin N.A.)// 8-th Congr. of Immunology- - Budapest, 1992. - P.423.

16. Изучение структурных особенностей комплексов макрогло-Сулннов с плазмшюм ( в соавт. с Жабиным С.Г., Зориным Н.А., Гориным B.C.)// Вопр. мед. хим. - 1993. - Т.39, N 4. - С. 53-56.

17. Кммунохимическое изучение взаимодействия макроглобулинов с лимфоцитами, моноцитами и нейтродинами ( в соавт. с Жабиным С.Г., Зориным Н.А., Мальцевой Н.В., Гориным B.C.)// Иммунология. - 1993. - N 6. - С. 20-21.