Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунорегуляторные В-клетки в норме и при иммунопатологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правая рукописи

КАЛИНКОВИЧ Александр Григорьевич

УДК 612.! 12.94.017.1

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ В-КЛЕТКИ В НОРМЕ И ПРИ ИММУНОПАТОЛОГИИ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА — 1989 г.

Работа выполнена в Институте иммунология Минздрава СССР Научный консультант -

доктор ыедшошских наук, профессор Б.В.Пинвгин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.А.Михайлова доктор ыедициноких наук, профессор В.А.Ляшенко доктор медицинских наук Б.Г.Неотеренко

Ведущее учреждение - 2-й Московский ордена Ленина Государственный Медицинский институт им. Н.И.Пирогова

Защита соотоитоя "_" _ 1989 года

в_часов на заседании Специализированного совета

Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: П5478 Москва, Каширское шоосе д. 24, корп. 2

иь)

С диссертацией можно ознакомься г библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР

• Автореферат разослан "_" _' 1989 г.

Ученый оекретарь Специализированного совета доктор биологических наук

А.В.Колобов

П23

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клетки, регулирующие иммунные реакции, играют важнейшую роль в поддержании иммунного баланса. Предполагается, что развитие аутоиммунных (Theofil:>pouloa, Dixon 1981) И опухолевых процессов (North, Burauker, 1984), иммунных дисбалансов при старении ( Walford, 1980), аллергических воспалительных заболеваний ( Chiorazzi et al., 1977) И некоторых других патологических процессов может быть следствием генетических или приобретенных дефектов иммунорегуляторных клеток. Наиболее известными и достаточно полно изученными представителями таких клеток являются различные субпопуляции Т-димфоцитов (хелпе-ры, супрессоры, амплифайеры, контрасупрессоры и др.) и макрофаги. Свои эффекты они реализуют, главным образом, путем синтеза многочисленных медиаторов, взаимодействующих с соответствующими рецепторами на клетках-мишенях.

Относительно B-лимфоцитов также получены убедительные доказательства, что они могут быть не только эффекторными клетками, синтезирующими иммуноглобулины, но и выполнять функции регуляторов иммунных реакций. Так, среда них обнаружены супрессоры анти-телообразования (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов с сотр., 1976, 1977; Shi-ташига at al., 1982) и гиперчувствительности замедленного типа ( Katz et al. 1974; Asheraon, Zemhaba, 1976), клетки С хелдер-ной'активностью (В.М.Манько с соавт., 1978; И.М.Дозморов с со-авт., 1985; Djrcainaki, Smith, 1977; del Guercio et al., 1980; Shenk et al., 1981; Yamamoto et al., 1984), супрессориццуцирую-щие клетки (Calcina et al., 1980, 1982; Shimamura et al., 1982, 1984), антигенпредставляющие клетки ( Cheanut et al., 1981; Grey et al., 1982; Krieger et al., 1985, 1986; Shimamura, Yochida, 1988), клетки, синтезирующие шгаерлейгаш I ( Matsuahi-ma at al., 1985), естественные цитотоксические клетки (Welsh

et al., 1986; Bersani et al., 1987).

Более того, постепенно накапливаются сведения об изменении активности иммунорегуляторных В-клеток, в частности, костномозговых супрессоров, при аутоиммунных процессах, опухолевом росте и старении у экспериментальных животных (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов с сотр., 1978, 1980, 1981). Эти данные, а также обнаружение дис-бактериоза кишечника у больных артритами ( Campa, 1983) и у мышей с врожденной аутоиммунной патологией (У.В.Мздщдов с соавт. 1986), сопровождающегося постоянно высоким уровнем в крови эндотоксинов - поликлональных активаторов В-лкмфоцитов - указывают на необходимость всестороннего изучения иммунорегуляторных В-клеток.

В связи с этим возникают проблемы индукции таких клеток, моделирования состояний, при которых регуляторами иммунных реакций являются В-димфоциты, поиска веществ, влияющих на их активность, изучения механизма действия и разработки тестов доя их оценки у человека. Следует признать, что за исключением коолю-мозговых супрессоров (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов с сотр., 19761987), В-супрессоров, индуцированных иммунными комплексами ( nasuda, Uiyama-Inaba et al., 1978-1988) и, в меньшей степени, В-хелперов, синтезирующих вер - "В-клеточный усиливающий фактор" (del Guercio,Katz, 1980-1987), подобные подходы не разработаны, 'а имеющиеся в литературё сведения ограничены немногочисленными сообщениями о различных индукторах иммунорегуляторных В-кле-ток ( Perason, 1977; Rivas, Rogers, 1983; Baker et al., 1985; Farkás et al.,1986).

Пелъ и задачи исследования. Цель настоящего исследования -- разработка новых подходов к индукции иммунорегуляторных ^-лимфоцитов, изучение их свойств, функциональной активности и

аутоиммунными заболеваниями и иммунодефивдтами.

Для достижения поставленной дели потребовалось решение следующих задач:

1. Разработать подходы к индукции иммунопегуляторных В-кле-ток при введении мышам тимус зависимого антигена - эритроцитов барана (ЭБ) и тимуснезависимого антигена - липополисахарида эн-теробактерий (ЛИС),

2. Разработать подходы к индукции ишунорегуляторных B-iuie-ток in vitro фармакологическими и биологическими препаратами.

3. Изучить иммунорегуляторные В-клетки у шшей линий NZB и MRl/MpJ-ipr/lpr (сокращенно url/i ) с врожденной аутоиммунной патологией.

4. Разработать подходы к индукции иммунорегуляторных В-кле-ток в периферической крови здоровых доноров и больных ревматоидным артритом, гипо- и агашаглобулинемиями.

5. На основе разработанных подходов изучить закономерности формирования, свойства, фенотип, функциональную активность и возможности ее изменения, а также механизм действия иммунорегу-ляторных В-клеток.

Научная новизна. Показано, что В-супрессоры в селезенке мышей мокно индуцировать введением субоптиыалышх доз ЭБ. Изучены кинетика их. формирования и чувствительность этого процесса к различным ингибиторам и стимуляторам, выявлен фенотип этих клеток, исследованы чувствительность к обработке in vi-tro различными веществами, зависимость эффекта от дозы, скорости седиментации в поле тяжести 1 g , наличия на мембране рецепторов к лектинам, изучен механизм действия и некоторые другие свойства.

Сформулировано представление о двойном механизме действия ЭБ-индуцированных В-супрессоров, зависящим от наличия на мембране рецептора R) : Pc¡¡ й+ _ В-клетки действуют непос-

родственно на клетки-мишени, а Fe у R™ -В-клетки - путем индукции Т-супрессоров, то есть являются оупрессоривдухщрующиш клетками.

Выявлены и проанализированы взаимосвязи медцу функциональной активностью иммунорегуляторных B-клеток нормальных и аутоиммунных мышей и внутриклеточным содержанием и способностью к секреции этими клетками циклических нуклеотидов и продуктов цик-лооксигеназного и лилоксигеназного путей окисления арахидоновой кислоты. При этом с помощью ингибиторного анализа установлено, что В-супрессоры нормальных мышей, индуцированных ЭБ, оказывают эффект за счет секреции липоксигеназных продуктов, а В-супресс^-ры аутоиммунных мышей - за счет циклооксагеназных продуктов.

Впервые обнаружены способность коклюшного токсина индуцировать и усиливать сулрессорную активность B-клеток и способность ЛПС индуцировать одновременно В-супрессоры и иммуностимулирующие B-клетки с превалированием последних.

Впервые выявлены В-супрессоры у больных ревматоидным артритом, гипо- и агашаглобулинемиями.

^аучно-практическая значимость. Разработан способ получения и обогащения В-супрессоров у мышей, основанный на сорбции спле-ноцитов на пластике, покрытом лектинами.

Данные о способности ЛПС Shigella sonnei индуцировать шмуностимулирующие В-клетки были использованы для разработки совместно с кафедрой микробиологии 2-го МОЛИЛИ им. Н.И.Пирогова (Зав. - дроф. В.М.Коршунов) и У.В.Мадявдовш (Институт онкологии и радиологии Минздрава УзССР) способа коррекции дисбактериоза кишечника аутоиммунных мышей с помощью общей гнотобиологической изоляции с селективной деконташнацией кишечника.

При создании вакцин, содержащих ввделяешй из Bordetella pertussis материал, необходимо учитывать обнаруженную в работе

способность коклюшного токсина индуцировать и усиливать активность В-супрессоров.

Выявленная зависимость функциональной активности супрессор-ных и иммуностимулирующих В-клеток у нормальных и у аутоиммунных мышей от уровня цАМФ, цМ$, простагландинов и лейкотриенов может служить предпосылкой для поиска эффективных иммунокорректоров среда веществ, точкой приложения которых являются ключевые ферменты метаболизма циклических нуклеотидов и арахидоновой кислоты.

Разработан способ индукции В-супрессоров в периферической 1фови людей, основанный на кратковременной инкубации мононуклеа-ров (МНК) с кальциевым ионофором А23187 (авторское свидетельство по заявке № 4467871/28-14 Кл.00^33/53 от 28.07.88 г.). Этот способ применяется в настоящее время для оценки иммунного статуса больных в Институте иммунологии Минздрава СССР, Университете Дружбы Народов им. Л.Лумумбы, Институте онкологии и радиологии Минздрава УзССР, Самаркандском медицинском институте им. акад. И.Л.Павлова, Киевском НИИ нейрохирургии.

Результаты, полученные в диссертации, использованы в преподавании на курсе иммунологии Факультета усовершенствования врачей в Институте иммунологии Минздрава СССР, на кафедра микробиологии 2-го МСШШ им, Н.И.Пирогова, в лекциях, прочитанных автором аспирантам ж ординаторам Института иммунологии Минздрава СССР (1985-1989), слушателям Всесоюзного совещания по молекулярной иммунологии (Петрозаводск, 1987), практическим врачам (Москва, 1986, 1988, 1989).

Работа выполнена в рамках Государственной программы 0.69.07, утвержденной Постановлением ГКНТ СССР и Госплана СССР Л 181/128 от 16.07.81 г.

2- ШЗ

Основные положения, выносимые на. защиту.

1. Индукция иммунорегуляторных В-клеток у мышей возможна следующими путями: А) введением субоптимальных доз ЭБ и ЖС;

Б) обработкой интактных В-клеток селезенки мышей кальциевым ионо-фором А23187 или агглютинином из проростков пшеницы (АШ) на фоне предварительной блокада синтеза простаглаццинов, а также обработкой коклюшным токсином; В) обработкой МНК периферической крова людей А23187.

2. Функциональная активность иммунорегуляторных В-клеток зависит от: А) внутриклеточного содержания циклических нуклеотвдов и циклооксигеназных и липоксигеназных продуктов окисления арахг-доновой кислоты; Б) диаметра клеток; В) наличия на мембране Усу И и рецепторов к лектинам. При этом Усу я+ -В-клетки действуют пу- , тем подавления активации предшественников В-клеток памяти, специфичных к носителю Т-хелперов и ангнтелообразушдих клеток (АОК),

а Ус ¿с й- -В-клетки - путем индукции Т-супрессоров.

3. В селезенке аутоиммунных мышей обнаружены В-супрес*. ¿ры, активность которых связана с секрецией простагландинов.

4. Разработан способ индукции В-супрессоров в периферической крови людей, который используется для оценки иммунного статуса.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Ш и 1У Всесоюзных симпозиумах "Регуляция иммунного гомеостаза" (Ленинград, 1982; Суздаль, 1986), I Всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная иммунология" (Москва, 1982), I Белорусской иммунологической конференции (Витебск, 1982), У Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ (Рига, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике" (1Ърький, 1983), УП и ЗХ научных конференциях "Факторы клеточного и гуморального иммунитета

при различных физиологических и патологических состояния" (Челябинск, 1984, 1988), 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985), семинаре "Актуальные проблемы иммунологии" в АН СССР (Москва, 1987), научной конференции "Пютобиология в теоретической и практической медицине" (Москва, 1987), Международной конференции "Возрастные изменения в иммунном балансе" (Ташкент, 1987), Объединенном Пленуме научного совета по иммунологии АМН СССР и проблемной комиссии "Общая и прикладная иммунология" (Киев, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в которых отражено основное содержание диссертации. Получено одно авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена, на страницах машинописного текста, включая таблиц и ри-

'сунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, изложенных в 6 главах, заключения и выводов. Библиография включает отечественных и зарубежных источников.

Место выполнения работы. Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР. По отдельным разделам работы осуществлялось сотрудничество с кафедрой микробиологии 2-го МОЛШИ им. Н.И.Пирогова, МНИИЭМ им. Г.И.Габричевского, МГУ им. М.В.Ломоносова, ВОНЦ АМН СССР, Институтом биоорганической химии им.И.И.Шемякина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Экспериментальная работа на мышах проведена с использованием линий СВА, с5?вь/6, (СВА х X С57ВЬ/б (сокращенно ),ВАДВ/с, ВАЛД/с-пи/пи, АКИ, N23

и шь/1 , Источником комплемента служила сыворотка крови кроликов породи Шиншилла и морских свинок. Приготовление клеточных

суспензий и определение жизнеспособности проводили общепринятыми способами. Все эксперименты со спленоцигааш проводили после освобождения от прилипающих клеток, которое осуществляли 2-3-краг-ной сорбцией на пластиковых чашках Петри; примесь клеток, несущих оС -нафтилацетат-эстеразу ( Yam et al., 1971), составляла 2-3$.

Популяцию, обогащенную В-клетками, получали 2 основными способами: I) в 2-эталной цитотоксической реакции (ЦГР) с монокло-нальными (МКАТ) анти- Thy 1.2-антителами или с асцитом, полученным в результате &-кратной иммунизации мышей akr тимоцитами мышей СБА, и сзехим нетоксичные кроличьим комплементом; 2) пэннш-гом на пластике (Wysocki, Sato, 1978) с использованием РСаЪ')^ фрагментов кроличьих аффинно очищенных антител против иммуноглобулинов мышей, предоставленных А.Д.Черноусовым а М.И.Карсоновой (Институт иммунологии Минздрава ССОР). Популяция, не прикреплявшаяся к сорбенту (ig -клетки), служила источником Т-клеток. От мертвых клеток освобождались центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина плотностью 1,099 с 0,1% азидом i. хтрия ( Davidson .Pariah, 1975). Степень обогащения оценивали в реакции непрямой иммунофдуоресценции с использованием меченных изотио-цианатом флуоресцеина соответствующих антител. Использованные метода позволяли получить обогащение до 90-98/S.

Фракционирование В-клеток по размеру осуществляли седиментацией в поле тяжести 1 g на установке типа "Станут" ( Miller, Phillips, 1969). Фракционирование В-клеток на клетки, содержащие и не содержащие Fey к проводили методом пэннинга на пластике, в котором в качестве сорбента использовали агрегированный нагреванием человеческий igG полученный методом ионообменной хроматографии (Б.В.Динегин с соавт., 2985). Фракционирование спленощ-тов на клетки, содержащие ж не содержащие рецепторы к лектшам, ------------------тттт!1г.пптоо i-mo -и тгях7йг!твй еотэбента

использовали следующие лектины: конканавалин А (КонА), агглютинин из проростков пшеницы (АЛИ), агглютинин из соевых бобов (АСБ), агглютинин из арахиса (АА) и агглютинин из улитки Helix pomatia (АУХП). Количественное определение в клетках цАЩ, цП© и простагландина Е проводили с помощью соответствующих ра-даоиммунологических наборов.

Способы индукции иммунорегуляторннх В-тслеток и тестирования их активности. Индукцию иммунорегуляторных В-клеток проводили однократншл внутрибрюшинным введением мышам 50 млн ЭБ и тем же способом - 50 мкг ЛПС, вццеленного из Shigella aonnsi методом Вестфаля, штамм 9090, серия 547 (предоставлен В.И.Левенсо-ном, МНШШ им. Г.И.Габричевского). Индукцию в системе гаптен-носитель проводили таким образом, что В-клетки получали от мышей, примированных носителем - ЭБ и от мышей, премированных гаптеном -тринитрофенилом' (ТНй), для чего ¡¿там вводили дважды конъю-гат тринитробензенсульфоновой кислоты с кроличьим гамма-глобули-нил. Т-клетки, примированные носителем, получали от мышей, примированных ЭБ. Реципиентов иммунизировали конъюгатом ТНФ-ЭБ, а ответ тестировали по числу АОК протиз ТНФ, конъюгированного с эритроцитами лопади, не реагирующими перекрестно с ЭБ. В периферической крови людей иммунорегуляторные В-клетки индуцировали путем инкубации Ш1К, ввделенных центрифугированием гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколла-верографина плотностью 1,077, с кальциевым ионофором A23I87 (10 мкМ) в течение 10 мин при 37°С с последующим тщательным отмыванием от ионофора и облучением индуцированных клеток в дозе 20 Гр.

Тестирование функциональной активности дедуцированных клеток у мышей проводили в системе адоптивного иммунитета с использованием летально облученных сингенных мышей или необлученных'

сингенных, полуаллогешшх или аллогенных мышей либо в культуре J- «У

клеток in vitro , Подсчет числа АОК проводили в селезенках реципиентов в реакции 1£не с модификациями (А.Р.Акрамов с соавт., 1985) против ЭБ или ТНФ, конъюгированного'с эритроцитами по методу Rittanberg и Pratt (1969). Облучение проводили на установке "Стебель За" (I37Cs , мощность дозы 5,5 Гр/мин). Анализ эффекта В-клеток в культуре клеток in vitro проводили в тест-системе, содержащей либо нормальные клетки селезенки (в опытах на мышах), либо МНК периферической крови людей. Культивирование проводили в течение 72 ч при 37°С в воздушной среде, содержащей 5% С02, в ср^де rpmi-1640 ("Flow ") с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коровы (" Plow"), 1 -глутамина (2мМ), hepes -буфера (10мМ; " Serva"), 2-эдеркаптоэтанола (5 х Ю-5 М; "Serva ") и гентамицина (100 мкг/мл; "Гедеон Рихтер"). В опытах со спленощ,-таш мышей в культуры вносили КонА (15 мкг/мл; " Sigma") или ЛГИ (20 мкг/мл; "Difco "), в опытах с МНК крови лвдей - фитогемагглк тинин (ФГА; 5 мкг/мл; " Sigma") или митоген лаконоса (15 мкг/мл; " sigma"). За 6 ч до окончания культивирования в культург вносили 3Н-тимидин. Результаты оценивали определением индекса стимуляции (ИС) - частное от деления числа имп./мин в опытной группе к числу имп./мин в контроле (без добавления митогена).

Статистическую обработку данных и расчеты достоверности проводили общепринятыми методами вариационной статистики. Результаты представлены в виде ы - mt при р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ

Иммунорегуляторные В-клетки, индуцированные in vivo эритроцитами барана. Основная часть экспериментов, кроме специально проведенных серий, включала в себя следующие условия: внутрибрю-шинное введение мышам-донорам СБА или ^ 50 млн ЭБ на мышь, извлечение селезенок через 7 или 14 суток, освобождение суспензии

спленоцитов от лршшдавдих к пластику клеток, получение обогащенной В-клеткаш популяции в ЦТР с анти-ТЬу I.2.-MKAT, введение сингенным необлученным реципиентам 25 млн донорских В-клеток на мышь, одновременную иммунизацию 200 млн ЭБ и определение через 4-5 дней в селезенках igM -А0К.

В этих условиях В-клетки подавляли ответ реципиентов на 50-90$. Получены следующие доказательства В-клеточной природы супрессоров: I) они не прилипают к пластику; 2) сохраняют активность после обработки в ЦТР анти- тьу1.2-сшзороткой и анти- Thy I.2-MKAT, антитимоцитарной сывороткой и ее глобулиновой фракцией, анти-Lyt 2-, анти-13Т4 или анти-Lyt I.I-MKAT, смесью ан-ти-Shy 1.2- и анти- Lyt 2-МКАТ; 3) напротив, они частично или полностью теряют активность после аналогичной обработки антигло-булиновой сывороткой, антисывороткой против спленоцитов "В-мы-шей" и глобулиновой фракцией этой.сыворотки, анти-1-Ак-!ЖАТ (в опытах на мышах СВА); 4) при электрофорезе на приборе "Пармо-кг шт-2" (эксперименты проведены совместно с А.М.Сапокниковым, Институт иммунологии Минздрава СССР) супрессорной активностью обладают только низкоподвижные фракции; 5) после разделения донорских спленоцитов пэннингом на сорбенте cP(ab»)2 -фрагментами кроличьих антител против иммуноглобулинов мышей супрессорной активностью обладали только ig+ -клетки.

Исследования кинетики формирования и зависимости эффекта от дозы показали, что В-супрессоры появляются в селезенке доноров не ранее, чем через 7 дней и сохраняются по меньшей мере в течение 21 дня (время наблюдения) после инъекции донорам 50 млн ЭБ. Важно, что в этих условиях не происходит формирование Т-супрес-соров. Более того, Т-клетки, полученные через 14 дней после иммунизации доноров, вызывали увеличение числа АОК в селезенке реципиентов на 61%. При использовании разных доз ЭБ для иммуниза-

ции доноров и стандартного срока получения В-клеток (7-й день после иммунизации) обнаружено, что формирование В-супрессоров происходит при введении донорам 500 и 50 млн ЭБ, но не 5-0,05 млн ЭБ на мша. При введении донорам 500 млн ЭБ в селезенке образуются также Т-супрессоры.

Функциональная активность иммунных В-клеток зависела от того, какие использовались реципиенты. Во всех случаях введение В-клеток необлученным реципиентам сопровождалось супрессий их ответа на ЭБ, сила которой (в диапазоне доз от 50 до 10 млн В-клеток на ишь) прямо пропорционально зависела от числа введенных реципиентам клеток; в дозе 5 млн на мышь донорские В-кгэт-ки были неэффективны. Напротив, если В-клетки вводили летально облученным реципиентам совместно со стандартным числом нормаль- , ных спленоцитов, то ни в одном из опытов не получали суп-

рессии ответа на ЭБ. Более того, в некоторых случаях наблюдали стимуляцию ответа.

Иммунорегуляторная активность иммунных В-клеток связсла также с их диаметром. Эту зависимость удалось проследить с использованием такого методического приема, как фракционирование клеток в поле тяжести 1 е . Обнаружено, что В-супрессоры есть в селезенках уже через 3 дня после инъекции антигена - они располагались среди самых мелких, медленноседшлентирущих клеток. Однако суп-рессорный эффект был слабым, хотя и статистически значимым - ответ реципиентов снижался на 32,4$. Среди клеток, полученных через 7 дней после иммунизации, супрессорной активностью обладали и несколько более крупные клетки, но наиболее сильный эффект вновь давали самые мелкие клетки. Если использовали облученных реципиентов, то супрессорный эффект давали только самые мелкие клетки, а более крупные клетки стимулировали ответ.

г

- 15 -

соров к различным препаратам, которые вводили донорам в различные сроки относительно иммунизации их 50 млн ЭБ. В-клетки получали через 7 дней и вводили необлученным реципиентам в дозе 25 млн на мышь. Обнаружено, что если донорам одновременно с иммунизацией вводили ингибиторы синтеза ДНК метотрексат (2,5 мг/кг), 5-фтор-урацил (100 мг/кг), цитозар (1000 мг/кг), митотический ад вин-бластин' (1,5 мг/кг) или миелопид (5,0 мг/кг), то в этих условиях В-клетки сохраняли свою супрессорную активность. Если препараты вводили через 5 дней после иммунизации, то донорские В-клетки частично или полностью теряли супрессорную активность. Миелопид вновь был неэффективен. Введение тактивина (250 мг/кг) одновременно или через 5 дней после иммунизации отменяло формирование В-оупреосоров. Введение циклофосфамвда во всех опытах (за I день до иммунизации доноров в дозе 20 мг/кг, либо одновременно или через 5 дней в дозе 200 мг/кг) полностью отменяло формирование В-супрессоров. Среди препаратов, которые вводили 3 дня подряд в разные сроки относительно иммунизации доноров ингибитор тром-боксансинтетазы -046 (5,0 мг/кг) не давал эффекта; ингибитор одклооксигеназы индометацин (1,5 мг/кг) и ингибитор липоксигена-зы нордигидрогуаиаретовая кислота (НДГК; 5,0 мг/кг) не влияли на формирование В-супрессоров при их введении до антигена, но если их вводили в разные сроки после иммунизации, то наблюдали частичную или полную отмену образования В-супрессоров.

Следующей задачей было выяснить зависимость эффекта иммунных В-клеток от наличия на мембране R, играющих ключевую роль в способности В-клеток, индуцированных иммунными комплексами, синтезировать sbf -"супрессорный В-клеточный фактор" (Мази-da et alI978; uiyama-inaba et al., 1987). Использовали В-клетки, взятые через 7, 14 или 21 день (получали одинаковые результаты)

после иммунизации доноров 50 млн ЭБ. После фракционирования до-Ч- 1323

\

норских клеток седиментацией в поле тяжести 1 & оказалось, что

11 -В-клетки являются крупныш, быстроеедиментирующими клетками , стимулирующие иммунный ответ реципиентов на ЭБ. Напротив, Рсу к+ -В-клетки локализовались среда мелких, медаенноседименти-рующих клеток, подавлявших ответ. Выявленные отличия могли зависеть от участия или не участия клеток-посредников в супрессорном действии В-клеток. ^¡днныe литературы говорят о том, что такими посредниками могут быть Т-лимфоциты (Са1с±в еъ а1. 1982; БЫшаши-га оЬ ей., I982). Для изучения этого вопроса в качестве инструмента был выбран циклофосфагчд, в отношении которого известно, что при введении в низких дозах (10-20 мг/кг) за 1-2 суток до иммунизации он избирательно элиминирует популяцию предшественников Т-супрессоров (1/7Ма1ег, Б1;оЪо, 1978). Показано, что если мышам— . реципиентам за 24 ч до инъекции им донорских иммунных В-клеток ввести 20 мг/кг циклофосфамида, то в этих условиях происходит полная отмена супрессии. Это означает, что супрессорное действие В-клеток, вероятно, опосредовано взаимодействием с клеткаи, чувствительными к низким дозам циклофосфамида. Эти клетки были найдены среди интактных Т-клеток, поскольку одновременное введение реципиентам (получившим предварительно циклофосфашд) иммунных В-клеток и интактных Т-клеток частично восстанавливало супрессию ответа, отмененную циклофосфамидом. Если вместо Т-клеток вводили интактные В-клетки, то напротив, регистрировали стимуляцию ответа.

Необходимо было установить, какая из двух субпопуляций иммунных В-клеток ( Рсу или Рс^ и" ) является индуктором Т-по-средников супрессии. С этой целью использовали систему двойного переноса: у доноров через 7 или 14 дней после введения им 50 млн ЭБ получали Рсу й+ и Рс^ н~ -В-клетки и вводили их промежуточным реципиентам вместе с ЭБ. Через разные сроки из селезенок

получали Т-клетки и вводили их другим мышам вместе с 200 млн ЭБ, после чего определяли число АОК. Обнаружено, что совместное введение промежуточным реципиентам нефракционированных иммунных В-клеток и ЗБ сопровождается появлением на 3 сутки Т-клеток, способных при переносе другим реципиентам подавлять их ответ на ЭБ. На этой модели показано также, что индукторами Т-супрессоров являются только Роу R~ -иммунные В-клетки. В свою очередь, ■Усу а+ -клетки являются, вероятно, "прямыми" супрессораш, поскольку было показано, что способностью подавлять формирование популяций В-клеток памяти, специфичных к носителю Т-хелперов и АОК обладали только Fey Е+ -В-клетки. Кроме того, Fcjf R+ -В-клетки подавляли ответ на ЭБ не только у сингенных, но и у аллогенных реципиентов, а Fey й~-В-клетки были неэффективны. Наконец, Fe ¡J R+ -В-клетки от мышей, иммунизированных ЭБ, подавляли иммунный ответ сингенных необлученных реципиентов не только на ЭБ, но и на эритроциты лошади и овальбумин.

Полученные результаты дают основание сделать вывод о существовании двойного механизма В-супрессии, зависящего от Fc^R: Т-супрессоривдуцирующей активностью обладают Fey R™ -В-клетки, действующие антигенспецифично и H-2-рестриктированно. Они являются крупными, быстроседиментирующими в поле тяжести 1 g клетками и выполняющими, по-видимому, функцию В-клеток памяти. Известно, что В-бласты и В-клетки памяти могут быть индукторами супрессоров ( l'Age-Stehr et al. 1980; Kennedy, Thonas, 1983), вероятно, за счет способности представлять антиген Т-супрессорам или их предшественникам (Shimamura, Yoshida, 1988). С ДРУГОЙ стороны, Fey R+ -В-клетки способностью индуцировать Т-супрессоры не обладают. Очевидно поэтому, их супрессорное действие является анти-геннеспецифичным и H-2-нерестриктированным и заключается, возможг-но, в прямом подавлении активации и/или пролиферации предшествен-

ников АОК, B-клеток памяти и Т-хелперов.

Исследована также зависимость эффекта иммунных B-клеток от наличия на мембране рецепторов к лектинам - КонА, АШ, АА, АСБ и АУХП. Их выбор объясняется двумя основными причинами - способностью каждого из них быть маркером ели индуктором различных оубпо-пуляций иммунорегуляторных клеток ( Sharon 1983) и тем, что сахара, специфичные для этих лектинов,'особенно специфичный дая КонА D -маянозид и специфичный для АШ я-ацетил- D-глюкозамин, вероятно, входят в состав Рсу н (А.И.Мартынов, Б.В.Бинегин, 1987). Разделение иммунных В-клеток; полученных через 7 дней после инъекции 50 млн ЭБ, на клетки, содержащие и не содержащие рецепто!j к лектинам, проводили методом пэнвинга. В этих опытах удалось показать, что супрессорной активностью обладали иммунные спленоци- -ты, содержащие рецепторы к КонА и АШ1 и лишенные рецепторов к другим использованным лектинам. Исследование зависимости эффекта от дозы обнаружило, что применение КонА+~, АШГ1"-, АС"-, АА~- и АШГ-хлеток позволяет обогатить донорские спленоциты cynptjcopa-ми примерно в 5 раз. Во всех случаях супрессорной активностью обладали В-, но не Т-клетки. Полученные данные позволили предположить, что В-сулрессоры, образующиеся при иммунизации мышей субоптимальной дозой ЭБ, характеризуются присутствием на мембране D-маннозы и я-ацетил- D-глюкозамина в формах, доступных для воздействия с КонА и АШ, и отсутствием на мембране D-галактозы и N -ацетил- D-галактозамина в формах, доступных для воздействия с АСБ, АА И АУХП.

С целью изучения механизма действия проведен ингибиторный анализ способности иммунных B-клеток к реализации своей функциональной активности. Ддя этого B-клетки, полученные через 7 дней после инъекции 50 млн ЭБ, обрабатывали m vitro различными веще-

ным реципиентам, иммунизировали их ЭБ и подсчитывали число АОК.

4 Показано, что обработка митомицином С (25 мкг/мл), актиномицином И (5 мкг/мл), колхицином (10 мкг/мл) или циклогексишдом (25 мкг/мл) слабо влияла на способность иммунных В-клеток супрессиро-вать ответ реципиентов. Такой же эффект давало облучение доноров в дозе 8,5 Гр за 4 ч до получения от них В-клеток. Следовательно, иммунные В-клетки'не теряют супрессорной активности при подавлении в них процессов деления, синтеза ДНК, РНК и белка. Если связывать их эффект с активностью какого-либо фактора, то тогда необходимо допустить, что к 7 даю он уже наработан и в организме реципиента происходит лишь его высвобождение. Не исключено, однако, что процессы синтеза белка, в частности, восстанавливаются через некоторое время в В-клетках после их трансплантации реципиентам, так как циклогексимид является обратимым ингибитором синтеза белка.

Поиск медиатора супрессии был проведен среди продуктов окис-лс-шя арахидоновой кислоты и циклических нуклеотидов - вторичных мессенджеров их действия на клетку, основываясь на известной способности этих веществ быть ингибиторами иммунного ответа (Ооо<1«1п в1*- а1. ,1980; Сеиррепа et а1. 1980). В предварительных экспериментах цри использовании суспензии спленоцитов, содержащих не более 2% макрофагов, была доказана способность использованных анализаторов оказывать такой же эффект, какой был известен для них в отношении макрофагов (ОоМупв, Б1;оъо, 1981). Так, уровень цШФ повышали дабутирил цШФ, ацетилхолш и левамизол. Уровень цАШ увеличивался под влиянием дабутирил цАМФ, ПЕЕ^, изопротеренола, ЛПС, коклюшного токсина. Напротив, уровень цАШ снижали пропранолол и квдометацин. Содержание ПГЕ увеличивали арахидоковая кислота, дабутирил цАМФ, изопротеренол, ЛПС, тоофлллин, коклюшный токсин и

АПП; левамизол и пропранолол снижали его уровень, а индокетащш 5• ад

отменял способность ЛПС увеличивать содержание ПГЕ. Эти результаты касаются популяции клеток, обедненной макрофагами. Однако В-клетки также, вероятно, способны синтезировать НЕЕ. Например, если нещишшающие спленоциты мышей BALB/c-nu/nu после 3-кратной сорбции на пластике и обогащения В-клетками в ЩР с анти-I.2-MKAT обработать АШ (10 мкг/мл), то уровень ПГЕ возрастал в 3-5 раз. Кроме того, опыты с человеческой В-клеточной линией ijj-9 показали, что уровень ПГЕ в них увеличивался в прямой зависимости от концентрации клеток. Эти данные можно рассматривать как доказательство способностт В-клеток синтезировать ПГЕ.

Что касается лейкотриенов, то методом высокоэффективной иг. костной хроматографии (эксперименты проведены оовместно о Г.Ф. Судьиной, ЖУ им. М.В.Ломоносова) нам не удалось их обнаружить в . исследуемых клетках. Это может быть связано либо с тем, что уровень лейкотриенов в клетках, обедненных макрофагами, ниже чувствительности метода, либо с тем, что такие клетки без дополнительной стимуляции не синтезируют лейкотриены ( Daviea, 1987). поэтому о зависимости эффекта от уровня лейкотриенов судили только с помощью специфического ингибитора липоксигеназы НДГК, так же, как о зависимости эффекта от уровня тромбоксанов судили с помощью ингибитора тромбоксансинтетазы oky -046.

Показано, что частичную или полную отмену супрессорного действия иммунных в-клеток наблюдали после их контакта с агонист&ш цАМЗ изопротеренолом, дибутирил цАШ, ЛПС, теофшшшом и гистами-ном, агонистом цГМФ левамизолом, а также НДГК (рис.1). Обработка донорских в-клеток дибутирил цШФ и другим агонистом цШФ ацетил-холином сопровождалась появлением у них иммуностимулирующей активности. Напротив, индометацин и агонист цАМФ коклюшный токсин усиливали супрессорное действие иммунных в-клеток. Препарат oky-046 был неэффективен. Поскольку в этих опытах агонисты пАМФ и пШ1>

ЮО АОК%

к

дибутирил цАМФ

изапротерснал

теофиплин

липопалиазхарид

гистамин

дибутирил цГМФ оцетилколин

мебамизол

индометацин

НДГК

ОКУ-О^в

кокп. токсин

шж

щ

ШПЕ

шт

ЗЭ

кг

шин

шш-1

ПТТШВН

ИЗ"

Е-

Рис.1. Ингибиторный анализ функциональной активности иммунных В-клеток.

Даны значения ^в^-АОК в селезенках мышей в процентах к контролю (введены ингактные В-клетки), принятому за 100$. К - контроль супрессии (введено 25 млн В-клеток от иммунных доноров). Всем реципиентам введено по 200 млн ЭБ.

снижали или отменяли сулрессорный потенциал иммунных В-клеток (за исключением коклюшного токсина), мокно предположить, что меэду содержанием циклических нуклеотидов в этих клетках и их супрессор-ной активностью существует обратная зависимость. Способность ин-дометацина усиливать супрессорное действие иммунных В-клеток говорит против участия ПГ в качестве возможных медиаторов В-супрессии. Напротив, отмена их активности НДГК свидетельствует о том, что такими медиаторами могут бить зависимые от липоксигеназы продукты окисления арахцдоновой кислоты. Наиболее вероятным кандидатом на эту роль является так называемый "иммунный" лейкотриен В4.

' Иммунорегудяторные В-клетки. индуцированные in vivo лрттп-полисахаридом. Использовали однократную внутрибршшнную инъекцию 50 мкг ЛПС на мышь - в этих условиях он вызывал выраженный поли-клональный иммунный ответ, характеризующийся высоким уровнем АОК против ТНФ и ЭБ, циркулирующих иммунных комплексов, значительной пролиферативной активностью клеток селезенки и зависимой от времени чувствительностью к цитозару и винбластину (А.Р.Акрамов с соавт., 1987).

Показано, что в интервале мезду 3 и 7 сутками после введения ЛПС мышам P.J з селезенке обнаруживаются не прилипающие к пластику В-клетки, способные в системе переноса облученным или необлучрч-ным реципиентам стимулировать их ответ на ЭБ в 2,3 - 5,4 раза. Эти клетки обладают следующими свойствами: I) процесс их формирования у доноров чувствителен к винбластину при введении его в дозе 1,5 мг/кг одновременно, но не через 5 дней после ЛПС; 2) они резистентны к обработке in vitro митомицином С; 3) по способности к кооперативному воздействию с интактными Т-клетками от"я не отличаются от интактных В-клеток; 4) клетки, резистентные к анти-тьу I.2-MKAT (ТЬу 1.2~-клетки) и ig+ -клетки обладают равной иммуностимулиругадей активностью; 5) после разделения Нцг 1.2""-клеток на Fc¡r R+ и R" -клетки первые подавляли ответ облученных реципиентов на ЭБ в 2 раза, а вторые, напротив, стимулировали его в 3,3 раза; 6) 1.2~-клетки резистентны к анти-Lyt I.I- и анти-Ьу* 2-МКА.Т, но чувствительны к анти-1-Ак-МКАТ и ан-гиглобулиновой сыворотке; 7) после разделения тьу1.2~-клеток на фракции, различающиеся по скорости седиментации в поле тяжести 1 s, иммуностимуляторы располагались среди клеток с высокой и вредней скоростью седиментации (рис.2, фракции Б и В); напротив, слетки с низкой скоростью седиментации были супрессорами (рис.2,

- Zá -

Рис.2. Седиментационный профиль В-клеток мышей , индуцированных in vivo MG, после фракционирования в поле тяжести 1 g и их функциональная активность. По оси абсцисс - номера фракций; А, Б и В - обозначения объединенных фракций, использованных для переноса облученным реципиентам. I - скорость седиментации; П - диаметр клеток.По левой оси ординат - число клеток во фракциях; по правой - число ign-AOK в селезенках реципиентов в процентах к контролю (введено 10 млн нормальных клеток селезенки), принятому за 100$. Клетки каждой фракции вводили в дозе 5 млн вместе с 5 млн нормальных спле-ноцг -ов.

лялся в сингенной, полуаллогенной и аллогенной тест-системах, то

есть не был подвержен Н-2-рестрикции; 9) они обладают способностью восстанавливать иммунный ответ реципиентов на ЭБ, подавленный цитозаром; 10) их индукторами могут быть иммунные комплексы, так как пул'овые сыворотки, полученные через 5-7 дней после инъек-

ции донорам ШС и введенные промежуточным реципиентам, индуцировали у них через 24 ч (но не через 72 ч) появление В-клеток, стимулировавших ответ вторых реципиентов на ЭБ.

Таким образом, в гетерогенной популяции поликлонально активированные В-клеток, наряду с клетками, продуцирующими широкий спектр антител и аутонатител ( Izui et al.,i98I), находятся также клетки, обладающие способностью и стимулировать, и подавлять иммунный ответ на ЭБ. Иммуностимулирующие клетки, эффект которых превалирует при введении реципиентам нефракционированных донорских В-клеток, являются крупными, быстроседаментирующими клетками с фенотипом Thy 1.2", 1g+, Fcj R~, Ia+, Lyt 1.1", Lyt 2~. Супрессорные клетки являются мелкими, медаешоседиментирующими ТЬу 1.27, 1g+, Fc¡( R+ -клетками.

Кмг.1УНорегуляторше В-клетки. иншпптрованные in vivo в системе гадтен-носитель. При введении облученным реципиентам 5 млн Т-клеток, примированных носителем (ТдБ) и В-клеток, примирован-ных галтеном (В-щ$) вместе с 200 млн. конъюгата ЭБ-ТНФ число le11 -АОК против ТНф на S день ответа реципиентов составило 2900,0 * 480,0. Дг*авление к этим клеткам 5 млн В-клеток, прими-рова..ных носителем (Bgg) увеличивало ответ в 3,4 - 3,8 раза, а добавление интактшх В-клеток - в 1,7 - 2,2 раза. Обработка ig+ -ВЭБ в ЦТР анти- 1.2-ЩАТ не влияла, на их хелперкую активность, а обработка антиглобулиновой сывороткой - полностью отменяла. После разделения ig+ -ВдБ на Fe у R+ и Ро^ й~-клетки первые не влияли на ответ, который давали Tgg + В^ф, а вторые стимулировали его в 3,8 - 4,5 раза. Таким образом, примированные носителем не прилипающие к пластику lg+ , Foy R~ -В-клетки давали в испытанной системе выраженный хеллерный эффект при ответе мышей на галтен.

й.мунорегудято^'ме В-клетки. кнчушпзованные in vitro различными препаратами. Набор веществ и условия постановки опытов были теш же, что и при ингибиторном анализе ЭБ-ивдуцированных В-клеток, но здесь испытывали интактные В-клетки. Кроме того, в части опытов был использован другой подход; клетки инкубировали с тем или иным ингибитором ферментов, окисляющим арахидоновую кислоту, а затем клетки стимулировали некоторыми лектинами или кальциевым ионофором A23I87.

Полученные результаты можно условно разделить на несколько групп. В 1-й из них В-клетки, обработанные in vitro некоторыми веществами, приобретали способность усиливать иммунный ответ син-генных реципиентов на ЭБ. Такой эффект давали В-клетки после обработки левамнзолом (40 мкг/шг), ацетилхолином (Ю-® М) и дибутирил цШ> (Ю-6 М). В другой группе слабой и не во всех опытах воспроизводимой иммуностимулирующей активностью обладали В-клетки после обработки супероксиддисмутазой (0,1 мкг/мл), теофиллином (3,0 мМ), изопротеренолом (100 мкг/мл), дибутирил цАШ (Ю-6 М), индометацином (200 мкг/мл) и интерлейкином 1<с (10 ед/мл; предоставлен СоА.Кетлинским, ВНИИ особо чистых веществ, Ленинград). В третьей группе обработка В-клеток не меняла их активности. К этим препаратам отнесены интерлейкин Iр ¡(10 ед/мл), фактор некроза опухолей (предоставлен Р.Л.Турецкой, ЙБ01 игл.И.И.Шемякина) и фактор Т-супрессорной гибридомы p1.2g4.K (предоставлен А.Д.Черно-усовым, Институт иммунологии Минздрава СССР). Наконец, коклюшный токсин (0,2 i :г/мл) индуцировал у интактных В-клеток появление супрессорной активности (рис.3).

В дополнительных опытах коклюшный токсин проявил себя как мощный супрессориндуцирующий агент. Показано, что супрессорной активностью обладали: I) спленоциты, лишенные прилипающих к пластику клеток; при этом клетки, введенные реципиентам сразу после

AQUÍ, 300

лобакядал

ацетмолин

faSymúfxifí цГМФ

суперокси&ялутоза

ювсфипдин

икпротеремал

Ъибутирил цШФ

индометацин

онтерле' чн U

интерлейкин 1j¡

атропин

фаопар некроза Ъпдолеи

фоктср F1.20k К ЛСЛУ7, токсин

Рис.З. Индукция иммунорегуляторных B-клеток ia vitro

Даны значения -АОК в селезенке мышей в процентах к контролю (реципиентам введены B-клетки, не обработанные веществагли), принятому за 100$. Реципиентам введено по 200 млн ЭБ у млн B-клеток, обработанных указанными веществами.

обработки токсином (тщательно отмытые от него), подавляли ответ реципиентов на ЭБ в 2,1 раза, а клетки, прокультивированные в точение 18 ч в среде без токсина, подавляли ответ в 2,8 раза; 2) B-клетки, отмытые от токсина, подавлявшие ответ реципиентов на 58$; 3) супернатанты, полученные в результате культивирования в течение 18-24 ч спленоцитов и В-глеток, которые была предварительно проинкубированы с токсином в течение 60 шц и затем тщательно отмытые от пего. Эти супернатанты подавляли РВТ сивгещщх спленоцитов на КонА в 6,0 - 12,7 раза и на 1П0 - в 1,5 - 9,1 раза; 4) интактные lg"* -клетки, обработанные в течение 60 í,uh теш

же супернатантами, отмытые от них и введенные в дозе 5 млн клеток на мышь облученным реципиентам вместе с 10 млн НКС, подавлявшие ответ на ЭБ в 2,1 раза,

В опытах о двойной обработкой интактных клеток показало, что использованные ингибиторы сами по себе не меняли активность В-клеток. Если, однако, В-клетки мышей или спленоциты мышей nu/nu предварительно обработать индометацином или аспирином, то после добавления A23I87 или АШ все эта клетки приобретают способность подавлять иммунный ответ на ЭБ после переноса необлучен-ным реципиентам (табл.1). Отсюда следует, что предварительное подавление синтеза ПГ (обратимое в случае с индометацином и необратимое в случае с аспирином) и последующая активация клеток кальциевым ионофором A23I87 или немитогенным лектином АШ создает условия, индуцирующие у клеток способность быть супрессорами. Такими клетками, являются, вероятно, В-клетки, так как Т-клетки в аналогичных условиях супрессорной активностью не обладали. Другой использованный лектин - ФГА в комбинации с индометацином был неэффективен, но сам по себе обладал слабым супрессоривдуцирую-щим действием. Обработка клеток НДГК отдельно или в комбинации о A23I87 не влияла на их активность (табл.1). Следовательно, предварительная блокада липоксигеназы (в отличие от предварительной блокады циклооксигеназы) не приводит к индукции В-супрессоров.

Иммунорегуляторные В-клетки у мышей о врожденной аутоиммунной патологией. Использовали неприлипающие к пластику В-клетки селезенки ин.актных мышей линий nzb и mri/1 - юных в возрасте 4-6 нед. и взрослых - в возрасте 24-28 нед. Опыты проводили в системе адоптивного иммунитета. Мя мышей nzb реципиентами служили мыши hzb в возрасте 6-8 нед., для мышей jjrl/l - Н-2к гал-лоидентичные мыши линии СБА в возрасте 8-10 нед. Необлученным реципиентам вводили по 25 млн В-клеток на мышь, облученным - по

Таблица I

Индукция иммунорегуляторных В- и Т-клеток in vitro фармакологическими препаратами

Клетки Г Вещества, которыми об-| рабатывали клетки перед } переносом реципиентам ! ! {Число АОК в селе-¡зенке мышей ¡в процентах к ¡контролю, принятому за ЮСЙ

_ 100,0 ± 11,5

Индометацин 120,6 ± 14,7

Аспирин 81,1 ± 9,7

АПП 99,7 ± 7,9

НДГК 93,2 ± 11,3

А23187 78,9 ± 9,8

В-клетки ФГА 71,9 ± 8,7*

Ивдометацин + А23187 57,7 ± 6,3й

Индометацин + АНН 51,4 + 6,7*

Идцометацин + ФГА 80,7 ± 10,2

Аспирин + А23187 49,8 ± 6,9^

Аспирин +'АШ 53,9 ± 5,3*

НДГК + А23187 84,5 ± 8,4

ВДГК + А1Ш 96,3 ± 11,4

- 100,0 ± 11,9

Спл^ноциты А23187 95,0 ± 8,2

nu/nu Индометацин + А23187 57,3 ± 5,1х

_ 100,0 ± 8,9

А23187 109,6 ± 15,0

Т-клетки АШ 130,8 ± 15,5*

Индометацин + А23187 110,0 ± 15,8

Индометацин + АШ 140,0 ± 15,I*

Даны значения '101 -АОК. Реципиентам введено по 200 млн ЭБ и

25 мхн клеток.

Звездочка - разница между опытом и контролем статистически значима при р « 0,05.

10 млн вместе с 10 : ш сингенных в отношении реципиента НКС или Т-клеток. Всем реципиентам вводили по 200 млн ЭБ и подсчитывали число АОК.

Показано, что В-клетки взрослых мышей nzb супрессировали ответ юных сингенных мышей на ЭБ на 67,05?, а. В-клетки взрослых мшей MRL/1 подавляли ответ мышей GBA на 68,2%. При использовании летально облученных реципиентов получены другие результаты: В-клетки взрослых мышей nzb полноценно отвечали на помощь от НКС или от Т-клеток юных мышей nzb . Напротив, В-клетки взрослых мышей KRI/1 не отвечали на помощь от НКС мышей СБА, а при совместном введении с Т-клетками мышей СБА наблюдали супрессию ответа на 92$.

Как и в опытах с нормальными (неаутоиммунными) мышами проведен анализ содержания циклических нуклеотидов и ДГ вспленоцитах, лишенных прилипающих к пластику клеток. Полученныэ результаты можно суммировать следующим образом: базальный уровень цАМЗ и ПЕЕ повышен у юных мышей uzb и особенно резко (в некоторых опытах - в 10 раз) у взрослых мышей mrz/i . Только юные мыши nzb реагировали адекватно на агонисты и антагонисты цАМФ и ПГ. Уровень ПГЕ

*

в клетках юных мышей шъ/l способен регулироваться лишь частично, а в клетках взрослых мышей MRX/L он почти не регулируем.

Выраженные аномалии в уровне цАЩ и ПЕЕ и его регуляции в обедненных макрофагами спленоцитах аутоиммунных мышей являются, вероятно, одной из причин обнаруженного разнонаправленного действия агонисто_ и антагонистов этих соединений на функциональную активность В-клеток после контакта с ними vitro . Эти опыты проведены на неприлилающих к пластику В-клетках взрослых мышей меь/1, тлеющих, как видно из предыдущих данных, наиболее грубые аномалии. Показано, что способностью отменять супрессорный эффект В-клеток, тестируемый у мышей СБА, обладали такие агонисты

цАМФ, как гистамин и теофиллин. Однако другие его агониоты оказывали иное действие - ЛПС не давал эффекта, а коклюшный токсин, напротив, усиливал В-супрессию. Ее отменял левамизол, но другой агонист цШФ (и, одновременно, антагонист цА№) ацетилхолин был неэффективен. Индометацин полностью отменял супрессорное действие В-клеток. Более того, после контакта о ним В-клетки давали иммуностимулирующий эффект (рис.4). Из этих данных следует, что оупрессорный эффект В-клеток взрослых мышей MHL/1 , по-видимому, не связан о изменением уровня циклических нуклеотвдов, поскольку вещества, снижающие и повышающие их уровень, давали различные и не коррелирующие о их механизмом действия эффекты. В то же время способность индометацина отменять супрессорное действие В-клеток скорее всего свидетельствует в пользу того, что оупрессорный эффект В-клеток мышей шь/1 зависит от наличия в них высокого уровня ПГ.

Это предположение было проверено в экспериментах, в которых использовали 2 системы оценки супрессорного действия В-клеток: I) подавление способности зрелых АОК к высвобождению антител in vitro ; эта система разработана М.С.Бляхер и Г.В.Щуриной (1987) для оценки Т-супрессоров; 2) подавление способности иммунных спленоцатов отвечать на ЭБ в организме летально облученных реципиентов; эта система разработана Suzuki et al.(1983) для оценки активности sbf. в первом случае к клеткам-мишеням, которые представляют собой 10 млн спленоцитов мышей СВА, взятых на пике их иммунного ответа на ЭБ, добавляли на 30 мин при 37°С (после чего

ч

подсчитывали число АОК в реакции Ерне) либо 10 млн спленоцитов и разных субпопуляций В-клеток от интактных взрослых мышей 1JRL/1 либо супернатант, полученный культивированием 10 млн В-клеток мышей MRL/1 в бессывороточной среде при комнатной температуре в течение 60 мин. Во втором случае к клеткам-мишеням, которые пред-

к

индометацин левамизал гистамин теофиллин ацетилхолин липопалисахарид кокл. токсин

Рис.4. Изменение функциональной активности иммунорегуляторных

В-клеток мышей HRL/1 послб обработки in vitro различными веществами.

Даны значения lg!i -AQK в селезенке мышей СБА в процентах к контроля (введены только ЭБ), принятому за 100$. К -контроль супрессии (введено 25 млн В-клеток селезенки взрослых мышей ши</1 , не обработанных веществами). Всем реципиентам введено по 200 млн ЭБ.

ставляли собой 10 млн спленоцитов от иммунных к ЭБ мышей GBA, добавляли на 30 мин при 37°С (затем тщательно отмывали, вводили сингенным облученным мышам вглесте с 200 млн ЭБ и через 6-7 дней подсчитывали число АОК) супернатант, полученный от интактных

В-клеток мышей ШЬ/1 . В качестве дополнительного контроля использовали моноклональный БВР , продукт гибридомы а$.4.44, полученный от ш.уата-1паЪа (Япония).

Показано, что после контакта спленоцитов мышей шь/1 с иммунными клетками-мишенями число АОК среди них не меняется, а В-клетки снижали их число на 44,5$. Среди В-клеток супрессорным действием обладали только Рс^ л+ -клетки. Сходной активностью обладал и супернатант В-клеток, причем бвр был неэффективен. Важно, что ПП^ ч этой системе также снижал число АОК. При тестировании в организме облученных реципиентов обнаружено, что способностью подавлять ответ иммунных спленоцитов на ЭБ обладают супернатант В-клеток мышей ШЬЛ , ДЕЕ^ и концентрированный в 10 раз ЭВР , при этом индометацин отменял супрессорную активность и ПГЕ^, и супернатанта В-клеток мышей ШЯ./1.

Таблица 2

Влияние В-клеток мышей МЮ./1 и юс супернатантов на способность иммунных спленоцитов мшей СБА давать иммунный ответ у летально облученных реципиентов

С^прессорный фактор

| Число I ей-АОК в селезенке реципиентов :в процентах к контролю (группа № I), принятому за 100£

Супернатант В-клеток СБА -

Супернатант В-клеток 1®Ь/1 Супернатант В-клеток Мй1/1 Индометацин звр неконцентрированный -

БВР концентрированный ПГЕз (Ю-6 М)

ПГЕз (Ю-6 м) Индометацин

100,0 ± 14,4 79,9 ± 16,6 48,0 ± 6,9* 89,7 ± 10,1

82.2 ± 14,3

58.3 ± 9,1*

54.4 ± 7,9" 91,2 ± 10,9

Облученным реципиентам введено по 200 млн ЭБ и 10 млн иммунных спленоцитов мышей СБА после обработки супрессорными факторами.

Результаты, порученные в этих и предыдущих опытах говорят о том, что супрессорный эффект В-клеток мышей МК1/1 наиболее вероятно связан с их способностью секретировать и, возможно, синтезировать ПГ, поскольку индометацин отменял их супрессорную активность. Отсюда следует, что механизм супрессорного действия В-клеток мышей ММ1/1 отличается от действия ЭБ-индуцированных В-суп-рессоров и интактных В-клеток, активированных АШ и кальциевым ионофором А23187, который, по данным ингибиторного анализа, связан не с ЯГ, а с липоксигеназными продуктами окисления арахидоно-вой кислоты.

Иммунорегуляторные В-клетки. индуцированные кальциевым ионофором А23187 в мононуклеарах периферической крови людей. Результаты, полученные в предыдущих разделах, свидетельствуют о возможности индукции иммунорегуляторных В-клеток с помощью различных подходов. Один из них, позволивший уточнить роль ПГ в индукции В-супрессоров, состоит в двойной обработке интактных спленоцитов ицдометацином и кальциевым ионофором А23187. Воспользовавшись этим приемом удалось показать, что если МНК доноров крови обработать в течение 2 мин ицдометацином (10 мкМ) ж затем в течение 10 мин А23187 (10 мкМ) при комнатной температуре или при 37°С, затем тщательно отмыть, облучить в дозе 20 Гр и добавить в тест-культуру, содержащую аутологичные или аллогенные МНК и ФГА, то ИС снижался примерно в 2 раза. Если, однако, донорские МНК обрабатывали только ионофором, то наблюдали не меньшее, но, как правило, еще более выраженное подавление РБГ в тест-культурах и на ЗГА, и на вдтоген лаконоса. В аналогичных условиях опыта КонА, ФГА и ми-тоген лаконоса не были способны индуцировать супрессорные клетки.

Таким образом, обработка МНК в течение 10 мин кальциевым ионофором А23187 (5-10 мкМ) сопровождается индукцией супрессорных клеток. Этот метод значительно сокращает время индукции судрессо-

ров в сравнении с традиционным способом получения "КонА-индуциро-ванных супрессоров", занимающим 48 ч, и в многочисленных повторах оказался надежно воспроизводимым. Показано также, что индуцированные ионофором супрессоры являются, вероятно, В-клеткамя, поскольку их эффект лишь частично снижался или не менялся после удаления из МНК клеток, прилипающих к пластику, клеток, образующих розетки с нагруженными нейраминидазой ЭБ, клеток, обработанных в ЦТР панклональными анти-Т-клеточными ЛТ1- и ЛТ7-МКАТ (предоставлены А.В.^клатовым, Институт иммунологии Минздрава СССР) или ОКТЗ-МКАТ. С другой стороны, удаление клеток, чувствительных в ЦТР к 0КВ7-МКАТ, резко снижало супрессорную активность МНК, индуцированных A23I87. Кроме того, такие клетки не обладали ЕК-активностью, которую оценивали по способности клеток-мишеней линии К 562 высвобождать 51Сг после контакта в течение 16 ч с МНК, обработанными A23I87.

Исследование рецепторного аппарата МНК, обработанных A23I87, показало, что они несут на мембране Ро у R , а также рецепторы к КонА и АЛЛ, но лишены рецепторов к АА и АСБ, то есть по фенотипу сходны с B-суп. ссорами, индуцированными ЭБ. В кинетических исследованиях обнаружено, что МНК, обработанные A23I87, способны подавлять РБТ на ФГА в случаях, когда их вносили в тест-культуры одновременно с ФГА, через 2, 6 шш 48 ч после ОГА. Эти данные позволяют исключить утилизацию интерлейкина 2 в качестве возможного механизма действия супрессоров, индуцированных A23I87.

Оценка функциональной активности МНК, обработанных A23I87, в периферической крови больных ревматоидным артритом, гило- и агаммаглобулинемией показала, что подобный прием также позволяет обнаружить супрессорные клетки. Однако у больных ревматоидным артритом снижена способность МНК воспринимать супрессорные сигналы от ШК здоровых доноров, индуцированных A23I87. У больных

гипо- и агаммаглобулянемией выявлены более существенные отклонения, в частности, снижение способности МНК воспринимать супрес-сорные сигналы от ШК доноров, индуцированных А23187. Эта аномалия подтвердилась и тогда, когда клетки-мишени больных воспринимали супрессорные сигналы от собственных МНК, индуцированных А23187. В последнем случае примерно у четверти всех больных отмечена инверсия супрессии - добавление МНК, индуцированных А23187 и облученных, сопровождалось не подавлением РБТЛ на ФГА, а, напротив, ее усилением. Кроме того, процент больных, у которых не удается индуцировать супрессоры обработкой МНК ионофором, был в 3 раза выше, чем у здоровых доноров.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы индукции иммунорегуляторных В-клеток у мышей и в периферической крови людей, использованные для изучения их свойств, функциональной активности, механизма действия и оценки иммунного статуса, в норме и при иммунопатологии.

2. Введение мышам субоптимальных доз эритроцитов барана сопровождается появлением в селезенке В-супрессоров, подавляющих иммунный ответ к различным антигенам у сингенных и аллогенных реципиентов. Процесс их формирования чувствителен к ингибиторам синтеза ДНК, клеточного деления, цийлооксигеназы и липоксигеназы. Супрессорный эффект этих клеток находится в прямой зависимости

от содержания лейкотриенов, в обратной - от содержания цАМФ, цШФ и простаглаццинов и не зависит от процессов синтеза ДНК, РНК, белка и .неточного деления.

3. Постулируется двойной механизм действия В-супрессоров, индуцированных эритроцитами барана, зависящий от наличия на мембране Роу -рецептора. Клетки, содержащие этот рецептор, подавляют иммунный ответ к различным антигенам, их действие не рестрик-тировано по Н-2-локусу и связано со способностью подавлять акти-

вацшо и/или пролиферацию клеток-мишеней - В-клеток памяти, Т-хелперов и антителообразующих клеток. Лишенные Роу -рецептора клетки подавляют иммунный ответ антигенспецифично путем индукции у сингенных реципиентов Т-супрессоров.

4. Иммунный ответ на носитель характеризуется формированием в селезенке мышей В-клеток, значительно усиливающих иммунный ответ на гадтен при иммунизации сингенных реципиентов конъюгатом гаптен - носитель.

5. Введени« мышам липополисахарида Shigella sonnei индуцирует на фоне полшслонального иммунного ответа появление в селезенке как иммуностимулирующих, так и супрессорных В-клеток, различающихся -скоростью седиментации в поле тяжести 1 g , фенотипом, антигенной специфичностью и зависимостью действия от наличия на мембране -рецептора.

6. Обработка В-клеток селезенки интактных мышей некоторыми веществами также приводит к индукции иммунорегуляторных клеток. При этом клетки с супрессорной активностью появляются после обработки кальциевым ионофором A23I87 или агглютинином из проростков пшеницы на фогз предварительного подавления синтеза проста-глаи^инов, а клетки с иммуностимулирующей активностью - после обработки агонистами цП«№.

7. Спленоциты взрослых интактных мышей с генетически детерминированной аутоиммунной патологией линий hzb и URL/1 содержат аномально высокие уровни цАМФ и простагландинов, которые не регулируются адекватно соответствующими агонистами и антагонистами. В селезенке этих мышей обнаружены В-супрессоры, функциональная активность которых, в отличие от В-клеток интактных мышей и мышей, иммунизированных эритроцитами барана, находится в прямой зависимости от содержания простаглавдинов.

8. Коклюшный тс^син обладает выраженной супрессориндуцирую-щей активностью: он резко усиливает супрессорную активность В-клеток, индуцированных ЭБ, и В-клеток мышей мы,/1 , а также индуцирует появление супрессорной активности у интак тных В-клеток, действующих после обработки токсином прямо и путем секреции супрессорных факторов.

9. Разработан способ индукции .супрессорных клеток в моно-нуклеарах периферической крови здоровых доноров, основанный на кратковременной инкубации с кальциевым ионофором А23187 и используемый в настоящее время для оценки иммунного статуса. Эти клетки подавляют реакцию бласттрансформации аутологичных и аллоген-ных мононуклеаров на фитогемагглютинш и митоген лаконоса при добавлении одновременно, через 2, 6 или 48 ч после митогенов. Они лишены цитотоксической активности, содержат на мембране Рсу--рецептор и рецепторы к конканавалину А и агглютинину из проростков пшеницы, не имеют рецепторов к агглютинам из арахиса и соевых бобов и эритроцитам барана, чувствительны к обработке антителами к дифференцировочным антигенам В-клеток, но резистентны к антителам против антигенов Т-клеток, то есть являются, вероятно, В-клетками.

10. Обработка мононуклеаров периферической крови больных ревматоидным артритом, гипо- и агаммаглобулинемией кальциевым ионофором А23187 сопровождается индукцией супрессорных клеток. В отличие от здоровых доноров, у больных гипо- и •агаммаглобули-немией часто ле удается индуцировать супрессоры и, кроме того,

у мононуклеаров этих больных снижена чувствительность к восприятию супрессорных сигналов от индуцированных ионофором собственных клеток и клеток здоровых доноров. Последний дефект характерен также для больных ревматоидным артритом.

СДИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ. ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г., Варданян И.К., Кузнецова Т.В.,

Маклаков А. И. Влияние преформированных иммунных комплексов из 1еО-антител и эритроцитов барана на формирование популяций иммунокомпетентных клеток. - Иммунология, 1982, И 4. - с. 39-42.

2. Калинкович А.Г., Варданян И.К., Пинегин Б.В. Различное дейст-

вие супраоптимаяьной дозы антигена и иммунных комплексов на формирование субпопуляций Т- и В-клеток. - Иммунология,

1983, В 2. - с. 47-49.

3. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В., Луганская Е.Л. Кинетика образо-

вания супрессорных клеток при иммунизации мышей антигеном и иммунными комплексами. - Иммунология, 1933, Л 3. - с.38-40.

4. Калинкович А.Г., Луганская Е.Л., Пинегин Б.В. Некоторые свой-

ства антигениццуцированных В-супрессоров. - Иммунология,

1984, И 2. - с. 21-24.

5. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г., Луганская Е.Л. Взаимодействие

ант иг ениндуциро ванных В-супрессоров с другими иммунорегуля-торными клетками. - Иммунология, 1984, $ 5. - с. 22-26.

6. Акрамов А.Р., Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Чувствительность

процесса формирования антигениндуцированных В-супрессоров к ингибиторам синтеза ДНК. - Дурн. микробиол. эпидемиол. иымунобиол., 1985, гё 3. - с. 82-86.

7. Акрамов А.Р., Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Влияние винбласти-

на и циклофосфамида на индукцию антигениндуцированных В-оуп-рессоров. - Фармакол. токсикол., 1985, № 5. - о. 89-92.

8. Калинкович А.Г., Николаева И.С., Луганская Е.Л., Кочеткова

М.О., Пинегин Б.В., Дозморов И.М. Сравнение функциональной активности субпопуляций иммунных В-клеток, различающихся по . скорости седиментации. - Иммунология,1985, Й 5. - с. 31-34.

9. Пинегин Б.В., Калнкович А.Г., Карсонова М.И. Распределение

В-супрессоров и В-клеток памяти в Рс у й+ и Рс у R" -популяциях клеток селезенки иммунных мышей. - Иммунология, 1985, № 5. - с. 38-40.

10. Пинегин Б.В., Карсонова М.И., Калинкович А.Г., Луганская Е.Л.,

Мартынов А.И. Роль Fe у -рецептора в антигениццуцированной В-супрессии. - У Всесоюзн. биохим. съезд. Киев. Тезисы сим-позиальных докладов. Том I. М. "Наука", 1985. - с. 183-184.

11. Акрамов А.Р., Калинкович А.Г. Влияние В-активина и Т-активи-

на на формирование антигенивдуцированных В-супрессоров. -Тезисы докл. 1У Всесоюзн. симп. "Регуляция иммунного гомео-стаза". Суздаль, 1986. - с. 129-130.

12. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В., Орлов Э.В., Моисеева Е.В., Ко-

четкова М.О. Распределение В-супрессоров и В-клеток памяти во фракциях клеток селезенки иммунных мышей, различающихся по скорости седиментации. - Иммунология, 1986, & 2. - с. 3134.

13. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г. Индукция носительспецифических

В-хелперов в ходе иммунного ответа на эритроциты барана у мышей. - Иммунология, 1986, № 3. - с. 81-82.

14. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Супрессия иммунного ответа. -

Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Морфология человека и животных, 1986, т. 12. - с. 5-66.

15. Pinegin B.Y., Kalinkovich. A.G., Lugangkaya E.L., Karsonova

U.I. Antigen-induced В suppressors: properties and mechanism of action. - 6*11 Int. Congr. Immunol. Abstr., 1936, p. 261.

16. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В., Луганская Е.Л. Двойной меха-

низм антигениццуцированной В-супрессин. - Иммунология, 1986, гё 4. - с. 21-23.

17. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В., Луганская Е.Л. Влияние анти-

гениндуцированных В-супрессоров на развитие B-клеток памяти, специфичных к носителю Т-хелперов и антителообразующих клеток. - Еюлл. экс. биол. мед., I98S, të 7. - с. 58-60.

18. Мадяидов У.В., Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Изучение некото-

рых показателей иммунного статуса мышей линии MRL/UpJ-lpr/lpr,•

- Иммунология, I98Ô, № 6. - с. 18-21.

19. Калинкович А.Г. Использование лектинов дая получения популя-

ций, обогащенных иммунорегуляторными клетками. - Иммунология, 1987, Л I. - с. 31-35.

20. Маджидов У.В., Калинкович А.Г., Гиадько И.А., Коршунов В.М.,

Савинкова В.Т., Пинегин Б.В. Иммунореактивность и микрофлора кишечника мышей URL/UpJ-lpr/ipr , находившихся в условиях общей гнотобиологической изоляции. - Иммунология, 1987, Уе 2.

- с. 71-74.

21. Акрамов А.Р., Пинегин Б.В., Максимова Г.Ф., Калинкович А.Г.

Ингибиторный анализ поликлонального иммунного ответа, индуцированного липополисахаридом. - Иммунология, 1987, 1« 3. - с. 30-33.

~2. Абрамов А.Р., Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Ингибиторный анализ антигениндуцированных В-супрессоров. - "Актуальные вопр. иммунофармакологии". Под ред. А.В.Вальдмана и Б.С.Утешева. M., 1987. - с. 39-46.

23. Акрамов А.Р., Калинкович А.Г., Пинегин Б.В. Индукция липопо-

лисахаридом иммуностимулирующих B-клеток у мышей. - Иммунология, 1988, iè I. - с. 33-34.

24. Калинкович А.Г., Маджидов У.В., Акрамов А.Р., Коршунов В.М.,

Пинегин Б.В. Иммунный статус аутоиммунных мышей HZB и MRl/Mpj-lpr/lpr и разработка новых методов иммунокоррек-ции. - Тезисы докл. зональной научн. конф. "Актуальные пробл.

иммунологии, т~лунодефициты и иммунокоррекция". Владивосток, 1988, с. I3I-I33.

25. Калинкович А.Г., 'Борисова Л.С., Инжеваткина С.М., Красильни-

ков И.В., Коршунов В.М., Пинегин Б.В. Влияние веществ, увеличивающих внутриклеточное содержание цШФ, на функциональную активность B-клеток у мышей. - Иммунология, 1988, J6 4. -с. 33-36.

26. Калинкович А.Г., Пинегин Б.В., Акрамов А.Р., Борисова Л.С.

Иммунорегуляторные В-клетки. - Тезисы докл. И. межинст. научн. конф. "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". Челябинск, 1988. - с. 54-55.

27. Акрамов А.Р., Калинкович А.Г., Копылова Е.А., Ведерников A.A.,

Пинегин Б.В. Некоторые свойства иммунорегуляторных В-клеток, индуцированных in vivo липополисахаридом. - Иммунология, 1988, & 5. - с. 23-26.

28. Борисова Л.С., Калинкович А.Г., Инжеваткина С.М., Закиров

U.M., Бэльдштейн М.М., Коршунов В.М., Пинегин Б.В. Влияние некоторых препаратов на внутриклеточное содержание проста-гландинов Е и цАМФ и функциональную активность антигенинду-цированных В-сулрессоров. - Фармакол. токсикол., 1988, № 6. -с. 65-69.

' 29. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г., Соболь С.И., Борисова Л.С., Коршунов В.М. Изучение способности коклюшного токсина индуцирован образование В-супрессоров. - Зурн, микробиол., эпи-демиол. иммунобиол., 1989, JS 4. - с. 6&-73. 30. Пинегин Б.В., Калинкович А.Г., Акрамов А.Р., Луганская Е.Л., Борисова Л.С., Карсонова М.И., Маджидов У.В., Соболь С.И., Корхов И.А., Сюнякова Е.В. Свойства и функции иммунорегуляторных В-клеток. - Тезисы докл. У1 научн. конф. "Клинико-им-

- -

мунологические исследования при иммунодефицитных состояниях". Самарканд, 1589. - с. 41-42.

31. Калинкович А.Г., Карсонова М.И., Шнегин Б.В. Ингибиторный

анализ участия продуктов окисления арахддоновой кислоты в феномене В-супрессии иммунного ответа. - Иммунология, 1989, й 3. - с. 21-24.

32. Карсонова М.И., Калинкович А.Г., Плнепш Б.В. Ингибиторное

действие Рс^ н+ -клеток, активированных иммунными комплексами или аггтютинином из проростков пшеницы, на функциональную активность иммунных клеток селезенки. - Иммунология, 1989, № 3. - с. 24-27.

-16Ш Подп. к печати 2/^/ 198-0 г. Ф.П.Л. 2,5 Тираж 120

Типография ХОЗУ Миннефтепрома . Звс 1323