Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Миелопептиды, обладающие иммунорегуляторными свойствами

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ШДИЦИНСКОЯ ПРОНЬИШШЮСТЙ РОССИЛСКОЯ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ ИШШЮЛОГИИ

РГ6 од

на правах рукописи

Еанурин Станислав Юрьевич

Ш<ЕЛОПЕПП(ДЦ. овладппщ ишноРЕгаляторшш свонсгапии.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

"V -

/ ^ с

Москва, 1ВД4 г.

/О

Работа выполнена в Институте биоорганической хиши нм.Ы.11 Шашкина и ПИ Овчинникова РАН.

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Михайлова А. А.

Официальные оппоненты: академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А. Л. Ярилик член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор

Е Я. Арион

Вэдущая организация: Российский государственный шдицинский университет.

на заседании диссер , ________., 1.09.01 при Институте

иммунологии по адресу 116478, г. Ыосква, Каширское шоссе, д. 24, к. 2.

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Ыииэдравмедпрома РФ.

Защдта состоится

в 14 час.

Автореферат разослан 1

1994 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

Л С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PABOTU.

Актуальность темы.

В настоящее время в экспериментальной и клинической иммунологии ' все большую значимость приобретают исследования, направленные на поиск средств и способов избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа, а также на отдельные субпопуляции клеток иммунной системы. Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы - создание лекарственных препаратов на основе эндогенных биологически активных вев*еств.

В середине 70-х годов в коллективе иммунологов, руководимом академиком Р. В. Петровым, были обнаружены костномозговые медиаторы -миелопептиды (МП), обладающие иммуностимулирующими (Petrov R. V. et al,1975, Михайлова А. А. 1981), дифференцировочными (Стрелков Л.А. и др. , 1987, 1989) и опиатоподобными свойствами (Петров Р. R и др. , 1982, Захарова А А., Детров Р. & , 1991). На основе смеси МП был создан иммунокорригирущий лекарственный препарат Шелопид, не имеющий аналогов за рубежом (Михайлова А. А. , 1988). Миелолид внедрен в клиническую и ветеринарную практику, он применяется для профилактики и коррекции иммунологических нарушений, связанных со стрессом, инфекционными и вирусными заболеваниями, эффективен при некоторых формах лейкозов. Клиническое использование Миелопида, а также многочисленные экспериментальные исследования,- проведенные со смесью неидентифицированных МП, выявили разнообразные иммунорегуляторные эффекты костномозговых медиаторов. Однако, до настоящего времени остается неясным вопрос о химической структуре действующих в Миело-пиде веществ и о механизмах их иммунотропных эффектов. Решение данного вопроса чрезвычайно актуально, поскольку оно позволит установить неизвестные ранее молекулярные механизмы регуляторной функции костного мозга в иммунном ответе, а также дает основу для разработки новых, структурно охарактеризованных иммуномодуляторов эндогенной природы, конкурентно способных на международном фармакологическом рынке.

В последние годы из супернатанта культуры клеток костного мозга свиньи были выделены и синтезированы два МП следующей структуры.: Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr (МП1) и Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp (МП2) (Фо

- г -

кина Л. А. и др., 1993). Наличие структурно охарактеризованных МП открывает возможность проводить всестороннее изучение их биологических свойств на различных экспериментальных моделях, изучать механизмы их действия на клеточном и молекулярной уровнях. Такие исследования необходимы для аффективного отбора вешэств, перспективных для разработки на их основе иммуноыодуляторов нового поколения. Цель в задачи исследования.

Целью настоящэй работы явилось всестороннее изучение имыуноре-гуляторных свойств синтетических аналогов пептидов костношагового происхождения Ш1 и ЖЕ и выяснение механизмов их иммунотропной активности. В процессе проведения работы решались следующие задачи: 1. Определение стимулирупцэго действия 1Л1 на антнтелообразоваииэ

in vitro при первичном и вторичном иммунном ответе. г. Изучение влияния Ш на функциональную активность различных популяций иммунокомпетентньа клеток (ИКК): Т-, В-клеток и макрофагов. -

а • Исследование иымунокорр'игируюшэго действия Ш1 в экспериментальной модели иммунодефицита мыши, вызванного ионизирующей радиацией, и разработка оптимальных схем введения ISL

4. Изучение корригирующего аффекта Ш на показатели иммунитета мышей, обработанных циклофосфаыидоы (ЦФ).

5. Исследование и..мунорегуляторноа активности Ш у мышей NZB с врожденным иммунодефицитом.

6. Выявление спецефических участко» связывания гексаяевтвдов с поверхностью клеток-мшиеней.

Научная новизна.

В результате проведенной работы получены экспериментальные данные, демонстрирующие иммунорегуляторные свойства двух новых гекса-пеятидон эндогенной'природы, Ш и ЫП2.

Впервые показано, что ШИ и Ш2 в системе in vitro повышает антителопродукцию на пике иммунного ответа, усиливают пролиферацию селезеночных клеток, стимулированных Кон А, и увеличивают фагоцитарную активность макрофагов при иммунодефицитах. Установлен дозо-эааисимый характер ишунорегуляторяого влияния ЫШ и ШЕ на иммунологические реакции, выявлены различия в характере

иммунорегуляторного действия Ш1 и ШЕ.

Впервыа выявлен иммунокорригирущий аффект Ш1 и ЫП2 на экспе риментальных мышиных моделях иммуиодефицитов, ¡шдуцированных иони оирушэй радиацией или ЦФ.

Установлено, что иммунорегуляторное влияние Ш1 осуществляется черев популяцию т-клеток.

Впервые показано регуляторное влияние МП на функциональную активность различных популяций иммунокомлетентных клеток мышей NZB со спонтанно развивающимся аутоиммунным процессом. Установлено, что

i

!JH и 1Ш2 на фоке повышенного ответа на тимусзависимые антигены увеличивают антителообрааование на пике иммунного ответа на ЭЕ, усиливают сниженный пролиферативньй ответ селезеночных клеток на Кон А, отменят ингибирующий эффект митогена лаконоса (ИЛ) на повы-пенную спонтанную секреции IgG в культуре селезеночных клеток и увеличивают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов.

Практическая шсащагоеть.

Научная-практическая значимость полученных данных заключается в выявлении неизвестных ранее иммунорегудяторных пептидов .эндогенной природы и расшифровке некоторых сторон механизма их иммунотропного действия. Эти данные вносят вклад в понимание роли веществ костномозгового происхождения (МП) в регуляции иммунного ответа и создают предпосылки для разработка на основе индивидуальных МП препаратов с направленным корригирующим эффектом. Индивидуальные, структурно охарактеризованные биологически активные молекулы эндогенной природы являются перспективной основой для создания эффективных иммуно-модуляторон, действующих физиологично и не вызывающих вредных последствий.

Основные положения, идгоскмые та запрету:

1. МП1 и МП2 оказывают антителе-тимулируюший эффект на пике иммунного ответа в культурё мышиных селезеночных клеток, усиливают пролиферацию селезеночных клеток в ответ на Кон А и не влияют на ЛЛС-;индуцированную пролиферацию селезеночных клеток in vitro.

2. ЫШ повышает уровень продукции IgG селезеночными клетками мьши. стимулированными Ш

3. Имцунорегуляторные эффекты ЫШ имеют дозозависимый характер.

4. МП1 и МП2 us влияют на фагоцитарную активность мшиных перито-нальных макрофагов в норме и усиливают ее при нарувватх иммунитета.

б. МП1 оказывает выраженное иммунокорригируюцее действие m vivo на антителообразование у животных, облученных гамма-лучами шш обработанных ПФ, и на Кон А-индуцированную. пролиферацию селезеночных клеток, подавленную ЦФ.

6. ЫП1 и КИЕ влияют на иммунные реакции у кшей NZB.

7. Иммуаорегулягорное действие Ш1 осуществляется через поиулаци» Т-лимфоцитов.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на 1 огеэде имцуиологов России ( Новосибирск, 1992) ; 8 Ыеждународнои иммунологическом когрессе (Будапешт, Венгрия, 1992); 12 Европейской иммунологической коферев-ции (Барселона, Испания, 1994); конференции отдела иыиужиюгкш Института Сиоорганической химии PAR Публикации.

По теме диссертации имеется 7 печатных работ, 1 патентна» зааа-ка в США и 1 патентная заявка в России. Объем м структура диссертации.

Диссертация изложена на Í&C. страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (2 главы), выводов и списка литературы (ДФ? источников, в tomí числе отечественных и зарубежных). Работа содержит рисунков и таблиц.

СОДВДШИВ ВАБОШ

Материалы и методы исследования.

Пептиды. Uni CPhe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr) и МП2 (LeurVal-Val-Туг-Рго -Тгр) были синтезированы в лаборатории химии пептидов, ШВД РАЖ ШП, меченный FITC (FlTC-lßÜ) и меченный родамином* (РД-ИП1), были иг готовлены к. х, и. Фоникой Л. А. (Инстинув биоорганической химии РАЮ

Животные и иммунизация. В экспериментах использовали мышей гибридов

первого поколения (CBAxC57Bl/6)F, самок весом 18-22 г., полученных из питомника лабораторных животных "Столбовая", а также мышей NZB самок и самцов весом 22- 25 г, полученных их питомника лабораторных животных "Светлое горы". Шшей иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) п/к или в/ 0 в оптимальной или в субоптимальной дозах. Повторную иммунизации животных проводили тем же антигеном и тем же способом через 2 недели.

Выделение и культивирование клеток. Мышей забивали цервикальной дислокацией шейных позвонков. Ткань селезенки или лимфатических узлов разрушали в гомогенизаторе, фильтровали через нейлоновый фильтр и дважды отмывали в среде 199. Перитонеальные макрофаги мыши вымывали из Оршной полости фосфатным буфером. Шприцом отсасывали смытые клетки,' фильтровали на нейлоновом фильтре и дважды отмывали в фосфатном буфере. Для выделения мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови человека проводили разделение цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,075 - 1,077) центрифугированием при 400 g в течение 45 мин при комнатной температуре, после чего клетки отмывали 3 раза в среде 199. Отмытые клетки разводили в 1 мл среды RPMI-1640.

Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в плоскодонных микроплатах в объеме 0,2 мл при 37 С, 51 COz, . при влажности 80-90Х. В культуральную среду добавляли 10Z фетальной сыворотки теленка, 50 мкМ 2 -меркалтозтанола, 2 мМ глугамина, 10 мМ Hepes буфера и 50 мкг /мл гентамицина Для оценки антителообраэования in vitro использовалась концентрация клеток 5x106 кл/мл (5x10s кл/лунку), во всех остальных .тестах концентрация клеток составляла 1х106 кл/мл (1х105 кл/лунку). Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию О,II раствором трипанового синего.

Реакция б лас трансформации (РВТ,. Тест ставили по общепринятой методике (Adriaansen H.J. et al., 1990). В суспензию CK (lxlO5 кл/лунку) добавляли митогены Кон А (2 мкг/мл) или ЛПС (50 мкг/мл)> Через 72 ч совместного культивирования в каждую лунку добавляли ЗН-тимидин (0, 5 мкКю/лунку) и инкубировали в течении 6 ч. Затем клетки переносили на фильтры с помощью харвестера. Радиоактивность каждой пробы определяли на "цинтиляционном счетчике Rack-bet л

- б -

(Beckman). Для количественной оценки реакции использованы абсолютная величина включения метки (число импульсов/мин) и процентное отношение числа импульсов/ мил в опыте к числу импульсов/мин в контроле.

Определение продукции IgG лимфоцитами, стимулированными митогеном лаконоса. СК или МНК периферической крови культивировали в присутствии МЛ (8 мкг/мл) в течении 8 дн. при 37 С в культуральной среде RPMI-1640 со стандартными добавками. Затем из каждой лунки осторожно отбирали по 0,05 мл супернатанта, в котором определяли концентрацию IgG с помощью твердофазного ИФА (Jahn S, 1986). Определение фагоцитарной активности. Перитонеальныа макрофаги вносили в лунки 96-луночного планшета (1x105 кл/лунку) и инкубировали в течении 2 ч. при 37 С. Затем клетки триады отмывали раствором Хенкса и определяли функциональную активность в тесте НСТ (Rook G. А. V., 1985). Для згого в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора нитросинего тетразолия в концентрации 1 мг /мл и 50 мкл 12 раствора опсонизированных ЭБ. После инкубации в течении 1 ч. при 37 С клетки отмывали растором Хенкса и фиксировали 10Х раствором формалина. Через 10 мин планшет промывали дистиллированной водой и высушивали. Затем в каждую лунку добавляли по 60 мкл 2Ы КОН и 70 мкл диметил-сульфоксида Уровень фагоцитоза оценивали по изменению оптической плотности (ОП) растЕлра, которую измеряли при длине волны 620 нм на приборе Multiskan КСС/340.

Определение антителостимулирующей активности. Для определения антителостимулирующей активности мышей иммунизировали в/б оптимальной дозой ЭБ. На 5 день выделяли СК или клетки ЛУ и культивировали их в среде RPMI-1g40 со стандартными добавками в течении 18 часов при 37 С. Концентрация клеток составляла 5х106 кл/мл (5х105 кл/лунку). Тестируемые вещества добавляли к клеткам в начале культивирования. ГЬ окончании инкубации в опытных и контрольных культурах определяли количество антителообразуиаих клеток (IgM-AOK методом Jerne N. R. ,1963 и IgG-AOK методом Dresser D. V. ,1965) и расчитывали процентное отношение количества АОК в опыте к контролю. Облучение животных. Ыьшкй облучали гамма-лучами на цезиевой установке в дозе 2 Гр при мощности доги О, 1 Гр/с на базе Института Им-

мунологии РАМН.

Циклофосфамид. В экспериментах использовали циклофосфан (ЦФ) Саранского завода медицинских препаратов. ЦФ растворяли в стерильной дистилированной воде и вводили мышам в/б из расчета 200 мг/кг.

Индукция Т;_и В-иммунодефицитов. Т- и В -дефициты индуцировали у

мышей с помощью ЦФ по описанной методике (Кондратьева Т.К. , 1993). Мышам вводили в/в Кои А (100 мкг/мьшь) или ЛПС (50 мкг/ мышь) и через 2 суток - ЦФ (200 мг/ кг). Через 9 дней после йньекции ЦФ мышей иммунизировали ЭБ в субопгимальной дозе и на б-е сутки определяли количество IgM-AOK в селезенке методом Ерне.

Иммунофлуоресцентный анализ. Окрашивание клеток FITC-МШ или РД-МП1 проводили по общепринятой методике (Ногan R. К., 1977). CK мышей дважды отмывали в фосфатном буфере,содержащем ZX эмбриональной те-лячей сыворотки, ресуспендировали в концентрации 3x10 7 кл/мл и инкубировали в присутствии №-1 или МР2 (100 mg/ml) в течении 30 мин при 4 С. После инкубации клетки трижды отмывали, ресуспендировали в той же концентрации в фосфатном буфере и анализировали на проточном цитофлуориметре ЕР ICS-5. В каждом эксперименте было проанализировано, по крайней мере, 10000 клеток. Для выявления участков связывания МП1 на Т- и В-лимфоцитах использовали двойное иммунофлуорес-центное окрашивание селезеночных клеток с РД-МП1 и моноклональными антителами анти-Thy 1.2, меченными F1TC или с РД-ШИ и анти-Ig антителами, меченными FITC. Данные обрабатывали с помощью специализированной программы QUADRANT STATISTIC (Coulter,USA). Статистическая обработка Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета компьютерных программ Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

К настоящему времени все известные в литературе данные по имму-норегуляторной активности ЫП получены на смеси Ш неизвестной структуры или на разработанном на ее основе лекарственном препарате Миелопид. Выделение из супернатанта культуры клеток костного мозга свиньи индивидуальных МП (МП1 и МП2), определение их структуры, и получение синтетических аналогов позволило изучить иммунорегулятор-

- в -

ние эффекты конкретных структурно охарактеризованных соединений, исследовать дозовые зависимости и взаыодействие с рецепторами.

1. Изучение »одунорегуляторной активности 1Ш1 и 1012 у нормальных животных.

Исходя из данных об усилении антителообрааования на пике иммунного ответа под влянием смеси Ш (Михайлова А. А., 1981), ш исследовали влияние ИШ и МП2 на антитедопродукцию на пике первичного и вторичного иммунного ответа на ЭБ in vitro. На рисунке 1 представлены данные по влиянию МШ и МП2 на содержание АОК в культуре СК, полученных от мыпей на пике первичного иммунного ответа на ЭБ. МШ вызывал дозозависимое увеличение содержания АОК в культуре иммунных

СК в дипазоне концентраций lxlO*,tt- 1х10"6г/мл. ЫП2 повышал уровень

-6 -и

АОК при Солее высоких концентрациях (1x10 до 1x10 г/мл), причем характер влияния данного пептида на антитедообразование не имел до-вовой зависимости. Сходный антителостимулирующий эффект МШ и МП2 отмечался и при исследовании их влияния на вторичный иммунный ответ.

АОК (¡С от контроля)

Рисунок 1. Влияние ИШ и ИГЕ на антителообразование in vitro в клетках селезенки, полученных от мышей на пике первичного иммунного ответа на ЭБ. * р\0,05

- g -

Мы изучали таюю способность 1Д11 и ЫП2 влиять на пролиферации лимфоцитов, индуцированную Т-клеточным (Itou А) или В-клеточным (ЛПС) митогеноы. Гексапептиды МП1 и Ш2 в интервале концентраций от lxlO"9 до 1х1СГ5 г/мл добавляли d культуру СК и инкубировали в присутствии Кон А или ЛПС. Из данных, представлении 'на рисунке 2, видно, что ни МП1, ни 1012, не влияют на пролиферацию СК, стимулированных В-клеточным мигогеном (ЛПС). Другая картина наблюдается при стимуляции СК Т-клеточным митогеном (Кон А). МП1 вызывает дозозави-симое усиление пролиферации СК в диапазоне концентраций 1 х10"8г/мл - lxlO"6 г/мл. При увеличэшш ютпценграцкп Mil до 1x1 СГ5 г/мл наблюдается подавление Кон А-индуцированной пролиферации СК 1Ш2 усиливает пролиферацию клеток в ответ на Кон А только при одной концентрации (1x104 г/мл). На основании полученных данных моино предположить, что гексапептиды, в особенности ЫП1, действуют на популяцию Т-клеток. На пролиферацию СК в ответ на В-клеточный митоген (ЛПС) оба пептида не осазывади влияния.

ИУП/1Д1Н (% от контроля)

Рисунок 2. Влияние Ш1 и МП2 на пролиферацию мышиных селезеночных клеток, стимулированных Кон А или ЛПС.

(о) - Ш1; (П) - МП2; (-) - Кон А; (---) - ЛПС; * - р<0,05

Изучение влияния гексапептидов на стимуляцию продукции в

культуре СК, стимулированных ЫЛ показало, -что МП1 в концентрации 1х10"6 г/ил повышал Ш1-индуцированную продукцию 1е<3 на 17,22. ШЕ, в отличие от 1Ш1, не оказывал влияния на МЛ- индуцированную продукцию 1е&

На фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мылей (СВАхС57В1/6)Р1 ни Ш11 ни МГЕ не оказывали влияния.

Таким образом, ЫШ обладает более выраженной иммунорегуляторной активностью, чем Ш2. Исследованные аффекты Ш11 имеют дозозависимый характер и проявляются в широком диапазоне концентраций.

2. Изучелзю кщунокоррлпфукчэй аиянвшстн 1Ш1 к 2Л12 в различных згаяшршентальиьа моделях ищукодефщитиш состошшй.

Известно. 'что Миелопид, представляющий собой смесь различных МП, оказывает выраженное иммунокорригируицре действие при таких заболеваниях, как острые или хронические пневмонии, бруцеллез и другие инфекции, некоторые аллергические заболевания, разного рода травмы, сопровождающиеся серьезными нарушениями иммунного статуса (ожоговая болезнь, посттравматический остеомиелит) и др. В экспериментальных моделях антителостимулирующий аффект смеси Ш1 в случае созданного иммунодефицита также более выражен по сравнению с кормой (Сорокин С. а ,1986, Петров Р. Е ,1986, Вартанова А. И., 1991). В данной работе мы исследовали иымунокорригирузощую способность ШП и ЫП2 в условиях иымунодефицитов различного геиеаа для выявления потенциальной возмодности использования структурно охарактеризованных ЫП в клинической практике. Нами были использованы три экспериментальные модели иммуиодефицитов: индуцированного ионизирующей радиацией, ЦФ и врожденного иммунодефицита на примере мышей МШ со спонтанно развивающимся .аутоиммунным процессом.

Для изучение корригирующего влияния ЩИ и ШЕ на антителообра-аованио у облученных мьвпей й определения оптимальных схем их введения проводили следующие эксперимент Животных иммунизировали ЗБ в субоптимальной доге на следующий день или через 12 дней после облу-

- 1Г -

чеши. ЫП1 и Ш12 в различных дозах вводили в/б по трем схемам 1) однократное введение одновременно с ЭБ (0 день); 2) однократное введение на пике иммунного ответа (+3 день) и 3) 4-х кратное введение в О 1,+ 2 и +3 дни первичного иммунного ответа на ЭК Пока-вано, что наибольшее повышение содержания АОК в селезенке облученных мышей наблюдается при многократном введении МП1 при иммунизации через 12 дней после облучения (рисунок 3). ШЦ во всех использованных дозах вызывал статистически достоверное увеличение уровня АОК у облученных мышей вплоть до 80,2% при дозе 1х1СГ5 г/мышь по сравнению о облученным!! животными (43,82). Однократное введение МШ в индуотнвиуп фазу па влияло, а в продуют«:жуп фазу лиеь незначительно повышало уровень АОК в селезенке (до 58,4%). ЫП2 вызывал небольшое увеличение антителообраэовання в селезенке облученных мышей только в доае 1хЮ*6 г/мышь при многократном введении (Б4.2Х).

АОК (Я от контроля)

Рисунок 3. Елиянда 1Ш1 и'МСЕ'иа формирование АОК в селезенке облученных мьшй при шшуииэации ЭБ через 12 дней после облучения. 1 - 1x10-9 г/мышь; 2 - 1x10-8 г/мьшь; 3 - 1x10-7 Г/мьшп»; 4 - 1x10-6 г/мышь; а* - р<0,01; * -р<0,05

Рисунок 4. Влияние ШИ и ШЕ на формирование АОК в селезенке мышей, обработанных ЦФ, при иммунизации ЭБ на следующий день (А) или через 9 дней (Б) после введения ЦФ. 1 - 1x10-7 г/мышь; 2 - 1x10-6 г/мышь; * -р<0,05

Исследование иммунокорригируюшей активности ЫП1 и 1Ш2 на юдели иммунодефицита, вызванного ЦФ также показало наиболее высокую эффективность ЫП1. Ш1 и ЫП2 вводили в/б в О ,+1,+ 2 и +3 дни первичного иммунного ответа при иммунизации кивогных ЭБ в субопгимальной дозе на следующий день или через 9 дней после инъекции ЦФ. Результаты экспериментов представлены на рисунке 4. ИП1 вызывал значительное увеличение уровня АОК в селезенке при иммунизации животных через 9 дней после введения ЦФ. Количество АОК в селезенке мышей, обработанных ЦФ, при дозе Ш1 1х10~6 г/шдпь достигало уровня контрольных животных (104.гх). ЫП2 во всех исследованных дозах не оказывал влияния на содержание АОК в селезенке мышей, обработанных ЦФ.

Т. о.. МШ оказывает выраженное иммунокорригируюшзе влияние на уровень АОК в. селезенке облученных и обработанных ЦФ мышей, причем для наиболее полного проявления эффекта ШИ необходимо его присутствие в течении всех этапов формирования иммунного ответа на ЭБ. Эф-

фэгстншость ¡шмунокорригирущэго действия ШИ в период восстановления тимусзависимого антителобр .зования (12 день для облучения, 9 день для ЦФ) объясняется, повидимому, тем, что к этому времени дим-фоидные органы начинают заселяться полноценными лимфоцитами, в том числе и клетками-мишенями для ШИ, способными к кооперативному взаимодействию в процессе иммунного ответа

Изучение влияния гексапептидов в условиях in vivo на мито-ген-индуцированнуг пролиферации селезеночных клеток мышей, обработанных ЦФ, показало, что МП1 частично восстанавливает пролиферацию клеток, стимулированных Т-клеточным митогеном (Кон А). Ежедневное введение ЫШ (в 1,2 и 3 дни после обработки ЦФ) приводило к jобличению Itou А-индуцированного пролкфератнвного ответа селезеночных клеток, полученных на 4 день посла обработки ЦФ (на 17,IX), и не оказывало никакого влияния на ЛИС-индуцированный пролиферативный ответ селезеночных клеток. МП2, в отличие от МШ, не влиял ни на Ron Л- ни на ЛШ-индуцированную пролиферацию СК мьшей, обработанных ЦФ.

Создание у мышей направленных дефицитов in vivo путем избирательной элиминации. Т- или В-клеток с помощью ЦФ, подтвердило факт реаллзацт! иммунорегулягорного действия 1Я11 через популяцию Т-кле-ток.. Комбинированное введение мышам Кон А и ЦФ вызывает Т-клеточную анергия, выралсагацуюся в резком снижек и ответа на тимусзависимый антиген (Кондратьева Т. К., 1993). Введение ШИ Т- дефицитным животным не приводило к каким-либо заметным изменениям антителообразования в селезенке в отЬет на ЭБ. Однако у В-дефицитных ш^еЯ, полученных последовательными инъекциями ЛПС и ЦФ, ЙП1 вшивал повыэение уровня АОК в селезенке в ответ на ЭБ (рисунок 5). Данное усиление антителообразования на тимусзависимый антиген под влиянием МШ опосредуется, очевидно, через популяцию Т-клеток, в частности Т -хелперов, сохранивших свою функциональную активность и, в свою очередь, способствующих вовлечению в дифференцировку неповрежденных В-клеток.

В условиях иммунодефицита, созданного ЦФ, ШИ и НП2 восстанавливали фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов как in vitro, так и in vivo. Под влиянием однократной инъекции ЦФ у мыией

АОК (Я от контроля) ÍOO-

ЛЛС лпс

Ц<р Ц* МЛ1

Рисунок 5. Влияние МП1 и Ш2 на антителообразование в селезенке мышей с Т- (А) или В-дефицитом (Б), индуцированным ЦФ. МП1 в дозе 1x10-6 г/мьшь; ЦФ - 200 мг/кг; Кон А -> 100 миг/мышь; ЖЮ - 50 мкг/мышь; * -р<0,05 •

черев 4 дня количество перитонеальных макрофагов уменьшалось почти в 2 рига, а уровень фагоцитоза снижался на 20%. Добавление Ш11 иди МП2 в культуру перитонеальных макрофагов, полученных от ыышей на 4 день после обработки ЦФ, восстановливало фагоцитоз, причем эффекты двух пептидов практическ?' совпадали. Введение МШ или ШЕ животным в 1, 2 и 3 дни после обработки ЦФ также приводило к восстановления сниженной фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.

Иммунорегуляторное влияние гексапептидов проявилось и при использовании мышей линии NZB, у которых в результате наличия врожденных дефектов иммунной системы происходит спонтанное развитие заболевания, сходного с системной красной волчанкой (СКВ) человека. Сравнение некоторых показателей иммукореактивности мышей NZB и нормальных мышей-линии (CBAxC57Bl/6)F, показало, что у мышей NZB отмечается: 1) повышенный иммунн \ ответ на ЭБ - содер-чниэ АОК в селезенке почти в 2 раза выше, чем в норме; 2)• высокая спонтанная

продукция IgG, которая в 6 раз превышала продукцию IgG седеэеночни ыи клетками нормальных мышей; 3) сниженный почти в 2 раза пролифе-ративный ответ на Кон А; 4) ур вень фагоцитарной активности перито-неальных макрофагов не отличался от нормы.

• Изучение влияния ММ и МП2 на эти 4 показателя иммуноре акт явности мышей NZB показало следукщэе. На фоне повышенного иммунного ответа МП1 и МП2 еще больше усиливали антителообразование па пике иммунного ответа на ЭБ (рисунок 6). Однако характер влияния МП1 и ИП2 • на количество АОК существенно различался. Кривая доза-эффект для 1ЯЦ носила бимодальный характер: увеличение уровня АОК наблюдалось при концентрации 1x10 "9 г/мл (135,61 от контроля) и при более высоких концентрациях 1х10*6 (119,77.) и 1х10"5 г/ мл u29,8X,. МП2 вызывал достоверное увеличение количества АОК только в концентрации 1x10"* г/мл (138.6Х).

ЫП1и МП2 усиливали Кон А-индуцированную пролиферацию селезеночных клеток мышей NZB (рисунок 7). Ш1 вызывал дозозависимое усиление пролиферации СК в диапазоне концентраций 1x10 "8 г/мл - lxlCT6 г/ил. дальнейшее увеличение концентрации 1Я11 приводило к подавль. .го пролиферативного ответа СК на Кон А. Ш2, в отличие от МШ, усиливал Кон А-индуцированную пролиферацию СК только при концентрации ШО"*1 г/мл. На пролиферации СК в ответ на В-клеточный митоген (ЛЕС) оба пептида не оказывали влияния.

ШИ и 1Ш2 восстанавливали npoflj длю IgG в культуре СК мышей MZB, подавленную ИЛ. В присутствии ;Ш11, взятого в концентрации 1х10"6 г/мл, наблюдалось восстановление секреции IgG (111,7 Z от уровня спонтанной секреции). 1.Ш2 вызывал лишь небольшое повышение продукции IgG, подавленной МЛ.

Исследование влияния гексапептидов на фагоцитарную активность перитонеальиых макрофагов мышей NZB in vitro показало, что МП2 в концентрации 1х10"6 г/мл вызывал небольшое, но достоверное увеличение уровня фагоцитоза на 14,8% относительно контроля. МП1 не оказывал кагаго-либо эффекта па функцию перитонеальиых макрофагов мышей NZB.

АОК. (X о- контроля)

Рисунок 6. BJL-.ние ЫП1 и 1ЯЕ на антителообразование in vitro в клетках селезенки, полученных от гашей NZB на пике первичного иммунного ответа на ЭК * - р<0,05

ИШ/МИН (Я от контроля)

Рисунок 7. Влияние ЫП1 и Ш2 на пролиферацию селезеночных 1слетоп

мышей NZB, стимулированных Кон А ил:-; ЛПО.

'о) - ЫП1;Ча) - МП2; (-) - Кон А; ( —) - ЛПС; - р<0,05

Можно заключить, что ЫП1 проявляет выраженные иммунорегулятор-ные и иммунокорригирующие с.эйства во всех исследованных моделях иммунодефицитов. Результаты исследования иммунорегуляторной актив ности ЫП2 показывают, что действие МП2 проявляется лишь в некоторых экспериментальных моделях и при более высоких концентрациях, чем МП1, и, как правило, в одной дозе. Погл достаточно трудно.объяснить механизм слабого регуляторного действия ИГЕ. Можно лишь предположить, во-первых, что слабая иммунорегуляторная активность МП2 свя-вана о низкой аффиностыо рецепторов к МГЕ на клетках, участвующих в формировании иммунного ответа, и, во-вторых, что Ш2 выполняет иную регуляторную функцию в организме. По предварительным данным, юлу-ченным в лаборатории медиаторов иммунной системы ИБХ, ШЕ обладает противоопухолевой активностью, отменяя ингибирующэе влияние лейкоз-ных клеток HL -60 на Т-лимфоциты периферической крови человека .

3. Выявление ка лимфоцитах специфических рецепторов к Ш1.

Связывание МП1 со специфическими рецепторами на клетках-мишенях изучали с помощью иммунофлуоресцентного анализа Результаты этих экспериментов представлены на рисунке 8. Всего в суспензии CK выявлялось 18Х FITC -положительных клеток. Добавление немеченного МГЦ в инкубационную смесь в избыточном количестве приводило к уменьшению количества FITC-положительных клеток вследствии вытеснения F1ТС-КШ немеченным МП1. Уменьшение количества FITC-положительных клеток зависало от количественного соотношения МП1 к FITC-МШ. Связывание ЫП1 с клеткой-мишенью бьшо спецефицескиы, так как добавление другого немеченного пептида, МП2, не приводило к вытеснению FITC-МШ из участков связывания (рисунок 8а). Использование моноклональных антител анти-Thy 1.2, меченных FITC (Т-кдеточный маркер) или антител анти-Ier, меченных F1TC (B-клеточный маркер) показало, что специфические участки связывания находятся на Т-клетках, но не на В-клет-ках (рисунок 86 и в). Во обоих случаях наблюдалось связывание РД-МП1. Однако только на Т-клетках происходило вытеснение ЫП1-РД из участков, связывания немеченным МП1.

В) В-клвтки

Рисунок 8. Специфическое связывание ЫШ с поверхностью мышиных селезеночных клеток.

по оси абсцисс: ПТС-Ш11/Ш1 (для А) или РД-ШИ/ЫШ (для Б И В) 1 - меченный 1Ш1/ШИ; 2 - меченный МП1/МП2; МК+ - процент ПТС-или РД-поэитивных клеток в суспензии селезеночных клеток без ЫШ. <ю оси-ординар: 'содержание меченных клеток в суспензии селезеночных клеток (X).

Наличие у МП1 иммунорегуляторной активности было подтверждено при использовании ЫНК перифери >ской крови человека Показано, что у здоровых доноров (3 чел.) ЫП1 усиливает продукцию в культуре ЫНК, стимулированных МЛ, в среднем на 22,57. и индуцирует продукцию у доноров, неотвечаюцих в норме на МЛ (1 чел.), вызывая ее повышение на 462. У больных с гипогаммаглобулинемией, ЫНК которых характеризуются очень низким уровнем МЛ-индуцированного синтеза, МГЦ не вызывал какого-либо изменения продукции 1е&

На основании выш приведенных данных можно утверждать, что им-мунорегуляторное действие МШ реализуется через Т-лимфоциты. Точный механизм такой регуляции пока неизвестен. Можно лишь предположить возможные пути воздействия Ш1 на Т-клетки: 1) МП1 блокирует функциональную активность Т-супрессоров, 2) ЫП1 стимулирует Т-хеперную функцию лимфоцитов и 3) МШ мотет модулировать хелпер-супрессорные взаимодействия, при этом возможно действие на Т-хелперы, Т-супрес-соры и их предшественники.

Недавно в лаборатории медиаторов иммунной системы ИБХ были 1..1-лучеиы данные, демонстрирующие анти-Т-супрессорное действие МШ. Ш11 предотвращал Кон А-индукцию Т-супрессоров и отменял иншбирую-щий эффект Кон А-индуцированных Т-супрессоров на антителообразова-ние в культуре мышиных клеток лимфатических узлов. Эти данные подтверждают факт, что мишенью действи.. ЫП1 являются Т-лимфоциты. Однако нельзя исключить возможность влияния МШ и на клетки макрофаг ального ряда, поскольку мы обнаружили усиление фагоцитарной активности под влиянием МП1 при нарушенных функциях этих клеток. У мышей, обработанных Цф и имеющих сниженную фагоцитарную активность, ЫП1 восстанавливал функцию макрофагов практически до нормы.

Сходство некоторых эффектов Миелопида, созданного на основе смеси МП, и ШИ показывает, что Ш11 ответственней за важные иммуно-регуляторные эффекты данного препарата. Так. МШ. подобно Ыиелопи-ду, увеличивет антителообразование на пике иммунного ответа на ти-мусзависимые антигены (ЭБ), усиливает пролиферацию клеток, стимулированных Т-клеточным ыитогеном (Кон А) и повышает продукцию лимфоцитами, стимулированными Ш1 ЫП1, так же как и Миелопид, в условиях иммунодефицита обладал выраженным иммунокорригирующим эф-

'tcKTOM: ЫП1 частично воосстанавливал уровень АОК в селезенке мышей, сниженный по,- воздействием ионизирующей радиацией, и нормализовал антителообразование, подавленное ЦФ.

Однако между эффектами ЫП1 и Миелопида имеется и существенные ,1'наличия. Известноi что Миелопид воздействут не только на Тклетки, но и на популяцию В-клеток. Он вызывал краткосрочную пролиферацию В -клеток (Кузнецова С. Ф. ,1989), повышал уровень АОК в культуре гиб-ридомных В-клеток 2С12 и 2В2 ("чхайлова А. А. ,1988) и усиливал секрецию антител в культуре В-клеточных клонов, полученных слиянием клеток меланомы AgX63. Р653 с клетками селезенки мышей Balb/c, дважды HM>,vHH3HpoBaiiHbK капсульным Fl-антигеном чумного микроба (клон 2 G6B3 и клон ЗС7С7) (Нэвиков R И, ,1989). В наших экспериментах МГЦ не влиял на популяцию В1лимфоцитов: не изменял пролиферацию лимфоцитов, стимулирог^нных В-клеточным митогеном (ЛПС), не повышал уровень АОК у животных, у которых избирательно быда элиминированы Т-клетки и, более того, на В-лимфоцитах не выявлено рецептора для ШИ. Различие в эффектах между ШИ и Миелопидом проявилось и в отношении клеток макрофатального ряда. Миелопид в норме у мышей повышал фагоцитарную активность макрофагов и стимулировал образование макрофагальных лизосомальных ферментов (Априкян В. С. ,1988, Сходова С. А. ,1986, 1990). 'По нажим данным ЫШ. в норме не влиял на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей. Однако в условиях иммунодефицита Ш1 восстанавливал сниженную фагоцитарную активность макрофагов у мышей, обработанных ЦФ, причем влияние носило бимодальный характер, который наблюдался и при исследовании эффекта Шелопчда на фагоцитоз СЧодоаа С. А. ,1990).

Очевидно, в состав Миелопида, помимо МШ, входят и другие биологически активные соединения, принимающие участие в реализации клинического эффекта этого препарата (Фонина Л. А. ,1993). В то же время ЫП1 принадлежит существенная роль в иммунорегуляторных эффектах Миелопида. На основании экспериментальных данных, демонстрирующих иммуностимулирующие (иммунокорригирующие) свойства МП1, можно ("читать, что данный пептид перспективен для разработки на его основе нового структурно охарактеризованного иммуномодулятора эндоген-природы.

вывода

1. Уиедопептнды kfflû и ШЕ, исходно выделенные из супернагганта культуры клеток костного мозга свиньи, структурно, охарактеризованные и синтезированные, обладают иммунорегуляторной активностью. Наиболее выраженные ишунорегудатсрвые свойства проявляются у Ш1. оказывает иммунорегудаторный аффект лишь в некоторых экспериментальных моделях и при более высоких концентрациях, чем ШИ.

2. ШП стимулирует антителсоСразование на пике иммунного ответа к ЭБ, усиливает Кои А-индуцированную пролиферацию лимфоцитов и повышает Ш-индуцированную продукцию IgG в суспензии клеток селс.енки мышей в условиях in vitro. Ммцуиорегуляторные эффекты МП1 доэозави-сшш. ШЕ повышает антитедообрааование на ЭБ и усиливает Кон А-индуцированную: пролиферацию лимфоцитов лишь в узком диапазоне концентраций и иэ вдаавт ва МЛ -индуцированную продукцию IgG. МП1 и Ш2 не оказывает влияний на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей в норме.

3. ЫШ проявляет ша^гнокорригирующие свойства. Данный пептид усиливает аитителсюбразованве к ЭБ в экспериментальных моделях иммунодефицита в, вызванных ионизирующей радиацией или ЦФ и повышает Кон А- индуцированную пролиферацию лимфоцитов и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, подавленные ЦФ. Для наиболее полного проявления иммунокорригируюшрго аффекта МШ необходимо его курсовое введение животным) на все» протяжении развития иммунного ответа ШЕ восстанавливает" фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов Мышей, обработанных ДФ, но обладает слабым иммунокорригирующим эффектом. в- отношении тимусзависимого иммунного ответа, вызывая лишь незначительное повышение ажгителообразования на ЭБ при курсовом введении облученным животным. ,

4. МШ и ШЕ влняш на "чмуниые реакции мышей NZB о dрожденным иммунодефицитом. МШ вызывав® доаозависимое увеличение антителообра-

зование на ЭВ на фоне повышенного иммунного ответа на тимусвависи-ные антигень' характерного для мышей NZB. Он усиливает сниженный ирчлифзративный ответ 'лимфоцитов на Кон А, а также отменяет ингиби-1>ук«ций эффект Ш1 на повышенную спонтанную секрецию IgG в культуре селезеночных клеток. МП2 обладает сходной активностью, однако аффекты данного пептида не имеют -дозовой зависимости и проявляются в кяждом случае лишь при одной из использованных Концентраций. Ш2, в л'личие от Ш1, повышает фагситарную активность перитонеальньй чакрофагов мышей NZB.

В. Иммунорегуляторные эффекты ШИ реализуются череа воздействие данного пептида на популяцию Т-лимфоцитов. ШИ усиливает пролиферацию мышиных селезеночных клеток лишь в ответ на Т-клеточный митоген (Кон А) и не влияет на пролиферацию лимфоцитов, стимулированных В-клеточным мич-.'еном (ЛПС). Избирательная элиминация у мышей Т-клеток с помощью ЦФ полностью отменяет антителосяимудирующий эффект МГЦ в условиях in vivo, в то время как у Б-дефицитных милей МШ вызывет повышение уровня антителообразования в селезенке. Имму-нофлуоресцентный анализ выявил наличие специфического рецептора для МШ на поверхности мышиных селезеночных клеток, который отсутсвует на В-лифоцитах.

6. Гексапептид МШ, ' входящий в состав Миелопида и обладающий выраженной иммунорегуляторной (иымунокорригирующей) активностью, является перспективной.основой для разработки нового структурно охарактеризованного иммуномодулятора эндогенной природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кирилина Е. А., Шанурин С. Ю., Аонина ДА., Гурьянов С. А., Яновский О. Г. , Михайлова А. А.. Изоляция индивидуального миелопептида, обладающего иммуностимулиующей активностью. Иммунология, 1992, No 4,с. 31-33

2. Шанурин С. KL .Кирилина Е. А., Фонина JL А. , Гурьянов С. А., Яновский О. Г., Михайлова А. А. Изоляция миелопептида,обладающего иммунос-тимулиру щим и иммунокорригируюшим эффектом. 1 съезд иммунологов России в Ново сибирск',1992, с. 62

3. Shanurln S. Yu. , Klrillna E. A. and Mikhail ova A. A. Bone man..* peptide with lnmunocorrecti э effect. 8th Internation. Congre:.^ Iiramol. (abstract). Budapesht, 1992.25,32. , p.'l62

4. Шанурин G. И., Гурьянов С. A. , Михайлова А. А;. Индивидуальный мие лопептид оказывает корригирующий эффект на антителопродукцию ь модели иммунодефицита,вызванного адриамицином. Иммунологии,1993, N2, с. 17-19.

Б.- Петров Р. В., Михайлова А. А. , Фонина Л А., Кирилина Е. А., Шанурин С. Ю., Гурьянов С. А. Щжменение пептида Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Tlu в качестве вещества, обладающего иммунорегуляторной активностью. Латентная заявка N 93040876 от 12.08.93 с приоритетом от 24.08.9а

6. Petrov R. V., Mikhailova A. A., Zakharova LA., FoninaLA., Shanurln S.Yu., Klrillna E. A., Gur'anov S. A. Myelopeptides affecting pain sensitivity and antibody formation. US Patent Application Ho Application No 08/143,815, 21 October, 1993.

7. П&нурин С. Ю. Шэлопептид-1 стимулирует гуморальный иммунный ответ у облученных мышей. Радиобиология, 1Q94, т. 34, N4-5.

8. Шхайлова А. А., . Кирилина Е. А., Шанурин С. а , «онина Л А. , Гурьянов С. А., Петров P. R Иммунорегуляторные свойства миелопептида-1 (ЫШ). ДАН, 1994, т. 337, N4, с. 845-848

9. Shanurin S. Yu., , Mlkhai lova A. А. , ur'yanov S. A., Petrov R. V. Iwmnocorreotlve effects of rryalopeptldes. 12th European Jnraunology tteeting (abstract).Barcelona, 1994.