Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Сравнительная цитологическая и гистологическая диагностика новообразований шейки матки (плоидометрическое исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ

На правах рукописи УДК 618.146-006-07

Глухова Юлия Константиновна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ И ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ

ДИАГНОСТИКА НОВООБРАЗОВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ

(ПЛОИДОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.46. - клиническая лабораторная диагностика 14.00.15. - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2004

Работа выполнена в Российской Медицинской Академии последипломного образования Министерства Здравоохранения и Социального Развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Шабанова И.П.

Научный консультант:

академик Российской академии естественных наук,

доктор медицинских наук, профессор Автандилов Г.Г.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ягубов А.С.

доктор медицинских наук Полонская Н.Ю.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН

Защита состоится «__»_2004 г. в_часов на

заседании специализированного Совета Д.208.071.04 при Российской Медицинской Академии последипломного образования МЗ РФ по адресу: 123836, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Российской Медицинской Академии последипломного образования МЗ РФ по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19.

Автореферат разослан «_»_2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

заслуженный деятель науки РФ, профессор

Морозова В.Т.

Актуальность темы

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место в мире по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин. По данным ВОЗ в 1990 году РШМ составил приблизительно 10% от всех 470000 случаев злокачественных эпителиальных новообразований во всем мире [Ferlay J. et al., 2000]. Уровень заболеваемости РШМ в большинстве развивающихся стран остается достаточно высоким [Fattaneh A., Devilee P., 2003]. По данным ВОЗ, уровень смертности от РШМ не имеет тенденции к снижению. Ежегодно во всем мире от РШМ умирают приблизительно 230000 женщин и 190000 из них (около 80%)- из развивающихся стран [Robles S.C. et al, 1996, Levi F. et al, 2000].

В Российской Федерации в последние годы отмечается стабилизация заболеваемости раком ШМ (14,9 на 100000 женского населения) и летальности (5 на 10000 женщин) [Кулаков В.И. с соавт., 2000]. Однако, несмотря на это, в нашей стране рак шейки матки -одна из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей [33,38]. Наиболее часто РШМ выявляется в старшей возрастной группе (60-70 лет и старше), однако в последнее время появляется все больше публикаций, описывающих случаи возникновения этой патологии у женщин репродуктивного возраста [Прилепская В.Н., 1999]. Самый высокий риск возникновения дисплазий, также имеется в молодом возрасте [Козаченко В.П. с соавт., 1996]. В связи с обширной распространенностью, высокой смертностью и заболеваемостью РШМ лиц всё более молодого возраста, профилактика рака и ранняя диагностика предраковых изменений остается актуальной медицинской и социальной проблемой [Бебнева с соавт., 2001, Явишева Т.М. с соавт., 2000].

Разрешение вопросов, связанных с диагностикой РШМ, и особенно его ранних форм затруднено, поскольку при этих формах заболевания отсутствуют патогномоничные клинические симптомы [Вишневская Е.Е., 1994, Fattaneh A. et al, 2003], и они могут быть своевременно установлены только посредством морфологических (цитологического и гистологического) методов исследования. До настоящего времени методы цитологической и гистологической диагностики по-прежнему являются наиболее доступными и распространенными из всех способов диагностики новообразований ШМ.

Однако, результаты морфологических методов исследования не всегда однозначны. Особенно это относится к оценке степени выраженности дисплазий плоского эпителия и определению начальных форм РШМ [Ганина К.П. с соавт., 1984]. Нередки случаи различной интерпретации одних и тех же препаратов высококвалифицированными патологоанатомами и цитологами. Предлагаемые морфологические критерии для дифференциальной диагностики разных проявлений опухолевой прогрессии в шейке матки остаются субъективными и не могут служить одинаковой воспроизводимости диагнозов разными исследователями. Всё это обуславливает поиск более точных и объективных подходов к диагностике данной

Современные вспомогательные методики, используемые в диагностике плоскоклеточных неоплазий шейки матки (электронная микроскопия, иммуногисто- и иммуноцитохимия, молекулярно-биологические методы), также не позволяют решать вопросы диагностики этой патологии в силу их недостаточной точности и дороговизны [Автандилов Г.Г., 2002]. В то же время изучение содержания генетического материала (ДНК) в ядрах клеток плоского эпителия ШМ в процессе канцерогенеза пока для этой цели используется недостаточно, хотя вызывает бесспорный научный интерес [Steinbeck R.G., 1997] и является более экономичным методом. Применение плоидометрического и кариометрического методов исследования при изучении предраковых процессов и рака может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики стадий развития онкологического процесса в шейке матки.

Цель настоящей работы - совершенствование дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки по данным плоидометрии при сравнительной цитологической и гистологической диагностике плоскоклеточных новообразований шейки матки.

. Задачи исследования:

1. На гистологическом и цитологическом материале осуществить плоидометрическое исследование ядер клеток плоского эпителия с учетом стадий канцерогенеза в шейке матки.

2. Определить диагностические плоидометрические критерии цервикальной интраэпителиальной неоплазий разной степени выраженности.

3. Установить плоидометрические показатели ядер опухолевых клеток, характерные для инвазивного рака шейки матки: плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего.

4. Определить возможности плоидометрии для совершенствования гистологической и цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.

5. Дать сравнительную оценку точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки по гистологическим и цитологическим препаратам и использовать эти данные для создания унифицированной морфометрической классификации.

6. Оценить возможности компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными красителями, для диагностики предрака и рака шейки матки.

Научная новизна.

•Впервые обоснован и апробирован метод компьютерной плоидометрии для дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.

•Впервые осуществлена визуализация плоидности ядер эпителиоцитов, характеризующей стадии канцерогенеза в шейке матки на тканевом и клеточном уровне.

•На основе плоидометрических и кариометрических данных впервые получен комплекс объективных характеристик, уточняющих дифференциально-диагностические критерии стадий развития плоскоклеточных новообразований шейки матки.

• Впервые проведен сравнительный анализ плоидометрических и кариометрических параметров ядер плоских эпителиоцитов, характеризующих стадийность развития рака в шейке матки и разработана морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки.

• Впервые предложен способ кариометрической диагностики предрака и рака шейки матки по цитологическому материалу на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов в различной цитологической окраске.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод компьютерной плоидометрии позволяет проводить визуализацию плоидности ядер клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия на клеточном и тканевом уровне и может быть использован при осуществлении дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.

2. Разная степень выраженности средних показателей плоидности доминирующих клонов клеток плоского эпителия характеризует низкую и высокую степени цервикальной интраэпителиальной неоплазии и позволяет дифференцировать их от инвазивного плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего рака.

3. Данные компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными методами, можно использовать для дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки.

4. Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки, проведенной по гистологическим и цитологическим препаратам, позволяет использовать сходные по значениям относительные показатели измерений (плоидность, кратность увеличения площади ядер, нарастание анеуплоидии, косвенные признаки пролиферативной активности) для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки.

Практическая значимость полученных результатов.

1. Полученные в работе данные позволяют использовать визуализацию плоидности и морфометрические характеристики ядер клеток плоского эпителия в качестве дополнительной информации к рутинной световой микроскопии - основному методу морфологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.

2. Получение результатов компьютерной плоидометрии не связано с применением сложных и дорогостоящих методик исследования, в то же время они являются объективными количественными критериями для проведения дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки, что позволяет минимизировать диагностические ошибки и определять прогноз заболевания.

3. В наиболее трудных для диагностики случаях разработанная морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки создает объективную основу для более четких морфологических заключений о характере неопластического процесса.

4. Предлагаемый способ цитологической диагностики предрака и рака шейки матки на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов при различной цитологической окраске может применяться в цитологических лабораториях лечебно-диагностических учреждений.

Личный вклад соискателя

Автором лично выполнены гистологическое, цитологическое и плоидометрическое исследования изучаемого материала. Автором лично проведена работа по количественной оценке, статистической обработке и анализу результатов исследований и созданию новой морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по теме: «Морфологическая диагностика опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки» на кафедре патологической анатомии РМАПО (зав. кафедрой профессор Перов Ю.Л.); внедрены в практику цитологической лаборатории при Центре патологоанатомических исследований на базе Московской городской клинической больницы № 33 им. проф. А.А. Остроумова, в работу патологоанатомического отделения НО «МФ МСЧ № 1 АМО ЗИЛ». Результаты компьютерной кариометрии ядер плоских эпителиоцитов в цитологических препаратах представлены к рассмотрению в качестве проекта научного изобретения.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине», (Москва, 2003); на XXI и XXII научно-практических конференциях «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2003,2004). Апробация

диссертации состоялась на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики и патологической анатомии РМАПО 29.06.2004.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, изданных в отечественной печати.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на страницах и состоит из введения, обзора

литературы, материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и приложения. Библиографический указатель включает в себя 149 источников (в т.ч. 69 отечественных и 80 зарубежных публикаций). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами, 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Световая микроскопия. Проведено гистологическое исследование

биопсийного и операционного материала за 2000-2003 годы, полученного от 78 пациенток в возрасте 20-78 лет, для морфологической верификации клинических диагнозов: эрозия, дисплазия и рак шейки матки. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, проводили по общепринятой методике и заливали в парафин. Препараты, окрашенные гематоксилином и эозином служили для общего суждения о морфологической картине и постановки гистологического диагноза дисплазии (ЦИН) различной степени тяжести и инвазивного плоскоклеточного рака разной степени дифференцировки. Гистологические диагнозы устанавливали в соответствии с гистологической классификацией опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки ВОЗ 1994 года.

Отдельно проводили цитологическое исследование гинекологических мазков из экто- и эндоцервикса от 66 пациенток в возрасте 20-80 лет с направительными клиническими диагнозами: эрозия шейки матки, дисплазия различной степени тяжести и рак шейки матки (материалы 2001-2003 гг). Цитологические мазки, высушенные на воздухе, окрашивали по методу Паппенгейма и изучали методом световой микроскопии. Препараты служили для постановки цитологических диагнозов дисплазий различной степени тяжести (цервикальных интраэпителиальных неоплазий - ЦИН) и инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки. Для удобства сравнения с гистологической группой, цитологический диагноз дисплазии (ЦИН) и инвазивного плоскоклеточного рака устанавливался также в соответствии с гистологической классификацией опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки ВОЗ 1994 г.

Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по гистологическим и цитологическим препаратам. После верификации гистологических и цитологических диагнозов методом световой микроскопии осуществили компьютерную

плоидометрию методом гистофотометрического и цитофотометрического анализа для установления плоидометрических критериев ЦИН разной степени выраженности и инвазивного плоскоклеточного рака, а также уточнения результатов световой микроскопии данными гоюидометрии. Исследование проводили на материале тех же пациентов, препараты которых изучались методом световой микроскопии. Исследование разных стадий канцерогенеза выполнено на 78 дополнительных гистологических срезах биоптатов шейки матки толщиной 8 мкм и 66 высушенных цитологических мазках, одновременно окрашенных в стандартных условиях по методу Фёльгена (без докраски фона). Плоидометрические и морфометрические измерения проводили на интерфазных ядрах эпителиоцитов базального слоя эпителия шейки матки и ядрах клеток доминирующего клона неоплазии. Исследовано 224 поля зрения в цитологических мазках и 136 - в гистологических срезах типичных участков ЦИН-1, ЦИН II, ЦИН Ш и инвазивных карцином шейки матки. Всего изучено 4953 ядра плоских эпителиоцитов и опухолевых клеток в цитологических мазках и 9525 ядер - в гистологических срезах. Исследование выполнили на компьютерном анализаторе изображений «Имаджер-ЦГ» с версией программы «Автан-Сан» с учетом требований метода сравнительной микроспектрофотометрии [Автандилов Г.Г., 2002]. Условия освещения оставались одинаковыми при всех измерениях. При увеличении микроскопа в 400 раз измеряли интегральную яркость окрашенных ядер, которая представляла собой сумму яркости всех точек ядра, отражающих содержание в них Фёльген-ДНК. Кроме того, измеряли площадь оптического сечения ядер, которая представляла собой сумму яркости всех хорд ядра. С целью установления «цитологического стандарта плоидности» определяли среднюю интегральную яркость достаточной выборки ядер малых лимфоцитов в центрифугате крови, которую принимали за диплоидный набор хромосом (2с). Половина указанного стандарта являлась единицей плоидности. «Тканевой стандарт плоидности» в гистологических срезах была определен по средней интегральной яркости ядер малых лимфоцитов в исследуемых срезах. Данные измерений ядер плоских эпителиоцитов и опухолевых клеток, изучаемые в типичных полях зрения, автоматически относились к стандартам плоидности и на экране дисплея демонстрировались сведения о средних значениях интегральной яркости, плоидности и площади оптического сечения ядер клеток эпителиоцитов (в псевдоцветах) и гистограмма их распределения. Результаты всех измерений автоматически регистрировались на картах плоидометрического исследования содержащих: изображение препарата с изучаемыми ядрами в псевдоцветах по содержанию в них ДНК, гистограммы, цифровые значения интегральной яркости (в относительных единицах - о.е.), плоидности (с) и площади оптического сечения (в пикселях) изучаемых ядер, а также в виде таблиц (таблицы 1,2,3,4,).

При статистическом анализе данных о плоидности ядер эпителиоцитов шейки матки получали сведения об особенностях «плоидометрического профиля» (гистограммы) каждой стадии канцерогенеза. Кроме прямых признаков малигнизации (плоидности ядер), использовали косвенные морфометрические признаки опухолевой прогрессии, в

числе которых были: коэффициент анеуплоидии - КА (отношение числа ядер с плоидностью более 4с к ядрам < 4с), пролиферативная активность (ПА), определяемая по превышению диплоидного уровня, показатель гетероморфности ядер (ПГЯ) оцениваемый по отношению средних арифметических и средних взвешенных показателей плоидности и показатель полиморфизма ядер-ППЯ (для цитологических препаратов)- отношение между средними взвешенными и средними показателями площадей оптического сечения ядер клеток.

Компьютерная кариометрия цитологических препаратов при рутинной цитологической окраске. Для оценки возможностей компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных рутинными красителями, для диагностики предрака и рака шейки матки, в условиях повседневной цитологической практики, дополнительно к кариометрическому изучению 4953 ядер клеток плоского эпителия в цитологических мазках, окрашенных по Фёльгену, провели сравнительную компьютерную кариометрию 1534 ядер плоских эпителиоцитов в цитологических мазках в рутинной окраске (по Паппенгейму). Площадь оптического сечения ядер плоских эпителиоцитов измеряли на компьютерном анализаторе «Имаджер -ЦТ» с версией программы по плоидометрии «Автан-Сан». По кратности превышения значений средней площади оптического сечения ядер неоплазии значений средней площади оптического сечения ядер нормальных эпителиоцитов уточняли степень интраэпителиальной неоплазии и диагноз инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки. Результаты измерений представлены в таблице 5 .

Сравнительная плоидометрическая и кариометрическая диагностика плоскоклеточных новообразований шейки матки. Данное исследование было выполнено для сравнительной оценки точности плоидометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки на тканевом и клеточном уровнях. Провели сравнительное изучение результатов плоидометрии ядер клеток плоского эпителия на различных стадиях канцерогенеза в шейке матки, предварительно проведенной на 66 цитологических цервикальных мазках и 78 гистологических срезах биоптатов шейки матки. Сравнивали результаты статистической обработки данных плоидометрии 4953 ядер в 224 полях зрения в типичных участках мазков и 9525 ядер плоских эпителиоцитов и опухолевых клеток в типичных участках срезов. Анализировали следующие показатели: среднюю плоидность и площадь оптического сечения ядер клеток неоплазии, изменения коэффициента анеуплоидии - КА (отношение числа ядер >4с к ядрам < 4с) и пролиферативной активности (ПА) ядер изучаемого клона клеток. Также оценивали увеличение площади оптического сечения ядер клеток неоплазий и инвазивного рака по отношению к площади оптического сечения ядра нормальной клетки.

Методы статистического анализа

Полученные характеристики исследуемых ядер подвергали статистической обработке в автоматическом режиме при помощи программы по плоидометрии "Автан-Сан" с использованием: М - средней арифметической, М взв - средней взвешенной, ± а среднего квадратического отклонения, ± m - ошибки выборки. Степень достоверности различий показателей оценивали t-критерием Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами принимали достоверными при 0,95 уровне вероятности безошибочного суждения (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты гистологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки.

Результаты световой микроскопии. При изучении методом световой микроскопии гистологических препаратов 78 пациенток с клиническими диагнозами: эрозия, дисплазия, рак шейки матки, в соответствии с гистологической классификацией опухолей и опухолеподобных состояний ШМ ВОЗ 1994 г. установлены следующие гистологические диагнозы: слабая дисплазия (НИН I) - у 9, умеренная дисплазия (ЦИН II) - у 26, тяжелая дисплазия / рак in situ (ЦИН III)- у 25 женщин, инвазивный плоскоклеточный рак у 14 больных: плоско клеточный ороговевающий рак - у 8, плоскоклеточный неороговевающий рак - у 6 пациенток. В 4 случаях была диагностирована физиологическая норма, послужившая контролем для проведения дальнейших исследований. Было выявлено, что диагностика плоскоклеточных неоплазий шейки матки методом световой микроскопии имеет ряд недостатков. Они состоят преимущественно в невозможности точного определения степени тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазий.

Так, трудности дифференциальной гистологической диагностики слабой (ЦИН-I) от умеренной дисплазии (ЦИН-И) имели место в 4±2 % случаев, умеренной от тяжелой дисплазии и внутриэпителиального рака (ЦИН-Ш) - в 7±3 % всех изученных случаев плоскоклеточных неоплазий шейки матки. Для решения этих диагностических проблем и установления морфометрических параметров каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки применили метод плоидометрии.

Результаты плоидометрии предраковых процессов и рака шейки матки по гистологическим препаратам. Для выполнения компьютерной плоидометрии был определен «тканевой стандарт плоидности», для чего были получены данные об интегральной оптической яркости 483 малых лимфоцитов в изучаемых срезах. Средняя интегральная яркость ядер малых лимфоцитов в гистологическом срезе (19568 относительных единиц - о.е.) были приняты за тканевой стандарт плоидности равный 2с, а единицей плоидности для измерений — половина этого значения — 1с. Данные о

плоидности изучаемых эпителиоцитов новообразований автоматически получались путем деления средних показателей интегральной яркости ядер клеток неоплазм на половину указанного стандарта плоидности. Результаты измерений представлены в таблице 1:

Таблица 1. Распределение плоидометрических и кариометрических показателей ядер клеток плоского эпителия в гистологической группе (в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ 1994 г.). __

№ Показатели / значения показателей Норма ЦИН-1 цин-11 ЦИН-Ш Инвазивный плоскоклеточный рак

Орогове-вающий рак Неорогове-вающий рак

1. Количество исследованных ядер в срезе 664 1041 2652 2013 1164 1991

2. Относительная доля ядер в срезе, % 4,72 7,44 8,89 9,42 11,5 10,06

3. Плоидометрия

3.1 Средняя плоидность, М с 2,3 3 1 *** 4,0* 4,5*** 5 4*** 5,8

4. Средняя площадь сечения ядер,пиксели 247 331 432 463 519 553

5. Характеристика ядер - - - - - -

5.1 Показатель полиморфизма ядер (М/Мв)-ППЯ 0,9 0,9 1,2 1,2 1,1 1,2

6. КА(>4с/<4с) 0 0,1 0,22 0,38 0,95 1,09

7. ПА(П-2с) 0,3 1,1 2 2,5 3,4 3,8

Примечание: достоверность различий между соседними группами — * р < 0,05 , ** р < 0,01, ***р< 0,001.

Результаты проведенной нами плоидометрии гистологических срезов шейки матки свидетельствуют о том, что по мере развития ЦИН различной степени тяжести и инвазивного плоскоклеточного рака разной степени дифференцировки последовательно нарастают плоидность и площадь оптического сечения ядер плоских эпителиоцитов шейки матки, нарастает ядерный полиморфизм, увеличивается число анеуплоидных (и

полиплоидных) клеток в ростковой зоне неоплазии, увеличивается пролиферативная активность клеток неоплазии и их количество в стандартном объеме неопластической ткани. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследований разных авторов, проводимых на других эпителиальных тканях [Автандилов Г.Г., Стрижева Н.В., 2003: Гундорова Л.В., 2002; Зайратьянц О.В., Пробатова Н.А., 2002]. Таким образом, в результате применения метода плоидометрии были получены объективные количественные плоидометрические и кариометрические характеристики нормального многослойного плоского эпителия и каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки: ЦИН I - ЦИН II - ЦИН III - инвазвного плоскоклеточного ороговевающего рака - инвазивного плоскоклеточного неороговевающего рака.

Применение плоидометрии способствовало разрешению трудностей дифференциальной гистологической диагностики, выявленных на светооптическом уровне: слабой (ЦИН-I) от умеренной дисплазии (ЦИН-II) в 4±2 % случаев (3 из 74 изученных случаев неоплазий), умеренной (ЦИН-II) от тяжелой дисплазии и внутриэпителиального рака (ЦИН-Ш) - в 7±3 % случаев (5 из 74 изученных случаев неоплазий). Таким образом, на основании результатов плоидометрии были уточнены гистологические диагнозы во всех сомнительных случаях - в 11 ±4 %.

В результате проведенного сравнительного анализа были выявлены статистически значимые различия показателей средней плоидности в последовательно сравниваемых группах: норма и CIN I; CIN III и инвазивный рак. (р<0,001). Группа CIN П в гистологической выборке отличалась более низким уровнем достоверности различий с соседними группами - р<0,05. Учитывая тот факт, что статистические различия между группой CIN II и соседними группами оказались низкими, следует ожидать, что в практической работе количество ошибочных диагнозов при дифференциальной диагностике этих стадий будет достаточно большим. Это побудило нас объединить группу CIN II с CIN III и карциномой in situ в единую группу. Укажем, что такое объединение уже имеет место в морфологической практике в системе регистрации цитологических данных плоскоклеточных новообразований шейки матки «Бетесда». В связи с этим была проведена перегруппировка изучаемого гистологического материала следующим образом: норма, CIN I, (CIN П и CIN III ), инвазивный рак. Полученные результаты также подвергли статистическому анализу по показателю средней плоидности (таблица 2):

Таблица 2. Распределение плоидометрических и кариометрических показателей ядер клеток плоского эпителия в гистологической группе (в соответствии с классификацией «Бетесда» 1989,1991гг.)___

№ Показатели / значения показателей Норма ЦИН I цин II, цин III Инвазивный плоскоклеточный рак

Ороговеваю-щий рак Неорогове-вающий рак

1. Количество исследованных ядер в срезе 664 1041 4665 1164 1991

2. Относительная доля ядер в срезе, % 4,72 7,44 9,16 11,5 10,06

3. Плоидометрия

3.1 Средняя плоидность, М с 2,3 3 1 * * * 4 3*** 5 4*** 5,8

4. Средняя площадь сечения ядер, пиксели 247 331 434 519 553

5. Характеристика ядер - -

5.1 Показатель полиморфизма ядер (М/Мв)-ППЯ 0,9 0,9 1,2 1,1 1,2

6. КА(>4с/<4с) 0 0,01 0,3 0,95 1,09

7. ПА(П-2с) 0,3 1,1 2,2 3,4 3,8

Примечание: достоверность различий между соседними группами — * р < 0,05, ** р< 0,01, ***р< 0,001.

В результате статистического анализа мы получили максимально высокий уровень достоверности различий этой объединенной группы с соседними CIN I и инвазивным раком (р < 0,001) (таблица 2). С учетом максимально высокого уровня полученной статистической достоверности различий всех исследуемых групп, распределение результатов плоидометрии плоских эпителиоцитов в гистологических срезах можно представить в виде следующей гистологической морфометрической классификации. В соответствии с предлагаемой классификацией при средних значениях плоидности ядер ростковых зон плоских эпителиоцитов шейки матки равной 2,0 с -2,4 с диагностируется нормальная ткань. Более высокие значения плоидности клона клеток дают основание для диагностики различных стадий канцерогенеза в шейке матки, а именно: 2,5 с -3,4 с —

цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени — куда относится слабая дисплазия; 3,5 с - до 4,5 с - цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени, объединяющей умеренную, тяжелую дисплазии и рак «in situ»; свыше 4,5 с - инвазивный плоскоклеточный рак - плоскоклеточные карциномы с различной степенью дедифференцировки, при показателях плоидности 5,4 с - ороговевающий рак, 5,8 с - неороговевающий рак. Используемая терминология заимствована из системы регистрации цитологических данных «Бетесда». На наш взгляд, предложенная морфометрическая классификация наиболее достоверно отражает суть происходящих изменений в эпителии шейки матки в процессе озлокачествления. Отдельные авторы, например, R.M. Richart [1990], Sherman ME. et al [1992], также высказывают суждение о правильности двуступенчатого деления предраковых процессов в эпителии шейки матки.

Таким образом, компьютерная плоидометрия гистологических срезов с визуализацией плоидности ядер клеток неоплазии позволяет определять главный признак озлокачествления многослойного плоского эпителия шейки матки, а результаты плоидометрии ядер могут служить дифференциально-диагностическими критериями, которые дают возможность более точно, чем обычные методы исследования, устанавливать стадии канцерогенеза и повышать надежность патогистологических заключений.

Результаты цитологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки.

Результаты световой микроскопии. Согласно гистологической классификации

опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки ВОЗ 1994 г. диагностировали: слабую дисплазию - в 17 случаях, умеренную дисплазию - в 11 случаях, тяжелую дисплазию /карциному in situ - также в 12 случаях, инвазивный плоскоклеточный рак ороговевающий и неороговевающий - в 22 случаях и контролем исследования послужила группа физиологической нормы - 4 наблюдения. Анализируя результаты проведенного цитологического исследования, следует отметить, что диагностика плоскоклеточных неоплазий шейки методом световой микроскопии имеет определенные недостатки. Они состоят преимущественно в невозможности точного определения степени тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазии, отсутствии четких цитологических критериев внутриэпителиального и инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки. Так, трудности дифференциальной цитологической диагностики слабой дисплазии (ЦИН-I) отмечены нами в 7±3 % случаев, умеренной (ЦИН-II) от тяжелой дисплазии (ЦИН-III) -в 5±3 % случаев и внутриэпителиального рака (ЦИН-III) от инвазивного рака- в 7±3 % случаев от всех изученных 62 наблюдений плоскоклеточных неоплазий шейки матки. Для решения этих диагностических проблем и установления морфометрических параметров каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки мы применили метод плоидометрии.

Результаты плоидометрии предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам. Для выполнения компьютерной плоидометрии

определяли «цитологический» стандарт плоидности. Для установления «цитологического» или «истинного стандарта плоидности» была определена средняя интегральная яркость ядер малых лимфоцитов в мазке центрифугата крови. На основании полученных данных о средней интегральной яркости ядер малых лимфоцитов -цитологическому стандарту плоидности в мазке соответствовало 20666 относительных единиц интегральной яркости ядра малого лимфоцита. В качестве единицы измерения соответствующей 1 с, была принята половина указанного стандарта яркости, т.е. - 10333 о.е. Для получения плоидности изучаемых ядер эпителиоцитов на этот параметр автоматически делились все показатели интегральной яркости ядер выделенных в мазке опухолевых клеток. При компьютерной диагностике ядер эпителиоцитов в мазках из шейки матки были получены следующие результаты (таблица 3):

Таблица 3. Распределение плоидометрических и кариометрических показателей ядер клеток плоского эпителия в цитологической группе (в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ 1994 г.)

№ Показатели / значения показателей Норма ЦИН-1 ЦИН-11 ЦИН-Ш Инвазивный плоскоклеточный рак

1. Количество исследованных ядер в мазке 248 1341 1298 975 1091

2. Относительная доля ядер в мазке, % 4,83 6,17 7,35 6,58 8,53

3. 3.1 Плоидометрия Средняя плоидность ядер М, с

2,3 3,3** 4,0 4,5* 6,0*

4. Средняя площадь сечения ядер, пиксели 552 833 983 1073 1423

5. Характеристика ядер - - - -

5.1 Показатель гетеро-морфности ядер - ПГЯ 1,00 1,07 1,09 1,03 1,12

6. КА(>4с/<4с) 0 0,09 0,33 0,9 1,3

7. ПА(М-2с) 0,3 1,3 2,0 2,5 4

Примечание к таблице 3: достоверность различий между соседними группами - * р < 0,05, **р<0,01,***р<0,001

Результаты проведенной нами плоидометрии цитологических мазков из шейки матки свидетельствуют о том, что по мере развития ЦИН различной степени тяжести и инвазивного плоскоклеточного рака разной степени дифференцировки последовательно нарастают плоидность и площадь оптического сечения ядер плоских эпителиоцитов шейки матки, увеличиваются ядерный полиморфизм, число анеуплоидных и полиплоидных клеток в ростковой зоне неоплазии, пролиферативная активность клеток и их число в стандартном объеме опухоли. Полученные нами результаты пловдометрии ядер плоских эпителиоцитов шейки матки полностью согласуются с данными исследований различных авторов, проводимых на других эпителиальных тканях [Автандилов ГГ. и соавт.2001, 2002; Гундорова Л.В., 2002; Steinbeck R.G., 1998].

Таким образом, в результате применения метода плоидометрии были получены объективные количественные плоидометрические и кариометрические характеристики нормального многослойного плоского эпителия и каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки: ЦИН I - ЦИН II - ЦИН III - инвазивного плоскоклеточного рака.

Применение плоидометрии способствовало разрешению трудностей дифференциальной цитологической диагностики, выявленных на светооптическом уровне: слабой дисплазии (ЦИН-1) в 7±3% случаев, умеренной (ЦИН-П) от тяжелой дисплазии и внутриэпителиального рака (ЦИН-Ш) - в 5±3%, внутриэпителиального рака от инвазивного рака - в 7±3% случаев от 62 всех изученных случаев неоплазии. Таким образом, на основании результатов плоидометрии были уточнены цитологические диагнозы во всех сомнительных случаях - в 19±5 % наблюдений.

В результате проведенного сравнительного анализа были выявлены статистически значимые различия показателей средней плоидности в последовательно сравниваемых группах: норма и CIN I (p<0,01); CIN III и инвазивный плоскоклеточный рак (р<0,05). Группа CIN II в цитологической выборке статистически не отличалась от соседних групп. Учитывая тот факт, что достоверных статистических различий между группой CIN II и соседними группами: CIN I и CIN Ш получено не было, следует ожидать, что в практической работе количество ошибочных диагнозов при дифференциальной диагностике этих стадий будет достаточно большим. С тем, чтобы точнее разделить исследуемые группы, мы воспользовались цитологической классификацией по системе «Бетесда», разделяющей цервикальные интраэпителиальные неоплазии на две группы: низкую и высокую степени ЦИН [Lundbeig G., 1989], и объединили в нашем исследовании CIN II и CIN III в единую группу. Полученные результаты также подвергли статистическому анализу по показателю средней плоидности (таблица 4):

Таблица 4. Распределение плоидометрических и кариометрических показателей ядер клеток плоского эпителия в цитологической группе (в соответствии с классификацией « Бетесда» 1989,1991гг.)_

№ Показатели / значения показателей Норма ЦИН I ЦИН II, ЦИН III Инвазивный плоскоклеточный рак

1. Количество исследованных ядер в мазке 248 1341 2273 1091

2. Относительная доля ядер в мазке, % 4,83 6,17 6,96 8,90

Плоидометрия

3. Средняя плоидность ядер М,с 23 3 з*** 4,3** 6,0**

4. Средняя площадь сечения ядер, пиксели 552 833 1028 1432

5. Характеристика ядер

5.1 Показатель гетеро-морфности ядер - ПГЯ 1,00 1,07 1,06 1,10

6. КА(>4с/<4с) 0 0,09 0,62 1,30

7. ПА (М-2с) 0,3 1,3 2,3 4

Примечание: достоверность различий между соседними группами - *р < 0,05, **р <0,01, ***р<0,001.

При сравнительном статистическом анализе показателя средней плоидности мы получили высокий уровень достоверности различий этой объединенной группы с соседними - ЦИН I и инвазивным раком (р < 0,01) (таблица 4).

С учетом высокого уровня полученной статистической достоверности различий всех исследуемых групп, распределение результатов плоидометрии плоских эпителиоцитов в цитологических мазках можно представить в виде цитологической морфометрической классификации, в основу которой положено изменение плоидности ядер плоских эпителиоцитов в соответствии со стадиями канцерогенеза в шейке матки.

В соответствии с этим при средних значениях плоидности ядер ростковых зон плоских эпителиоцитов в цитологических мазках из шейки матки: 2,0 с -2,4 с диагностируется нормальная ткань. Более высокие значения плоидности клона клеток дают основание для диагностики различных стадий канцерогенеза в шейке матки, а именно: 2,5 с -3,4 с — цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени - куда относится слабая дисплазия (ЦИН I); 3,5 с до 4,5 с - цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени, объединяющей умеренную дисплазию (ЦИН II), тяжелую дисплазию и карциному in situ (ЦИН Ш);

свыше 4,5 с - инвазивного плоскоклеточного рака - плоскоклеточные карциномы с различной степенью дедифференцировки. Используемая терминология («цервикальная интраэпителиальная неоплазия низкой степени», «цервикальная интраэпителиальная неоплазия высокой степени», «инвазивный плоскоклеточный рак») заимствована нами из системы регистрации цитологических данных «Бетесда» [Lundberg G., 1989].

Кроме Lundberg G. [1989], отдельные авторы, например, R.M. Richart [1990], Sherman М.Е. et al [1992], также высказывают суждение о правильности двуступенчатого деления предраковых процессов в эпителии шейки матки. В последние 10 лет в литературе широко обсуждается правильность и возможность практического применения двуступенчатого деления цервикальных интраэпителиальных неоплазий [Минкина Г.Н. и соавт., 2001; Автандилов Г.Г.2002]. На наш взгляд, предложенная морфометрическая классификация наиболее достоверно дифференцирует стадии опухолевой прогрессии, отличающиеся друг от друга на одну единицу плоидности.

Таким образом, получаемые с помощью плоидометрии средние значения плоидности ядер эпителиоцитов плоскоклеточных неоплазий шейки матки в цитологическом мазке отражают изменяющиеся биологические свойства клеточных элементов неоплазии по мере развития каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки и могут служить основой для их дифференциальной цитологической диагностики и выбора адекватной клинической тактики.

Полученные объективные результаты демонстрируют возможности плоидометрии для совершенствования цитологической диагностики плоскоклеточных неоплазий в шейке матки.

Компьютерная кариометрия плоских эпителиоцитов в цитологическихмазках врутинной окраске.

В повседневной цитологической практике клинические цитологи используют рутинные методы окраски цитологических препаратов, не дающие представления о количестве ДНК в ядрах плоских эпителиоцитов шейки матки, как это происходит в окраске по методу Фёльгена. Однако, известно, что при проведении цитофотометрии в окраске по методу Фёльгена интегральная яркость ядер эпителиоцитов шейки матки представляет собой сумму яркостей всех точек, приходящихся на ядро и отражающих содержание в них Фельген-ДНК, а сумма яркости всех хорд ядра - площадь его оптического сечения. Поэтому дифференциальная диагностика стадий канцерогенеза в шейке матки могла бы проводиться не только по плоидности, но и по площади оптического сечения ядер клеток плоского эпителия в цитологических мазках. Так, возникла задача провести сравнительное измерение площадей оптического сечения ядер нормальных и неопластических клеток плоского эпителия шейки матки в цитологических мазках, окрашенных рутинными красителями, и по методу Фёльгена.

Для оценки возможностей компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных рутинными красителями, для диагностики предрака и рака шейки матки, дополнительно к кариометрическому изучению 4953 ядер клеток плоского эпителия в цитологических мазках, окрашенных по Фёльгену (таблица 4), мы провели сравнительную компьютерную кариометрию 1534 ядер плоских эпителиоцитов в цитологических мазках в рутинной окраске (по Паппенгейму). По кратности превышения значений средней площади оптического сечения ядер неоплазии значений средней площади оптического сечения ядер нормальных эпителиоцитов уточняли степень интраэпителиальной неоплазии и диагноз инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки. Цитологический диагноз дисплазии (ЦИН) и инвазивного плоскоклеточного рака устанавливался в соответствии с системой регистрации цитологических данных «Бетесда» 1988, 1991. Результаты измерений представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты компьютерной кариометрии плоских эпителиоцитов в цитологических мазках в рутинной окраске. ___

Показатель

соотношения Показатель

Стадии/ Окраска Число ядер Средняя площадь ядер, пиксели площади ядер нормальных плоских эпителиоцитов и ядер клеток неоплазии Число ядер Средняя площадь ядер, пиксели соотношения площади ядер нормальных плоских эпителиоцитов и ядер клеток неоплазии

Окраска по Фёльгену Окраска по Паппенгейму

Норма 248 552 1,0 138 612 1,0

ЦИН низкой 1341 833 1,5 раза 356 924 1,5 раза

степени

ЦИН высокой 2273 1028 2 раза 523 1199 2 раза

степени

Инвазив-

ный

плоско- 1091 1423 2,5 раза 517 1529 2,5 раза

клеточный

рак

При сравнительном анализе полученные относительные показатели соотношения площадей ядер нормальных плоских эпителиоцитов и ядер клеток неоплазии в цитологических мазках в окрасках по Фёльгену и по Паппенгейму оказались сходными, что позволило установить: цервикальную интраэпителиальную неоплазию низкой степени (ЦИН I) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток в 1,5 раза; цервикальную интраэпителиальную неоплазию высокой степени (ЦИН П и ЦИН III) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток до 2 раз; инвазивный плоскоклеточный рак (плоскоклеточные карциномы различной степени дифференцировки) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток в 2,5 раза и более.

Таким образом, компьютерная кариометрия является доступным и объективным способом, уточняющим цитологическую диагностику плоскоклеточных неоплазий шейки матки по цитологическим мазкам, окрашенным различными способами, с учетом изменений средних значений площади ядер клеток новообразования.

Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики предрака и рака шейки матки по гистологическим и цитологическим препаратам.

Для сравнительной оценки точности плоидометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки на тканевом и клеточном уровне провели изучение результатов плоидометрии ядер клеток плоского эпителия на различных стадиях канцерогенеза в шейке матки. Сравнивали результаты плоидометрического измерения 4953 ядер в 224 полях зрения в типичных участках мазков (таблица 4) и 9525 ядер плоских эпителиоцитов и опухолевых клеток в типичных участках срезов (таблица 2). Провели сравнительный анализ в гистологической и цитологической группах следующих показателей: средней плоидности и площади оптического сечения ядер клеток неоплазии, изменения коэффициента анеуплоидии - КА (отношение числа ядер >4с к ядрам < 4с) и показателя пролиферативной активности (ПА) ядер изучаемого клона клеток. Также оценивали увеличение площади оптического сечения ядер клеток неоплазии и инвазивного рака по отношению к площади оптического сечения ядра нормальной клетки. Сравнение плоидометрических и кариометрических показателей проводилось в соответствии с ранее выделенными группами: норма-ЦИН-1 -ЦИН II, ЦИН Ш-инвазивный плоскоклеточный рак.

Для удобства сравнения с цитологической группой, в гистологической группе инвазивный ороговевающий и неороговевающий плоскоклеточный рак объединили в общую группу «инвазивный плоскоклеточный рак».

Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики новообразований шейки матки выявила высокое соответствие относительных показателей: плоидности, кратности изменения площади ядер клеток неоплазии, коэффициентов анеуплоидии и показателей пролиферативной активности в гистологической и цитологической группах. Это позволяет проводить объективную и достоверную морфометрическую диагностику плоскоклеточных неоплазий шейки матки как по гистологическому, так и по цитологическому материалу и, с учетом высокого уровня статистической достоверности различий всех исследуемых групп (р<0,001), может быть использовано для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки. В основе данной классификации лежит изменение плоидности ядер плоских эпителиоцитов в соответствии со стадиями канцерогенеза в шейке матки.

Согласно предлагаемой классификации, при средних значениях плоидности ядер ростковых зон плоских эпителиоцитов в гистологических срезах и цитологических мазках из шейки матки - 2,0 с -2,4 с диагностируется нормальная ткань. Более высокие значения плоидности клона клеток дают основание для диагностики различных стадий канцерогенеза в шейке матки, а именно: 2,5 с -3,4 с — цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени — куда относится слабая дисплазия (ЦИН I); 3,5 с до 4,5 с — цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени, объединяющей умеренную дисплазию (ЦИН II), тяжелую дисплазию и карциному in situ (ЦИН III); свыше 4,5 с - инвазивного плоскоклеточного рака -плоскоклеточные карциномы с различной степенью дедифференцировки.

Выявленное соответствие относительных плоидометрических и кариометрических показателей позволило рекомендовать данную морфометрическую классификацию к использованию как в цитологической, так и в патологоанатомической практике.

Таким образом, плоидометрическое исследование гистологических и цитологических препаратов дает возможность уточнять диагностику стадий канцерогенеза в шейке матки и принимать обоснованные диагностические решения в отношении «доброкачественных процессов» (слабо выраженных интраэпителиальных неоплазий), пограничных состояний (выраженных интраэпителиальных неоплазий) и злокачественных новообразований шейки матки (плоскоклеточных инвазивных раков). Полученные данные могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциально-диагностических критериев при морфологической диагностике стадий канцерогенеза в шейке матки.

ВЫВОДЫ:

1. Плоидометрия ядер клеток многослойного плоского эпителия, выполненная на гистологическом и цитологическом материале, выявила нарастание значений их плоидности, площади оптического сечения и пролиферативной активности по стадиям канцерогенеза в шейке матки.

2. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия низкой степени (ЦИН I или слабая дисплазия эпителия) шейки матки диагностируется при значениях средних показателей плоидности ядер клеток плоского эпителия, соответствующих 2,5 - 3,4 с.

3. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (ЦИН П или умеренная дисплазия, ЦИН III или тяжелая дисплазия эпителия и карцинома in situ) шейки матки устанавливается при значениях средних показателей плоидности ядер клеток плоского эпителия - 3,5 - 4,5с. Выделение в этой обобщенной группе стадии ЦИН II статистически не обосновано, т.к. средние показатели плоидности ядер плоских эпителиоцитов групп ЦИН II и ЦИН III статистически не отличаются.

4. По результатам плоидометрии гистологических препаратов установлены критерии степеней дедифференцировки инвазивных плоскоклеточных карцином шейки матки: значения средних показателей плоидности 5,4 с характерны для плоскоклеточного ороговевающего рака, 5,8 с - для неороговевающего рака шейки матки.

5. По изученному материалу, на основе результатов плоидометрии, уточнены морфологические диагнозы плоскоклеточных новообразований шейки матки: при гистологических исследованиях - в 11±4 % и при цитологических в -19±5 % наблюдений.

6. Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики новообразований шейки матки выявила высокое соответствие относительных показателей: плоидности, кратности изменения площади ядер клеток неоплазии, коэффициентов анеуплоидии и показателей пролиферативной активности в гистологической и цитологической группах, что было использовано для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки, применимой к цитологической и гистологической диагностике.

7. Результаты компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными красителями, с учетом относительных показателей площади ядер клеток плоскоклеточных неоплазий шейки матки, позволяют диагностировать: ЦИН низкой степени - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток в 1,5 раза, ЦИН высокой степени - в 2 раза и инвазивный плоскоклеточный рак - в 2,5 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Целесообразно использовать разработанную унифицированную морфометрическую классификацию при гистологическом и цитологическом

исследовании плоскоклеточных новообразований шейки матки в наиболее трудных для диагностики случаях.

2. Предлагаемый способ цитологической диагностики предрака и рака шейки матки на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов в различной цитологической окраске следует применять в цитологических лабораториях лечебно-диагностических учреждений в повседневной диагностической практике.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Плоидометрическая характеристика клеток плоского эпителия при дисплазиях шейки матки. // «Успехи теоретической и клинической медицины». - М.: РМАПО, 2003. -вып.5.-СЛ39-140.

2. Сравнительная оценка цитологических и гистологических препаратов дисплазий и рака шейки матки по данным плоидометрических исследований. // Материалы 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине». - Москва, 2003. - С.5-8.

3. Дифференциальная диагностика стадий канцерогенеза в шейке матки (по данным плоидометрического исследования). // Архив патологии. - 2003. - том 66. - № 3.- С.23-27 (Совместно с Г.Г. Автандиловым, Т.М. Преображенской).

4. Сравнительная оценка точности плоидометрической диагностики предрака и рака шейки матки по результатам гистологических и цитологических исследований.'// Российские медицинские вести. - 2004. - том IX. - № 2. - С.35-38 (Совместно с Г.Г. Автандиловым).

5. Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 11. -С.45-47 (Совместно с Г.Г. Автандиловым, И.П. Шабаловой).

Перечень принятых сокращений

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения (англ. WHO) ВЭР - внутриэпителиальный рак (карцинома in situ, рак in situ) Д - дисплазия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИР - инвазивный рак

ПНОР - плоскоклеточный неороговевающий рак ПОР - плоскоклеточный ороговевающий рак ПРШМ - плоскоклеточный рак шейки матки РШМ - рак шейки матки

ЦИН - цервикальная интраэпителиальная неоплазия -(от англ. CIN - cervical intraepithelial lesion) ШМ - шейка матки

Заказ №508. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». Г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место в мире по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин [143]. По данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) в 1990 году РШМ составил приблизительно 10% от всех 4700000случаев злокачественных эпителиальных новообразований во всем мире [97]. В некоторых регионах, таких как Экваториальная Африка, Центральная Америка, Южная и Центральная Азия данная патология достигает 1/3 всех наиболее распространенных раков [19,143].

Уровень заболеваемости раком ШМ в разных странах неодинаков. Так, заболеваемость РШМ в последние 3-4 десятилетия в большинстве развитых стран заметно снизилась [143]. Ряд авторов связывают это с введением программ цитологического скрининга [96,118] и улучшением уровня жизни населения [81]. Уровень заболеваемости РШМ в большинстве развивающихся стран остается достаточно высоким [143].

По данным ВОЗ, уровень смертности от РШМ не имеет тенденции к снижению [143]. Ежегодно во всем мире от РШМ умирают приблизительно 230000 женщин и более 190000 из них (более 80%)- из развивающихся стран [112,131].

В Российской Федерации в последние годы отмечается стабилизация заболеваемости раком ШМ (14,9 на 100000 женского населения) и летальности (5 на 100000 женщин) [33,38], благодаря активно развивающемуся цитологическому скринингу, способствующему раннему выявлению РШМ у женщин [21,54,58]. Однако, несмотря на это, в нашей стране рак шейки матки -одна из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей [33,38].

Основным фактором, провоцирующим развитие РШМ, является вирус папилломы человека (ВПЧ или англ.НРУ), а точнее онкогенные его типы: 16,18 и 31 [40,42,89,90,95,105,108,111,113,116].

Наиболее часто РШМ выявляется в старшей возрастной группе (60-70 лет и старше), однако в последнее время появляется все больше публикаций, описывающих случаи возникновения этой патологии у женщин репродуктивного возраста [33,92,143]. Самый высокий риск возникновения дисплазий, по данным В.П. Козаченко и соавт., также имеется в молодом возрасте [36]. По данным W.D.Rosenfeld HPV впервые обнаруживается у 39% подростков во время единственного скринингового визита [132]. М. Frisch, Н. Hausen связывают это с ранним началом половой жизни и снижением иммунитета у подростков [99,104].

В связи с обширной распространенностью, высокой смертностью и заболеваемостью раком ШМ (шейки матки) лиц всё более молодого возраста, профилактика РШМ и ранняя диагностика предраковых изменений остается актуальной медицинской и социальной проблемой [19,22,26,42].

Разрешение вопросов, связанных с диагностикой рака ШМ, и особенно его ранних форм затруднено [30,84,85], поскольку при этих формах заболевания отсутствуют патогномоничные клинические симптомы: предраковые изменения чаще всего маскируются фоновыми процессами [22,46,61], начальные формы РШМ у 57,7% больных протекают клинически бессимптомно [25,143] и могут быть своевременно установлены только посредством морфологических (цитологического и гистологического) методов исследования [26]. До настоящего времени методы цитологической и гистологической диагностики по-прежнему являются наиболее доступными и распространенными из всех способов диагностики новообразований ШМ [37,127].

Однако, результаты морфологических методов исследования не всегда однозначны. Особенно это относится к оценке степени выраженности дисплазий плоского эпителия и определению начальных форм рака ШМ [28]. Нередки случаи различной интерпретации одних и тех же препаратов высококвалифицированными патологоанатомами и цитологами [29]. Предлагаемые морфологические критерии для дифференциальной диагностики разных проявлений опухолевой прогрессии в шейке матки остаются субъективными и не могут служить одинаковой воспроизводимости диагнозов разными исследователями. Всё это обуславливает поиск более точных и объективных подходов к диагностике данной патологии.

Современные вспомогательные методики, используемые в диагностике плоскоклеточных неоплазий шейки матки (электронная микроскопия, иммуногисто- и иммуноцитохимия, молекулярно-биологические методы), не позволяют окончательно решать вопросы диагностики этой патологии в силу их недостаточной точности и дороговизны [10]. В то же время плоидометрическое исследование содержания генетического материала (ДНК) в ядрах клеток плоского эпителия ШМ в процессе канцерогенеза используется для этой цели пока недостаточно, хотя вызывает бесспорный научный [6,7] и практический интерес, так как является более экономичным и доступным в использовании методом [10].

Применение плоидометрического и кариометрического методов исследования при изучении предраковых процессов и рака может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики стадий развития онкологического процесса в шейке матки [2].

В связи с этим, целью настоящей работы явилось совершенствование дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки по данным плоидометрии при сравнительной цитологической и гистологической диагностике плоскоклеточных новообразований шейки матки. Исходя из этого задачи исследования определялись следующим образом::

1. На гистологическом и цитологическом материале осуществить плоидометрическое исследование ядер клеток плоского эпителия с учетом стадий канцерогенеза в шейке матки.

2. Определить диагностические плоидометрические критерии цервикальной интраэпителиальной неоплазии разной степени выраженности.

3. Установить плоидометрические показатели ядер опухолевых клеток, характерные для инвазивного рака шейки матки: плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего.

4. Определить возможности плоидометрии для совершенствования гистологической и цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.

5. Дать сравнительную оценку точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки по гистологическим и цитологическим препаратам и использовать эти данные для создания унифицированной морфометрической классификации.

6. Оценить возможности компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными красителями, для диагностики предрака и рака шейки матки.

Научная новизна

Впервые обоснован и апробирован метод компьютерной плоидометрии для дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.

Впервые осуществлена визуализация плоидности ядер эпителиоцитов, характеризующей стадии канцерогенеза в шейке матки на тканевом и клеточном уровне.

На основе плоидометрических и кариометрических данных впервые получен комплекс объективных характеристик, уточняющих дифференциально-диагностические критерии стадий развития плоскоклеточных новообразований шейки матки.

Впервые проведен сравнительный анализ плоидометрических и кариометрических параметров ядер плоских эпителиоцитов, характеризующих стадийность развития рака в шейке матки и разработана морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки. Впервые предложен способ кариометрической диагностики предрака и рака шейки матки по цитологическому материалу на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов в различной цитологической окраске.

Практическая значимость полученных результатов

1. Полученные в работе данные позволяют использовать визуализацию плоидности и морфометрические характеристики ядер клеток плоского эпителия в качестве дополнительной информации к рутинной световой микроскопии - основному методу морфологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.

2. Получение результатов компьютерной плоидометрии не связано с применением сложных и дорогостоящих методик исследования, в то же время они являются объективными количественными критериями для проведения дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки, что позволяет минимизировать диагностические ошибки и определять прогноз заболевания.

3. В наиболее трудных для диагностики случаях разработанная морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки создает объективную основу для более четких морфологических заключений о характере неопластического процесса.

4. Предлагаемый способ цитологической диагностики предрака и рака шейки матки на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов при различной цитологической окраске может применяться в цитологических лабораториях лечебно-диагностических учреждений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод компьютерной плоидометрии позволяет проводить визуализацию плоидности ядер клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия на клеточном и тканевом уровне и может быть использован при осуществлении дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.

2. Разная степень выраженности средних показателей плоидности доминирующих клонов клеток плоского эпителия характеризует низкую и высокую степени цервикальной интраэпителиальной неоплазии и позволяет дифференцировать их от инвазивного плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего рака.

3. Данные компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными методами, можно использовать для дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки.

4. Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки, проведенной по гистологическим и цитологическим препаратам, позволяет использовать сходные по значениям относительные показатели измерений (плоидность, кратность увеличения площади ядер, нарастание анеуплоидии, косвенные признаки пролиферативной активности) для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по теме: «Морфологическая диагностика опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки» на кафедре патологической анатомии РМАПО (зав. кафедрой профессор Перов Ю.Л.); внедрены в практику цитологической лаборатории при Центре патологоанатомических исследований на базе Московской городской клинической больницы № 33 им. проф. А.А.

Остроумова, в работу патологоанатомического отделения НО «МФ МСЧ № 1 АМО ЗИЛ». Результаты компьютерной кариометрии ядер плоских эпителиоцитов в цитологических препаратах представлены к рассмотрению в качестве проекта научного изобретения. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине», (Москва, 2003); на XXI и XXII научно-практических конференциях «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2003,2004). Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики и патологической анатомии РМАПО 29.06.2004.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, изданных в отечественной печати.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Плоидометрическая характеристика клеток плоского эпителия при дисплазиях шейки матки. // «Успехи теоретической и клинической медицины». - М.: РМАПО, 2003. - вып. 5. - С. 139-140.

2. Сравнительная оценка цитологических и гистологических препаратов дисплазий и рака шейки матки по данным плоидометрических исследований. // Материалы 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине». - Москва, 2003. - С.5-8.

3. Дифференциальная диагностика стадий канцерогенеза в шейке матки (по данным плоидометрического исследования ). // Архив патологии. - 2003. - том 66. - № 3.- С.23-27 (Совместно с Г.Г. Автандиловым, Т.М. Преображенской).

4. Сравнительная оценка точности плоидометрической диагностики предрака и рака шейки матки по результатам гистологических и цитологических исследований. // Российские медицинские вести. - 2004. - том IX. - № 2. - С.35-38 (Совместно с Г.Г. Автандиловым).

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Библиографический указатель включает в себя 149 источников (в т.ч. 69 отечественных и 80 зарубежных публикаций). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами, 28 рисунками.

Выводы

1. Плоидометрия ядер клеток многослойного плоского эпителия, выполненная на гистологическом и цитологическом материале, выявила нарастание значений их плоидности, площади оптического сечения и пролиферативной активности по стадиям канцерогенеза в шейке матки.

2. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия низкой степени (ЦИН I или слабая дисплазия эпителия) шейки матки диагностируется при значениях средних показателей плоидности ядер клеток плоского эпителия, соответствующих 2,5 - 3,4 с.

3. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (ЦИН II или умеренная дисплазия, ЦИН III или тяжелая дисплазия эпителия и карцинома in situ) шейки матки устанавливается при значениях средних показателей плоидности ядер клеток плоского эпителия - 3,5 - до 4,5с. Выделение в этой обобщенной группе стадии ЦИН II статистически не обосновано, т.к. средние показатели плоидности ядер плоских эпителиоцитов групп ЦИН II и ЦИН III статистически не отличались.

4. По результатам плоидометрии гистологических препаратов установлены критерии степеней дедифференцировки инвазивных плоскоклеточных карцином шейки матки: значения средних показателей плоидности 5,4 с характерны для плоскоклеточного ороговевающего рака, 5,8 с - для неороговевающего рака шейки матки.

5. По изученному материалу, на основе результатов плоидометрии, уточнены морфологические диагнозы плоскоклеточных новообразований шейки матки: при гистологических исследованиях - в 11±4 % и при цитологических в - 19±5% наблюдений.

6. Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики новообразований шейки матки выявила высокое соответствие относительных показателей: плоидности, кратности изменения площади ядер клеток неоплазии, коэффициентов анеуплоидии и показателей пролиферативной активности в гистологической и цитологической группах, что было использовано для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки, применимой к цитологической и гистологической диагностике.

7. Результаты компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными красителями, с учетом относительных показателей площади ядер клеток плоскоклеточных неоплазий шейки матки, позволяют диагностировать: ЦИН низкой степени - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток в 1,5 раза, ЦИН высокой степени - в 2 раза и инвазивный плоскоклеточный рак - в 2,5 раза.

Практические рекомендации

Недостатками световой микроскопии, как основного метода морфологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки, являются невозможность в ряде случаев проведения точного разграничения доброкачественных и злокачественных изменений, однотипной диагностики степеней дедифференцировки карцином, а также большая зависимость от опыта врача. В практической работе клинических цитологов и патогистологов возникают диагностические ситуации, когда наблюдаются разночтения одних и тех же препаратов неоплазий шейки матки, связанные с субъективностью восприятия специалистами микроскопической картины.

В связи с указанным состоянием качества гистологической и цитологической диагностики плоскоклеточных неоплазий шейки матки важное значение приобретает объективизация исследования клеточного состава мазков и оценки структуры гистологических срезов.

Предлагаемый объективный и более точный способ дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки может быть использован в практической работе морфолога. Сущность описываемого метода состоит в том, что по гистологическим срезам и цитологическим мазкам, окрашенным обычными красителями, проводят рутинную морфологическую диагностику и затем уточняют ее на компьютерном анализаторе изображений при помощи программы по плоидометрии «Автан-Сан». При выполнении требований сравнительной микроспектрофотометрии с учетом значений средней плоидности ядер плоских эпителиоцитов неоплазии и в соответствии с разработанной в настоящем исследовании унифицированной морфометрической классификацией диагностируют: цервикальную интраэпителиальную неоплазию низкой степени (CIN I, слабую дисплазию) - при значениях средней плоидности плоских эпителиоцитов - 2,5с - 3,4 с; цервикальную интраэпителиальную неоплазию высокой степени, объединяющую умеренную (СIN II), тяжелую дисплазию и карциному in situ (CIN III)-3,5с-до 4,5 с и инвазивный плоскоклеточный рак (карциномы с различной степенью дедифференцировки) - свыше 4,5 с: при плоскоклеточном ороговевающем раке -5,4 с, плоскоклеточном неороговевающем раке -5,8 с.

Разработанную унифицированную морфометрическую классификацию целесообразно использовать при гистологическом и цитологическом исследовании плоскоклеточных новообразований шейки матки в наиболее трудных для диагностики случаях.

Диагностику различных стадий канцерогенеза в шейке матки можно осуществлять при помощи программы по плоидометрии «Автан-Сан» на компьютерном анализаторе изображений не только с помощью анализа показателей средней плоидности ядер, но также при помощи анализа средней площади оптического сечения ядер клеток неоплазии в цитологических мазках, окрашенных различными красителями.

Полученные в данной работе результаты кариометрического исследования позоляют устанавливать: цервикальную интраэпителиальную неоплазию низкой степени (CIN I - слабая дисплазия) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток до 1,5 раз; цервикальную интраэпителиальную неоплазию высокой степени, объединяющую умеренную (CIN II), тяжелую дисплазию и карциному in situ, (CIN III) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток - до 2 раз и инвазивный плоскоклеточный рак (карциномы с различной степенью дедифференцировки) - при кратности превышения значений площади ядер нормальных эпителиальных клеток - в 2,5 раза и более.

Предлагаемый способ цитологической диагностики предрака и рака шейки матки на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов в различной цитологической окраске следует применять в цитологических лабораториях лечебно-диагностических учреждений в повседневной диагностической практике.

Предлагаемые способы плоидометрической и кариометрической диагностики позволяют проводить лишенную субъективизма цитологическую и гистологическую дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза в шейке матки (норма-предрак-рак) с учетом изменения средних значений плоидности и относительных значений площади оптического сечения ядер клеток плоскоклеточных новообразований.