Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Прогностическое значение молекулярно-генетических онкологических маркеров при лечении заболеваний шейки матки

На правах рукописи

4

Свидинская Евгения Александровна

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ

14.01.01.- акушерство и гинекология

Автореферат С-

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ИЮН 2011

МОСКВА 2011

4848537

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, доцент

Джибладзе Tea Амирановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Сичинава Лали Григорьевна

Доктор медицинских наук, профессор Геворкян Марианна Арамовна

Ведущая организация: ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»

заседании диссертационного совета Д 208.040.03 при ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан « и** 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлович

Защита диссертации состоится « £2011 года в

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Диагностика и лечение заболеваний шейки матки представляет до настоящего времени большой интерес в связи с не снижающейся частотой этой патологии, в том числе и ростом заболеваемости раком шейки матки, который является одним из самых частых заболеваний в онкогинекологии и составляет около 16% злокачественных опухолей у женщин.

Доброкачественные заболевания шейки матки являются одной из актуальных проблем современной гинекологии и имеют большое значение с точки зрения возникновения и развития злокачественных новообразований (Прилепская В.М., 2007). Среди гинекологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста патология шейки матки, по данным различных авторов, колеблется от 10 до 15% и служит фоном для развития предраковых заболеваний и рака шейки матки (Прилепская В.Н., Голубенко А.Е., 2007).

Многие исследователи отмечают, что доброкачественные рецидивирующие заболевания шейки матки являются факторами риска в развитии предраковых изменений и рака шейки матки (Кулаков В.И. и др., 1999, 2005; Прилепская В.Н., 2000, 2005, 2007; Franco E.L. et al., 1997, 2002).

В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, все большую значимость приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска.

Одно из основных генетических событий, необходимых для развития опухоли - инактивация генов-супрессоров опухолевого роста. Гиперметилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, происходит на ранних стадиях опухолеобразования и часто обнаруживается во многих предраковых состояниях (Maruyuma R., Toyooka S., Toyooka К. et al. 2002; House M., Guo M. et al. 2003).

Гиперметилирование генов может служить молекулярным маркером ранней диагностики, мониторинга и клинического прогноза развития опухолей (Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., 2004; Muller Н. et all, 2004).

Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических признаков, позволяет вовремя начать более тщательную диагностику и превентивную терапию, а также выявить группу риска развития предраковых заболеваний и рака шейки матки (Подистов Ю.И., 2006).

Широкая распространенность, разнообразие патологических состояний и потенциальный риск злокачественной трансформации эпителия шейки матки определяют высокую значимость прогностических критериев возникновения и развития патологических процессов.

Цель исследования:

Определение прогностического значения выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров у пациенток с доброкачественными и предраковыми заболеваниями шейки матки.

Задачи исследования:

1. Разработать комплексную методику диагностики патологических процессов шейки матки на основании выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров.

2. Определить роль молекулярно-генетических маркеров в диагностике патологических изменений эпителия шейки матки.

3. Разработать принципы хирургического лечения в зависимости от выявленных молекулярно-генетических онкологических маркеров.

4. Разработать дальнейшую тактику ведения пациенток с различной патологией шейки матки в зависимости от выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров.

Научная новизна исследования

Впервые проведено комплексное обследование пациенток с различной патологией шейки матки с включением молекулярных методов диагностики в общий комплекс диагностических мероприятий.

Выявление изменений на уровне генома клетки ещё до её морфологической модификации позволит значительно улучшить раннюю диагностику предраковых заболеваний и рака шейки матки, что является новшеством диагностики.

Впервые определено прогностическое значение выявления молекулярно-генетических маркеров у пациенток с доброкачественными и предраковыми заболеваниями шейки матки и предложен алгоритм комплексного обследования с использованием молекулярных методов диагностики.

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования предложен рациональный алгоритм обследования и ведения пациенток с заболеваниями шейки матки.

Определено значение молекулярно-генетических маркеров опухолевой трансформации в тканях шейки матки, что позволяет повысить качество диагностики и определить выбор тактики ведения больных.

Определено значение аномального метилирования генов для выявления групп риска развития предраковых заболеваний и рака шейки матки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров может быть рекомендовано как одна из эффективных методик в диагностике заболеваний шейки матки, в том числе и в скрининговых программах.

2. Обнаружение молекулярно-генетических онкологических маркеров в тканях шейки матки позволяет выявить пациенток с повышенным риском рецидива как доброкачественных, так и предраковых заболеваний шейки матки.

3. Выявлен высокий уровень гиперметилирования генов р16, MLH1 и N33 при предраковых процессах и раке шейки матки в сравнении с доброкачественными заболеваниями шейки матки.

4. Инактивация генов р16, MLH1 и N33 в результате аномального метилирования играет существенную роль в переходе обратимых доброкачественных заболеваний и цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки в необратимые злокачественные.

Личное участие

Автором лично проводился отбор соответствующих теме исследования пациенток, забор материала для цитологического исследования, расширенная кольпоскопия, выполнялась прицельная биопсия шейки матки и выскабливание цервикального канала. После сбора материала проведена статистическая обработка данных и их интерпретация с использованием современных статистических методов.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологического отделения клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первого МГМУ им.И.М. Сеченова.

Результаты научного исследования и основные рекомендации, представленные в диссертационной работе, включены в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета Первого МГМУ им.И.М. Сеченова.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, протокол № 12 от 26 ноября 2010 г. Диссертация рекомендована к защите.

Материалы диссертации были представлены и доложены на:

-III Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии» 2009 г;

- X Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» 2009 г;

- XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования РФ.

Структура и объем диссертационного исследования

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, содержит 31 таблицу, 6 рисунков. Список литературы состоит из 199 источников (113 на русском языке, 86 на английском языке).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клиническая характеристика больных, методы исследования и лечения

Базами для проведения исследования явились:

• клиника акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова;

• лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии ЦПАО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова;

• лаборатория патоморфологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

В клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова за период с 2007 по 2010 годы было проведено обследование и лечение 46 пациенток с различной патологией шейки матки.

На каждую пациентку заполнялась карта обследования, которая позволяла учитывать данные анамнеза, объективного исследования, дополнительных методов исследования, протоколы операций.

Методы исследования, использованные в работе:

• клиническое обследование (анализ жалоб, анамнеза заболевания, данных объективного обследования);

• расширенная кольпоскопия;

• цитологическое исследование мазков-отпечатков с экзо- и эндоцервикса;

• морфологическое исследование биоптатов шейки матки и соскобов эндоцервикса;

• молекулярное исследование биоптатов шейки матки и соскобов эндоцервикса;

• ультразвуковое исследование внутренних половых органов.

Оценивалась менструальная и репродуктивная функция пациенток, в том

числе исходы предыдущих беременностей, осложнения абортов, родов, такие как разрывы шейки матки, и послеродового периода, наличие сопутствующих гинекологических заболеваний.

С целью определения предрасполагающих факторов для возникновения предраковых заболеваний изучались клинические особенности течения фоновых заболеваний шейки матки - длительность заболевания, количество родов и абортов, наличие воспалительных заболеваний гениталий, носительство вируса папилломы человека (ВПЧ), травм шейки матки.

При гинекологическом исследовании оценивали состояние шейки и тела матки. При осмотре шейки матки в зеркалах выявляли наличие гипертрофии, рубцовой деформации, эрозированного эктропиона, эктопии цилиндрического эпителия, лейкоплакии и ретенционных кист шейки матки.

Для исключения сопутствующей гинекологической патологии и определения состояние внутренних половых органов проводилось трансвагинальное ультразвуковое исследование. Использовался ультразвуковой

аппарат «Toshiba SSH-140A» с трансвагинальным конвексным датчиком с частотой 6,5 МГц.

Для уточнения состояния шейки матки всем пациенткам выполнялась расширенная кольпоскопия на бинокулярных кольпоскопах фирм «Kaps» и «Zeiss» (Германия), при 5-25 кратном увеличении. В начале исследования осуществляли простую (обзорную) кольпоскопию, при которой определяли величину и форму шейки матки и наружного зева, цвет и рельеф слизистой, особенности сосудистого рисунка, границу плоского и цилиндрического эпителия. Для выявления более четких кольпоскопических картин использовалась проба с 3% раствором уксусной кислоты и проба Шиллера.

Кольпоскопические картины оценивались по Международной кольпоскопической классификации (обновленной Международной Ассоциацией по патологии шейки матки и кольпоскопии в 2003г).

Всем пациенткам проводилось цитологическое исследование мазков-отпечатков с экзо- и эндоцервикса. Трактовка результатов цитологического исследования осуществлялась согласно системе Bethesda.

Гистологическое исследование тканей, полученных во время операции, проводилось в лаборатории патоморфологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Результаты гистологического исследования трактовались согласно Международной гистологической классификации опухолей женского полового тракта X пересмотра (1995) и системе CIN (CIN system).

Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров в биоптатах шейки матки и соскобах эндоцервикса проводили в Лаборатории электронной микроскопии и иммуногистохимии ЦПАО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Исследование выполнялось в течение 3-5 рабочих дней с момента получения материала.

В нашей работе мы определяли аномальное метилирование 3-х генов: р16, N33, MLHI.

После получения результатов исследования всем пациенткам был поставлен заключительный клинический диагноз согласно статистической

классификации болезней и проблем, связанных с репродуктивным здоровьем X пересмотра (МКБ X).

Ножевая биопсия шейки матки и выскабливание эндоцервикса проводилось в условиях стационара под внутривенной анестезией на 5-7 день менструального цикла с обязательным гистологическим исследованием полученного операционного материала.

В качестве основного метода лечения было выбрано лазерное воздействие, которое осуществляли с помощью излучения углекислотного (СО2) лазера с длинной волны 10,6 мкм в импульсном или непрерывнрм режиме работы на базе установки «Access-бО». Воздействие осуществлялось бесконтактным методом с обязательным кольпоскопическим контролем. Мощность лазерного излучения составляла 20-40 Вт.

Лазервапоризация патологических участков шейки матки производилась в амбулаторных условиях без предварительного обезболивания в первую фазу менструального цикла (на 5-9 день).

Параметры лазерного воздействия составили: мощность 25,2±0,86 Вт, время экспозиции 4,9±0,36 мин, площадь коагулируемой поверхности составила 7,08 ± 0,25 см2. Глубина испарения тканей на неизмененной шейке матки составила 1,0 - 2,5 мм, увеличиваясь по мере удаления от периферии к центру. Непосредственно после лазервапоризации область воздействия СО2 лазера представляла собой дефект в виде «ниши» различной глубины (от 1 до 15 мм), имеющей резкие границы с окружающей тканью. Средняя продолжительность эпителизации составила 27,01±0,72 дня.

Лазерная конизация шейки матки проводилась пациенткам с подтвержденным после биопсии шейки матки гистологическим диагнозом -CIN (2-3 степени тяжести).

Процедура проводилась в условиях стационара под внутривенной анестезией на 5-7 день менструального цикла с обязательным гистологическим исследованием полученного операционного материала.

Конизацию выполняли при помощи твердотельного лазера на алюмо-иттриевом гранате с неодимом (Nd-YAG) с длиной волны 1,064 мкм и проникающей способностью 4-6 мм. Лазерную энергию получали с помощью установки «Medilas 4060 Fibertom» фирмы «Dornier» (Германия). Лазерное излучение подводилось к области воздействия с помощью гибких волоконных систем - световодов со свободным наконечником диаметром 600 мкм. Воздействие осуществлялось в контактном режущем режиме. Средняя мощность излучения составила 43,04±1,07 Вт, время воздействия 8,15±1,7 мин. Глубина иссечения тканей в области цервикального канала достигала 20 мм.

При гистологическом исследовании биоптатов шейки матки во всех случаях был подтвержден диагноз цервикальной интраэпителиальной неоплазии.

Средняя продолжительность эпителизации составила 39,08±0,82 дня.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 7.0 (США).

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты проведенного исследования основаны на анализе течения заболевания, данных клинико-лабораторных и инструментальных методов обследования, хирургического лечения с использованием лазерного излучения, оптимизации ведения больных в послеоперационном периоде.

После получения результатов обследования все пациентки были разделены на 2 группы.

I группу составили 16 пациенток с патологией шейки матки в возрасте от 21 до 51 года, у которых в результате проведённого исследования были обнаружены молекулярно-генетические онкологические маркеры в биоптатах шейки матки.

Средний возраст пациенток составил 39,3±1,01 лет. Беременности были в анамнезе у 15(94%) пациенток. Роды в анамнезе были у 13(81,25%) пациенток, аборты у 11(68,75%).

После получения результатов гистологического исследования пациенткам поставлен заключительный клинический диагноз: CIN (дисплазия шейки матки) - 8(50%); лейкоплакия шейки матки, хронический цервицит- 6(37,5%); плоскоклеточный рак шейки матки - 2(12,5%).

Анализ жалоб больных не выявил специфических симптомов, позволяющих заподозрить патологию шейки матки. Длительность заболевания с момента диагностики до обращения в клинику составила от 1 года до 12 лет, в среднем 2,9±2,1 года. По поводу заболеваний шейки матки лечение было проведено 9 пациенткам. Из них консервативное лечение проводилось 2 больным, электрохирургическое и криотерапия 6, одной пациентке -лазервапоризация по поводу лейкоплакии шейки матки, положительный эффект отметили 3 пациентки, неэффективным лечение оказалось у 6 больных.

II группу больных составили 30 пациенток в возрасте от 24 до 72 лет, с патологией шейки матки, у которых в результате проведённого исследования не было выявлено молекулярно-генетических онкологических маркеров.

Средний возраст больных составил 35,7±1,01 лет. Беременности были в анамнезе у 21(70%) пациентки. Роды у 13(34%) женщин, аборты у 14(46,6%) обследованных пациенток.

После получения результатов гистологического исследования всем пациенткам поставлен заключительный клинический диагноз: лейкоплакия шейки матки, хронический цервицит - 15(50%); CIN (дисплазия шейки матки) - 4(13%); эктопия цилиндрического эпителия - 11(37,5%).

Продолжительность заболевания у обследованных больных составила от 1 года до 24 лет, в среднем - 6,4± 1,2 года.

Анализ жалоб больных не выявил специфических симптомов, позволяющих заподозрить патологию шейки матки. По поводу заболеваний шейки матки лечение было проведено 9 пациенткам. Из них консервативное лечение проводилось 5, электрохирургическое и криотерапия - 4,

положительный эффект отметили 2 пациентки, неэффективным лечение оказалось у 7 пациенток.

При изучении репродуктивной функции 46 обследованных пациенток было выявлено, что у 36 (78,2%) обследованных в анамнезе имелись указания на наличия беременности, у 10 (21,8%) заболевания шейки матки возникли при отсутствии беременности. У 26(56,5%) пациенток в анамнезе было 1-2 родов. К факторам риска развития патологии шейки матки следует отнести аборты, которые имели место у 25 (54,3%) женщин.

Изучение данных акушерского анамнеза показало, что у 4 (25%) пациенток I группы и 3 (10%) пациенток II группы в родах были разрывы шейки матки.

Подробному анализу были подвергнуты перенесенные в прошлом гинекологические заболевания, относящиеся к факторам, влияющим на морфофункциональное состояние шейки матки, а также на различные звенья репродуктивной системы женщины (табл. 1).

Таблица 1

Гинекологические заболевания у пациенток I и II группы

Нозология I группа п(%) II группа п(%)

Хронический сальпингоофорит 4(25%) 5(16,6%)

Бесплодие вторичное 1(6,25%) 3(10%)

Миома матки 4(25%) 2(6,6%)

Урогенитальные инфекции 3(18,75%) 2(6,6%)

Гиперпластические процессы эндометрия 2(12,5%) 2(6,6%)

Генитальный эндометриоз 1(6,25%) 1(3,3%)

Бесплодие первичное - 1(3,3%)

СПКЯ - 1(3,3%)

Обследуемые пациентки I группы среди перенесенных заболеваний наиболее часто упоминали: хронический сальпингоофорит (25%) и миому матки (25%), пациентки II группы - хронический сальпингоофорит (16,6%) и бесплодие (13,3%).

Среди гинекологических заболеваний у 7 (43,75%) пациенток I группы и 7 (23,3%) пациенток II группы в прошлом были воспалительные заболевания

различной этиологии, из которых наиболее часто встречались сальпингоофориты и вульвовагиниты, урогенитальные инфекции. Среди этиологических факторов воспалительных заболеваний наиболее часто встречалась анаэробная микрофлора, уреаплазмы, микоплазмы, хламидии, грибы рода Candida.

Следует обратить внимание на то, что в I группе частота перенесенных гинекологических заболеваний была выше, чем во II группе.

При выяснении особенностей контрацепции установлено, что наиболее распространенным способом у всех обследуемых пациенток являлось использование физиологического метода контрацепции - данный метод предпочитала почти каждая третья женщина (табл. 2).

Таблица 2

Методы контрацепции у пациенток I и II группы

Показатель I группа п=16 II группа п=30

абс. % абс. %

Не предохранялись 6 37,5 14 46,7

Физиологический метод 5 31,25 7 23,4

Барьерные методы 4 25 8 26,6

ВМК 1 6,25 - -

Гормональные средства - - 1 3,3

Всего 16 100% 30 100%

Таким образом, только 25% пациенток I группы и 26,6% пациенток II группы использовали барьерные методы контрацепции, остальные - или не предохранялись совсем - или отдавали предпочтение физиологическим методам контрацепции (календарный метод, прерванный половой акт), что повышает риск передачи различных урогенитальных инфекций, в том числе и ВПЧ.

Таблица 3

Носительство ВПЧ у пациенток I и II группы

Показатель I группа п=16 II группа п=30

Носительство ВПЧ 11(68,75) 10(33,3)

Носительство ВПЧ не обнаружено 5(31,25) 20 (66,7)

Всего 100% 100%

Проведенный анализ полученных данных показывает, что в I группе носительство ВПЧ встречалось в 2 раза чаще, чем во II группе (табл. 3), что подтверждает существующую в настоящее время ключевую концепцию этиопатогенеза рака шейки матки - вирусную гипотезу, в которой ведущая роль отдается папилломавирусной инфекции. ДНК вируса папилломы человека выявляется практически у всех больных с предраковыми состояниями и РШМ.

По результатам проведенного молекулярно-генетического исследования биоптатов шейки матки было установлено, что у 30 пациенток не было обнаружено молекулярно-генетических онкологических маркеров, и только у 4 из них выявлены предраковые изменения (CIN).

У 16 пациенток в материалах биопсии были обнаружены молекулярно-генетические онкологические маркеры - определено аномальное метилирование генов: р16 - в 94 % случаев, N33 - у 50 %, MLH1 - в 81 % случаев.

В зависимости от гистологического диагноза была обнаружена следующая частота распределения аномального метилирования генов: при лейкоплакии (дискератозе) шейки матки в 83 % случаев определено гиперметилирование гена р16, в 66% случаев - гена MLH1, в образцах CIN гиперметилирование генов р16 и MLH1 определялось с одинаковой частотой - в 100% случаев, при плоскоклеточном раке шейки матки в 2 случаях определено аномальное метилирование гена р16 (рис. 1).

Рис. 1 Частота аномального метилирования генов р 16, N 33, MLH1 в биоптатах шейки матки в зависимости от гистологического диагноза.

Всем 46 пациенткам проведено комплексное обследование, включающее расширенную кольпоскопию, цитологическое исследование, гистологическое и молекулярно-генетическое исследования биоптатов шейки матки.

Таблица 4

Результаты цитологической диагностики у пациенток I и II группы (Bethesda 2001 г)

Показатель Всего п I группа п(%) II группа п(%)

Негативный результат (норма, реактивные изменения) 16 2(12,5%) 14(87,5%)

LSIL 13 6(46%) 7(54%)

HSIL 17 8(47%) 9(53%)

Всего 46 16(35%) 30(65%)

После проведенной цитологической диагностики, в мазках-отпечатках с шейки матки у пациенток I группы получены следующие результаты: негативный результат (норма, реактивное воспаление) у 2 пациенток, LSIL - у 6 пациенток, HSIL - 8 пациенток. У пациенток II группы: негативный результат

(норма, реактивное воспаление) у 14 пациенток, LSIL - у 7 пациенток, HSIL -9 пациенток (табл. 4).

При гистологическом исследовании биоптатов шейки матки и соскобов эндоцервикса у пациенток I группы было обнаружено: CIN различной степени тяжести - в 8 случаях, хронический цервицит, койлоцитоз - у 3 пациенток, картина простой лейкоплакии - у 2 пациенток, плоскоклеточный рак - у 2 пациенток, цервикальная эктопия - у 1 пациентки; во II группе обнаружено: хронический цервицит, койлоцитоз - у 14 пациенток, картина простой лейкоплакии - у 5 пациенток, цервикальная эктопия - у 5 пациенток, CIN различной степени тяжести - в 4 случаях, плоские папилломы шейки матки - у 2 пациенток (табл. 5).

Таблица 5

Частота определения гиерметилирования генов в образцах тканей

шейки матки при различной патологии

Гистологический диагноз Всего п (%) I группа п (%) II группа п (%)

Хронический экзо- и эндоцервицит 17(36,9%) 3 (18%) 14(82%)

CIN 12(26%) 8 (67%) 4 (33%)

Лейкоплакия шейки матки (дискератоз) 7(15,3%) 2 (28,5%) 5 (71,5%)

Эктопия цилиндрического эпителия 6(13%) 1 (17%) 5 (83%)

Плоскоклеточный рак шейки матки 2(4,4%) 2 (100%) -

Плоские папилломы шейки матки 2(4,4%) - 2 (100%)

Всего 46 (100%) 16(35%) 30 (65%)

Таким образом, самым частым гистологическим диагнозом стали хронический цервицит - 17 (36,9%) случаев и CIN - 12 (26%) случаев, лейкоплакия шейки матки была диагностирована у 7 (15,3%) пациенток, цервикальная эктопия цилиндрического эпителия у 6 (13%) пациенток.

Необходимо отметить, что при подтвержденном диагнозе CIN аномальное метилирование генов было обнаружено в 67% случаев, при плоскоклеточном раке шейки матки - у обеих пациенток. В то же время было определено метилирование генов при гистологической картине цервикальной эктопии в 17 % случаев, при явлениях воспаления - в 18% случаев, при лейкоплакии - в

28% случаев. В случае плоских папиллом шейки матки метилирования генов определено не было.

В соответствии с поставленными задачами оперативное вмешательство было произведено пациенткам первой и второй группы.

После получения результатов гистологического исследования 2 пациенткам с диагностированным раком шейки матки выполнены радикальные операции в онкологических стационарах; 10 пациенткам с CIN (6 пациенткам I группы и 4 пациенткам II группы) — лазерная конизация шейки матки, остальным (8 пациенткам I группы и 26 пациенткам II группы) -лазервапоризация патологических участков шейки матки (рис 2).

6(87%)

□ группа I ■ группа II

6(37,50%)

4(13%) 2(12,50%)

7

Лазервапоризация Лаз.конизация Экстирация матки Рис. 2 Методы хирургического лечения пациенток I и II группы

Всем пациенткам перед лазерохирургическим воздействием, в случае необходимости, проводилась этиотропная терапия выявленных воспалительных процессов.

Лазервапоризация патологических участков шейки матки была выполнена: в I группе - 6 (37,5%) пациенткам с лейкоплакией шейки матки и 2 (12,5%) пациенткам с CIN 1; во II группе - 15 (50%) пациенткам с лейкоплакией шейки матки и хроническим цервицитом и 11 (37%) пациенткам с эктопией цилиндрического эпителия.

Процедура проводилась в амбулаторных условиях без предварительного обезболивания в первую фазу менструального цикла (на 5-9 день).

Заканчивалась эпителизация у большинства больных к 28-30 суткам, в результате область воздействия лазером покрывалась плоским многослойным эпителием. Несмотря на то, что средняя продолжительность эпителизации составила 27,01±0,72 дня, продолжительность репаративного процесса имела существенные различия - от 18 до 48 дней.

Динамическое кольпоскопическое наблюдение больных после лазервапоризации показало, что у 32 пациенток полная эпителизация наступила после однократного лазерного воздействия. У 2 больных при расширенной кольпоскопии через 4-6 недель была обнаружена эктопия цилиндрического эпителия с зоной трансформации, в связи с чем им была произведена повторная лазервапоризация.

Лазерная конизация шейки матки выполнена 6 (37,5%) пациенткам I группы и 4 (13%) пациенткам II группы с подтвержденным гистологическим диагнозом - CIN.

В послеоперационном периоде за пациентками осуществлялось всестороннее динамическое наблюдение. Проводилась комплексная противовоспалительная, антиоксидантная терапия, при необходимости лечение дополняли антибактериальными, противовирусными и иммуномодулирующими препаратами. После лазерной конизации пациентки находились в стационаре 3-4 суток. Средняя продолжительность эпителизации составила 39,08±0,82 дня.

Динамическое кольпоскопическое и цитологическое наблюдение пациенток с CIN осуществлялось через 1,5; 6 и 12 месяцев после оперативного лечения.

После завершения эпителизации (в среднем через 1,5 месяца), всем больным было проведено комплексное обследование, включающее расширенную кольпоскопию и цитологическое исследование, при котором патологии обнаружено не было.

Контрольное обследование, проводившееся через 6, 12 и 24 месяца, включало в себя осмотр шейки матки в зеркалах, расширенную кольпоскопию и цитологическое исследование.

Анализ отдаленных результатов проведен у 14 пациенток I группы и 30 пациенток II группы, которые наблюдались в течение 2-х лет.

Контрольное обследование включало расширенную кольпоскопию и цитологическое исследование. В результате динамического кольпоскопического наблюдения у 6 пациенток (37,5%) I группы обнаружены участки ацегобелого эпителий шейки матки, что было расценено как рецидив заболевания. При контрольном обследовании 30 пациенток II группы патологии слизистой влагалищной части шейки матки выявлено не было.

Таблица 5

Частота рецидивов в I группе

Диагноз Всего случаев п (%) Рецидив п(%)

Лейкоплакия шейки матки 6 (100%) 3(50%)

CIN 8 (100%) 3(37,5%)

У трех (50%) пациенток с подтвержденным гистологическим диагнозом лейкоплакия шейки матки (дискератоз) и установленным гиперметилированием генов MLH1, N33 р16 при контрольном обследовании обнаружен рецидив лейкоплакии, тогда как ни у одной из пациенток с тем же диагнозом, но без установленного гиперметилирования генов за время наблюдения не было зафиксировано ни одного рецидива.

У трех (37,5%) пациенток с подтвержденным гистологическим диагнозом CIN и установленным гиперметилированием генов при кольпоскопии были обнаружены участки ацетобелого эпителия, что было также расценено как рецидив заболевания.

Таким образом, обнаружена высокая частота гиперметилирования генов р16(100%), N33(62%) и MLH1(100%) в образцах тканей шейки матки с подтвержденным гистологическим диагнозом CIN и рецидивом заболевания за время наблюдения.

Всем пациенткам была произведена повторная лазервапоризация патологических участков шейки матки. При контрольном цитологическом исследовании после завершения эпителизации патологии не обнаружено.

Проанализировав полученные в результате исследования данные, можно предположить, что выявление молекулярно-генетических онкологических маркеров - аномального метилирования генов р16, N33 и MLH1 в образцах тканей шейки матки может свидетельствовать о потенциальном риске развития предраковых изменений и рака шейки матки у пациенток с доброкачественными заболеваниями.

Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров в материалах биопсии может указывать на вероятный риск рецидива заболеваний шейки матки. В то же время, отсутствие молекулярно-генетических маркеров может служить благоприятным прогностическим признаком относительно риска рецидива заболеваний шейки матки.

Обнаружение метилирования генов в тканях шейки матки позволяет выявить пациенток с повышенным риском рецидива как доброкачественных, так и предраковых заболеваний шейки матки.

Таким образом, определение молекулярно-генетических онкологических маркеров в тканях шейки матки до появления клинических признаков позволяет усовершенствовать алгоритм обследования и ведения пациенток с патологическими процессами шейки матки, выявить группу риска развития предраковых и онкологических процессов и определить выбор тактики ведения таких пациенток.

Введение данной системы маркеров в широкую клиническую практику позволит значительно улучшить качество диагностики, прогнозирования и профилактики предраковых изменений и рака шейки матки.

ВЫВОДЫ

1. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров в программе скрининга у женщин с патологическими процессами шейки матки позволяет повысить эффективность ранней диагностики в группах риска по развитию предраковых состояний и рака шейки матки.

2. Обнаружение молекулярно-генетических онкологических маркеров в тканях шейки матки позволяет выявить пациенток с повышенным риском рецидива как доброкачественных, так и предраковых заболеваний шейки матки. В группе пациенток с установленным аномальным метилированием генов рецидив лейкоплакии обнаружен в 50 % случаев, рецидив CIN (в виде ацетобелого эпителия) в 37,5% случаев. Отсутствие молекулярно-генетических онкологических маркеров может служить благоприятным прогностическим признаком относительно риска рецидива заболеваний шейки матки.

3. Гиперметилирование генов р16, MLH1 и N33 наиболее характерно для предраковых процессов и рака шейки матки, в меньшей степени выявляется при доброкачественных заболеваниях шейки матки (при плоскоклеточном раке - в 100% случаев, при CIN в 70% случаев, при лейкоплакии - в 28% случаев, при хроническом цервиците - в 18% случаев, при цервикальной эктопии в 17% случаев).

4. Как при предраковых, так и при доброкачественных заболеваниях шейки матки и выявленном аномальном метилировании генов показано проведение конизации шейки матки с последующим гистологическим исследованием ткани, тогда как у больных с доброкачественными заболеваниями шейки матки и отсутствием аномального метилирования генов достаточно ограничиться лазерной вапоризацией.

5. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров позволяет выделить группу риска пациенток с доброкачественными заболеваниями шейки матки для более тщательного и длительного наблюдения после проведенного лечения с целью раннего выявления рецидива.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Включение системы определения молекулярно-генетических маркеров в алгоритм обследования пациенток с заболеваниями шейки матки позволит значительно улучшить качество диагностики и прогнозирования предраковых изменений и рака шейки матки, выделить группу риска по возникновению рецидивов заболевания.

2. Выявление молекулярно-генетических онкологических маркеров вместе с гистологическим исследованием тканей шейки матки может использоваться для диагностики CIN II-III степени при наблюдении пациенток с риском развития рака шейки матки.

3. Пациенткам с доброкачественными заболеваниями шейки матки и отсутствием молекулярно-генетических онкологических маркеров показана лазервапоризация патологических участков шейки матки.

4. Пациенткам с CIN, рецидивирующими доброкачественными заболеваниями шейки матки и выявленными молекулярно-генетическими онкологическими маркерами показана конизация шейки матки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свидинская Е.А. Использование молекулярно-генетических онкологических маркеров при лечении заболеваний шейки матки // Материалы III Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы Акушерства и гинекологии». - Москва, 2009. - С. 114-115.

2. Джибладзе Т.А., Свидинская Е.А. Прогностическое значение молекулярно-генетических онкологических маркеров при лечении заболеваний шейки матки // Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума Мать и дитя. - Москва, 2009. - С.296.

3. Свидинская Е.А., Джибладзе Т.А. Значение определения молекулярно-генетических маркеров для диагностики и лечения заболеваний шейки матки // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2010. Т. 9 - №3 — С.16-20.

4. Свидинская Е.А., Джибладзе Т.А. Роль определения молекулярно-генетических маркеров в диагностике и прогнозировании течения заболеваний шейки матки // Опухоли женской репродуктивной системы: маммология/гинекология-2010- №2 - С.93-98.

5. Джибладзе Т.А., Свидинская Е.А. Роль выявления гиперметилирования генов р16, N33 и MLH1 при лечении заболеваний шейки матки // Материалы XI Всероссийского научного форума Мать и дитя. - Москва, 2010. -С.357.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 517. Тираж 100 экз.

Диагностика и лечение заболеваний шейки матки представляют до настоящего времени большой интерес в связи с не снижающейся частотой этой патологии, в том числе и ростом заболеваемости раком шейки матки, который является одним из самых частых заболеваний в онкогинекологии и составляет около 16% злокачественных опухолей у женщин.

Доброкачественные заболевания шейки матки являются одной из актуальных проблем современной гинекологии и имеют большое значение с точки зрения возникновения и развития злокачественных новообразований (Прилепская В.М., 2007).

Среди гинекологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста патология шейки матки, по данным различных авторов, колеблется -от 10 до 15% и служит фоном для развития предраковых состояний и рака шейки матки (Прилепская В.Н., Голубенко А.Е., 2007г).

Многие исследователи отмечают, что доброкачественные рецидивирующие заболевания шейки матки являются факторами риска в развитии предраковых изменений и рака шейки матки (Franco E.L. et al., 1997, 2002; Кулаков В.И. и др., 1999, 2005; Прилепская В.Н., 2000, 2005, 2007).

В России по данным 2009 года заболеваемость РШМ составила 13,8 случаев на 100 000 женского населения и заняла 2-е место в структуре злокачественных новообразований у женщин. Важно отметить, что у женщин в возрасте от 15 до 39 лет смертность от РШМ занимает 1-е место среди онкологических заболеваний (Кулаков В.И., Прилепская В.Н., 2007г.), а ежегодный прирост заболеваемости среди молодых женщин составляет от 2 до 5% (Прилепская В.Н., 2010).

В Европе РШМ продолжает занимать второе место в структуре онкологических заболеваний у женщин в возрасте от 15 до 49 лет и первое место среди женщин от 15 до 29 лет, в среднем составляя 7-8 случаев на1 100 ООО населения (GLOB ОС AN 2002; Прилепская В.Н., 2007).

В настоящее время, благодаря успехам, достигнутым в диагностике, лечении и профилактике рака шейки матки, а так же введению скрининговых программ, наблюдается снижение заболеваемости инвазивным раком шейки матки. Тем не менее,, онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности и инвалидизации женского населения репродуктивного возраста (Critchlow C.W., Koutsky L.A.,1995; Franco E.L., 1997; Кулаков В.И., Тохман A.A. 2000).

В то же время рак шейки матки является заболеванием, возникновение которого возможно предупредить путем выявления и лечения предраковых изменений. По данным ВОЗ переход CIN II-III в рак in situ в среднем занимает 3-8 лет, ещё 10-15 лет проходит до развития микроинвазивного рака и столько же до перехода в распространенную форму (Новикова Е.Г.,1991). Доказано, что рак шейки матки имеет надежно распознаваемую преклиническую фазу, длительный период развития, следовательно, существуют возможности для своевременного установления диагноза и выбора эффективного метода лечения.

В силу доступности для цитологического и гистологического исследования шейка матки явилась удобной моделью для изучения этапов развития патологического процесса. Опухоль на шейке только в 2-15% случаев гистологически представлена аденокарциномой,.а в 85-90% случаев развивается из плоского эпителия, что подтверждает необходимость своевременной диагностики патологических процессов многослойного плоского эпителия (Новикова Е.Г.,1991; Козаченко В.П., 2001).

На сегодняшний день имеется достаточно данных, подтверждающих причинную связь между папилломавирусной инфекцией и предраковыми заболеваниями и раком шейки матки. Практически все дисплазии содержат' вирус папилломы человека (ВПЧ) - либо в виде инфекционных вирионов, либо в виде эписомалыюй или интегрированной ДНК. Необходимо отметить, что присутствуя в макроорганизме, вирусы не всегда вызывают заболевание. Установлено транзиторное и персистирующее носительство ВПЧ (Коломиец Л.А., 2002; Роговская С.И., Прилепская В.Н., 2005; Подистов Ю.И., 2006; Вергейчик Г.И., 2008).

Несмотря на очевидную связь ВПЧ с развитием предрака и рака.шейки матки, в, ряде исследований' показана: высокая; распространенность ВШЧ высокого онкогенного риска среди здоровых женщин - до 58%, причем* более чем у половины из них отмечена латентная форма инфекции (Коломиец Л.А., 2002).

Многие исследователи считают, что чувствительность цервикального эпителия к вирусу папилломы человека связана с генетической восприимчивостью (Р. Mäciag et all., 1999; Уразова Л.Н., 2008; Кузнецов ВВ., 2010).

Одно из основных генетических событий, необходимых для развития опухоли. - инактивация генов-супрессоров опухолевого роста: Самым распространенным механизмом подобной инактивации является метилирование CpG-островков в промоторных и регуляторных областях этих генов. Гиперметилирование генов, вовлеченных в канцерогенез; происходит на ранних стадиях опухолеобразования и часто обнаруживается при многих предраковых состояниях (Maruyuma R., Toyooka S., Toyooka К., et al. 2002; House M., Guo M. et al. 2003). Гиперметилирование может служить молекулярным маркером ранней диагностики, мониторинга и. клинического прогноза опухолей (Muller Н. et All, 2004; Залегаев Д.В, Немцова М.В, Стрельников В.В., 2004).

В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, все большую активность, приобретает проспективная диагностика рака шейки матки в рамках ежегодных диспансеризаций в группах риска. Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических признаков, позволяет вовремя начать более тщательную диагностику и превентивную терапию, а также выявить группу риска развития предраковых заболеваний и рака шейки матки (Подистов Ю.И., 2006).

Широкая распространенность, разнообразие патологических состояний и потенциальный риск злокачественной трансформации эпителия шейки матки, определяют высокую значимость прогностических критериев возникновения и развития патологических процессов.

Новизна предлагаемой темы

Впервые -проведено комплексное обследование пациенток с различной патологией шейки матки с включением молекулярных методов диагностики, в общий комплекс диагностических мероприятий.

Выявление изменений на уровне генома клетки ещё до её морфологической модификации, позволит значительно улучшить раннюю диагностику- предраковых заболеваний и рака шейки матки,, что является новшеством диагностики.

Впервые определено прогностическое значение выявления молекулярно-генетических маркеров у пациенток с доброкачественными и предраковыми заболеваниями шейки матки и предложен алгоритм комплексного обследования с использованием молекулярных методов диагностики.

Цель и задачи планируемого исследования

Цель исследования: определить прогностическое значение выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров у пациенток с доброкачественными и предраковыми заболеваниями шейки матки.

Задачи исследования:

• Разработать комплексную методику диагностики патологических процессов шейки матки на основании выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров.

• Определить роль молекулярно-генетических маркёров в диагностике патологических изменений эпителия шейки матки.

• Разработать принципы хирургического лечения в зависимости от выявленных ' молекулярно-генетических маркёров.

• Разработать дальнейшую тактику ведения пациенток с различной патологией шейки матки в зависимости от выявления молекулярно-генетических онкологических маркеров.

Структураработы

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, содержит 31 таблицу, 6 рисунков. Список литературы состоит из 199 источников (113 на русском языке, 86 на английском языке).

Практическая значимость

В результате проведенного исследования предложен рациональный алгоритм обследования.и ведения женщин с заболеваниями шейки матки.

Определено значение выявления молекулярно-генетических маркеров опухолевой трансформации в тканях шейки матки, что позволяет повысить качество диагностики и определить выбор тактики ведения больных.

Определено значение аномального метилирования генов для выявления групп риска развития предраковых заболеваний и рака шейки матки. >

Апробация и внедрение в практическое здравоохранение

Данная работа является фрагментом комплексной темы кафедры ^«Разработка и внедрение современных технологий для профилактики, диагностики и лечения различных нарушений репродуктивного здоровья женщин» 01.200.11045.

Материалы диссертации были доложены на X Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» 2009 г; на III Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии» 2009 г, на XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» 2010 г.

Клинические исследования, анализ и интерпретация данных проведены автором самостоятельно. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров может быть рекомендовано как одна из эффективных методик в диагностике заболеваний шейки матки, в том числе и в скрининговых программах.

2. Обнаружение молекулярно-генетических маркеров в тканях шейки матки позволяет выявить пациенток с повышенным риском рецидива как доброкачественных, так и предраковых заболеваний шейки матки.

3. Выявлен высокий уровень гиперметилирования генов р16, МЬН1 и N33 при предраковых процессах и раке шейки матки в сравнении с доброкачественными заболеваниями шейки матки.

4. Инактивация генов р16, МЬН1 и N33 в результате аномального метилирования играет существенную роль в переходе обратимых доброкачественных заболеваний и цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки в необратимые злокачественные.

выводы

1. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров в программе скрининга у женщин с патологическими процессами шейки матки позволяет повысить эффективность ранней диагностики в группах риска-по развитию предраковых состояний и рака шейки матки.

2. Обнаружение молекулярно-генетических онкологических маркеров в тканях шейки матки позволяет выявить пациенток с повышенным риском рецидива как доброкачественных, так и предраковых заболеваний шейки матки. В группе пациенток с установленным аномальным метилированием генов рецидив лейкоплакии обнаружен в 50 % случаев, рецидив CIN (в виде ацетобелого эпителия) в 37,5% случаев. Отсутствие молекулярно-генетических онкологических маркеров может служить благоприятным прогностическим признаком относительно риска рецидива заболеваний шейки матки.

3. Гиперметилирование генов р16, MLH1 и N33 наиболее характерно для предраковых процессов и рака шейки матки, в меньшей степени выявляется при доброкачественных заболеваниях шейки матки (при плоскоклеточном раке — в 100% случаев, при CIN в 70% случаев, при цервикальной эктопии в 17%, при хроническом цервиците — в 18%, при лейкоплакии - в 28% случаев).

4. Как при предраковых, так и при доброкачественных заболеваниях шейки матки и выявленным аномальном метилировании генов показано проведение конизации шейки матки с последующим гистологическим исследованием ткани, тогда как у больных с доброкачественными заболеваниями шейки матки и отсутствием аномального метилирования генов достаточно ограничиться лазерной вапоризацией.

-995. Определение молекулярно-генетических онкологических маркеров позволяет выделить группу риска пациенток с доброкачественными заболеваниями шейки матки для более тщательного и длительного наблюдения после проведенного лечения с целью раннего выявления рецидива.