Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Специфичность и функциональная активность моноклональных антител к поверхностным структурам мышиных спленоцитов, активированных липополисахаридом

' (

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РО&СР МОСКОВСЮЙ НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕДЬШЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИИ. Г.Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

Ш - II" V У' | И|Д_1_Л1__\-__■_I____I_■!_I____иШ1_■_!_.-. I-«

На правах рукописи

ЛОГУНОВА Надежда Николаевна

СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ИШОЮЮНАЛЬННХ АНТИТЕЯ К ПОВЕРХНОСТНЫ« СТРУКТУРАМ МЫШИНЫХ СШШНОЦИГОВ, АКТИВИРОВАННЫХ лшопшшсшщдоы

. (14.00.36. - Аллергология и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусных препаратов АШ СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ :

доктор биологических наук Е.В.СИДОРОВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ :

доктор медицинских наук А.П.СУСЛОВ, кандидат медицинских наук В.А.АЛЕШИН

ВЩЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ :

Институт иммунологии МЗ СССР

Защита состоится " 1991 г. в часов

на заседании Специализированного совета К 084.18.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского МЗ РОФСР по адресу: 125212 Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИЭЫ им.Г.Н.Габричевского МЗ РСФСР.

Автореферат разослан " & " ян ¿а^я 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О .'В. Котел ьникова

; АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Иммунная система организма представляет собой сложно организованное сообщество клеток, различающихся по своей специфичности,функциям, способности взаимодействовать друг с другом и остальными клетками организма и т.д. В процессе своего развития клетки подвергаются воздействию ряда внутренних и внешних факторов, на которые они могут и должны реагировать, или, напротив, не реагировать. Все эти воздействия осуществляются через молекулы, расположенные на клеточной поверхности.Таким образом, поверхностные структуры, с одной стороны, несут определенную информацию о функциональном состоянии клетки и ее способности воспринимать определенные сигналы, а,с другой стороны - обеспечивают проведение этих сигналов внутрь клеток. Установление природы и функций поверхностных молекул позволяет понять язык клеточного общения, а значит и получить возможность специфически воздействовать на поведение иммунокомпетентных клеток. Очевидно, что исследования, направленные на выяснение всех этих вопросов являются необходимыми и актуальными.

Вместе с тем, изучение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток сопряжено со значительными трудностями. Клетки иммунной системы чрезвычайно гетерогенны, а количества многих поверхностных антигенов крайне невелики, поэтому применение чисто биохимических методов часто ограничено или даже невозможно. Определенный прогресс в этой области достигнут благодаря использованию моноклональных антител (монАТ). МонАТ являются удобным инструментом исследования,так как с их помощью можно не только изучать экспрессию, идентифицировать и выделять те или иные поверхностные антигены, но также и воздействовать на сами клетки через специализированные поверхностные структуры, имитируя естественные лиганды.

Наиболее исследованными в настоящее время являются иммуноком-петентные клетки мыши и человека. К настоящему времени идентифици-

ровано несколько десятков поверхностных антигенов иммунокомпетент-ных клеток человека и мыши, и число их продолжает расти. Сложнее обстоит дело с выяснением функций идентифицированных структур, которые пока определены только для очень ограниченного числа поверхностных антигенов.

До последнего времени исследования поверхностных структур иммунокомпетентных клеток развивались в осног' гп рубежом. В СССР получены монАТ лишь к некоторым антигенам главного комплекса гист! совместимости (МНС), и к Т клеткам, но практически отсутствуют антитела (АТ) к поверхностным антигенам В клеток или макрофагов мыши. Отсутствие наборов монАТ к поверхностным антигенам иммуноком-петентных клеток замедляет изучение механизмов активации и диффе-ренцировки этих клеток, а тем самым и развитие подходов для регул, ции этих процессов. Это и определило направление настоящего после-дования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель работы - получение гибридом, продуцирующих монАТ к пове; хностным структурам иммунокомпетентных клеток мыши, анализ этих структур и изучение функциональной активности полученных монАТ. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи :

1. Получить панель крысиных монАТ, направленных к поверхностны антигенам спленоцитов мыши ( Т-,В-лимфоцитам и макрофагам).Поскол ку на поверхности активированных клеток экспрессия ряда антигенов выше, чем на покоящихся клетках, для повышения разнообразия потен циальных монАТ было решено использовать спленоциты, активировании липополисахаридом (ЛПС).

2. Изучить распределение выявляемых монАТ поверхностных антиге нов на различных популяциях иммунокомпетентных клеток.

3. Идентифицировать антигены, выявляемые полученными монАТ.

4. Исследовать функциональную активность полученных монАТ в системе индукции иммунного ответа in vitro , а такте в пролифера-тивных тестах.

5. Отработать необходимые для изучения функциональной активности иммуноферментные способы выявления единичных клеток, продуцирующих AT и иммуноглобулины (Ig ).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Показано, что путем иммунизации крыс спленоцитами мыши, активированными ЛПС, могао получить гетерогибридомы, продуцирующие монАТ Igf.l и IgG изотипов к антигену Форсмана (Фо). Полученные монАТ использованы для изучения экспрессии антигена Фо на различных клетках и тканях мыши. Показано, что он представлен на макрофагах селезенки, но не макрофагах перитонеальной полости, клетках макрофагоподобной линии Р 388Д1 или моноцитах крови.

Впервые исследована экспрессия антигена Фо на клетках, культивируемых in vitro . Установлено, что экспрессия антигена Фо на макрофагах селезенки нестабильна и ш.....пется при культивировании

их в полной среде в течение 24-48 час. Выявлена зависимость экспрессии антигена Фо от факторов, содержащихся в супернатантах спле-ноцитов, стимулированных конканавалином А ( КонА). Добавление этих факторов не только стимулирует экспрессию антигена Фо на части пе-ритонеальннх макрофагов и клетках линии Р 388Д1, но и способствует сохранению экспрессии антигена Фо на культивируемых макрофагах селезенки.

Показано, что монАТ к антигену Фо реагируют не только с гли-колипидом, но и преципитируют поверхностные гликопротеины.

При исследовании функциональной активности монАТ к антигену Фо ( ^ 'изотип) выявлена их способность индуцировать пролиферацию в культурах нормальных спленоцитов.

На основе иммуноферментного метода разработаны способы выявления клеток, продуцирующих AT к вирусу гриппа и поливинилпиррол> дону с мол.массой 350 кДа (ПВПдзд), что расширяет возможности использования этого метода. Данный метод модифицирован в случае выявления иммуноглобулинобразующих клеток (ИГОК).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Выявление антигена Фо на макрофагах селезенки, но не перито-неальной полости мыши и установление зависимости экспрессии этогс антигена на макрофагах и клетках линии Р 388Д1 от наличия растворимых факторов расширяют наши представления как о популяциях Мининых макрофагов, так и об антигене Фо. МонАТ к антигену Фо могут быть применены для специфического выявления и характеристики различных популяций макрофагов мыши.

Полученные нами монАТ к другим поверхностным, антигенам иммуг компетентных клеток могут использоваться в разнообразных иммунолс гических исследованиях.

Разработанные иммуноферментные методы выявления клеток, сек-ретирующих AT, расширяют арсенал методов определения клеток-анти-телопродуцентов, это особенно существенно при изучении иммунного ответа, индуцированного in vitro (снимается проблема неспецифичес кого фона). Кроме того, описанная в работе модификация иммуноферментного метода выявления клеток, продуцирующих Ig , упрощает процедуру определения и стандартизует условия выявления этих клеток.

ВНЕДРЕНИЕ

Способ определения клеток, продуцирующих AT и ig внедрен в лаборатории клинической иммунологии Института иммунологии МЗ CCCI и в лаборатории иммунологической толерантности НИИЭМ им.Н.Ф.Гама; АМН СССР.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы доложены на ХУ Мечниковской конференции молодых ученых в г.Одессе (1987 г.), заседании Всесоюзного научного общества иммунологов (1988 г.), I Всесоюзном иммунологическом съезде в г.Сочи (1989 г.), заседании лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР (1990 eV

Диссертация апробирована на конференции НИИВП АМН СССР 29 октября 1989 г.

ПУБЛИКАЦИИ

Результаты проведенных исследований представлены в 4-х публикациях по теме диссертации.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных экспериментальных исследований (главы : материалы и методы исследования, результаты исследований), обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 166 страниц машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 198 источников, из них 22 - отечественных и 176 - зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дня получения монАГ к поверхностным антигенам спленоцитов мыши крыс иммунизировали однократно внутривенно или двукратно (сначала внутрибрюшинно и через месяц - внутривенно) бластными клетками (20 млн. клеток на крысу). Властные клетки выделяли и з активированных ЛПС Е.coli (50 мкг/мл,48 час.,37°С) спленоцитов мыши ВА1В/с центрифугированием в градиенте плотности Перколла (о =1,070-1,072 г/см31.

Слияние иммунных спленоцитов крысы с клетками миеломы P3.X63-Ag.8.653 проводили на 4 сутки после последней иммунизации с помощью полиэтиленгликоля с мол.массой 3350 ( Sigma ) п0 методу uavid-

son (1977). Для селекции гибридом использовали селективную среду Littiefield (1964). Скрининг гибридом проводили на 10-14-й дни после слияния в несколько этапов. Сначала с помощью иммунофермент ного метода ( elisa ) отбирали все культуры, продуцирующие ig кры сы. Затем эти культуры тестировали на наличие AT к мышиным igM и igg , и, наконец, - на наличие AT к ЛПС-бластам. В последнем случае в лунки 96-луночного плейта вносили 2-5x10 ЛПС-бластов, высушивали клетки и ставили elisa ,как обычно. Гибридомы, реагирующие ЛПС-бластами отбирачи и клонировали методом лимитирующих разведений.

В дальнейшем специфичность полученных гибридом исследовали методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), используя различные популяции живых клеток, прикрепленных к стеклу с помощь поли-j, -лизина. В качестве клеток-мишеней использовали спленоциты тимоциты, клетки костного мозга и крови, Т- и B-лимфоциты, перито неальные макрофаги, В-бласты (спленоциты, активированные ЛПС), Т-бласты (спленоциты, активированные КонА) и активированные пептоно макрофаги мышей BAIB/с, а также различные иммунокомпетентные клет ки мышей СВА и C57BI/6.

Молекулярные веса и субъединичную структуру поверхностных ан тигенов, выявляемых полученными монАТ, определяли в sds -ПААГ- фо реэе по Jiaemmli (1971). Для этого поверхностные структуры метили лактопероксидазным способом, клетки лизировали и из лизатов выделяли поверхностные антигены на сефарозных сорбентах, содержащих AT к ^g крысы и насыщенных исследуемыми монАТ. В контроле использовали сорбент, насыщенный нормальными ig крысы. После проведения фореза гели высушивали и экспонировали на рентгеновской пленке (FM-I,CCCP) в течение 48-72 час)

Идентификацию гликолипидных антигенов проводили с помощью

тонкослойной хроматографии и последующего иммуноблоттинга. Липиды экстрагировали из клеток смесью хлороформ-метанол (2:1) и наносили на алюминиевые пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии ( !: ,силикагель 60). Разделение липидов проводили в системе хлороформ-метанол-вода- 1% CaCIg (60:40:7:2). Гликолипиды с пластины переносили на нитроцеллюлознуто мембрану в растворителе изо-пропанол-вода (2:1) и обрабатывали сначала исследуемыми монАТ крыс, а затем конъюгатом монАТ мышей против .х -цепей крыс с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали 4-ci -1-нафтол.

Для выявления гликолипидных антигенов с помощью ьыза к их смеси в хлороформ-метаноле добавляли воду (соотношение хлороформ-метанол-вода - 20:10:6) и верхнюю водно-метанольнуго фазу использовали в качестве антигена для покрытия плейтов. В лунки вносили 20 мкл гликолипидов и 20 мкл метанола, после чего плейты высушивали.Далее реакцию ставили стандартно, исключая лишь добавление в растворы тви-на-20.

Функциональную активность полученных монАТ изучали в пролифера-тивном тесте и в системе индукции иммунного ответа in vitro-

Для определения пролиферативного ответа к 2-3 дневным культурам спленоцитов в полной среде с 5% ЭТС в последний день инкубации на 4 часа добавляли %-тимидин (1мкКи на лунку 96-луночного плейта) и определяли количество включившейся метки. Пролиферативный тест ставили в двух модификациях, во-первых, исследовали влияние самих монАТ на пролиферацию нормальных спленоцитов, и, во-вторых, определяли влияние монАТ на пролиферативный ответ, индуцированный ЛПС. В обоих случаях к культурам спленоцитов (5 млн/мл клеток;0,2мл ,ла лунку) добавляли препараты монАТ (сульфатные фракции или аффинно очищенные монАТ) в различных разведениях и инкубировали клетки в течение 48-72 час. Во-втором случае к культурам одновременно с препа-

ратами монАТ добавляли ЛПС в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Индукцию первичного иммунного ответа in vitro проводили п< методу Kishell и Dutton (1967). В качестве антигенов использ< ли вирус гриппа A/PR8/34 и ДНФ-фиколл. Иммунный ответ определял! по числу АТ-образующих клеток (АОК) и 1е -образующих клеток (ИГ( на 3-4-й день. В некоторых случаях определяли секрецию AT с пом< щью ¿LISA . Для определения числа АОК и ИГОК использовали подх< предложенный Borreback « UBller (1985) в разработанной нами i дификации.

Для получения активированных Т-клеток и супернатанта от hi использовали КонА ( ы^па • 5 тип) в концентрации 5 мкг/мл. Им бацию спленоцитов проводили в течение 48 часов. Супернатанты xpj нили при -20°С.

Реакцию гемагглютинации монАТ с эритроцитами барана (ЭБ), осла, коровы, кролика, крысы, мыши и человека ставили стандарт» Для цитотоксической реакции использовали полученные монАТ и koi племент морской свинки.

Для выявления клеток, обладающих фагоцитарной активностью использовали флуоресцирующие и немеченные монодисперсные латекс) частицы размером 1,5 мкм (НПО "Биотехнология"). На стекла с при. пающими клетками селезенки наносили взвесь латексных частиц в ю центрации 5-10 млн/мл в полной среде и инкубировали I час при 3' в СО^-инкубаторе.

Идентификацию макрофагов проводили цитохимически (реакция неспецифическую эстеразу) с использованием в качестве субстрата X-нафтил-ацетата и краски - красного прочного. Макрофаги окраш] вались диффузно в буро-красный цвет.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Получение монАТ и анализ их специфичности.

Клетки, полученные от каждого слияния, высевали на два 96-луночньгх плейта и через 10-14 дней проводили скрининг супернатан-тов в лунках с растущими клонами. Обычно эффективность слияния (процент лунок, содержащих клоны) достигала 90-95%. В таблице I представлены результаты 3-х слияний. При всех трех слияниях число лунок, в которых выявлялся синтез I к крысы, составляло не менее 72-87% от числа всех лунок, содержащих клоны.

Таблица I.

Первичный анализ гибридом, полученных в результате 3-х слияний (по данным дьиа ).

№ Способ иммуни-опы- зации та

% лунок, % лунок, реа-

проду- гирующих с

цирущих _

крысы ]•

Число отобранных культур, реагирующих с

с ЛПС мыши блас-_ тами

мыши

ЛПС бласта-ми

1.

2.

однократная (внутривенная)

72

двукратная

(внутрибрюшинная, 72 внутривенная)

- " - 87

5,7 28,8

10,8 28,8 9,6 40,8

10

II

30

47

На следующем этапе специфичность АТ, продуцируемых гибридными культурами, определяли в иммунофлуоресцентном анализе (ИФА), используя в качестве тест-антигена разные типы живых иммунокомпе-тентных клеток. Результаты, полученные в ИФА, подтвердили данные иммуноферментного анализа. Из 88 отобранных гибридом, продуцирую-

щих АТ, реагирующие с ЛПС-бластами в еыэа , 84 "работали" и в ИФА. По данным иммунофлуоресцентного анализа все гибридомы бьши разбиты на группы. Для дальнейшей работы было отобрано по несколь ку гибридом каждого типа. Эти гибридомы были клонированы методом лимитирующих разведений, и их специфичность снова проверена в ИФА на различных популяциях клеток. Результаты этого исследования пре ставлены в таблице 2.

Все клонированные гибридомы ( 18 ) удалось подразделить на 5 групп. Для первой группы характерна способность окрашивать гемо поэтические клетки многих типов. В нее вошли 10 гибридом. Во вторую группу была отнесена I гибридома, реагирующая с В лимфоцитами и макрофагами. Для третьей группы гибридом (в нее вошли 3 гибридо мы) характерным являлось интенсивное окрашивание активированных Е и Т лимфоцитов и очень слабое взаимодействие с 60-лимфоцитами. С макрофагами монАТ этой группы не реагировали. В четвертую группу вошли 2 гибридомы, продуцирующие монАТ, преимущественно окрашивая щие В клетки. Экспрессия поверхностных антигенов, распознаваемых монАТ 4-й группы, при активации В лимфоцитов практически не менялась. Наконец, монАТ 5-й группы (2 гибридомы) окрашивали небольшо процент ( 5-10 % ) клеток селезенки и единичные клетки тимуса и костного мозга, но не реагировали с перитонеальными клетками и кл тками крови. Среди ЛПС-бластов селезенки число окрашиваемых этими монАТ клеток не превышало 0,1%.

Выделение поверхностных структур, реагирующих с монАТ, из л

ток

зата клеток, меченных I, осуществляли с помощью специфической сорбции на сефарозных сорбентах, содержащих исследуемые монАТ.

С помощью монАТ первой группы ( и 1д ) удалось специфиче ски выделить поверхностные антигены, обладающие сходной форетичес

СПЕЦИФИЧНОСТЬ КЛОНИРОВАННЫХ ГИБРИДОМ 3 ОТНОШЕНИИ РАЗНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ (данные иммунофлуоресцентного енализа).

линия

мышей

Группа гибридом

I. /1Г110/ г. /гг/

3. /згз3/

4. /4Х,42/

5. /5р52/

+ +

ВА1В/с / Н-2 /

СБА С57В1/6 /Н-£/ /Н-2Ь/

п у л я ц и

к л

к

спле- тимо- кост- эрит- В- Т- МФ1 6 В- Т-ноци- циты номоз- рощ- клет- клет- /пери- спле- клет- клет-ты говые ты ки ки тоне- ноци- ки,ак- ки,ан-

альные/ ты тиви- тиви-

рован- рован- пепто ные ЛПС ные ном КонА

МФ, активированные

ед

1%

+ +

ч— и—

+

5-10%

ед

ед

ед

++

++

+-0,1%

+

ед +

спле- спле-ноци- ноци-ты ты

+

или -

+-

+-

+

+

или -

+-

+

+

+-

МФ - макрофаги

кой подвижностью. Они состояли из 2-х субъединиц с мол. массами 45 и 12 кДа. Такая структура, а также широкое распространение на разных типах иммунокомпетентных клеток характерна для молекул I класса МНС.

МонАТ второй группы преципитировали поверхностный антиген, состоящий из 2-х субъединиц с мол. массами ~28 и 34 кДа. По хера теру экспрессии этого антигена (преимущественно на интактных В л фоцитах и макрофагах), значительно возрастающему при активации э клеток, а также на основаниии субъединичной структуры его можно нести к антигенам второго класса МНС.

Выделить поверхностные антигены с помощью монАТ третьей гр пы нам не удалось. Вероятно, это связано с более низкой экспресс этих антигенов на иммунокомпетентных клетках.

Исследование структуры поверхностных антигенов, распознава мых монАТ 4-й группы, показало, что монАТ ^ узнает антиген с мс массой 45 кДа. Так как известно несколько типов поверхностных аь тигенов с такой мол. массой, для идентификации этого антигена н^ ны дальнейшие исследования.

ЫонАТ 5-й группы ( 5| и ), окрашивающие небольшую попу.); цию клеток селезенки, преципитировали поверхностные антигены схс ной структуры, состоящие из 3 субъединиц ~ 25,15 и 12 кДа. Поскс ку такие структуры необычны, то специфичность антигенов и клето! его экспрессирующих, были исследованы более детально.

Изучение экспрессии поверхностного антигена, выявляемого монАТ 5 -группы.

МонАТ 5-й группы в ИФА окрашивали спленоциты, которые при следовании в фазовом контрасте имели морфологические особенност!

макрофагов. На очищенных популяциях Т и В лимфоцитов экспрессии антигенов, выявляемых монАТ 5-ой группы, выявлено не было. При разделении суспензии спленоцитов на прилипающие и неприлипающие клетки 70-80% прилипающих клеток окрашивались монАТ 5j и в то время как в неприлипающей популяции спленоцитов оставалось не более 0,1% позитивных клеток. Среди фагоцитирующих клеток монАТ 5j- окрашивали 35-40% (фагоцитоз определяли по поглощению латексних частиц).

Идентификация макрофагов с помощью реакции на ис.^.сцифическую эстеразу и одновременная окраска клеток монАТ 5j- показали, что несмотря на сильное угнетение флуоресценции, в этих условиях все клетки, реагирующие с монАТ 5j, окрашивались диффузно в буро-красный цвет, т.е. содержали маркерный фермент макрофагов - .лчес-

кую эстеразу. Таким образом, большая часть клеток, выявляемых монАТ 5j, по-видимому, относится к макрофагам.

Следовало установить, отражает ли наличие выявляемого монАТ 5j и £¡2 антигена функциональное состояние макрофагов, или же данный антиген является маркером определенной субпопуляции макрофагов. С этой целью исследовали экспрессию антигена в различных условиях. У интактных мышей число клеток перитонеальной полости, эк-спрессирующих данный антиген, не превышало 0,1%. Внутрибрюшинное введение пептона или эритроцитов коровы не приводило к возрастанию числа антиген-позитивных клеток. Однако, стимуляция перитонеальных макрофагов тиогликолятом индуцировала увеличение количества антиген-позитивных клеток до 3-10%.

Исследовпс/,; экспрессии исследуемого антигена (на клетках линии Р 388Д1) in vitro показало, что ни изменение клеточной плотности, ни увеличение концентрации ЭТС в среде, ни добавление JI11C к изменению числа антиген-позитивных клеток не приводят (рис.ХА). В то же время, добавление КонА-супернатанта к культивируемым пери-тонеальным прилипающим клеткам, клеткам линии Р 388Д1 значитель-

но стимулировало экспрессию антигена по сравнению с таковой в ко троле (рис. I А и I Б).

Прилипающие клетки селезенки при инкубации in vitro , н против, теряли способность экспрессировать данный антиген в тече ние 24-48 часов (рис. I В). Ни ЛПС, ни КонА, сами по себе, как и в случае с перитонеальными клетками, не стимулировали экспрессию данного антигена, и только добавление в среду для культивировани КонА супернатанта приводило к сохранению экспрессии антигена на первоначальном уровне.

Таким образом, экспрессия антигена, узнаваемого монАТ 5j- и 62, не является стабильным признаком и может быть индуцирована (на перитонеальных клетках и клетках линии Р 388 Д1), так и наоб рот снята (на прилипающих клетках селезенки) при инкубации in v r0 . Это позволяет отнести выявленный антиген к функциональным маркерам (активационным), а не к линейным или дифференцировочным маркерам.

Природа антигена, распознаваем го монАТ 5-й группы.

Изучение специфичности монАТ 5j и 5g показало, что помимо макрофагов селезенки мыши они реагируют с ЭБ, вызывая их агглюти нацию, а в присутствии комплемента - лизис (в титрах 1:1048 и I: соответственно). Исследование изотипов монАТ показало, что монА! 5j относится к IgM, а монАТ 5^ - к IgG изотипу.

Было установлено, что монАТ 5j и гемагглгатинируют эритр циты барана и осла, но не эритроциты кролика, коровы, мыши или ч ловека. Распределение антигена, распознаваемого монАТ 5j и 5g, н эритроцитах различных животных оказалось, таким образом, сходные распределением антигена Форсмана (Фо), имеющим структуру: И -ai: тилгалактозаминозил-( <=С 1-3) К-ацетилгалактозаминозил ( jb 1-3)-ге

Рис.1.Влияние условий культивирования на экспрессию антигена, выявляемого монАТ 5р А - клетки линии Р 388Д1 ; Б - клетки перитонеального экссудата ; Б- прилипающие клетки селезенки.

гтгтттпт

У/А

10 15 25 3 Г 0,3 Щ 0,03 5 10 20 40 % ЭТС Концентрация ЛПС % КонА-супер-

клеток млн/мл мкг/мл натанта

50

\ \

О)

а к

Е-1 «

(Л Н

¡5

» 2

о \

а ё

о ю

со а|

О) о

хэ И

I й

м л

о к

и с*, щ

в- а

м о

о я к н й п5 Ен

К о

ЧЭ

о ч

т ф ■о

3

<й н

а Й

о к

« »

(О

^ а

о >-»

м о

й

ктозил-(л 1-4)-галактозил($ 1-4)-глюкозил-(£ 1-1)-церамид, т.е. являющимся гликолипидом.

Возникло предположение, что монАТ и 52 распознают антиг Фо. Для проверки этого предположения из ЭБ и клеток селезенки м ши были выделены гликолипиды и исследована их способность реаги ровагь с монАТ в льгза • В результате было установлено, что мон и 52 реагируют с гликолипидами, как из ЭБ, так и из клеток с лсзенки мыши. Для доказательства идентичности гликолипидов, узн ваемых монАТ и 52 в препаратах гликолипидов из ЭБ и клеток с лезенки мыши, была проведена тонкослойная хроматография с после дующим иммуноблоттингом. Было показано, что монАТ 52 и 52 выявл ют в обоих препаратах гликолипиды, обладающие одинаковой хромат графической подвижностью. В то же время с гликолипидами из эриг роцитов человека, содержащими входящий в антиген Фо глобозид, монАТ и 52 не реагировали. Это позволяет заключить, что монА 5-й группы узнают концевой дисахарид антигена Фо о-.!.-!, (ы. 1-' Са1М:-с($>1--.) ' а не "стальную часть молекулы ( глобозид).

Поскольку монАТ и 52 реагируют не только с гликолипидом из клеток селезенки, но преципитируют и макромолекулярные повер ностные антигены ( ~ 25,15,12 кДа) можно предположить, что последние являются гликопротеинами, несущими перекрестно-реагирующие с антигеном Фо детерминанты. Этот вопрос нуждается в дальне шем исследовании.

Исследование функциональной активности полученных монАТ. Для исследования функциональной активности монАТ в пролифе ративном тесте ставили опыты двух типов. В первом случае изучал влияние монАТ на индукцию пролиферативного ответа под действиек ЛПС. Для этого была подобрана минимальная доза ЛПС, вызывающая

ответ, сходный с ответом на обычно используемую дозу - 50 мкг/мл. Такая минимальная доза ЛПС оказалась равной 2 мкг/мл. К культурам спленоцитов одновременно добавляли ЛПС и сульфатную фракцию монАТ. Результаты определения включения ^-тимидина на 3-й день в культурах представлены на рис.2. Как видно из рисунка, только одно из 7 исследуемых монАТ дало выраденный эффект угнетения пролиферации, индуцированной ЛПС - это монАТ 1д. Остальные монАТ вызывали, напротив, даже незначительное увеличение включения %1-тимидина. Поскольку такое увеличение наблюдалось во вех пробах и носило сходный характер, можно предположить, что этот эффект неспецифичен. Во втором варианте опытов исследовалась пролиферация спленоцитов, индуцированная самими монАТ. Для этого к нормальным сплено-цитам добавляли в разных разведениях сульфатные фракции монАТ и на 3-й день инкубации учитывали включение метки, которую вносили в пробы за 4 часа до окончания инкубации. Из исследуемых монАТ (1д, 3^,32,4^,42,5^,52) только добавление монАТ 5^ в культуру нормальных спленоцитов приводило к значительному усилению пролиферации ( в 2,5-3 раза). На рис.3 представлены данные только по монАТ 5р52 и З2, действие остальных монАТ носило характер сходный с действием монАТ 62 и З2. Следует отметить, что несмотря на одинаковую специфичность монАТ 5| и 62 лишь монАТ 5J индуцировали усиление пролиферации.Это можно было бы объяснить изотипом этих АТ ( монАТ 5^ изотипа, а 62 - изотипа), хотя в этом случае не понятны данные, полученные с монАТ З2, которые тоже имели 1вм изотип. Истощение препарата монАТ 5J ЭБ снимало эффект усиления пролиферации монАТ 5^ полностью (рис.3).

Таким образом, исследование влияния препаратов монАТ на пролиферацию нормальных спленоцитов показало, что монАТ 1д угнетают

О и

- о

к- а ел си

9 ё

я о

ф

ее ►а

о

£ 1-3

И

3

П Г1

Включение Н тимвдина срм'Ю /¡культура

СЛ

монАТ 5Т

монАТ 5-|-,сорбированные на ЭБ

о л

Включение Н тимидша ерм 10 /культура

монАТ

монАТ 3.,

2

1д крысы 4~ Фон

сл _1_

•-о

О

ы

' монАТ 5

к о 43

(г" К

Ф К о

1-3

о ш

к р

я

«

о &

со 43

1-Э

а

угнетения

ЕЙ СЛ СО

О) 1—1 ю

со » в Ю

>-э » 43

о

И I

1-3 43

к го к

о 1-Э

о 5=1

сх

к сл к

н о

р

и

со и

.н со к о

о

1-Э

о

ь

сх

о

£0 1-Э

© •о

0

1

о

сл о

■гй.

м со 1-Э а>

к §

о +

о р

р»

1-3

о о

Т) й о

Ё ^

й д

^ си

Р н

в ст>

•й а

о к

Ы св

3 и

а 43

о о

»

^ к

0 й' О 43

-о Ё

я

о

о Е ь<

3

О £

►-3

о

я

н о ы

стимуляцию пролиферации, вызванную ЛПС, а монАТ 5j способны усиливать пролиферацию нормальных спленоцитов в 2-3 раза. Последний эффект обусловлен как специфичностью монАТ, так и их изотипом (ig J. Вместе с тем, маловероятно, что усиление пролиферации обусловлено клетками, экспрессирующими антиген Фо. Такие клетки составляю» небольшой процент спленоцитов, и кроме того в обычных условиях макрофаги практически не пролиферируют. Очевидно, эффект монАТ 5j на пролиферацию носит опосредованный характер.

Изучение функциональной активности полученных монАТ проводили также на модели индукции иммунного ответа in vitro • Об иммунном ответе судили по числу АОК и ИГОК на Ю^живых клеток на 4-й день культивирования их с антигеном. В основу определения был положен иммуноферментный метод ( ¿LISPOT), введенный Corrcback и "'¡oiler (1985) и адаптированный нами для корпускулярного антигена - вируса гриппа (A/PR8/34) и синтетического антигена поливинилпирролидо-на (м.в.350 кДа). Иммунный ответ на ДНФ-фиколл определяли вSLISA . Для определения ИГОК оригинальный метод был упрощен и модифицирован.

Было обнаружено, что при индукции иммунного ответа на вирус гриппа добавление монАТ - в Диалаз0не концент-

раций 0,5-5 мкг на лунку вызывало угнетение иммунного ответа. Однако, поскольку таким же эффектом обладали и нормальные ig крысы, вероятно, что этот эффект неспецифичен. Ответ на ДНФ-фиколл монАТ 5j не угнетался. Не исключено, что эти монАТ, действительно, по-разному влияют на ответ на Т-зависимый и Т-независимый антигены, однако, полученные в этих опытах дани*--: ■ оеят предварительный характер и вопрос требует дальнейшего исследования.

- 20 -

ВЫВОДЫ

I.Получена панель крысиных моноклональных антител (монАТ), напраг ленных к различным детерминантам поверхностных антигенов сгшеь цитов мыши.

2.Определены специфичности пяти монАТ. Два из них направлены к at тигенам, по молекулярным весам соответствующим антигенам 1-го класса МНС и одно - к антигенам 2-го класса МНС. Два монАТ (5j 5g) специфичны в отношении антигена Форсмана.

3.Установлено, что монАТ к антигену Форсмана распознают концевой сахарид этого антигена.

А.Детерминанты, распознаваемые монАТ 5j и Sg, обнаружены не толы в поверхностных гликолипидах спленоцитов, но и в поверхностных гликопротеинах с мол.массами ~25,15,12 кДа.

5.Выявлена экспрессия антигена Форсмана на макрофагах селезенки, не на макрофагах и моноцитах крови и перитонеальной полости. Е; ничные клетки, экспрессирующие антиген Форсмана,обнаружены в ti мусе и костном мозге.

6.Показано, что экспрессия антигена Форсмана нестабильна,и что ei можно индуцировать на макрофагах перитонеального экссудата и к. ках макрофагоподобной линии Р 388Д1 in vivo и in vitro .Опред! ляющую роль в этом процессе, по-видимому, играют клеточные фак1 ры.

7.Модифицирован иммуноферментный способ выявления клеток, продуц рующих Ig мыши, показана возможность применения иммуноферментн го метода для выявления единичных клеток, продуцирующих антите. к вирусу гриппа и поливинилпирролидону.

8.Выявлена функциональная активность двух монАТ : одно из монАТ, специфичных к антигену 1-го класса МНС, угнетает пролиферацию спленоцитов, индуцированную ЛПС, a IgM монАТ к антигену Форсма

(5j), напротив, стимулируют пролиферацию нормальных спленоци-тов.

9.Предлагается использовать монАТ к антигену Форсмана для дискриминации субпопуляций макрофагов мыши.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Логунова Н.Н., Агаджанян М.Г., Сидорова Е.В. Определение клеток, секретирующих иммуноглобулины и антитела к вирусу гриппа и поливинилпирролидону, иммуноферментным методом // Иммунология.-1989.2.-С.77-79.

2. Логунова Н.Н., Сидорова Е.В. Антиген Форсмана - маркер прикрепляющихся клеток селезенки мыши // Тезисы докладов I Всесоюзного иммунологического съезда. Сочи, 15-17 ноября 1989 г.-С.64.

3. Логунова Н.Н., Сидорова Е.В. Моноклональные антитела крысы к поверхностным антигенам спленоцитов мыши. Выявление антигена Форсмана на макрофагах селезенки // Иммунология.-1990.-№5 -С. 29-34.

Sidorova e.v., Logunova H.N. Forssman - like antigen -a marker of adherence of mouse spleen cells// In: 7th Intern. Congr.Immunol. July 30 - August 5, Berlin, 1989.-P.398.