Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика и биотехнология моноклональных антител против лимфоцитарных антигенов

%

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК имени И. И. МЕЧНИКОВА

ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЛИМФОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

* > Москва

Г Б ОЛ

На правах рукописи УДК 576. 8. 097. 3

НОВИКОВ Виктор Владимирович

1994

Работа выполнена в лаборатории моноклональных антител Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии ГК СЭН России

Научный консультант: доктор мед.наук, профессор, академик РБА А. Ю. Барышников.

Официальные оппоненты: доктор мед.наук, профессор

Л. И. Краснопрошина доктор биол. наук, профессор

Р. В. Ленская; доктор мед.наук, профессор, академик РАЕН А. А. Ярплин

Ведущее учреждение: институт клинической онкологии ОНЦ РАМН

Защита состоится " " 1995 г. в 14 час.

на заседании Специализированного ученого совета (Д 001.38.01) при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И.Мечникова РАМН по адресу: 103064, г.Москва, пер. Мечникова, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан " Ь " Л^ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного ученого совета,

канд.мед. наук

Н.Г.Кудрявцева

Актуальность проблемы. Моноклональные антитела (МКА) находят все более широкое применение в биологии и медицине. Являясь реагентами направленного действия, они позволяют идентифицировать отдельные детерминанты в сложных композициях антигенных структур. Преимущества МКА перед поликлональными антителами выравненно проявились в области, связанной с идентификацией поверхностных антигенов клеток иммунной системы. Благодаря применению гибридомной технологии в настоящее время выявлено более ста ранее неизвестных антигенных структур, локализованных на мембране клеток различных ростков гемопоэза. Многие из антигенов классифицированы в соответствии с кластерами дифференциации (cd), утвержденными на Международных рабочих совещаниях по лейкоцитарным антигенам. Накоплены обширные данные о том, что МКА способны выявлять дифференцировочные антигены, характерные для отдельных субпопуляций клеток, а также для отдельных этапов их дифференцировки в процессе гемопоэза (Барышников А. Ю. и др., 1989, 1990; Глузман Д. Р. и др., 1991; Када-гидзе 3. Г. и др., 1990; Манько В. М., 1990; Сидоренко С. П. и др., 1990; Foon К., Todd R.F., 1986).

В связи с этим стало возможным использовать МКА не только в научных исследованиях, но и при диагностике иммунологических подвариантов гемобластозов, а также при оценке состояния клеточного иммунитета. Это явилось значительным шагом вперед в совершенствовании диагностических методов. Одновременно возникла необходимость в наличии диагностических препаратов МКА, предназначенных для иммунофенотипирования клеток и доступных практическому здравоохранению. Разработке таких препаратов и посвящена данная работа.

Цель исследования. Изучение специфичности ряда новых МКА серии ИКО против лимфоцитарных антигенов и создание технологии производственного получения диагностических препаратов МКА для выявления дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы.

1. Провести детальную характеристику специфичности ряда МКА серии ИКО, направленных к поверхностным антигенам клеток иммунной системы и показать их применимость для иммунофеноти-пирования клеток.

2. Разработать оптимальные методы наработки, очистки и стабилизации МКА, применимые в производственных условиях, и создать на этой основе единую технологию получения диагностических препаратов МКА для выявления антигенов клеток иммунной системы.

, 3. Используя МКА к пероксидазе хрена (ПХ), сконструировать диагностический моноклональный ПАП-набор (ПХ-анти-ПХ), предназначенный для проявления взаимодействия МКА с поверхностными антигенами клеток.

4. Основываясь на единой технологии производства, получить и внедрить в практику здравоохранения панель диагностических препаратов МКА для оценки состояния клеточного иммунитета и иммунодиагностики лейкозов.

Научная новизна. Впервые в России охарактеризованы отечественные МКА против СВ451{А антигена человека, а также МКА против антигенов и класса главного комплекса гистосовместимости крыс.

Выявлено, что полученные ранее МКА ИКО-1, ИКО-2 и ИКО-8 против мономорфной части антигенов ньа п класса взаимодействуют у человека только с Н1А-бе антигенами. Показано, что МКА ИКО-15.5 взаимодействуют с антигенами и класса комплекса гис-

тосовместимостк, по не с hla-dr антигенами.

Впервые обнаружено, что MRA МКО-1, ИКО-2 и ИКО-8 дают межвидовые перекрестные реакции с антигенами главного комплекса гистосовместимости ряда лабораторных и сельскохозяйственных животных. Показана возможность применения МКА ИКО-1 для радио-иммунолокализации солидных опухолей у мышей.

Проведена характеристика специфичности новых отечественных МКА против гамма, мю, каппа и лямбда цепей иммуноглобулинов человека. Показана их применимость для иммунофенотипирова-ния клеток человека.

В результате кариологичеокого анализа гибридомных клеток выявлена более стабильная антителопродукцня у гибридных линий, характеризующихся сверхтетраплоидным набором хромосом в сравнении с линиями, обладающими околотетраплоидным набором хромосом. Предложен новый метод стабилизации гибридомных линий путем повторного слияния клеток.

Разработан эффективный метод культивирования гибридом в присутствии коллагеновых микроносителей, на который получено авторское свидетельство n 1794950 "Способ культивирования гибридных клеток мыши" от 18 октября 1992 г.

Впервые продемонстрирована возможность использования лабораторных беспородных мышей для наработки МКА, а также предложено три стимулятора асцитообразования, не уступающих по эффективности пристану.

Предложен новый метод очистки МКА с помощью отечественного стафилококкового реагента, содержащего белок А.

Выявлена сложная картина количественных взаимоотношений между иммунохимическими ингредиентами, обеспечивающими проведение ПАП-реакции с применением МКА.

Впервые в стандартизированных условиях проведено изучение

устойчивости МКА разных изотипов к обработке протеолитическими ферментами. Полученные данные, а также результаты, полученные при изучении воздействия других физико-химических факторов на стабильность МКА позволили продемонстрировать прямую зависимость стабильности МКА от их изотипа. Построен ряд стабильности МКА. Показано, что наиболее стабильными являются МКА 2а-изотипа класса g.

Практическая значимость. Разработана технология производственного выпуска отечественных диагностических препаратов МКА, предназначенных для выявления дифференцировочных антигенов поверхности клеток иммунной системы. Оформлена и утверждена нормативно-техническая документация на их производство: регламенты производства N 59 от 25.05.87 и n 324-91 от 01.07.1991 г.

В качестве медицинских диагностических препаратов утверждены препараты МКА ИКО-1 против hla-dr антигенов (ВФС 42-113ВС-87, ФС 42-367ВС-91); МКА ИК0-90 против cd3 антигена (ВФС 42-294ВС-91); МКА ИКО-86' против cd4 антигена (ВФС 42-296ВС-91); МКА ИК0-31 против cds антигена (ВФС 42-295ВС-91); МКА ИКО-ГМ-1 против CDllb антигена (ВФС 42-112ВС-87, ФС 42-366ВС-91); МКА ИКО-Г-2 против' cois антигена (ВФС' 42-114ВС-87, ФС 42-368ВС-91); МКА ИКО-12 против согг антигена (ВФС 42-293ВС-91).

На примере ряда заболеваний инфекционной и неинфекционной природы продемонстрирована применимость разработанных препаратов МКА для иммунодиагностики гемобластозов и оценки состояние клеточного иммунитета.

Показано, что для иммунофенотипирования клеток в научно-практических целях пригодны также И других МКА, охарактеризованных в процессе работы и направленных против лимфоцитарны:

антигенов человека и животных. Среди них МКА ИК0-10, ИКО-2, ИКО-8, ИКО-15.5, ИКО-166, ИКО-ЗО, МКО-97, ИК0-Ю6, ИК0-107, ИК0-Ю9, ИКО-112. Охарактеризованная панель МКА позволяет выявлять не только поверхностные антигены клеток человека, но и некоторые антигены клеток лабораторных и сельскохозяйственных животных. Это дает возможность использовать МКА в ветеринарии и экспериментальной иммунологии.

Разработан диагностический моноклональный ПАП-набор для иммунопероксидазного проявления взаимодействия различных МКА с антигенами поверхности клеток и растворимыми антигенами. Отработана технология его выпуска, оформлена и утверждена нормативно-техническая документация на производство ПАП-набора: регламент производства N 146-88, ВФС 42-193ВС-88. Разработаны методы применения ПАЛ-набора для иммунофенотипирования с помощью МКА клеток крови и клеток тканей на криостатных срезах. Показана возможность использования ПАП-набора для твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга.

Организован производственный выпуск разработанных диагностических препаратов МКА, позволяющий обеспечить потребности отечественного здравоохранения в данных препаратах.

1. Охарактеризована специфичность 12 моноклональных антител серии ИКО, направленных против антигенов поверхности лим-фоцитарных клеток.

2. Разработана технология производственного получения диагностических препаратов МКА против антигенов клеток иммунной системы, а также создан моноклональный ПАП-набор (перокси-даза-антипероксидаза) и технология его производства.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы доложены на I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии

s

и медицине" (Москва, 1983); и Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1985); II Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 1985); Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, .1986); 4 Международном симпозиуме стран-членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам для радиоиммунологического анализа (Обнинск, 1986); Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Москва, 19S7); Всесоюзной конференции "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пущино, 1987); vu Республиканской конференции "Еиоорганическая и органическая химия (Таллинн, 1987); VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Вильнюс, 1988); Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988); Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии (Тарту, 1989); I Всесошном иммунологическом съезде (Москва, 1989); Республиканской конференции "Применение иммуноферментного анализа в медицине" (Харьков, 1989); Республиканской конференции "Экология и иммунитет" (Горький, 1990); Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии" (Томск, 1991); I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992).

По теме диссертации опубликовано 45 работ.

Обьем ц структура работы. Текст диссертации изложен на 310 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Библиографический указател! RK-Tim-aa^T 344 литепатуоных источника отечественных и иностран-

ных авторов. Диссертация иллюстрирована 51 таблицей и 81 рисунком.

Материалы и методы В работе были использованы вновь полученные МКА серии ИКО, а также МКА серии ИКО ранее охарактеризованные другими авторами (Барышников А. Ю. и др., 1989). Кроме того, применяли отечественные МКА других серий (Филатов А. В. и др., 1987; Кущ А. А. и др., 1987, и др. ), а также импортные антитела, направленные против различных клеточных антигенов. Полный перечень использованных МКА составил 52 наименования.

МКА применяли для определения антигенов на клетках крови здоровых доноров, больных вирусными гепатитами, недоношеных новорожденных, клетках онкологических больных, на клетках перевиваемых клеточных линий, а также на клетках крови и других тканей лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Чистые фракции клеток получали общепринятыми методами. Взаимодействие МКА с клетками человека и животных определяли в прямой и непрямой реакции иммунофлуоресценции с использованием ФИТЦ-меченных (F), фикоэритрин-меченных (ре) и биотинилирован-ных антител. Флуоресценцию клеток учитывали с помощью микроскопов ЛЮМАМ-ИЗ, Leitz, opton или лазерного проточного цито-флуориметра FACScan (Becton Dickinson). Анализ полученных при цитофлуорометрии данных при постановке реакции на клетках цельной крови проводили с использованием гейтов "лимфоцитов", "гранулоцитов", "моноцитов" и "тромбоцитов" на основании комбинации светорассеяния и размера клеток.

Культивирование и клонирование in vitro гибридом и перевиваемых клеточных линий проводили с использованием общепринятых питательных сред. Асцитическую жидкость, содержащую МКА, нарабатывали путем пассирования гибридом на мышах с использо-

ванием различных стимуляторов асздтообразовакия. Кариотипиро-вание клеток осуществляли общепринятыми методами.

Очистку МКА проводили сульфатным, риванольным, каприлат-ным методами, с помощью полиэтиленгликоля, ДЕАЕ-целлюлозы, белок А-сефарозы (агарозы), с помощью стафилококкового реагента, содержащего белок А, и сорбента, несущего белок g стрептококков группы С. Фрагментирование МКА осуществляли с помощью сериновых протеиназ в стандартных условиях. О чистоте МКА или степени их фрагментированности судили по данным электрофореза в тонком слое ПААГ в присутствии sds в буферной системе Лзм-мли. Электрофокусированиэ МКА проводили с помощью системы Мультифор ("lkb", Швеция).

Молекулярну» массу антигенов, выявляемых МКА, определяли с помощью иммунопрециштации, радиоиммунопреципитации и имму-ноблоттинга. Для характеристики специфичности МКА использовали различные варианты непрямого иммуноферментного анализа, в том числе ЛАП-метод (лероксидаза-антипероксидаза). Радиоиммунологические исслеования проводили с помощью 131г-меченных МКА.

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ МОНОКЛОКАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЛИМФОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ

МКА ИКО-ЗО были получены после иммунизации мышей линии balb/c лимфоцитами человека и слияния слленоцитов иммунной мыши с клетками мышиной миеломной линии рзхАд8.б5з. Методами непрямой иммунофлуоресценции с использованием люминесцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии выявлено, что МКА ИКО-ЗО взаимодействуют с 5,2±1,0% лимфоцитов человека и не реагируют с моноцитами, гранулоцитами, тромбоцитами, эритроци-

тами. В реакции двойного мечения клеток МКА ИКО-ЗО взаимодействовали с 11% В-лимфоцитов, окрашивая при этом одну и ту же популяцию клеток, что и моноспецифическая сыворотка против 1дМ человека (Рис.1).

АНТИ-IgM-F

w о.

гЧ

■ШiL

АНТИ-IgM-F

Рис.1. Двойное окрашивание лимфоцитов периферической крови человека с помощью МКА ИКО-ЗО и моноспецифической сыворотки против 1дМ человека, меченной ФИТЦ.

Сравнение реактивности МКА ИКО-ЗО с МКА 9С11В8, направленных против Хдм человека, показало, что лимфоциты, обработанные данными МКА, дают сходные профили иммунофлуоресценции, обнаруживая близкое по процентному соотношению количество антиген-положительных клеток.

С помощью твердофазного варианта ПАП-метода (пероксидаза-антипероксидаза) выявлено, что МКА ИКО-ЗО взаимодействуют с 1дм человека, сорбированными на планшетах для иммуноферментно-го анализа, и не реагируют с igG человека. Моноспецифическая

сыворотка против IgM человека подавляла такое взаимодействие в отличие от моноспецифической сыворотки против IgG человека. В иммуноблоттинге МКА ИКО-ЗО реагировали с тяжелой цепью 1дм человека, не давая реакции с легкими цепями igM. Представленные результаты позволили сделать вывод о направленности МКА ИКО-ЗО против мю-цепей IgM человека.

С применением клеток больнык ХЛЛ была оценена -диагностическая значимость МКА ИКО-ЗО. Использование МКА ИКО-ЗО совместно с другими МКА к антигенам поверхности лимфоцитов позволило разделить больных ХЛЛ на две группы. Лимфоциты больных первой группы не экспрессировали поверхностный IgM, что свидетельствует в данном случае о трансформации наименее зрелых B-лимфоцитов. Во второй группе больных антиген, выявляемый МКА ИКО-ЗО, присутствовал на части лимфоцитов. На примере одного из больных второй группы методом двойного мечения клеток было продемонстрировано наличие двух популяций cd19* В-димфоцятов, одна из которых несет поверхностный IgM. Гетерогенность клеток больного может быть объяснена способностью трансформированных B-лимфоцитов к частичной дифференцировке, ■ следствием чего является наличие в крови ИК0-30"-клеток, которые по своей природе являются более зрелыми, чем ИКО-ЗО" клетки (Злобина Е. Н. и др., 1987).

Проведена характеристика МКА ИКО-97, также полученных после иммунизации мышей balb/c лимфоцитами человека. Антитела специфически взаимодействовали с 17,3±2, 4 /в мононуклеарных клеток периферической крови здоровых лиц и не реагировали с моноцитами, гранулоцитами, тимоцитами и эритроцитами. С помощью ПАП-метода было показано, что МКА ИКО-97 реагировали с сорбированными на твердой фазе IgG человека и не реагировали с igM. Наблюдалось подавление взаимодействия МКА ИКО-97 с igG челове-

ка при использовании моноспецифической сыворотки к IgG человека. В то же время моноспецифическая сыворотка к 1дм человека не блокировала взаимодействие МКА ИКО-97 с IgG человека. Анализ специфичности МКА ИКО-97 с помощью иммуноблоттинга показал направленность данных антител против тяжелых цепей igG (Рис.2).

_ ^

Fe

i I 4 3

Рис. 2 Анализ специфичности МКА ИКО-97 с помощью иммуноблоттинга; 1. IgG человека, разделенные на легкие и тяжелые цепи; 2. 1дм человека, разделенные на цепи; 3. F (ab') ?-фрагменты igG; 4. Нерасщепленный IgG. Проявление реакции ПАП-методом.

Более детальное изучение специфичности МКА ИКО-97 с использованием фрагментированного пепсином IgG, твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга показало, что МКА ИКО-97 реагируют с F (ab'^-фрагментами rgG. Полученные результаты позволили нам заключить, что 'МКА ЖО-97 направлены к одной из антигенных детерминант, локализованной на F(ab' ^-фрагменте тяжелой цепи IgG человека.

Следующими двумя МКА, специфичность которых была нами охарактеризована, явились МКА ЙК0-108 и МКА ИК0-Ю7. Оба МКА, как и описанные выше МКА ИКО-ЗО и МКА ИКО-97, взаимодействова-

ли в реакции иммунофлуоресценции только с лимфоцитами, не давая реакции с другими клетками крови здоровых лиц. В то же время в твердофазном ПАП-методе они реагировали как с 1дм, так и с igG человека. Тем не менее, при использовании ряда моноспецифических сывороток к различным цепям иммуноглобулинов человека было выявлено, что взаимодействие МКА ИКСЫ06 с иммуноглобулинами человека более всего блокировалось моносывороткой к лямбда-цепям. В свою очередь реакция МКА ИК0-Ю7 с иммуноглобулинами человека наиболее выраженно подавлялась моноспецифической вывороткой к каппа-цепям. В иммуноблоттинге с применением в качестве антигена IgG человека МКА ИК0-Ю6 и ИК0-107 взаимодействовали с полипептидом, соответствующим по своей молекулярной массе легким цепям иммуноглобулинов человека' (Рис.3).

Рис.3 Анализ специфичности МКА ИК0-106 (1)

и ИК0-107 (2) с помощью иммуноблоттинга.

Специфичность МКА ИКСЫ ОБ и ИК0-Ю7 сравнивалась также со специфичностью МКА 5В4Д6, направленных против лямбда-цепей иммуноглобулинов человека и со специфичностью МКА 6Е7Д7, направленных против каппа-цепей. Лимфоциты четырех использованных в работе больных миеломной болезнью сходным образом взаи-

модействовали с МКА ИК0-Ю7 и МКА 6Е7Д7 против каппа-цепей иммуноглобулинов человека и не давали реакции с МКА ИКСЫ 06 и МКА 5В4Д6. В то же время цнтофлуориметрический анализ показал сходство профилей иммунофлуоресценции лимфоцитов здоровых лиц, окрашенных МКА ИК0-10Б и МКА 5В4ДС против лямбда-цепей иммуноглобулинов человека. Представленные данные позволили сделать вывод о том, что МКА ИКО-106 направлены против лямбда-цепей, МКА ИК0-107 против каппа-цепей иммуноглобулинов человека.

Таким образом, нами была охарактеризована специфичность группы МКА, направленных против различных цепей иммуноглобулинов человека. Было показано, что МКА ИКО-ЗО взаимодействуют с мю-цепью 1дм? МКА ИКО-97 взаимодействуют с гамма-цепью 1да в области ее Р{аЬ')г~фрагмента, МКА ИК0-10В реагируют с лямбда-цепью, а МКА ИК0-107 взаимодействуют с каппа-цепью иммуноглобулинов человека. Продемонстрирована, кроме того, применимость охарактеризованных МКА для определения различных цепей иммуноглобулинов в растворах и применимость МКА для выявления мембранных форм иммуноглобулинов при иммунофенотипировании клеток крови человека.

Еще одной группой антител, детально охарактеризованных нами, явились МКА против мономорфной части антигенов и класса главного комплекса гистосовместимости. Ранее А. Ю. Барышниковым были получены МКА ИКО-1, ИКО-2, ИКО-8 и ИК0-15.5, взаимодействующие с антигенами и класса системы гистосовместимости (1985, 1989). Однако, оставалось неясным, с какими из подклассов антигенов и класса комплекса гистосовместимости взаимодействуют данные антитела. В связи с этим мы провели сравнительное изучение реактивности МКА ИКО-1, ИКО-2, ИКО-8 и ИКО-15. 5 с импортными МКА против различных подклассов антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости.

С помощью проточной цитофлуориметрии и люминесцентной микроскопии на клетках перевиваемых клеточных линий человека, клетках периферической крови и клетках больных ХЛЛ было показано, что МКА ИКСЫ, ИКО-2 и ИКО-8 имеют характер реактивности, сходный с характером реактивности МКА хот2а, направленных против мономорфной части hla-dr антигенов. В то же время МКА ИКО-15. 5 обнаруживали реактивность, сходную с реактивностью МКА hl37 против hla-dq антигенов и МКА fb6 против hla-dp антигенов. В частности, количество антиген-положительных лимфоцитов и -моноцитов периферической крови, выявляемое МКА ИКО-1, ИКО-2 и ИКО-8, соответствовало количеству клеток, выявляемых МКА ют2а против hla-dr антигенов, а содержание антиген-положительных клеток, определяемых МКА ИКО-15.5, соответствовало количеству hl37* и fb6+-клеток. Кроме того, среди клеток крови больных ХЛЛ МКА ИКО-1, ИКО-2 и ИКО-8 выявляли 70-80% антиген-положительных клеток, в то время как МКА ИКО-15. 5, МКА hl37 и МКА fb6 выявляли только 18-30% антиген-положительных клеток.

С применением методов иммунопреципитации и радноиммуно-преципитации было выявлено, что как МКА ИКО-1, так и МКА ИКО-15.5 взаимодействуют с белковым гетеродимером, имеющим молекулярную массу 29 и 34 кДа, что соответствует массе антигенов ii класса главного комплекса гистосовместимости. При этом МКА ИКО-1, ИКО-2 и ИКО-8 блокировали связывание с лимфоцитами МКА Leu-HLA-DR против hla-db антигенов в отличие от МКА ИКО-15. 5, МКА hl37 против hla-dq антигенов и МКА В7/21 против hla-dr антигенов, которые не блокировали присоединение к клеткам МКА Leu-HLA-DR (Рис. 4).

Полученные результаты дали возможность сделать заключение, что МКА ИКО-1, ИКО-2 и ИКО-8 направлены против мономорфной части hla-dr антигенов, а МКА ИКО-15. 5 взаимодействуют с антигенами

Ii класса комплекса гистосовместимости, не относящимися к hla-dr антигенам.

| UKO-i 1 1 UKO-X

-_J

! ико-8

_i

ИКО - 15.5

HL ЗгГан-ги-НЬА-ЗЭО^ Ь^/жГанти-НЬД-ЮР)

Leu-ЙЬА-Ъг

1 1 I-'-""" es

50 юо 7°

Рис. 4 Блокада связывания МКА Leu-HLA-DR с лимфоцитами доноров, предобработанными другими MRA против антигенов hla и класса.

Основываясь на многочисленных сообщениях о возможности межвидовых перекрестных взаимодействий МКА, направленных против антигенов и класса комплекса гистосовместимости, и с целью расширения спектра применения МКА мы исследовали характер взаимодействия МКА ИКО-1, ЖО-2 и ИКО-8 с клетками различных животных. Методами люминесцентной микроскопии и проточной цито-флуориметрии было показано, что данные МКА взаимодействуют с лимфоцитами и спленоцитами, но не тимоцитами лабораторных мышей и крыс. МКА ИКО-1 и ИКО-8 давали также реакцию с мононук-леарными клетками крови свиней и овец. МКА ИКО-1 реагировали с

мононуклеариыми клетками и спленоцитами коз (Таблица 1). С тимоцитами последних трех животных MRA ИКО-1 и ИКО-8 не реагировали. Такой характер реактивности МКА свидетельствует о их направленности к антигенам XI класса главного комплекса гисто-совместимости животных.

Таблица 1

Взаимодействие МКА ИКО-1 с клетками животных

содержание антиген-положительных клеток, %

Животные мононуклеарные клетки тимоциты спленоциты

Мыши ВАЬВ/с 12,5 + 3,1 0 44,9 ± 12,8

Крысы 20,0 ±2,2 0 22,4 ± 4,5

Свиньи 19,1 + 0,9 0 Н.Т.

Козы 19,3 + 2,7 0 21,4

Овцы 25,0 ± 9,4 0 Н.Т.

Крупный рогатый скот 0 0 0

Кролики 0 0 0

Поскольку было выявлено, что МКА ИКО-1 взаимодействует с 1а-антигенами мышей, была изучена их применимость для экспериментальной радиокммунолокализации опухолей, несущих 1а-аитигены. В опытах с использованием клеток линии Ъ12Ю (мышиный лимфолейкоз) на мышах линии вор1 было продемонстрировано избирательное накопление 1311-меченых МКА ИКО-1 в местах локализации солидных форм опухоли. Это показало возможность применения МКА ИКО-1 в экспериментальных исследованиях на таких широко распространенных лабораторных животных, как мыши.

С целью использования в области экспериментальной биологии и медицины были получены и охарактеризованы МКА ИКО-109 и

МКА ИКСЫ 12. МКА были получены после пмунизации мышей лимфоцитами крысы. В реакции непрямой иммунофлуоресценции, регистрируемой с помощью проточной цитофлуориметрии или люминесцентной микроскопии, МКА ЙК0-109 и ИКО-112 взаимодействовали с лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, спленоцитами и клетками лимфоузлов крыс, не давая реакции с тимоцитами, гранулоцитами и эритроцитами (Таблица 2).

Таблица 2

Взаимодействие МКА ИКСЫ 09 и МКА ИКО-112 с клетками крыс

линии wistar

Содержание антиген-положительных клеток, %

Тип клеток

ИК0-109

ИКО-112

Лимфоциты

Моноциты

Макрофаги

Гранулоциты

Эритроциты

Тимоциты

Спленоциты

Клетки лимфоузлов

16,2 ± 2,6 31,3 + 8,6 18,7 ± 8,6 О О О

20,7 ± 4,8 8,6 ± 2,9

21,5 ± 5,0 20,9 ± 7,1 22,5 ± 4,5 О О

о

22,1 ±2,9 8,2 ± 3,1

Оба МКА блокировали также реакцию бласттрансформации крысиных спленоцитов, что характерно для МКА к la-подобным антигенам (Clark R.B. et al., 1982). МКА 0X3 против la-подобных антигенов крысы блокировали присоединение МКА ИК0-109 и ИКО-112 к крысиным спленоцитам. В то же время МКА ИК0-Ю9 и ИК0-112 блокировали взаимодействие со спленоцитами крысы МКА ИК0-1, которые, как описано выше, реагируют с антигенами II класса главного комплекса гистосовместимости крыс. Полученные результаты

позволили сделать вывод о направленности МКА ИКО-ЮЭ и ИКО-112 к мономорфной части антигенов и класса главного комплекса гистосовместимостя крыс.

Таким образом, была охарактеризована группа из шести МКА, направленных против антигенов ii класса главного комплекса гис-тосовместимостк человека и животных. Показано, что МКА ИКО-1, ИКО-2 и ЖО-8 взаимодействуют с ньа-он антигенами человека, а также с 1а-подобными антигенами рада животных, МКА МО-15.5 реагируют с антигенами ii класса ньа, ' не относящимися к ньА-ок-антигенам, а МКА ИКО-ЮЭ и ИКО-112 взаимодействуют с 1а-подобными антигенами крыс. Продемонстрирована применимость охарактеризованных МКА для иммунофенотипирования клеток человека и животных.

Изучена специфичность МКА ИКО-166, полученных после иммунизации мышей Т-клетками человека. В реакции непрямой иммуно-флуоресценции МКА ИКО-166 реагировали с мононуклеарными клетками, не давая реакции с гранулоцитами, тромбоцитами, эритроцитами и тимоцитами. Среди перевиваемых клеточных линий МКА ИКО-166 выявляли антиген на клетках Т- и В-клеточного происхождения. Методом двойного мечения клеток с использованием МКА ИКО-166 и различных МКА против антигенов лимфоцитов было показано, что МКА ИКО-166 выявляют все В-клетки, все мк-клетки, 31% зрелых Т-лимфоцитов, 55% сив^-клеток и 21% со4+-клеток (Рис.5). При этом экспрессия антигена на В-лимфоцитах значительно превышала экспрессию антигена на Т-клетках. Сравнение МКА ИКО-166 с МКА, направленными против со37, со45й и соте антигенов обнаружило, что МКА ИК0-16В имеют характер взаимодействия с клетками крови доноров, аналогичный характеру взаимодействия МКА 4КВ5 и Г8-И-13, направленных против со45И антигенов человека.

С помощью двойного мечения клеток,с использованием проточной цитофдуориметрии было показано также, что МКА ИКСЫ66 к МКА аьви, направленные против 00451* антигенов, выявляют одну и ту же популяцию клеток. Кроме того, МКА ИКСЫ 66 и МКА Р8-и-13■ против С045ИА антигена сходным образом блокировали присоединение к лимфоцитам крови доноров МКА аьви.

Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что МКА ИКСЫ66 направлены к одной из изоформ С045К антигенов и предположить, что антитела выявляют сильна изоформу.

и* о. Т-»летки ^ о ь; II

Ьеи-Л-Фити

ш о. 1 '-келпэры £ 1 а к 3 1

Ьеи-Эа-Фити.

и1 си В-клетки з 1 о 3 ЯЗЙг>\ Л- •.

//1С-клетки

Т- мпрессоры

Ьеи-2а-Фыт

МС-клетки и

цишокс-ическиг

клетки

Рис. 5

ик о-1-Фмти ико-166-Фити

Экспрессия антигена, определяемого МКА ИК0-16В, на субпопуляциях лимфоцитов периферической крови человека.

Последними из охарактеризованных нами МКА явились МКА

ИК0-1С, выявляющие, как было показано ранее, антиген, характерный для ранних тимоцитов человека (Барышников А.Ю., 1984). Анализ специфичности МКА ИКСЫ 0 позволил предположить, что антитела выявляют видонеспецифичеекий Thy-i антиген, являющийся высококонсерватавным гликопротеидом. Для подтверждения этого предположения было исследовано взаимодействие МКА ИКСЫ 0 с клетками ряда животных. Выявлено, что МКА ИКСЫ0 реагируют с клетками большинства тестированных животных. В реакции иммуно-флуоресценции, регистрируемой на проточном цитофлуориметре, МКА ИКО-10 взаимодействовали" с лимфоцитами, тимоцитами, спле-ноцитами и клетками лимфоузлов мышей линии balb/c (Thy-1.1. аллель) и с клетками мышей линии akr (Thy-1.2 аллель). У мышей Thy-i антиген принято считать маркером Т-лимфоцитов (Брондз И.Д., 1987). Количество' ИКО-lCf-лимфоцитов, выявляемых среди лимфоцитов периферической крови мышей, соответствовало содержанию Т-клеток.

МКА ИК0-10 реагировали также с тимоцитами, слленоцитами и небольшой частью лимфоцитов крыс линии wistar, что соответствует данным об экспрессии Thy-i антигена на клетках крови этого вида животных (Hunt s. , 1979; Ritter м.а. et.al., 1963). Выявлена, кроме того, реакция МКА ИК0-10 с клетками иммунной системы кроликов, свиней, овец и крупного рогатого скота (Табл. 3).

Полученные результаты подтвердили предположение о направленности МКА ИКО-10 против Thy-i антигена и дали возможность использовать МКА ИКСЫ О для иммунофенотипирования клеток как человека, так и животных. Было продемонстрировано, что при развитии лейкоза у крупного рогатого скота параллельно с появлением в крови антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота происходит статистически достоверное нарастание количества

Таблица 3

Взаимодействие МКА ИКО-Ю с клетками животных

содержание антиген-положительных клеток, %

Животные п мононук-леарные клетки крови П тимоциты п сплено-циты

Мыши Вalb/с

Мыши akr

крысы Wistar

Крупный рогатый скот

Свиньи

Овцы

Кролики

Козы

Собаки

Кошки

Морские свинки

4

19

12 4

6 3 3 3

87,9 Н.Т.

23,0+7,0* 23,3+3,1

21,6+4,3 24,5±2,9 Н.Т.

О О О О

4 2 4

62,3±4,8 50,0 50,0+1,1 Н.Т.

н.т . Н .Т.

61,4+7,1 20,3±3,0 Н.Т. О О

4 4 4 3

47 , 1±4 , 8 57,6+0,4 3 6,0+4,0 56,8+10,5

О

Н.Т.

18, 1 40,0+5,о О О О

н. т. - не тестировали; * - лимфоциты

тьу-1 положительных мононуклеарных клеток периферической крови, выявляемых с помощью МКА ИКО-Ю. С другой стороны, у человека иммунофенотипирование бластных клеток больных лейкозом -и лимфосаркомой показало, что МКА ИКО-Ю выявляют тьу-1 антиген, экспрессирующийся на стадии дифференцировки Т-клеток, соответствующей ранним тимоцитам и, кроме того, МКА ИКО-Ю позволяют установить ограниченный этап дифференцировки в пределах В-клеточного ряда, характеризующийся экспрессией тьу-1 антигена и соответствующий поздним пре-В-клеткам, ранним В-клеткам (Табл. 4).

Таблица 4

Реакция монооональных антител ЖО-10 с бластными клетками крови и костного мозга больных лейкозом и лимфосаркомой

Диагноз Число положительных случаев Число обследованных лиц Частота экспрессии антигена Процент антиген положительных клеток (Шт.)

Т-1 ОЛЛ 6 25 24, 0 13 ,6 + 2,9

Т-2 ОЛЛ 19 19 100 36,6 ± 6,5

Т-3 ОЛЛ 0 9 0 0

"общий" ОЛЛ 0 57 0 0

ха-подобный ОЛЛ 0 42 0 0

В-ОЛЛ 2 5 40, 0 51,2 + 12,1

пре-В-ОЛЛ 0 13 0 0

Т-1 ЛСА 3 3 100 26,2 + 11,5

Т-2 ЛСА 4 4 100 22, 3 + 7,1

Т-3 ЛСА 0 4 0 0

"общий" ЛСА о 3 0 0

1а-подобныЙ ЛСА о 4 0 0

В-ЛСА 3 14 21,4 48 ,4 + 13 ,4

Суммируя представленные данные, можно заключить, что МКА ИК0-10 выявляют видонеспецифический №у-1 антиген и могут быть использованы в экспериментальной биологии и медицине, а также для иммунодиагностики лейкозов.

Таким образом, в результате проведенных исследований была осуществлена характеристика целого ряда МКА, направленных про-

• тив антигенов поверхности клеток иммунной системы и применимых для иммунофенотипирования клеток человека и животных.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ' ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МКА

Во второй части работы представлены результаты разработки приемлемых для производственных условий методов получения ди-

агностических препаратов на основе МКА. Конечным итогом этой части работы явилось создание ряда иммунодиагностических препаратов и технологии их производства.

При получении диагностических препаратов МКА существенным моментом явилось наличие эффективных методов поддержания гибридом и наработки МКА. В связи с этим была разработана серия методических подходов, связанных с решением этих вопросов в производственных условиях.

Предложен унифицированный иммуноферментный метод оценки продуктивности гибридомных клонов, применимый в условиях периодического реклонирования множества культур, продуцирующих МКА к различным антигенам поверхности клеток. Метод основан на использовании сорбированных на планшетах мышиных иммуноглобулинов, моделирующих иммобилизованный на твердой фазе комплекс "антиген-антитело". Метод имеет высокую чувствительность и не требует наличия специфических антигенов, что особенно важно, когда антиген труднодоступен. Несмотря на то, что по завершении реклонирования предложенный метод должен сочетаться с методом поверхностной иммунофлуоресценции, поскольку не дает характеристики специфичности МКА, тем не менее при реклониро-вании гибридом в производственных условиях он обеспечивает намного более высокую производительность, чем иммунофлуорес-ценция. '

Проведен анализ гетерогенности хромосомного набора и динамики изменения кариотипа при длительном пассировании гибридом ИКСЫ, ИКО-ГМ-1 и ЙКО-Г-2 в асцитной форме и культуре клеток. Показано, что при длительном культивировании клеток наряду с утратой хромосом происходит постепенное падение антитело-продукции. То есть, элиминация хромосом и падение антителопро-дуцирующей функции являются параллельными процессами. Однако,

у клеток, обладающих сверхтетрагглопдным набором хромосом, падение продукции МКА было намного менее выраженным (Рис. Б).

| титр МКА

(Сол- но ХРОПОСОН Ь клетке

»81

44

- 1 •• iOTblC.

4! 5 тыс.,

2о 40 60 30 СУТ.

Рис. 6 Содержание хромосом и уровень антитедопродукции гибридом ИК0-1(')и ИК0-Г-21*)три длительном культивировании в форме асцитной опухоли.

.Полученные результаты позволили высказать предположение о возможности стабилизации гибридомных клонов путем повторного слияния гибридомных клеток друг с другом или с родительскими миеломными клетками, что позднее было подтверждено другими авторами экспериментальным путем (Mattes с.е. et.al., 1991).

Предложен способ культивирования гибридомных клеток в присутствии разработанных Центром медицинской биотехнологии (Буадзе 0. П. и др., 1990) коллагеновых микроносителей, который позволяет в несколько раз увеличить концентрацию клеток в культуре, а также их продуктивность (Табл. 5).

Метод не требует дополнительного оборудования для культивирования клеток, применим для слабоприкрепляющихся культур, зарегистрирован в качестве изобретения и может использоваться для наработки МКА или гибридомных клеток, в том числе перед введением их мышам для культивирования в асцитной форме.

Таблица 5

Культивирование гибридом в присутствии различных коллагеновых микроносителей (2 мг/мл)

Штамм гибридных клеток

Микроноситель

Конечная концентрация клеток (кл/мл)

Титр МКА в реакции иммуно-флуоресценции

ИКО-Е

мнк 1/1 мнк 1/2 мнк 2 мнк 3 мнк 4

2,6 1,6 4,0 1,5 2,0 4,0

х 10 х 106 х 106 х 106 х 10 х 10

6

6

1 1

50 1 10 50

ико-ю

инк 1/1 инк 1/2 мнк 2 мнк 3 мнк 4

2,8 1,0 4,3 1,2 1,3 5,6

б

х 10 х 106 х 106

х юб

X 10 х 10

6

б

10 10 50 10 10 50

Разработаны методы наработки препаративных количеств МКА в асцитной форме, применимые для производственных условий. Методы основаны на использовании предложенных нами стимуляторов асцитообразования, не менее эффективных, чем традиционно применяемый "пристан" и превосходящих его в большинстве случаев по количеству суммарно получаемых от каждой мыши МКА. Такими стимуляторами явились вазелин-пептоновая смесь (вазелиновое масло + 3% пептона), неполный адъювант Фрейнда и адъювантид производства ВНИИ ОЧБ (С.-Петербург), представляющий собой смесь минерального масла, эмульсификатора и олигомерного гли-копентапептида, выделенного из клеточных стенок лактобактерий (Табл. 6).

Таблица 6

Эффективность различных стимуляторов асцитообразования у мышей линии вдьв/с - носителей гибридомы ИКСЫ

Стимулятор асцитообразования

Срок пре инъекции стимулятора (сут

К-во мышей, дав ших асци тную опу холь га

Объем асциги-ческой хидкос-ни на мышь (мл)

Обратный титр МКА

(х103)

Неполный 2 - 7 85 3,7 + 0,2 1 ,0 - 5,0

адыэвант 8 - 15 86 4,4 + 0,2 1 ,0 - 5,0

Фрейнда

Вазелин-пеп- 2 - 7 87 3,8 + 0,3 2 ,5 - 5,0

тоновая смесь 8 - 15 82 3,9 + 0,4 2 ,5 - 5,0

Адьввантид 2 - 7 89 5,4 + 0,4 2 ,5 - 5,0

8 - 15 90 4,0 + 0,3 1 0 - 5,0

Пристан 2 - 7 71 3,2 + 0,2 2 5 - 5,0

8 - 15 100 1,5 0,2 1 ,0 - 5,0

Количество вводимых клеток - 10 кл. на мышь Конечная концентрация клеток - 2x106 - 7x107 кл/мл

Детальные исследования с использованием ряда гибридомных клеточных линий позволили предложить схему наработки МКА, включающую в себя обработку мышей линии ваьв/с одним из указанных выше стимуляторов асцитообразования с последующим внут-рибршным введением гибридомных клеток в объеме 3 мл и сбором асцитической жидкости по мере ее накопления. Данная схема обеспечивает высокую частоту формирования асцитных опухолей и приводит к эффективной наработке МКА. Выявлено, что количество получаемых МКА не зависит от пола животных - реципиентов гибридомных клеток. Это позволило рекомендовать в качестве реципиентов клеток не только традиционно применяемых самок, но и самцов мышей линии ваъб/с.

Изучена возможность применения беспородных лабораторных мышей для наработки МКА. Показано, что беспородные животные,

обработанные стимулятором асцитообразования и получившие затем дозу облучения, равную 800 рад, способны служить реципиентами гибридомных клеток, обеспечивая наработку МКА в количествах, сравнимых с продукцией антител мышами линии balb/c (Табл.7). Тем не менее, пассирование гибридом на облученных беспородных мышах быстро приводит к гибели клеток, что ограничивает использование беспородных животных.

Таблица 7

Асцитообразование у беспородных мышей-реципиентов 2 х 106 гибридомных клеток ИК0-ГМ-1

Показатели Доза облучения (рад)*

асцитообразования 400 600 800

Частота формирования асцитной опухоли (%) 33 аз 67

Объем асцитической жидкости на мышь (мл) 2,0 ± 0,3 5,4 ± 0,7 3,5 ± 0,5

Обратный титр МКА 2,5 - 5,0 2,5 - 5,0 2,5 - 5,0

( х 103 )

* - животных облучали за 5-7 суток до введения клеток.

Для нарабатываемых в асцитной и культуральной форме МКА были применены различные методы их очистки. Показано, что такие методы выделения сывороточных иммуноглобулинов, как сульфатный, риванольный, с помощью ПЭГ, с помощью каприловой кислоты, не позволяют в один этап выделить электрофорегически чистые МКА. При значительных потерях получаемые МКА оставались загрязненными сывороточными белками. Кроме того, при использовании сульфатного и риванольного методов очистки обнаруживалось значительное падение специфической активности, что было связано, вероятно, с денатурирующим воздействием применяемых агентов на конформационную структуру МКА. Удовлетворительные

результаты давал каприлатный метод очистки МКА. Однако в чистую фракцию МКА могли быть выделены только при использовании дополнительного этапа очистки с использованием ДЕАЕ-целлюлозы. Полученные результаты согласуются с данными других авторов 'Carlsson М. et al. , 1985; Manil Ъ. et al., 1986; McKinney M.M. et al., 1987; Reik L.M. et al., 1987) И свидетельствуют О том, что для очистки МКА необходимо применять методы, обеспечивающие более мягкое воздействие на белковую структуру молекул МКА.

В связи с этим для очистки МКА нами были использованы методы с применением сорбентов, несущих белок G стрептококков группы с и белок а- золотистого стафилококка. В результате скрининга ряда штаммов streptococcus был получен сорбент, представляющий собой 10%-ную суспензию фиксированных клеток streptococcus pyogenes nctc 4s40, способных обратимо связывать иммуноглобулины мыши. Однако, использование данного сорбента не позволило выделить чистые МКА, поскольку они оставались загрязенными сывороточным альбумином. И только сорбенты, несущие белок А золотистого стафилококка, обеспечили получение электрофоретически чистых МКА без больших потерь специфической активности и в один этап. В качестве таких сорбентов были использованы белок А-сефароза и белок А-агароэа.

На примере ряда МКА, относящихся к различным изотипам, продемонстрировано, что при низкой ионной силе раствора оба сорбента обеспечивают эффективную очистку из асцитической жидкости МКА 2а, 2Ь и з подклассов IgG, а при повышении ионной силы растворов с помощью 3 М Naci были получены также электрофоретически чистые МКА первого подкласса IgG. При выделении с помощью данных сорбентов МКА из культуральной жидкости достигалась не только очистка МКА, но их концентрирование в 10-20

раз. Использованный метод показал себя как простой, надежный и воспроизводимый, позволяющий получать чистые МКА класса а с минимальными потерями в мягких условиях, не нарушающих структурно-функциональных свойств МКА. Единственным недостатком метода явилась высокая стоимость сорбентов, что осложняет их использование в промышленных условиях производства массовых количеств МКА. Поэтому в нашей работе был испытан еще один сорбент - стафилококковый реагент, содержащий белок А (Рис.7).

Проведены детальные исследования по отработке оптимальных условий выделения МКА с помощью стафилококкового реагента. Среди них такие показатели, как допустимые величины объемных соотношений реагента и асцигической жидкости, содержащей МКА; наличие хлористого магния в элюирующем растворе в качестве хаотропного агента, облегчающего элюцию МКА; состав буферных растворов и другие. Результатом явился подбор условий, которые обеспечили сходную с белок А-сефарозой эффективность очистки МКА разных подклассов мьшиных Где.

1 ■ г Ъ

Рис. 7 Очистка МКА ИКО-1 с помощью стафилококкового реагента, содержащего белок А. 1 - смыв с реагента; 2 - очищенные МКА; 3 - исходная асци-тическая жидкость.

Нужно заметить, что стафилококковый реагент, содержащий белок А, был использован для очистки МКА впервые и показал себя как сорбент, который с успехом может заменить белок А-се-фарозу (агарозу). Методы очистки с применением белка А были заложены в дальнейшем в технологическую схему производства диагностических препаратов на основе МКА.

Низкая стабильность МКА, наблюдавшаяся нами при-разработке методов их очистки, а также противоречивые литературные данные по этому вопросу послужили причиной изучения устойчивости МКА разных изотипов к физико-химическим воздействиям. Было выявлено, что МКА, относящиеся к различным изотипам, обнаруживают различную стабильность. Так, обработка МКА пепсином, трипсином и папаином в стандартных для каждого фермента условиях показала, что наиболее устойчивы к протеолитическому расщеплению МКА 2а-подкласса igG. Вторыми по устойчивости к действию данных сериновых протеиназ в этом ряду стоят МКА первого подкласса, затем МКА 2Ь-подкласса и, наконец, наименее устойчивыми среди мышиных МКА, относящихся к igß, оказались МКА третьего подкласса. В условиях, когда МКА 2а-подкласса (ЙКО-ГМ-1, ИКО-Г-2) расщеплялись пепсином до F(ab') -фрагментов в течение 18 часов с сохранением 60% специфической активности, МКА ИК0-1 и ИК0-2, относящиеся к lgG3 мыши, расщеплялись до f(ab') з-фрагментов в течение 15 минут. Быстрое фрагментирова-ние МКА сопровождалось драматическим падением их специфической активности (Рис.8).

Продолжительное хранение при температуре 4°С или 37°С жидких и лиофилизированных препаратов МКА как в очищенной, так и в асцитной форме подтвердило намного более высокую устойчивость МКА 2а-подкласса в сравнении с МКА третьего подкласса.

Рис.8 Активность МКА различных изотипов при обработке пепсином рн 4, 3, 37"С, соотношение пепсин/белок 1:50; х -МКА ИК0-1; о - МКА ИКО-2; а - МКА ИКО-ГМ-1; Л - МКА ИКО-Г-2; - - МКА ЙКО-31; А - МКА' Анти-ПХ; о - МКА ЛТ-S .

МКА первого подкласса также были менее стабильны, чем МКА 2а-подкласса'. Наименьшую устойчивость при хранении обнаружили МКА, относящиеся к 1дм мыши, что заставило нас поставить их в ряду стабильности мышиных МКА на последнее место после третьего подкласса igG.

Для увеличения сроков хранения МКА был использован ряд стабилизирующих добавок различной природы. В среднем добавки примерно вдвое увеличивали сроки хранения МКА. Однако, ни одна из использованных добавок не обеспечила стабилизирующего действия, статистически достоверно превышающего действие других добавок, а продолжительность сроков хранения препаратов МКА во всех случаях зависела от их принадлежности к тому или иному изотипу иммуноглобулинов.

На основании полученных данных был построен ряд стабильности изотипов МКА, который выглядит следующим образом: г2а > > г 1 > г2b > гз > ц. Заметим, что указанная последовательность снижения стабильности согласуется с данными, полученными рядом

авторов с ПОМОЩЬЮ других методов (Denkers E.Y. et al., 1985; Kaminsky M.S. et al., 1986).

Таким образом, представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что стабильность препаратов МКА определяется в первую очередь их изотипом, и различия в стабильности МКА разных изотипов необходимо учитывать при разработке препаратов на основе МКА.

Одним из разработанных нами диагностических препаратов на основе МКА явился моноклональный ПАП-набор, полное название которого в соответствии с требованиями Фармкомитета звучит следующим образом: набор моноклональный для иммунодиагностиче-ских реакций с помощью моноклональных антител методом ПАП (пе-роксидаза-антипероксидаза), сухой. В основу набора вошли полученные ранее А. И. Фаерманом и А. В. Червонским (1987) МКА к перо-ксидазе корня хрена (Анти-ПХ). Набор предназначен для проведения иммуноферментных реакций ПАП-методом. с целью выявления антигенов с помощью различных МКА мышиной природы как в имму-ноцитохимических реакциях, так и в твердофазном иммунофермент-ном анализе. В состав набора вошли: преформированный ПАП-комплекс, состоящий из ПХ и МКА Анти-ПХ, поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши и нормальные сывороточные иммуноглобулины мыши, используемые в качестве отрицательного контроля взамен МКА к антигену.

При разработке ПАП-набора исследовалась зависимость интенсивности реакции от количественного соотношения ПХ и МКА Анти-ПХ в составе ПАП-комплекса, от концентрации связующих антител против иммуноглобулинов мыши, RZ ПХ и др. Было выявлено, что максимальная интенсивность иммуноферментной реакции регистрируется в ограниченном интервале концентраций ПХ в составе ПАП-комплекса и зависит от RZ пероксидазы (Рис.9). Изме-

нение концентрации МКА Анти-ПХ приводило к изменению интенсивности реакции, однако, наибольшая интенсивность обнаруживалась в том же диапазоне концентраций ПХ. В то же время диапазон концентраций ПХ, внутри которого ПАП-реакция наиболее выражена, оказался зависим от концентрации связующих анти-мышиных антител.

ПАП-комплексАЙИоо)

Рис. 9 Зависимость интенсивности ПАП-реакции

от содержания ПХ в составе ПАП-комплекса при разных ш ПХ.

Изучена стабильность компонентов ПАП-набора. Показано, что наименее устойчивым ингредиентом ПАП-набора, снижающим свою активность при хранении, является ПХ, находящаяся в составе ПАП-комплекса.

Проведенные исследования обнаружили, таким образом, сложную картину соотношений между ПХ, МКА, Анти-ПХ и связующими антителами, что было учтено при конструировании ПАП-набора и при разработке технологии его производства. В результате нами

был разработан новый иммунодиагностический препарат - ПАП-на-бор моноклональный, ВФС 42-193ВС-88, и с учетом результатов, полученных при разработке методов получения и очистки МКА была создана, технология его производства ( регламент производства N 146-88).

ПАП-набор был использован нами для выявления взаимодействия различных МКА как с растворимыми антигенами, так и с антигенами поверхности клеток человека. В качестве растворимых антигенов были использованы нвэ-антиген и иммуноглобулины человека. Было продемонстрировано, что МКА ЖАК-22 против НВб-антигена в ПАП-методе выявляют данный антиген с той же чувствительностью, что и коммерческий иммуноферментный диагности-кум для выявления нвэ-антигена (1-2,5 нг/мл). ПАП-метод с применением моноклонального ПАП-набора и МКА ИКО-ЗО, ЙК0-Э7, ИКСЫ 06, ИКО-107 также был эффективен для определения различных цепей иммуноглобулинов человека как в обычных иммунофер-ментных реакциях, так и в иммуноблоттинге.

Для сокращения времени проведения реакции были отработаны варианты "ускоренной" постановки ПАП-реакции. Оптимизировано количественное соотношение ПАП-комплекса и связующих антител при постановке "ускоренных" вариантов реакции, заключающихся в одновременном внесении в реакционную смесь МКА к антигену и компонентов ПАП-набора. Показано, что чувствительность реакции при этом сохраняется на прежнем уровне при несомненной экономии времени на постановку реакции (Рис.10).

На примере ряда МКА серии ИКО совместно с В. В. Починко продемонстрирована, применимость ПАП-набора для выявления клеточных антигенов на криостаткых срезах лимфоузлов и тканей доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы. С помощью предложенного метода постановки ПАП-реакции иссле-

Рис.10 Зависимость интенсивности ПАП-реакции от концентрации нвз-антигена при использовании промышленного диагностикума (о); ПАП-набора и МКА 1АК-22 в варианте I (Д); в варианте ii (□); в варианте iii Ы.

дована экспрессия ньа-го антигена, ста, сб4, сое, соив, со22 антигенов. Показано преобладание количества со8+-клеток над С04^-клетками в периферическом инфильтрате злокачественных опухолей. При доброкачественных опухолях наблюдалась обратная картина, характеризующаяся преобладанием в инфильтратах со4+-клеток, выявляемых с помощью МКА ИК0-86, над спв+-клетками, определяемых МКА ИКО-31.

ПАП-метод был применен также для иммунофенотипирования мононуклеарных клеток периферической крови. Яри использовании ЫКА ИК0-1, ИК0-12, ИКО-31, ИКО-53, ИК0-90 полученные результаты статистически не отличались от результатов иммунофенотипирования клеток, полученных в параллельных опытах в реакции

непрямой иммунофлуоресценции. Это свидетельствует о применимости разработанного нами ПАП-набора для оценки состояния клеточного иммунитета и для иммунодиагностики гемобластозов с помощью МКА против антигенов поверхности клеток.

Разработанные методы поддержания гибридом, наработки МКА, очистки МКА, результаты оценки стабильности препаратов МКА легли в основу единой технологии производственного получения ряда препаратов МКА против дифференцировочных антигенов поверхности клеток иммунной системы, предназначенных для оценки состояния клеточного иммунитета и иммунодиагностики лейкозов.

В перечень препаратов МКА, утвержденных Фармкомитетом в качестве медицинских диагностических препаратов и выпускаемых по единой технологии (регламенты производства N 59 от 25.05.87-и N 324-91) вошли следующие МКА:

1. Антитела моноклональные ИКО-1 для выявления hla-dr антигенов, сухие. ВФС 42-113ВС-87; ФС 42-367ВС-91. Предназначены для оценки состояния клеточного иммунитета и иммунодиагностики лейкозов, в частности для определения количества активированных Т-клеток и антиген-положительных моноцитов и B-лимфоцитов. Кроме того, МКА ИКО-1 выявляют ia-подобный под-вариант острого лимфолейкоза (Барышников А. Ю. и др., 1989).

2. Антитела моноклональные ИКО-ГМ-1 для выявления CDiib антигена, сухие. ВФС 42-112ВС-87, ФС 42-366ВС-91. Выявляют антиген, экспрессирующийся на полиморфноядерных нейтрофилах, моноцитах, части Т-клеток, на нк-клетках. Предназначены для дифференциальной диагностики иммунологических подвариантов лейкозов и оценки состояния клеточного иммунитета.

3. Антитела моноклональные ИКО-Г-2 для выявления CD15 антигена, сухие. ВФС 42-114ВС-87, ФС 42-ЗБ8ВС-91. В крови здоровых лиц выявляют антигеи, экспрессирующийся на полиморф-

ноядерных нейтрофилах и на части моноцитов. Предназначены для дифференциальной диагностики гемобластозов.

4. Антитела моноклоиальные ИКСЫ2 для выявления С022 антигена, сухие. ВФС 42-293ВС-91. Предназначены для иммунодиагностики лейкозов и оценки В-клеточного звена иммунитета. Обнаруживают мембранный антиген, характерный для зрелых В-лимфоцитов.

5. Антитела моноклоиальные ИК0-90 для выявления соз антигена, сухие. ВФС 42-294ВС-91. Предназначены для оценки состояния клеточного иммунитета и иммунодиагностики лейкозов. В периферической крови здоровых лиц выявляют зрелые Т-лимфоциты.

6. Антитела моноклоиальные ИК0-86 для выявления С04 антигена человека, сухие. ВФС 42-296ВС-91. Предназначены для количественной оценки состояния Т-клеточного звена иммунитета, выявляют в крови здоровых лиц с04+-клетки, характерные для Т-хелперов/индукторов.

7. Антитела моноклоиальные ИКО-31 для выявления СИ8 антигена человека, сухие. ВФС 42-295ВС-91. Выявляют антиген Т-лимфоцитов, характерный в основном для супрессорных и цито-токсических клеток. Предназначены для количественной оценки Т-клеточного звена иммунитета.

Все препараты представляют собой лиофилизированные в присутствии бычьего сывороточного альбумина антитела в неочищенной или очищенной с помощью стафилококкового белка А форме. Препараты предназначены для реакции непрямой иммунофлуо-ресценции или иммунопероксидазного метода.

Диагностические препараты МКА серии ИКО были использованы для оценки состояния местного иммунитета у больных опухолями молочной железы. В совместных исследованиях с 0. В. Милови-довой МКА серии ИКО были использованы для оценки состояния

иммунитета у новорожденных. Обнаружена тенденция к нормализации соотношения со4+/со8+-клеток в крови недоношенных новорожденных при их лечении внутривенным иммуноглобулином. В совместных исследованиях с К. М. Перфиловой МКА серии ИКО использовали также для изучения состояния клеточного иммунитета у больных острыми вирусными гепатитами. Показано достоверное снижение количества ИК0-90+ и ИК0-86+ клеток в периферической крови больных гепатитами А и В.

Таким образом, в результате проведенной работы была.разработана технология производства диагностических препаратов МКА для выявления различных антигенов клеток иммунной системы, оформлена и утверждена нормативно-техническая документация на производство 7 диагностических препаратов, утверждены фармакопейные статьи и показана применимость разработанных препаратов МКА для иммунофенотипирования клеток иммунной системы при различных заболеваниях инфекционной и неинфекционной этиологии.

ВЫВОДЫ

1. Определена специфичность группы МКА серии ИКО, направленных против различных цепей иммуноглобулинов человека. Показано, что МКА ИК0-30 направлены против мв-цепи иммуноглобулинов М, МКА ИКО-97 направлены против г (аЬ') 2-фрагмента гамма-цепи иммуноглобулинов в, а МКА-106 и ИК0-107 направлены против легких цепей иммуноглобулинов человека, выявляя лямбда и каппа-иепи, соответственно.

2. Продемонстрировано, что МКА ИК0-1, ИК0-2 и ИК0-8 направлены у человека против мономорфной части Н1А-ок. антигенов, а МКА ИК0-15.5 взаимодействуют с антигенами II класса ньа, не относящимися к ньд-ои антигенам.

3. Обнаружено, что МКА ИК0-1, ИК0-2 и ИК0-8 реагируют с

клетками лабораторных мышей и крыс, а также с клетками других животных, выявляя антигены II класса главного комплекса гис-тосовместимости. Продемонстрирована применимость МКА ИКО-1 для радиоиммунолокализации опухолей у лабораторных мышей в экспериментальных условиях.

4. Установлено, что МКА ИК0-109 и ИКО-112 направлены против мономорфной части антигенов и класса главного комплекса гистосовместимости лабораторных крыс.

5. Проведена характеристика специфичности МКА ИКО-1Б6. Показано, что данные МКА направлены против CD4 5RA антигена человека.

6. Выявлено, что МКА ИК0-10 направлены против видонеспе-цифического Thy-i антигена и взаимодействуют с антиген-положительными клетками человека, лабораторных мышей, крыс и ряда других животных. Обнаружено нарастание Thy-1-положитель-ных клеток в крови крупного рогатого скота при развитии лейкоза. Показано, что у человека МКА ИКО-10 позволяют определить ограниченные этапы дифференцировки клеток в пределах Т-клеточного и В-клеточного ряда.

7. На основе МКА к пероксидазе хрена разработан монокло-нальный ПАП-набор (пероксидаза-антипероксидаза), предназначенный для проявления иммунопероксидазным методом реакции различных МКА как с растворимыми антигенами, так и с антигенами поверхности клеток.

8. Предложены эффективные методы культивирования гибридом и наработки МКА in vitro и в асцитной форме с использоа-нием линейных и беспородных мышей. Предложен метод очистки МКА с помощью отечественного стафилококкового реагента, содержащего белок А. Показана зависимость стабильности МКА от изотипа МКА.

9. Разработана единая технология производства диагностических препаратов МКА для выявления поверхностных антигенов клеток иммунной системы. В соответствии с разработанной технологией получено 7 диагностических препаратов МКА серии ИКО, предназначенных для оценки состояния клеточного иммунитета и иммунодиагностики лейкозов.

Список работ, опубликованных по теме диссертационной

работы

1. Новиков В.В., Трофимова М. Н. Очистка моноклональных антител ИКО-1 с помощью белок А - сефарозы // В кн.: Хроматография в биологии и медицине: Тез. докл. 1 Всес,конф. - М. -1983. - С. 65-66,

2. Барышников А.Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе 3.Г., Новиков В. В., Трофимова М. Н., Ледян К. М., Соколов А. В., Тупицын Н. Н., Морозова Л. Ф. , Крыжанов М. А. , Агафонов В. А. Монокло-нальные антитела ЖО-1 против константной части 1а-подобных (ог) антигенов // Эксперим. онкология. - 1984. -и 6.-С. 44-46.

3. Трофимова М.Н. , Новиков В. В., Полянская Г.А., Сандова 0. М. Эффект действия неполного адъюванта Фрейнда при пассировании В-гибридомы ИК0-1 на мышах // В кн.: Новое в практике лабораторных исследований. - Горький, 1984. - С. 76-80.

4. Новиков В. В., Трофимова М.Н., Андреев А.В., Сандова 0. М. Использование хроматографических методов для очистки моноклональных антител // В кн.: Новые биотехнологические процессы и биопрепараты. - Горький, 1985. - С.70-75.

5. Новиков В.В., Трофимова М. Н., Сандова 0. М., Комарова 0. Б. Связь изотипа моноклональных антител с их стабильностью // В кн.: Новые направления в биотехнологии: Тез. докл. Всес. конф. - Пущи но на Оке, 1986. - С. 56-56.

6. Анохин 0. Н., Петрова Г. А., Ендолов В. В., Норец Т. А., Трофимова М. Н., Новиков В. В. Экспериментальное обоснование возможности использования меченых моноклональных антител ИК0-1 для радиоиммунолокализации опухолей // В кн.: 4 Международный симпозиум стран-членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам для радиоиммуннологического анализа: Тез. докл. - Обнинск, 1986. - С. 144-145.

7. Новиков В.В., Трофимова М.Н., Андреев А.В., Дубинкин И. В. Определение моноклональных антител в культуралыюй жидкости иммуноферментным методом // В кн.: Биохимия и биофизика микроорганизмов. - Горький, 1985. - С. 37-42.

8. Барышников А. Ю., Дубинкин И. В., Савельева Е. В. , Кры-жанов М. А. , Тупицнн Н. Н., Короткова 0. В., Соколов А. В., Новиков В. В., Кадагидзе 3. Г. Моноклональные антитела против человеческого лимфоцитарного функционально-ассоциированного антигена У/ Иммунология. - 1987. - N 5. - С. 78-81.

9. Новиков В.В. , Трофимова М; Н., Крыжанов М.А., Барышников А. Ю. Иммунодиагностические препараты на основе моноклональных антител к поверхностным антигенам клеток крови человека // В кн.: Актуальные вопросы биотехнологии: Тез. Всес. конф. - М. : 1987. - С. 105-107.

10. Фаерман А.И., Червонский A.B., Новиков В.В., Чипыше-ва Т. А.Гельштейн В. И., Коляда А. Ю. Моноклональные антитела к пероксидазе хрена: использование в твердофазном иммунофер-ментном анализе, иммуногистохимии, иммуноблоттинге и иммуно-схрининге библиотек кДНК // В кн.: Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы: Тез. докл. -Пущино на Оке, 1987. - С. 56-56.

11. Новиков В.В., Трофимова М. Н., Андреев A.B., Сандова 0. М. Очистка моноклональных антител с помощью стафилококково-

го реагента, содержащего белок А // Лабораторное дело. 1987. - N 6. - С. 605-610.

12. Новиков В.В., Андреев А. В., Червонский А.В. , Фаерман А. И. Анализ соотношения компонентов, необходимых для проведения иммуноферментных реакций с помощью моноклопальных антител методом ПАП // В кн.: Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький, 1987. - С. 42-48.

13. Барышников А. Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе 3.Г., Тупи-цын Н. Н., Соколов А. В., Ледян К. М., Савельева Е. В., Короткова 0. В. , Новиков В. В. , Сандова 0. М., Крыжанов М. А., Мерсон А. Г., Карминская М. Н., Гипш Н. М,, Митерев Ю. Г., Булычева Т. И. Стандартизация моноклональных антител ИК0-1 против мономорфных ia-подобных (Dr) антигенов // Эксперим. онкология. - 1987. -N 6. - С. 45-48.

14. Новиков В. В. Стафилококковый реагент, содержащий белок А, как сорбент для очистки моноклональных антител // В кн.: Биоорганическая и органическая химия: Тез. докл. vn респ. конф. Часть г. // Таллинн. 1987. - С. 72-72.

15. Трофимова М. Н., Новиков В.В., Сандова 0. М., Жильцова М. А., Мартынова Т. Г. Наработка моноклональных антител в ас-цитной форме и методы очистки антител // Биотехнология. -1987. - N 6. - С. 735-737.

16. Новиков В.В., Андреев A.B., Трофимова М. Н., Моренков 0. С.' Очистка моноклональных антител с помощью традиционных методов выделения сывороточных иммуноглобулинов // В кн.: Научно-производственные проблемы повышения качества вакцинно-сывороточных препаратов. Часть I. - Ташкент, 1987.-С. 108-111.

17. Анохин К). Н., Петрова Г. А., Норец Т. А.,- Деденков А. Н., Ендолов В. В. , Трофимова М. Н. , Новиков В. В. Избирательное накопление меченных 1311 моноклональных антител ИК0-1 в ткани

мышиного лимфолейкоза Li 210 // Медицинская радиология. - 1988. -Ni. - С. 31-34.

18. Новиков В.В., Андреев A.B. Конструирование ПАП-набора на основе моноклональных антител к пероксидазе хрена // В кн.: Инженерная энзимология. Материалы vi Всес. сими, : Часть Ii JJ Вильнюс, 1988. - С. 30-30.

19. Новиков В. В. , Трофимова М. Н., Жильцова М. А. , Сандова 0. М. Сравнение действия пристана и неполного адъюванта Фрейн-да на формирование асцита у мышей-носителей гибридомных клеток // Антибиотики и химиотерапия. - 1988. N 7. - С. 530-532.

20. Барышников А. Ю., Дубинкин И. В., Савельева Е.В., Ту-пицын Н. Н., Короткова 0. В., Соколов А. В., Новиков В. В. , Када-гидзе 3.Г. Моноклокальнке антитела против A-цепи человеческого лимфоцитарного функционально-ассоциированного антигена (lfa-1) // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1988.-n 1.-С. 55-58.

21. Новиков В. В., Андреев A.B., Трофимова М.Н., Мартынова Т. Г. Разработка и возможности применения ПАП-иабора на основе моноклональных антител к пероксидазе хрена // В кн.: Современные направления создания медицинских диагностикумов.

- М. , 1988. - С. 83-84.

22. Новиков В.В., Трофимова М. Н., Сандова 0. М., Комарова 0. Б. , Мартынова Т. Г., Бирюкова JI. 3. Факторы, влияющие на стабильность диагностических препаратов моноклональных антител //В кн.: Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. - Пермь, 1988.

- С. 199-200.

23. Барышников А. Ю., Трофимова М. Н., Новиков В. В., Полянская Г. А., Сандова 0. М. , Жильцова М. А., Мартынова Т. Г. Вазелин-пептиновая смесь как стимулятор образования асцита у мышей-носителей гибридом // Журн.микрсбиол., эпидемиол., имму-

нобиол. - 1988. - ИЗ. - С. 90-93.

24. Новиков В.Б., Трофимова М.Н., Дубинкин И. В., Барышников А.Ю. Биотехнологические аспекты получения диагностических препаратов на основе моноклональных антител // В кн.: Физиология и молекулярная биология болезнетворных микроорганизмов. - Горький. - 1988. - С. 77-82.

25. Новиков В.В., Трофимова М.Н., Жильцова М. А. , Бирюкова Л. 3. Пассирование гибридом на самцах мышей линии ваьв/с // Антибиотики и химиотерапия. 1988. - N 11. - С. 836-838.

26. Новиков В. В., Трофимова М. Н., Барышников А. Ю. , Чер-вонский А. В. Моноклональные антитела к антигенам клеток иммунной системы и ПАП-набор моноклональный. Характеристика, применение // В кн.: Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии. - Тарту, 1989. - С. 227-231.

27. Короткова 0. В., Барышников А. Ю., Тупицын Н. Н., Чи-мишкян К. Л., Кострыкина В. Н., Овумян Г. !Н., Сандова 0. М., Новиков В.В. Моноклональные антитела ИКО-Ю к антигену тьу-1 // Эксперим.онкология. - 1989. к 2. - С. 33-35.

28. Новиков В. В., Сандова 0. М., Комарова 0. Б. , Мартынова Т. Г. Исследование стабильности моноклональных антител // В кн.: I Всес. иммунологический съезд. Тез. докл. Т. I. - М. , 1989. - С. 163-163.

29. , Жильцова М. А., Трофимова М. Н., Новиков В. В. Кариоло-гический анализ длительно культивируемых гибридомных клеток // 1урн. микробиол., эпидемиол. , иммунобиол. - 1989. - N 6. -С. 99-102.

30. Новиков В. В., Дубинкин И. В., Трофимова М. Н. , Комарова 0.Б., Бирюкова Л.3. Возможность использования беспородных мшей для получения моноклональных антител // Журн. микробиол. ,

эпидемиол., иммунобиол. - 1989. - n 7. - С. 81-84.

31. Новиков Б.В., Приказчикова Е.В., Мартынова Т.Г. Модификация метода ПАП (пероксидаза-антипероксидаза) // В кн.: Применение иммуноферментного анализа в медицине. Тез. докл. респ. конф. - Харьков, 1989. - С. 61-61.

32. Новиков В. В., Трофимова М.Н. , Сандова 0. М. , Комарова 0. Б. Стабильность препаратов моноклональных антител при хранении // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1989.

- n 11„ - С. 115-116.

33. Новиков В.В., Приказчикова Е.В., Бурков А.Н., Мартынова Т. Г., Зубов С. В. Определение нвз-антигена с помощью мо-ноклональных антител ПАП-методом // В кн. : Иммунология и биотехнология. - Горький, 1989. - С. 17-22.

34. Новиков В. В., Бирюкова Л. 3. ,■ Комарова 0. Б., Аврице-вич Г.В., Барышников А. Я. Моноклональные антитела для оценки клеточного иммунитета // В кн.: Экология и иммунитет. - Горький, 1990. - С. 126-127.

35. Сандова 0. М., Илларионова М. Ю., Новиков В. В. Повышенное содержание тьу-1 положительных клеток в крови больного лейкозом крупного рогатого скота //В кн. : Экология и иммунитет. - Горький, 1990. - С. 154-156.

36. Новиков В.В. , Мартынова Г. Г. Свойства и направленная регуляция изотипов моноклональных антител // В кн. : Регуляция биологических систем. - Н. Новгород, 1990. - С. 45-49.

37. _ Новиков В.В., Сандова 0. М. , Барышников А. Ю. 0 взаимодействии между моноклональными антителами серии ИК0 и клетками крови животных // Сельскохозяйственная биология. - 1991.

- n 2. - С. 126-131.

38. Починко В.В., Новиков В. В. Определение клеточных антигенов на криостатных срезах с помощью моноклональных ан-

тител ПАП-методом // В кн. : Новое в практике лабораторных исследований. - Н.Новгород, 1991. - С. 76-79.

39. Новиков В. В., Барышников А. Ю. , Фролова Е. А. , Мартынова Т. Г., Машковцева Н. В. Характеристика моноклональных антител ИКО-ЗО // В кн.: Биотехнология и генетика. - Н. Новгород, 1391. - С. 83-87.

40. Ермолина Г. Б., Мартынова Т. Г., Новиков В. В., .Дегтева Г. К. Реагент для выделения иммуноглобулинов класса g // В кн.: Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. Часть 2. -Томск, 1991. - С. 58-59.

41. Новиков В. В., Илларионова Л.3., Буадзе 0.П. Использование коллагеновых микроносителей для культивирования гибридом // Тез. докл. I съезда иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - С. 337-338.

42. Новиков В. В., Бирюкова J1.3. , Буадзе 0. П., Мостовая В. Ю., Егоров Б. Б. Способ культивирования гибридных клеток мыши // Авт. свидетельство n 1794950 от 18 октября 1992 г.

43. Еочинко В. В., Новиков В.В. Использование ПАП-метода для определения клеточных антигенов на криостатных срезах с помощью моноклональных антител серии ИКО // Клин. лаб. диагностика. - 1993. - N 4. - С. 59-62.

44. Фролова Е. А. , Барышников А. Ю., Новиков В.В., Сыркин А. Б. Монооональные антитела ИК0-16Б против антигена CD45RA // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1993. - N 7. - С. 63-66.

45. Новиков В. В. , Барышников А. Ю., Перфилова К..М., Травина Н. М. , Починко В. В., Миловидова 0. В. Клинический набор моноклональных антител для определения клеточного иммунитета // Тез. докл. Межд. симп. по аллергологии и клинической иммунологии. - Алма-Ата, 1993. - Т. 2. - С. 228-228.