Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование специфичности и идиотипический анализ аллоантител к продуктам главного комплекса гистосовместимости крыс

Министерство здравоохранения РСФСР 2-ой Московский государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова

На правах рукописи

УДК 612.118.221.2.019.083.3 6.089.67.017.1.33

ГОРОХОВЕЦ Неонила Васильевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ И ИДИОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АЛЛОАНТИТЕЛ К ПРОДУКТАМ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ КРЫС

(14.00.36 — аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории иммунологии Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов Министерства медицинской промышленности СССР.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук В. Л. Юрин.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В. Г. Нестеренко; доктор биологических наук И. Н. Головастиков.

Ведущая организация: НИИ иммунологии Минздрава СССР.

Защита состоится «_»_ 1991 г. в 14 часов

на заседании специализированного ученого совета К-084.14.06 ■при 2-м Московском ордена Ленина государственном медицинском институте им. Н. И. Пирогова по адресу: г. Москва, ул. Островитянова, дом. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го Московского ордена Ленина медицинского института имени Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан «_»_1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук,

доцент Т. Е. Кузнецова

„"-remsir . -л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:ертаци!*| ]

"Актуальность проблемы. В основе физиологической регуляции им-унного ответа лежат, согласно теории сетей Ерне, идиотип-антииди-типические взаимодействия. В ряде экспериментальных работ Hiernaux et al, 1981;Rubinstein et al,1982) получены результаты, оказывающие влияние идиотипов антител на формирование репертуара лимфоцитов как до контакта с антигеном, так и в ходе иммунного твета. Доказательства функционального значения идтотипических вза-модействий были получены в опытах по индукции гуморального Uytdehaag et al,1985) и клеточного CErtl et al,1984;Sher et al, 972;Zoller et al,1986) ответа в отсутствие антигена при введении нтиидиотипических антител или антиидиотипической В клеточной инии (Bitoh et al, 1990).. Показано участие Id-анти-И взаимодейс-вия в активации клеточных клонов, реактивных к собственным анти-энам (Zanetti et al,1983), что может являться одним из механизмов эзникновения аутоиммунных заболеваний.

Для каждой конкретной экспериментальной модели иммунного от-;та идиотипические свойства генерируемых антител являются одной з важнейших характеристик, которая не только отражает разнообра-ie антител и вероятный механизм его формирования, но и открывает эзможность избирательной регуляции иммунного ответа антиидиотипи-?скими антителами.

В настоящее время разработан ряд ставших уже классическими даотипических систем, демонстрирующих экспрессию доминантного шотипа при ответе на такие экзоантигены, как соединения арсоната Згееп et al,1982), синтетические полипептиды (Ju et al,1979;Theze ; al,1978) фосфорилхолин (Potter et al,1970), декстран (Hansburg ; al,1977; Kennedy et al,1984) и другие.Получены также данные о ишчии общих (IdX) идиотипических маркеров на антиаллотипических нителах человека (Feizi et al,1974), кролика (Gilman-Sachs et .,1980; Gilman-Sachs et al,1982; Nfetzger et al,1982), мыши (Bona et .,1980), и крысы (Юрин и др. ,1981) и возможном их участии в идиотической регуляции экспрессии аллотипа.

Особый интерес представляет идиотипический анализ антительно-| ответа на антигены главного комплекса гистосовместимости НС), поскольку последние характеризуются уникальными свойствами, тачающими их от других экзо- и эндоантигенов (Брондз,1987). Во-рвых, они универсальны, т. е. экепресеируюгся на клетках почти

- s -

всех органов и тканей индивидуума. Во-вторых, они отличаются крайне высоким полиморфизмом внутри вида (Duncan et al,1980;Klein et al,1981). В-третьих, обладают уникальной способностью вызывать первичный пролиферативный ответ нормальных лимфоцитов in vitro, причем доля пролиферирующих на каждый конкретный МНС гаплотип непропорционально велика (Singal et al,1980; Zeijlemaker et al,1981) и во много раз превышает частоту Т лимфоцитов, реагирующих на другие (не МНС) антигены (Nilsson et al, 1978;Wagner et al,1981).

Благодаря перечисленным свойствам гликопротеины гистосовмес-тимости играют исключительно важную роль в основных иммунных реакциях и процессах: реакция трансплантационного иммунитета (аллорас-познавание), формирование репертуара специфичности Т клеток (феномен адаптивной дифференцировки) и через систему "network" - репертуара В клеток, феномен МНС рестрикции (сингенное распознавание), уровень иммунных реакций ( отвечаемость) на различные антигены.

Таким образом, проблемы иммунологического распознавания антигенов гистосовместимости, его отличительные черты определяют актуальность нашей работы. Обвдй подход к решению этой проблемы заключается в исследовании идиотипических структур в составе активных центров аллоантител, распознающих гликопротеины гистосовместимости. Этот подход позволяет оценить разнообразие антител, участие наследуемых генетических элементов ("germline" генов иммуноглобулинов) , а также влияние соматических мутаций на репертуар аллоантител. В ряде случаев этот подход позволяет анализировать распознающие рецепторы Т и В лимфоцитов.

Цель работы. Данная работа посвящена исследованию особенностей гуморального ответа на антигены главного локуса гистосовместимости 11 класса.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

- исследование специфичности аллоантисывороток к различным классам антигенов гистосовместимости крыс;

- разработка комплекса методов выделения RT-1 гликопротеинов крыс, приготовление RT-1 антиген-сорбентов и получение очищенных поликлональных аллоантител;

- получение антиидиотипических сывороток и проведение идиоти-пического анализа поликлональных анти-RT-l аллоантител от индиви-

дуальных животных;

- получение и исследование тонкой специфичности моноклональ-ных анти-RT-lB антител;

- сравнительный идиотипический анализ поли- и моноклональных анти-RT-lB антител с помощью выделенных на поликлональных аллоан-тителах ксеногенных антиидиотипических антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. Инструментом в исследовании идиотипических детерминант активных центров аллоан-тител служат антиидиотипические антитела. В ряде работ для получения анти-Id антител использовали моноклональные аллоантитела (Bluestone et al, 1986; Devaux et al,1982;Henmi et al,1985). Этот подход является удобным и продуктивным, однако моноклональность аллоантител, используемых для иммунизации, затрудняет получение антиидиотипических сывороток, способных различать широкий спектр аллоантител. Вторым известным способом получения антиидиотипических сывороток является иммунизация толерантных к мышиному иммуноглобулину кроликов Ig фракцией аллоантисывороток мышей (Rubin et al, 1978). Этот способ менее продуктивен, кроме того, создает некоторую неопределенность и трудность в интерпритации результатов, связанную с гетерогенным составом и малой долей аллоантител в Ig фракции аллоантисыворотки, используемой для ксеноиммунизации. В исследовании с использованием чистых поликлональных аллоантител, выделенных аффинно из объединенной иммунной сыворотки от нескольких десятков животных (McKearn et al,1974), не были учтены индивидуальные особенности ответа на антигены гистосовместимости, что не позволило получить однозначный- результат.

Новизна наших исследований заключается в следующем: 1) впервые для получения антиидиотипических сывороток были использованы аффинно выделенные поликлональные аллоантитела от индивидуальных животных; 2) впервые проведен сравнительный идиотипический анализ поли- и моноклональных аллоантител против RT-1B гликопротеинов гистосовместимости. Для проведения этих экспериментов потребовалось решить ряд дополнительных задач по выделению и очистке МНС-антиге-ков и приготовлению аллоантиген-сорбента. Приоритетным является основной вывод, вытекающий из результатов исследования, указывающих га кардинальное отличие антител^ного ответа на МНС-антигены от гу-

- 4 -

морального ответа на другие чужеродные антигены.

Практическая значимость работы определяется комплексом методов очистки гликопротеинов гистосовместимости, позволяющих выделить чистые поликлональные аллоантитела. Последние в совокупности I моноклональными аплоантителами и чистыми молекулами гликопротеина ЯТ-1В являются ценными инструментами в исследованиях механизмов ТВ клеточного взаимодействия, активации аллореактивных Т клеток, в создании искуственных клеточных структур. Основной вывод настоящей работы о чрезвычайно широком спектре аллоантител и невозможности ] связи с этим получения антител к общему идиотипу аллоантител таю» имеет практический аспект, так как исключает возможность применения антшдиотшшческих антител в качестве универсального протектора аллотрансплантата. Уникальность репертуаров идиотипов аллоантител, различающихся даже у особей одной инбредной линии, приводит ^ необходимости индивидуального подхода при решении проблемы трансплантационного иммунитета, то есть создания, возможно, также уникального набора антиидиотипических антител.

^

Апробация результатов и публикации. Апробация результатов состоялась на семинаре отдела биотехнологии "ВНИИгенетика" Минмед-биопрома СССР. Результаты работы были представлены на конференции "Генетика и биохимия микроорганизмов" (Москва, 1986), на Первом всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи,1989). Основные материалы диссертации изложены в 5 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав изложения собственных результатов и их обсуддения, заключения, 7 выводов и списка литературы из 174 наименований (из них 7 источников отечественных и 167 - инстранных авторов). Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 4 таблицы.

Список сокращений. МНС - главный комплекс антигенов гистосовместимости; И1-! - главный комплекс антигенов гистосовмести-

ости крыс; МкАТ - моноклональные антитела; ПкАТ - поликлональные нтитела; Ig - иммуноглобулин; IdX - общий идиотип; IdI - частный диотип; БСА - бычий сывороточный альбумин; КРО - метод клеточно-о радиоиммунологического определения; ПВХ - поливинилхлоридные ланшеты; ДОХ - дезоксихолат натрия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Животные. В работе использовали крыс инбредных линий August

RT-1C гаплотип) и WAG (RT-1U гаплотип) из питомника АМН СССР

Столбовая" и крыс линии Fisher (RT-1* гаплотип) из ВОНЦ АМН ССР. Поддержание инбредной линии крыс MSU, а также межлинейные крещивания для выведения гибридных животных проводили в виварии МЧ АМН СССР. Для получения гибридом использоеэли мышей линии ¡ALB/c в возрасте 2-4 месяца. Б работе использовали также кроликов ороды "Шиншилла".

Аллоант ис ыв о рот ки. Аллоант ис ив о рот ки, направленные к антиге-[ам гистосовместимости крыс, были получены перекрестной иммуниза-[ией крыс инбредных линий August, VAG и Fisher, а также иммунизацией гибридов August xM3U) клетками VAG по видоизмененной схеме

!ason и Gálico (Mason et al, 1978). Сыворотку получали через 7-10

[ней после 2,3,4 и 5 иммунизация, инактивировали 30 мин., при 56° С

[ хранили при -20° С. Асцит генерировали у иммунных крыс August :месью полного адъюванта фрейнда и буферного раствора в соотноше-[ии 9:1.

Получение антиидиотипических сывороток и антисывороток против g крысы. Антиидиотипические сьшоротки получали путем иммунизации роликов аффинно выделенными аллоантителами крыс. На одну иммунй->ацию использовали 80-100 мкг белка в объеме 2 мл с полным адъю-)антом Фрейнда (соотношение 1:1). Сыворотки получали на 7-11 день юсле второй иммунизации.

Для получения антисывороток к Ig крысы кроликов иммунизирова-и по аналогичной схеме иммуноглобулином крысы. На одну иммунизацию юпользовали 1-3 мг белка Ig фракции нормальной сыворотки крысы.

Иодирование белков. Б работе использованы препараты антител,

норм. Ig и RT-1 гликопротеины, меченные Радиоиодирование белков проводили с помощью хлорамина Т (Hunter,1967).

Клеточное радиоиммунологическое определение. Для тестирован! аллоантисывороток применяли метод клеточного радиоиммунологическс го определения (КРО) с использованием планшетов с круглодонными лунками (Longenecker et al,1978), а также ПВХ планшетов с фиксирс ванными глутаровш альдегидом лимфацигарными монослоями.

Цитотоксический тест. Постановку цитотоксического теста проводили по способу ¿лльсона и Бигзелла (Nilsson et al,1978) с некс торыми модификациями.

Иодирование поверхностных белков и лизис лимфоцитов. В работ применяли лактопероксидазный метод иодирования поверхностных белков клеток (Emerson et al,1979;Marchalonis et al,1972), модифицированный для иодирования лимфоцитов. Лизиз лимфоцитов проводили с помощью неионного детергента NP-40.

Анализ радиоиодированных белков поверхности лимфоцитов. Для выделения отдельных видов молекул белков поверхности лимфоцитов и смеси (лизата) использовали метод непрямой иммунопреципитации. При этом в одном случае в качестве первых антител использовали кроличьи антитела к Ig крыс (контролем служила нормальная сыворотка кролика), в другом случае - аллоантисыворотки (контроль - нормаль ная сыворотка крысы). Вторым компонентом реакции преципитации в первом случае была ослиная иммунная сыворотка против Ig кролика, во втором случае - кроличьи антитела против Ig крысы. Количество добавляемого второго компанента определяли пробным титрованием. После инкубации и осаждения образовавшиеся осадки отмывали, а су-пернатанты вновь подвергали иммунопреципитации. Первым компонентом реакции была аллоантисыворотка, вторым компонентом - кроличьи антитела против Ig крыс.

1PS

Мэченные I поверхностные белки лимфоцитов, выделенные методом иммунопреципитации, анализировали с помощью электрофореза в

(лиакриламидном геле о додецилсульфатом натрия (Ьаешт11 et а1, 170).

Получение иммуносорбентов. Иммуносорбенты готовили путем фик-1ции антигенов (антиген-сорбенты) или антител (антительные сор-■нты) на мелких частицах аминоцеллюлозы или активированной сефа->зы. Аминоцеллюлозу готовили по методу (Гурвич и др. ,1981), [азотировали и конъюгировали с белком. Сефарозу 4В активировали с »мощью ВгСИ в ацетонитриле и также конъюгировали с белком.

Радиоиммуноадсорбция и торможение радиоиммуноадсорбции. Метод 1ДИОиммуноадсорбции заключается в специфическом связывании мечен-1

>го I материала с иммуносорбентом. В работе использовали три :новные системы радиоиммуноадсорбции. Первая система - связывание 1

генных I крысиных аллоантител с антиидиотипическими иммунны-[ сорбентами (антиидиотипические кроличьи антитела, иммобилизо-дные на аминоцеллюлозе). Вторая система - связывание меченных

• с:

I кроличьих антиидиотипических антител с аллоантительными им-гнными сорбентами (крысиные аллоантитела, иммобилизованные на •СМ-активированной сефарозе). Третья система - связывание мечен-1 ря

гх I кроличьих антител против крысы с антиген-сорбентом (¡ё >ысы, иммобилизованный на аминоцеллюлозе).

Реакция торможения радиоиммуноадсорбции (во второй системе)

1 Р1!

шючается в том, что свягывание меченных I аллоантител с ан-шдиотипичеекими иммунными сорбентами ингибироьали добавлением •меченых гомологичных -аллоантител. В качестве ингибиторов исполь->вали крысиные иммунные асциты от индивидуальных животных. По сте-•ни ингибиции определяли содержание аллоантител определенного 1Иотипа.

Еыделение антител. Антитела выделяли методом аффинной хрома-»графии из фракций иммунных сывороток или асцитов. Сульфатные ¡акции получали двукратным осаждением белков 18% и 14% раствором Фнокислого натрия. Крысиные аллоантитиела выделяли на ИМ мате-[але, иммобилизованном на сефарозе. Кроличьи антитела против >ысы выделяли на соответствующем антиген-сорбенте. Иммуносорбентом гя выделения антиидиотипических антител служила сефароза с иммо-

билизованной Ig фракцией соответствующего иммунного асцита крыс.

Получение моноклональных антител. Гибридома 4W, продуцирующая МкАТ к мономорфной детерминанте RT-1B молекул, получена путем слияния мышиных миеломных клеток X63Ag. 653 и клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных частично очищенным препаратом RT-1U гликопротеинов. Гибридомы, продуцирующие моноклональные аллоантите-ла получили в результате межвидовой гибридизации клеток мышиной миеломы ХбЗА^З. 653 с клетками селезенки крыс линии August, иммунизированных спленоцитами WAG. Слияние клеток проводили по (Köhler et al,1975) с использованием полиэтиленгликоля 4000 .Для культивирования клеток использовали среду Игла в модификации Дальбекко (Flow, Англия) содержащую следующие компоненты: раствор пенициллина (50 ЕД/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл), 10 мкг/мл тилозина, 2 мМ пирувата натрия, 4 мМ L-глутамина, витамины, 10 % инактивиро-ванной эмбриональной сыворотки теленка. Использовали селективную культуральную среду, содержащую гипоксантин (100 мкЮ, аминоптерга (0,4 мкМ) и тимидин (16мкМ). Скринирование супернатантов первичны: гибридбмных культур и клонов проводили методом клеточного радиоиммунологического определения. Первичные культуры, которые -по данным скрининга продуцировали специфические антитела, клонировали методом лимитирующих разведений.

Определение экспрессии "IgX"7£l4 идиотипа на моно- и поликло-нальных аплоантителах. Экспрессию "IdX"7214 идиотипа определяли

1 95

путем прямого связывания меченных Х анти-"1с1Х"7214 антител с моно- и поликлональными антителами, выделенными из супернатантов гибридом на кроличьих антителах против Ig крысы. Последние были адсорбированы на ПВХ планшетах.

Определение перекрестной специфичности поли- и моноклональньго аллоантител. Перекрестную специфичность поли- и моноклональных ал-лоантител определяли по способности МкАТ ингибировать связывание

меченных поликлональныых аллоантител с молекулами RT-1BU гли-копротеина, адсорбированными на ПВХ планшетах.

Определение перекрестной специфичности анти-RT-lB11 МкАТ F5E5 и "IdX"7214-негативных поликлональных аллоантител проводили выше

зписанным' способом, предварительно удалив " idX"7214-позитивные ан-

rH-RT-lBu,Du антитела из меченного 1251 препарата поликлональных 1нтител путем адсорбции на анти-"МХ"7214 антителах.

Определение перекрестной специфичности МкАТ F5E5 и "IdX"7214-

юзитивных поликлональных анти-РТ-1Ви,0и антител проводили следую-цим образом. Анти-" IdX"7214 антитела адсорбировали на ГШХ планшетах. На них селектировали "IdX''-позитивные поликлональные аллоанти-

гела. Затем добавляли смесь меченного RT-1BU гликопротеина и

:упернатанта, содержащего-анти-К:Т-1Ви МкАТ F5E5 или анти-Igk-lb {кАТ 3.53 (негативный контроль). Контролем к акти"1с(Х"7'214 антите-1ам служили адсорбированные на ПВХ планшетах анти-"1с!Х"822 антите-

ia, выявляющие идиотипические детерминанты на анти-RT-l^ антителах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и анализ аллоантисывороток к продуктам главного гомплекса гистосовместимости крыс.

Антигены гистосовместимости представляют собой довольно гете-югбнную группу гликопротеинов поверхности клеток. В качестве антигена этот комплекс белков обладает очень высокой иммуногенностыо. >сновой серологических исследований природы антигенов гистосовмес-■имости является получение антисьгвороток, направленных к продуктам як всего комплекса, так и его районов. В нашей работе применялся радиционный способ получения антисывороток к антигенам гистоеов-гестимости, который заключается в использовании аллогенных клеток

качестве антигена. Крысы инбредных линий August (R7-Iе гаплотип),

'AG (RT-1U гаплотил) и Fisher (RT-11 гаплотип) подвергались перекрестной гипериммунизации, так как пересадка кожного трансплантата очеталась с введением суспензии селезеночных клеток.

С помощью чувствительного метода клеточного радиоиммунологи-еского определения с использованием в качестве клеток-мишеней лмфоцитов и эритроцитов, а также комплементзависимого цитотокси-еского теста было показано, что антитела, содержащиеся в аллоан-исыворотках делятся по специфичности на два вида. Аллоантисыворот-и WAG анти-August, WAG анти-Flsher, Fisher анти-WAG, Fisher нти-August, August анти-Fisher содержат антитела как к классически (RT-1A) антигенам гистосовместимости, экспрессируемым на эрит-

Ь*-5Э9

роцитах (рис. 1А) и лимфоцитах, так и к 1а белкам (RT-1B.D), прел тавленным на В лимфоцитах (рис. 2А, рис. 3). Адсорбция аллоантисывс роток на гетерологичных эритроцитах позволяет отделить вторые антитела от первых.

С помощью перечисленных выше методов обнаружен иммуноспеци^ ческий дефект крыс линии August в способности к образованию анп тел к RT-1A антигенам VAG (рис. 1С,ID): в сыворотках August ан-ти-WAG обнаруживаются антитела только к антигенам гистосовмести-мости II класса WAG (рис.2В,рис. 3), что делает их удобным источи ком антител к 1а белкам. Этот дефект компенсируется у F^AugustxMSU) гибридных животных (рис. 1В) и связан, по-видимому

с отсутствием соответствующего 1г гена/генов.

Как уже отмечалось, использование антител является непреме} ным условием специфического извлечения аллоантигенов из сложной смеси клеточных молекул и оценки качества их выделения. С другой стороны, уже известные биохимические характеристики молекул гист совместимости (четвертичная структура, молекулярные массы субъе; ниц) позволяют оценить специфичность самих аллоантисывороток. В f шей работе мы также сделали попытку охарактеризовать размеры субъединиц антигенов гистосовместимости (по электрофоретической подвижности в 10%. полиакриламидном геле, содержащем додецилсуль>; натрия), выделяемых с помощью аллоантител. С этой целью проводилс маркирование белков поверхности лимфоцитов крыс August методом лактопероксидазного радиоиодирования. VAG анти-August аллоантисьи ротка специфически преципитирует три полипептидных цепи с ориент ровочными мол. весами 45 kDa, 33 kDa и 27 kDa (рис. 4А), что соответствует классическому трансплантационному антигену (RT-1A), альфа- и бета-цепям 1а белков (RT-1B) главного комплекса гистосовместимости крыс. August анти-WAG антитела специфически выявл! исключительно альфа- и бета-цепи RT-1B гликопротеинов (рис. 4Б).

2. Выделение RT-1 антигенов гистосовместимости

Антигены главного комплекса гистосовместимости представляю] собой полиморфную систему белковых антигенов поверхности лимфои; ных клеток, выделение которых требует значительных усилий. В напк работе при участии м. н. с. Бобреневой Р. А. разработан комплекс ме; дов на основе ряда работ (Hyman et al,1972;Letarte-Muirheed et

logg разведения сывороток logg разведения сывороток

logg разведения сывороток logg разведения сывороток

Рие.1 Представлены кривые титрования методом клеточного радиоиммунологического определения (КРО) сывороток индивидуальных животных. А - результаты титрования аллоантисывороток WAG анти-August на эритроцитах крыс August. В - результаты титрования анти-WAG аллоантисывороток гибридных крыс Fj(AugustxHSU) на эритроцитах WAG.

С - результаты титрования аллоантисывороток August анти-WAG на эритроцитах WAG. D - уровкъ фонового связывания иммуноглобулинов из сывороток неиммунизированных крыс August (1,2) и WAG (3,4) эритроцитами крыс August (1,4) и WAG (2,3).

m 50000-

75000 -

50000 -

2SOOO -

) 11 Ulli) 10

разведения сыворотки

TTTTTÍT]—i 11 mii|—i 11 iiiii| 10* 101 10*

в

I I lllllll—I I I lllll|—I 1 11111Ц—I I in 10 10* 10' разведения сывороть

Рис.2 Результаты типичного титрования методой клеточного радиоиммунологического определения аллоантисывороток HAG анти-August (А) и August анти-HAG на лимфоцитах селезенки крыс August (1) и ИAG С

Ii разведения сывороток

Рис.3 Комллемектзависимое цитотоксическое действие аллоантисывороток на лимфоидные клетк* селезенки крыс. 1,2 - эффект WAG аити-August аллоантисывороток на лимфоциты крыс August.

3,4 - Эффект August анти-WAG аллоантисывороток на лимфоциты крыс HAG.

300-

200-

♦

БФС \

1500-1

1000-

500-

111 11111 111 11111 11111 11111 1111 20 40 60

номера фракций

А

L БФС

WV2

Л-V

II 111 11111 I 1111 11111 I I II I 11111

20 40 60

номера фракций

Б

L

f4C.4 Электрофоретическое распределение энзиматически мечен-

4 П С

ных аллоактигенов поверхности лимфоцитов крыс August (А) и

WAG (Б) в 10% геле, содержащем додецилсулырат натрия. Из лизатов

125.

клеток первоначально удаляли иммунопреципитацией меченные I иммуноглобулины поверхности клеток, а затем с помощью аллоантисы-вортки WAO анти-August (А) и August анти-WAG (Б) выделяли глико-протеины гистоеовместимости (1).В качестве контроля использовали соответствующую нормальную сыворотку (2). Стрелками обозначены позиции маркерных белков -цепей - м.в. 53000, L-цепей -м.в.22000) и йромфенолового синего (БФС).

al., 197?;KfcMaster et al, 1979) по выделению мембранных гликопро-теинов и антигенов. Последовательность этапов выделения и очистки RT-1 материала представлена на схеме (рис.5).

На различных этапах выделения RT-1 гликопротеинов отбирали пробы для оценки эффективности и степени очистки RT-1 материала (рис. 5). Содержание последнего определяли методом ftPO по ингибиции связывания аллоантител с лимфоцитарными монослоями.

Первый этап выделения плазматических мембран заключается в обработке клеточных гомогенагов ZZ раствором.Tween-40.Солюбилиза-цию мембранных белков проводили Z7, раствором ДОХ. При этом било выделено примерно 24% RT-1 материала. Для очистки гликопротеинов гистоеовместимости использовали метод аффинной хроматографии на колонке с Lentil lectin сефарозой 4В. Связавшиеся гликопротеины, в том числе и RT-1 молекулы, элюировали 5% раствором глюкозы в 0.01М трис-Ш1 буфере с 0,1М МаС1 и 0,5% ДОХ. Соответствующее фракции объединяли и концентрировали. При этом общее количество белка во фракции значительно уменьшается (примерно в 15 раз), а относительная активность возростает примерно в 25 раз по сравнению с активностью фракции клеточных мембран.

Далее материал, сэлюироьанный с Lentil lectin колонки подвергали дальнейшей очистке путем гель-фильтрации на еефадексе 5-£00. Этот .этап очистки наиболее зффжтиьен, так как относительная активность проб возрастает примерно в 160 раз. 1

3. Характеристика поликлональных аллоантител.

Поликлональные аллоантитела August анти-WAG и August ан-ти-Fisher выделяли методом аффинной хроматографии из Ig фракций

иммунных асцитов на RT-1U (VAG) и RT-11 (Fisher) сорбентах соответственно. Методом клеточного радиоиммунологического определения с использованием лимфоцитарных монослоев оценивали активность выделенных аллоантител и степень истощенности Ig фракций иммунных асцитов. Методом радиоиммуноадсорбции на аминоцеллюлозе с Фиксированными антителами кролика против Ig крыс определяли количество

иммуноглобулина в меченых препаратах ПкАТ. Оказалось, .что August анти-VAG и August анти-Fisher аллоантител содержат более, чем 70%, и 60 % иммуноглобулинов соответственно.

1

Количество эффективных аллоантител в меченных ! препаратах

Гомогенат селезенок и лимфоузлов (гордокс 200 ед/мл)

Инкубация (лизис) 1 час 3000 г 30 мин.

Осадок клеточных органелл

Смешивание с равным объемом 4% раствора Т*ееп-40, гомогенизация

Осадок клеточных мембран.

I

Супернатант - проба N 1

80000 е 60 мин.

1

Супернатант - проба N 2

Ресуспендирование в 27. ДОХ (гордокс)

- проба N 3

Г

Осадок

Солюбилизация мембранных белков 1 час

100000 % 60 мин. ЬепиЫесип-сефароза 4В

Г

1

- проба N 4

Фракция, прошедшая Элюция (5Х глюкоза)-проба N 5 - через колонку Концентрирование - проба N 6

Сефадекс 0-200

Концентрирование - проба N 7

Рис. 5. Схема выделения 17Г-1 антигенов гистосовместимости

определяли по их связыванию с соответствующими лимфоцитами. Оказалось, что эффективные August анти-WAG аллоантитела составляют 57% меченого препарата, a August анти-Fisher аллоантитела - 40%. Таким образом, материал, сэлюированный с RT-1 сорбентов, представляет собой хорош очищенные препараты с высоким содержанием аллоантител.

4. Получение и исследование тонкой специфичности моноклональных _анти-РГ-1 В антител.

Основной целью получения моноклональных аллогенных анти-RT-lBu антител в нашей работе явилось использование их совместно с поликлональными аллоантителами в исследовании идиотипических характеристик антительного ответа при аллоиммунизации. Кроме того,

определение эпитопов RT-1BU молекулы с помощью набора моноклональных аллоантител дает представление о степени антигенности этой молекулы и разнообразии специфичности антител при иммунном ответе в данной системе August анти-WAG. Для решения этой задачи кроме моноклональных антител потребовалось выделение RT-1BU молекулы в

чистом виде. Выделение RT-1BU гликопротеинов проводили методом аффинной хроматографии с помощью иммобилизованных на сефарозе 4В моноклональных антител 4JS7, специфичных к мономорфной детерминанте RT-1B молекулы крыс.

В результате двух гибридизаций были отобраны и расклонированы восемь гибридом, продуцирующих моноклональные аллоантитела: B1G10, В6Е5, C3F4, C4G10, F4E5, С8В6, Е7В6, D8D6. Методом иммунодиффузии (Mancini et al,1965) с помощью набора класспецифических антител фирмы "Serotec" установлено, что МкАТ B1G10, В6Е5, C3F4, С8В6, D8D6 принадлежат IgM классу, C4G10 - IgG2b, F4E5.E7B6 - IgG2c подклассам

Для определения эпитопов RT-1BU молекулы, обнаруживаемых мо-ноклональными аллоантителами, использовали метод перекрестной ин-гибиции. Оказалось, что МкАТ B1G10, В6Е5,, C3F4, С8В6, Е7В6 и D8D6 практически полностью ингибируют друг друга, но не ингибируют F4E5, C4G10 антитела, и наоборот.

Таким образом, с помощью набора моноклональных антител показано, что при аллоиммунизации в системе August анти-WAG по крайней

мере два неперекрывающихся участка RT-1BU молекулы вызывают образование аллоантител.

- 17 -

5. Получение антиидиотипических сывороток к аллоантителам крыс. Определение антител к индивидуальному идиотилу.

В нашей работе для получения анти-Id антител впервые были использованы крысиные аллогенные ПкАТ против МНС-антигенов II класса, аффинно выделеные из иммунных асцитов индивидуальных животных.

Анти-Id сыворотки N 7214, 825 и 826 были получены в результате иммунизации кроликов поликлональными аллоантителами August анти-WAG N 5. Кроличьи анти-Id сыворотки N 7217 и 7218 получены против поликлональных аллоантител August анти-WAG N 1. Анти-Id выворотки N 821 и 822 направлены против поликл. аллоантител August анти-Fisher N 2. Специфичность ксеногенных анти-Id сывороток исследовали методом радиоиммуноадсорбции. Приготовленные из Ig фракций анти-Id сывороток иммунные сорбенты преимущественно связы-

зали гомологичные меченные I поликлональные антитела (таблица < 1), что свидетельствует о наличии в ксеногенных сыворотках антител против индивидуального идиотипа (анти-IdI) аллоантител.

6. Определение антител к общему идиотипу аллоантител.

Определение экспрессии общего идиотипа аллоантител в асцитах,

толученных от индив. животных, проводили методом торможения связы-

1 РЯ

?ания меченных I ПкАТ с гомологичным анти-Id сорбентом. Однако, !есмотря на высокую степень чувствительности метода, ни в одном из 5 исследованных иммунных асцитов August анти-WAG не удалось обна->ужить.идиотипы общие с ПкАТ August анти-WAG N 1 и N 5. Аналогично t 6 иммунных сыворотках August анти-Fisher не выявлены общие с IkAT August анти-Fisher N 2 идиотипические детерминанты.

7. Анализ специфичности анти-''IdX" антител.

Полагая, что доля антиидиотипических антител к общим идиоти-[ическим детерминантам может составлять небольшую часть от всех дти-Id антител, мы для обогащения Ig фракции кроличьей антиидио-ипической сыворотки анги-IdX антителами использовали метод аффин-ой хроматографии на гетерологичном аллоантительном сорбенте.

Специфичность кроличьих антител к общим (по условиям выделе-ия) идиотипическим детерминантам крысиных анти-МНС антител ис-ледовали методом радиоиммуноадсорбции. Для этого использовали ал-оантительные сорбенты, приготовленные иммобилизацией на BrCN-

Таблица 1. Связывание меченных I аллоантител с аитиидиотипическики сорбентами.

Связывание Связывание Связывание Связывание

Имиуносорбеят Айв ажти-НАО Айв аяти-К1вЬ Айв акти-ИАв кори.Iв

Н 5 а) N 2 б) Н 1 в) крысы г)

(иип/нин) (имп/иин) (имя/мин) (имп/иин)

хори.Ig

кролика 900 800 700 800

анти-1с! 7217 700 900 8000 700

анти-1с1 7218 1100 1000 8000 1100

аяти-1(1 7214 18000 1000 - 1000

аяти-1с1 825 18000 1850 - 850

анти-1с1 826 17500 1300 - 1100

акти-1<1 821 2000 19000 - 1200

аыти-1с1 822 950 22000 - 1200

Е О

а) в пробу вносили 1,5x10 имя/мин (уд.актив. 26x10 инп/мин/нкг)

с о

б) в пробу вносили 1,8x10 имя/мин (уд.актив. 23x10 имп/мин/мкг)

с о

в) в пробу вносили 1,0x10 имя/них (уд.актив. 23x10 имп/мин/мкг)

с с

г) в пробу вносили 1,3x10 имя/ник (уд.актив. 24x10 имп/мин/мкг)

125 *

Таблица 2. Связывание меченных I ахти-"1<1Х"

антител с аллоактительными сорбентами.

акти-" ИХ" анти-"1с1Х" |

Иммукосорбект 7214-125! 822-1251 1

(имп/мин) (имп/мин)

анти-11Т-1Ви,0и

(Айв анти-НАв )

N 2 10700 1000

N 3 7000 1100

Н 4 5700 1100

N 5 9500 300

N 8 7000 1000

Н 9 5400 800

анти-М-11

(Айв анти-Р1аЬег)

Н 1 900 4800

Н 2 800 6000

Н 4 800 3000

N 5 800 2600

Н 6 1000 3900

Н 8 600 3500

Н 9 800 2500

125

* Меченные I анти-"1<ЗХ" антитела предварительно истощали на нормалном 1в крысы-сорбеяте. В пробу вносили примерно

Л а

8x10 имп/иин (удельная активность 9x10 имп/мих/мкг).

активированной сефарозе 4В аллоантител от индивидуальных животных.

1ак видно из таблицы N 2, меченные 1251 ант и-" JdX"7214 антитела ¡пецифически связываются со всеми исследованными препаратами анти-

?T-1BU, Du антител, но не,анти-RT-l1 антител. Меченные 1251 анти-'IdX" 822 антитела специфически взаимодействуют со всеми исследо-

1анными препаратами анти-RT-i1, но не анти-СТ-1Ви,Ви антител.

Результаты, представленные выше, подтверждают предполагаемую 1Йти-1с1Х специфичность кроличьих антиидиотипических антител. Об ном же свидетельствуют данные, демонстрирующие способность ан-и-''IdX" 7214 и 822 антител специфически ингибировать взаимодейс-

194

вие 50% соответствующих меченных I анти-RT-l ПкАТ с антигеном.

8. Анализ экспрессии "IdX"7214 на поли- и моноклональных ллоантителах.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, то выделенные на гетерологичных сорбентах, антитела направлены к бщем/ идиотипу анти-RT-l антител, причем доля определяемых ими dX-позитивных поликлональных аллоантител составляет примерно 50%. днако остается неясным, почему при такой широкой экспрессии 5щего идиотила в популяции поликлональных анти-RT-l антител ксе-огенная иммунизация приводит к преимущественному образованию ан-ител против индивидуального идиотипа. Объяснением этого факта мо-5Т быть предположение, что полученные анти-''IdX" антитела являют-i не истинными антителами к общему идиотипу, а суммой антител эотив набора индивидуальных идиотипических детерминант (Idl), на-5олее часто представленных на анти-RT-l антителах у крыс линии • lgust. Для решения этого вопроса был проведен совместный идиотипи->ский анализ поли- и моноклональных анти-RT-l антител.

Экспресию "IdX" 7214 идиотипа определяли путем прямого связы-

шия меченных 1251 анти-''IdX" 7214 антител с поли- и моноклональ-1ми антителами. Оказалось, что в отличие от поликлональных анти-

'-1BU,DU анител, ни одно из семи моноклональных анти-RT-lB11 анти-!Л не экспрессирует "IdX" 7214 (рис.6).

Отсутствие общих идиотипических детерминант на поли- и монок-'Налышх аллоантителах южно было бы объяснить тем, что последние едставляют собой отобранные случайным образом (при получении бридом) аллоантитела. Составляя лишь часть всего возможного

имп/мин

5080-

2500

(3 о

СП со

шыи.шшшы<сы<сн-тю

ч'ЮП^-СОГЧ'Ч- ^ 'Ч) О) С О) .

ттооошь-соысосо

Рис.6 Связывание меченных

125

I анти-"1(1Х"7214 антител

с поли- и моноклональными анти-БТ-1В антителами. В1в10,В6Е5,СЗР4, С4СИ0 ,С8В6,Е7В6,

Р4Е5 - моноклональкые анти-ВТ-1Ви антитела

ПкАт - поликлональные анти-КТ-1Ви,Си антитела 06Е7,Е9А1 - моноклональкые анти-КТ-11 антитела ПАТ - поликлональные анти-ЕТ-1^ антитела СЗВ9, 3.53 - моноклональные анти-1нк-1*3 антитела

ИМП/МИН

80

60-

40-

20-

<3

И И) + щ Ю

(3 и и. ш и ^ >о со со ч-шшиии

Ч) ю |- со

ш Шс с и

N 1£ Ы ■

Ы Ь. Е с «

+ +

ю

ы и.

«г со

и. о

И

Рис.7 Ингибиция связывания меченных

125

I поликлокаль-

кых акти-11Т-1Ви,0и антител с 1}Т-1Ви гликопротеинаии.

ВЮ10, В6Е5, СЗР4, С8В6,Р4Б5,К7В6 -ИкАт -

моноклональкые аити-1?Т-18 антитела

смесь всех анти-ет-1Ви моноглоналыгах антител

ПкАт - кемечекхые анти-ЕТ-1Ви,0и поликлональные антитела

3.53 - анти-1йк-1 мококлокальхые антитела

спектра аллоантител, исследуемые наш моноклональные антитела могут обладать уникальными специфичностями, отличными от большей части поликлОнальных аллоантител. Однако результаты исследования перекреста антигенной специфичности моно- и поликлональных аллоа! тител исключают возможность такого объяснения. Оказалось, что сме( всех семи исследуемых МкАТ примерно на 80% ингибирует связывание

меченных ПкАТ с RT-1U молекулами, адсорбированными на полив! нилхлоридных планшетах. Дня отдельных МкАТ (рис. б) ингибиция тако! взаимодействия составляла от 0% (В6Е5.С8В5) до 52% (F4E5). Более того, МкАТ F4E5, специфичность которых наиболее широко представлю

на среди пула поликлональных анти-Г?Т-1Би, Du антител, ингибируют как "IdX" 7214-позитивные, так и " 1с1Х"-негатиБные поликлональные аллоантитела. Это свидетельствует о том, что F4E5 МкАТ не являете! "случайными", результатом случайной соматической мутацией вариабельного гена иммуноглобулина, отличного от "germliпе" гена, обус лавливающего доминантный или общий идиотип.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что полученные анти-''IdX" антитела являются не истинными антителами к общему идиотипу, а суммой антител прот! набора индивидуальных идиотипических детерминант (Idl), наиболее часто представленных на анти-RT-l антителах у крыс линии August. Исходя из этого предположения, гуморальный ответ отдельно! особи на МКС-антигены можно представить как широчайший набор различных по идиотипу антител, генерируемых в результате активации большого числа клонов В клеток. Количественное представительство антител, продуцируемых отдельными клонами, формируется у каждого индивида своим определенным образом. Идиотип или сумма идиотипов антител доминирующих клонов составляет тот уникальный Idl, котopt отличает данную особь от особей той же инбредной линии и вызывает образование основной массы ксеногенных анти-идиотипических антител. Адсорбция последних на гетерологических аллоантителах позвол! ет выделить минорную часть анти-Id антител, которые определяют 1с аллоантител, составляющих общую или перекрывающуюся область идиотипических спектров разных особей.

- 23 -ВЫВОДЫ

1. Оценена иммунологическая специфичность аллоантисывороток к дуктам главного комплекса гистосовместимости крыс. Методами точного радиоиммунологического определения и комгглементзависи-цитотоксичности установлено присутствие в сыворотках VAG анти-ust, WAG анти-Fisher, August aHraFisher аллоантител как к клас-еским трансплантационным (RT-1A), так и лимфоцитарным (1а бел, RT-1B.D) аллоантигенам. Показано, что адсорбция аллоантисйво-эк на эритроцитах иммунизирующей линии крыс позволяет получать унные сыворотки, избирательно направленные к 1а аллоантигенам.

?.. Обнаружен иммуноелецифический дефект крыс линии August в зобности к образованию антител к RT-1A антигенам VAG: в сыво-<ах August анти-VAG обнаруживаются антитела только к 1а белкам ^цитов VAG. Этот дефект компенсируется у Fl(AugustxM3U) гибрид-животных и связан, по-видимому, с отсутствием соответствующего ;на/генов. В связи с этим наблюдением крысы линии August являют-эдобным объектом получения поликлональных анти- Ia( VAG) антител.

3. Методами энзиматического радиоиодирования белков поверхнос-шмфоцитов и электрофоретического анализа показано, что August i-VAG аллоантисыворотки направлены только к RT-1B, D гликопроте-1, полипептидные цепи которых имеет мол. веса 33 kDa и 27 kDa .'¿а и бета-цепи). Аллоантисыворотки VAG анти-August в дополнение [ беж-ям взаимодействуют с классическими антигенами гистосов-'ймоо'Ги, тя.челые цепи которых именл1 мол. вес 45 kDa

4. Разработан новый способ аффинного выделения чистых поликло-ных антител из аллоантисывороток, в котором в- качестве антиген-ента используются фракции RT-1 гликопротеинов мембран лимфоци-

иммобилизованные на частицах сефарозы. Более 70X иммуноглобу-вого материала в таких препаратах представлено аллоантителами.

5. Путем межвидовой гибридизации клеток мышиной миеломы

g8.653 с клетками иммунных крыс August получены и охарактери-ны восемь моноклональных антител к антигенам гистосовместимос-I класса крыс VAG. Анализ эпитопной специфичности моноклональ-антител методом перекрестной ингибиции связывания RT-lBu эпротеина показал наличие, по крайней мере, двух неперекрываю-

1 антигенных участка на RT-1BU молекуле.

6. Впервые получены ксеногенные (кроличьи) антиидиотипические

сыворотки к aHTH-RT-lBu,Du (WA6) и анти-RT-l1 (Fisher) аллоантите-лам от индивидуальных животных (August).Установлено, что более 90/ антител в таких сыворотках направлено к индивидуальным идиотипи-ческим детерминантам (Idl) аллоантител.

7. Идиотипический анализ поли- и моноклональных аллоантител выявил их исключительное разнообразие. Установлено, что антительньй ответ" на МНС-антигены кардинальным образом отличается от антительного ответа на другие чужеродные антигены и характеризуется широким спектром индивидуальных идиотипов (Idl), различающихся у разных особей одной инбредной линии. Данное явление может объяснять« высокой микрогетерогенностью МНС-продуктов, образующих стабильные комплексы с процессированными эндогенными пептидами на поверхност! клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гороховец ЕЕ Антигены основного локуса гистосовместимос-ти (RT-1), выявляемые на поверхности лимфоцитов крыс. // Труды ИМЧ АМН СССР "Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии", М., 1980. - С. 111.

2. Гороховец Е Е , Бобренева Р. А., Кулакова О. Г. RT-1 антигены гистосовместимости крыс. Выделение, свойства, антигенная структура.// Генетика и биохимия микроорганизмов - биотехнологии:

Тез. докл. Всесоюзной научной конференции. - М. , 1986. - С. 54.

3. Гороховец Е В. , Бобренева Р. А., Юрин В. JL Получение и характеристика ксеногенных антиидиотипических антител к антителам против антигенов главного комплекса гистосовместимости крыс.// Иммунология, М. ,1989. - N2.- С. 17-20.

4. Гороховец Е Е Идиотипический анализ поли- и моноклональных антител к RT-1B/D антигенам гистосовместимости II класса крыс. // Тезисы Первого всесоюзного съезда иммунологов. Сочи. ,1989. -Том 2. - С. 36.

5. Гороховец Е В., Бобренева Р. А. , Юрин В. Л. Идиотипический анализ поли- и моноклональных антител к RT-1B/D антигенам гистосо! местимости II класса крыс.// Иммунология, М.,1990. - N 5. - С. 14-1Е