Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Специфические антитела в препаратах крови, обработанных криорадиационным методом

На правах рукописи

АТАНГУЛОВА РАМИЛЯ ГАЙСАРОВНА

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА В ПРЕПАРАТАХ КРОВИ, ОБРАБОТАННЫХ КРИОРАДИАЦИОННЫМ МЕТОДОМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2004

Работа выполнена в лаборатории препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Нигматуллин Тимирбек Газизович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Маннапова Рамзия Тимергалиевна доктор медицинских наук Азнабаева Лилия Фаритовна

Ведущееучреждение: Казанская государственная медицинская

академия

Защита диссертации состоится » ¿кл^ем-Р 2004 г. в. часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01. при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105,

Автореферат разослан 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

К. А. Лукманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Применение в клинической практике иммунных препаратов направленного действия в настоящее время становится основным этапом развития трансфузиологии и службы крови [В. А. Пшеничное, 1992; Е.В. Селиванов, 1999; В. В. Анастасиев, 2000]. Увеличение объема выпуска препаратов крови достигается главным образом за счёт увеличения объема перерабатываемого сырья, роста трудовых и "материальных затрат и в значительно меньшей степени за счет совершенствования технологического процесса, повышения качества готовой продукции [В.Н. Шабалин, 1982].

Разработка и совершенствование технологий производства высокоэффективных препаратов из плазмы донорской крови, обеспечивающих, вирусную безопасность и сохранение биологической активности является актуальной задачей [В. Horovitz. 1988, 1993; Т. Novak, 1992; F. Gao, 1993; D. Josic et al.,. 1997; X. Шторх, 1997; M.M. Алсынбаев и др., 1998; Ю.Л. Тюрикова, 1999; Н.В.Зубкова и др., 2001, 2002]. Одним из перспективных методов обеспечения вирусной безопасности донорской плазмы крови и ее препаратов считается способ криорадиационной обработки с программируемым замораживанием [Патент РФ 2000109454/13].

Данная работа является. фрагментом исследований, проведенных подпрограмме Международного, научно-технического центра и Консорциума наук о плазме (США) «Разработка метода и основ технологии инактивации вирусов путем радиационной обработки программно-замороженных препаратов крови»

Влияние гамма-облучения с программируемым замораживанием на структуру и свойства белков более подробно освещено в исследованиях донорской плазмы крови и ее препаратов: альбумина, концентрата фактора VIII, человеческого лейкоцитарного интерферона [АХ Купцов, В.И. Трофимов и др., 1985; Т.Г. Нигматуллин и др., 1995; В.Ф. Кулагин и др., 1995; В.И. Трофимов, 1995]. В работах Р.Ф. Шангареевой с соавт. (2001) были определены основные подходы для отработки режима гамма-облучения, позволяющие сохранить нативность и физико-химические свойства белков плазмы крови. Было показано, что замораживание плазмы по специальной программе до температуры (-78) С с последующей радиационной обработкой в дозах 35 и 50 кГр, обеспечивающих надежную инактивацию всех возможных вирусов-контаминантов. не приводит к

значительным изменениям

альбумина, иммуноглобулинов G и А, церулоплазмина, липопротеидов высокой и низкой плотности. Установлено, что оптимальной дозой криорадиационной обработки плазмы донорской крови, при которой происходит наименьшее изменение основного белкового состава, является доза 35 кГр. Таким образом, влияние криорадиационной обработки на белковый состав донорской плазмы в основном изучен. Тем не менее, иммунобиологические свойства иммуноглобулина G после криорадиационной обработки оставались не исследованными.

Препараты иммуноглобулинов из крови человека и животных широко используются в медицине. Действующим началом препаратов иммуноглобулинов являются специфические антитела. Поэтому изучение влияния криорадиационной обработки на титры специфических антител, а также физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов представляет значительный , научный и практический интерес.

Цель исследования. Оценить влияние криорадиационной обработки донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов на иммунобиологические свойства антител lgG класса.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние криорадиационной обработки в дозах 5-50 кГр на титры антител к вирусным и бактериальным антигенам в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов человека нормального и специфических.

2. Определить влияние криорадиационной обработки на протективные вируснейтрализующие титры антител в реакции биологической, нейтрализации на животных (in vivo).

3. Исследовать функциональные свойства авидность и аффинность специфических антител в донор^ой плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом

4. Изучить влияние различных доз криорадиационной обработки на основные физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов

5. Установить оптимальные дозы криорадиационной обработки, при которых физико-химические свойства молекул IgG соответствуют критериям качества препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного применения

Научная новизна.

Впервые:

- установлено, что в результате криорадиационной обработки плазмы донорской крови и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50. кГр статистически достоверно и дозозависимо повышаются (в 1.2-4.6 .раза) титры специфических антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов;

-показано, что в, результате криорадиационной обработки происходит повышение (в 1,3-4,6 раза) вируснейтрализующих титров антирабических антител в реакции биологической нейтрализации на животных;

-выявлена тенденция к повышению авидности и аффинности антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом, установлена сильная корреляция между относительной аффинностью и титрами антител (к вирусу ГЛПС и коклюшному токсину);

- обнаружена корреляционная зависимость между содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального и титрами антител к вирусу клещевого энцефалита;

-установлено, что криорадиационная обработка не приводит к значительным изменениям молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов, выходящих за пределы требований к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения.

Научно-практическая значимость работы.

По материалам исследования получена приоритетная справка №2003123647 на изобретение «Способ повышения специфической активности антител IgG класса».

Полученные результаты являются основой для создания технологии, направленной на повышение специфической активности препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток в производстве соответствующих препаратов крови. Установленная высокая корреляция между аффинностью и титрами антител позволяют рекомендовать метод криорадиационной обработки для повышения функциональной активности антител с дальнейшим использованием в качестве иммунохимических реагентов дианостических тест-систем, а также для производства специфических иммуноглобулинов, применяемых по жизненным показаниям.

Результаты проведенного исследования могут служить основанием для предложения практических рекомендаций при использовании метода криорадиационной инактивации вирусов готовых препаратов

иммуноглобулинов и методов контроля возможных изменений антител в процессе инактивации вирусов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Криорадиационная обработка донорской плазмы й~ препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр сопровождается повышением титров антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов (в 1,2-4,6 раза), при этом уровень повышения титров антител коррелирует с дозой гамма-облучения.

2. Криорадиационная обработка препаратов антирабического иммуноглобулина в дозах 5-50 кГр приводит к повышению (в 1,3-4,6 раза) протективных вируснейтрализующих титров антирабических антител.

3. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом, соответствуют требованиям, предъявляемым к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Повышенный уровень титров специфических антител в процессе хранения после криорадиационной обработки сохраняется в течение 1,5 лет (срок Наблюдения).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV международном съезде по радиационным исследованиям (Москва, .2001), 7-ой Пущинской школе-конференции молоды ученых (Пущино, 2003), Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003), научно-практической конференции «Биохимия:'от исследования молекулярных механизмов - до "внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов АН РБ и УНЦ РАН (Уфа, 2003), Ученых Советах ГУП «ИммунопрепараТ» (Уфа, 2003, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, принята заявка на изобретение Федеральным Институтом Патентной Собственности.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных йсследований (5 глав), заключения и выводов. Материал изложен на 139 страницахдекста, содержит 20 рисунков и 23 - таблицы. Библиографический список включает 229 источников (87 отечественных и 142 иностранных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При выполнении работы использовали плазму донорской крови, полученную в донорском пункте ГУП «Иммунопрепарат». Применяли как плазму отдельных доноров (от 23 доноров), так'и объединенную донорскую плазму крови от 100-300 доноров (10 партий) Также исследовали 36 серий препаратов иммуноглобулинов: иммуноглобулины человека нормального и специфические (антирабический лошадиный, антистафилококковый, против вируса клещевого энцефалита, анти-ГЛПС, антицитомегаловирусный) производства ГУП «Имму-нопрепарат» и антирабический лошадиный иммуноглобулин производства ЗАО «Биолек» (г. Харьков, Украина)

Образцы плазмы крови объемом 300-400 мл в гемаконах и препараты иммуноглобулинов в пластиковых пробирках объемом 1-5 мл замораживали со скоростью (0,2-2,0) °С/мин до температуры не менее (-78) °С. Для замораживания образцов применяли низкотемпературные морозильные камеры MDF-792 (Япония) и сухой лед Контролем служили образцы, замороженные до температуры (-78) °С, но не подвергавшиеся радиационному воздействию. Далее осуществляли обработку замороженных образцов гамма-излучением в дозах 5, 15, 25, 35 и 50 кГр. Гамма-облучение замороженных образцов донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов проводили на изотопной установке РЦ-100М с мощностью поглощенной дозы 60110 Гр/мин в НТЦ «Лекбиотех» (г. Москва). Для обеспечения гамма-обработки объектов в установке использовали изотоп 60Со. Размораживание образцов осуществляли в термостатах с водой при температуре (37±1) °С до температуры 10 °С.

Антитела ^ класса к цитомегаловирусу, вирусам бешенства, ГЛПС, гепатита А, В, кори, паротита, клещевого энцефалита, микобактериям туберкулеза, экзотоксину коклюшного микроба в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов исследовали методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали с помощью спектрофотометра «DYNATECH MR 5000» (Швеция), измеряя оптическую плотность при длине волны 450 и 490 нм. Применяли коммерческие тест-системы фирм ТОО Биотехнологическая компания «Биосервис» (г. Москва), тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», (г. Новосибирск), тест-системы для выявления антирабических антител (ВНИВИ, г. Казань), тест-системы для выявления антител к экзотоксину коклюшного микроба производства ГУП «Иммуно-препарат» (ФС 42-3711-99), а также экспериментальную тест-систему

для выявления антител против нуклеокапсидного антигена вируса ГЛПС (ГУП «Иммунопрепарат»).

Оценку специфической активности антистафилококкового иммуноглобулина производили путем определения антиальфастафи-лолизина в реакции нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфатоксина специфическими антителами согласно «Методическим указаниям по определению антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных» (Москва, 1984).

Протективную активность антирабического лошадиного иммуноглобулина изучали согласно ФС .42-412ВС-93 в реакции биологической нейтрализации на белых лабораторных мышах. Для опытов использовали 1270 белых мышей, массой (11 +2) г, полученных из питомника лабораторных животных ГУП «Иммунопрепарат». Применяли вирус бешенства (штамм CVS) с предварительно установленной дозой, предоставленный цехом культуральной антирабической вакцины ГУП «Иммунопрепарат». Исследуемые образцы и стандартный образец антирабического иммуноглобулина разводили физиологическим раствором 1:250, 1:1250, 1:6250, 1:31250, разливали в пробирки по 1 мл. В каждую пробирку добавляли по 1 мл разведенного вируса содержащего вирус в пределах (100-1000) LD50. Все пробы выдерживали в течение 1 часа при. температуре 37 С. Затем содержимое из каждой пробирки вводили по 0,03 мл интрацеребрально мышам, на каждое разведение использовали 5 мышей. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток. Мышей, погибших в течение первых 5 суток, из опыта исключали. Анализ результатов и расчет титра иммуноглобулина проводили по методу Reed и Muench [Методы исследований по бешенству, ВОЗ, 1975].

Исследование авидности донорской плазмы и препаратов иммуноглобулина проводили методом иммуноферментного анализа с использованием мочевины. Для проведения анализа применяли коммерческую иммуноферментную тест-систему для определения низкоавидных антител к цитомегаловирусной инфекции «ЦМВ-Диагност» (ТОО Биотехнологическая компания «Биосервис» г. Москва).

Индекс авидности (ИА) антител рассчитывали по следующей формуле и выражали в процентах:

ОП после обработки мочевиной

ОП в лунках, не обработанный мочевиной

где ОП - оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 490 им.

Вычисление относительной аффинной величины RHAV (Relative High Affinity Vallue) в донорской плазме и препаратах иммуноглобулина проводили также в иммуноферментном анализе по методу R.W. Luxton и E.J. Tomphson, (1990). Метод заключается в применении в твердофазном иммуноферментном анализе по определению титров антител IgG класса тиоцианата натрия (NaSCN). Особенностью этого анализа является внесение в лунки после удаления исследуемых образцов растворов NaSCN возрастающей концентрации. Этот реагент, изменяя рН и ионную силу, разрушает комплекс антиген-антитело. Затем с помощью коньюгата проявляли реакцию и вычисляли значение RHAV по формуле:

RHAV= А1х12 + А2х11 + АЗхЮ + А4х9, где А1 -А4 - процент антител, оставшихся в лунках после внесения соответствующей концентрации NaSCN (рассчитали относительно контрольной лунки, куда NaSCN не вносили), а цифры соответствуют концентрации NaSCN.

Определение молекулярного состава проводили методом гель-проникающей жидкостной хроматографии низкого давления согласно методике, изложенной в ФС-42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов». В этих целях использовали автоматическую- систему фирмы «LKB-Фармация» (Швеция). Препараты иммуноглобулинов наносили на хроматографическую колонку размером 25X1000 мм. В качестве носителя использовали ультрагель АсА-34.

Для исследования электрофоретической картины иммуноглобулинов G использовали метод диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле (ПААГе) в денатурирующих условиях [Л.А. Остерман, 1981] на аппарате для вертикального электрофореза фирмы «LKB-Фармация» (Швеция).

Автор выражает благодарность P.C. Шафеевой, А Г. Исрафилову за помощь в проведении исследований и С.Ю. Веселову за предоставленные тест-системы.

Электрофорез препаратов иммуноглобулинов на пленках из ацетата целлюлозы проводили на оборудовании НТЦ «Астра» (г. Уфа) с последующей обработкой полученных данных компьютерной программой.

Для статистической обработки результатов исследований применяли стандартный пакет прикладных статистических программ «Statistica 5.7», «Excel 4.0». Вычисляли средние значения со стандартным отклонением (M±SD), средние величины сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента. На диаграммах значения контроля принимали за «0». Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез считали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначальные исследования показали, что после криорадиа-ционной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 35 и 50 кГр титры антител к вирусам бешенства, гепатита А, цитомегаловирусу, экзотоксину коклюшного микроба повысились в значительной степени.

"J5F"

■ W-i

□ 35 кГр 0 50 кГр

204*

"1

индивидуальная плазма

объединенная плазма

иммуноглобулин

Рисунок 1. Влияние криорадиационной обработки на титры антицито-мегаловирусных антител в индивидуальной плазме, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулина человека нормального (* - Р<0,05).

Как следует из рисунка 1, наибольшее повышение титров антицитомегаловирусных антител происходит в индивидуальной донорской плазме на 362-402 %, затем в объединенной донорской плазме На 114-204 % и в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 135-154 % по сравнению с контролем.

vo. в дальнейшем для более детального изучения этого явления применили криорадиационную обработку в диапазоне доз облучения от 5 до 50 кГр. В результате установили достоверное повышение титров антител при всех испытанных дозах облучения к цитомегаловирусу, вирусам бешенства, гепатита А, клещевого энцефалита, ГЛПС, паротита, кори, а также микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба

Рисунок 2. Влияние криорадиационной обработки на титры антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулина человека нормального (Р<0,05)

Как видно из рисунка 2, повышение титров антител к вирусу гепатита А происходит при всех дозах облучения в индивидуальной, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулинов.

Увеличение титров специфических антител наблюдали в различной степени: в большей степени в индивидуальной донорской плазме и в меньшей степени в объединенной донорской плазме и препаратах иммуноглобулина. В то же время увеличение титров антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального более значительно, чем в специфических препаратах иммуноглобулина.

Так, в результате криорадиационной обработки препаратов антицитомегаловирусного иммуноглобулина повышение антицитоме-галовирусных антител отметили на 53-88 %, а в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 36-154 %. Титры антител к вирусу клещевого энцефалита в препаратах специфического противоклеще-вого иммуноглобулина в результате криорадиационной обработки изменились незначительно в пределах от (-13) до (+9) %, тогда как в препаратах иммуноглобулина человека нормального повысились на 19-154 %. Титры антител к вирусу ГЛПС в анти ГЛПС-иммуноглобулине повысились всего на 5-33 %. Увеличение титров антител к микобакте-риям туберкулеза в препаратах иммуноглобулина человека нормального отметили на 48-166 %, к вирусу кори на 5-56 %, а к вирусу паротита на 17-87 %. Повышение титров антител к вирусу гепатита А в индивидуальной донорской плазме происходит на 21-236 %, в объединенной донорской плазме на 25-57 %, а в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 28-88 %.

При сравнении исходных титров исследуемых образцов отметили, что повышение титров специфических антител зависит от исходного уровня антител: чем ниже титр антител исследуемого образца, тем большее повышение титров антител после криорадиа-ционной обработки наблюдается. С целью подтверждения зависимости титров антител при криорадиационной обработке от исходного уровня антител в исследуемом образце, провели обработку индивидуальной донорской плазмы с исходным низким, средним и высоким титром антицитомегаловирусных антител. Полученные данные показали, что в индивидуальной плазме с исходным высоким уровнем антител изменения были практически не существенны в пределах от (-4,5) до (+7,9) %, а в индивидуальной плазме с исходным средним и низким титром антител повышение было в значительной степени (Р<0,05). Наибольшее повышение титров антител наблюдали в индивидуальной донорской плазме с исходным низким титром антител от 11 до 134%.

Анализ повышения титров специфических антител в результате криорадиационной обработки показал корреляционную зависимость от дозы гамма-облучения. Коэффициент корреляции Пирсона (г), определяющий связь между дозой облучения и титрами антител к цитомегаловирусу, вирусам гепатита А, кори, паротита, клещевого энцефалита, ГЛПС, микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба составил более 0,9 при уровне вероятности Р<0,05, то есть является достоверным.

Рисунок 3. Влияние дозы облучения на титры антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме

Как следует из рисунка 3, повышение титров антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме имеет линейную зависимость «доза-эффект» (г=0,92 при Р<0,01).

Криорадиационная обработка препаратов иммуноглобулина человека нормального показала отсутствие значительных изменений титров антител к вирусу краснухи. Незначительно изменились также титры антител к вирусу гепатита В в индивидуальной и объединенной донорской плазме. В объединенной донорской плазме с исходным высоким титром антител к вирусу гепатита В и препаратах иммуноглобулина при дозах облучения 5-25 кГр отклонения от контроля были незначительные, однако при дозах 35 и 50 кГр отметили значительное понижение титров антител на 38-49 %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и препаратах антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки практически не изменились. Следовательно, в результате криорадиационной обработки

повышение титров специфических антител происходит в зависимости от специфичности антител: к определенным антигенам отмечали значительное повышение титров антител, а к другим - повышения титров антител не отмечали, что, вероятно, связано с иммуно-химическими свойствами антител.

Одним из критериев оценки протективных свойств препаратов иммуноглобулинов является определение уровня нейтрализующих антител. Поэтому для подтверждения данных, полученных методом иммуноферментного анализа (таблица 1), изучили титры нейтрализующих антител. Протективную активность препаратов иммуноглобулина исследовали в реакции биологической нейтрализации вируса бешенства антирабическим иммуноглобулином (таблица 2).

Таблица 1

Титры специфических антител в препаратах антирабического иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом

Доза облучения (кГр) при (-78)°С Титр АТ (М±80), -' МЕ/мл " СУ, % "Отклонение от контроля, %

0(Контроль) 585,7±20,9 3,6 -

35 2352,4±113,5 4,8 +302

50 2235,6± 30,9 1.4 +282

Примечание. Различия статистически достоверны относительно конт-

роля (Р<0,05); М - среднее значение, Бй - стандартное отклонение, ¿V - коэффициент вариации

Таблица 2

Нейтрализующие титры препаратов антирабического иммуноглобулина : -<

Доза облучения (кГр) при (-78) "С Средний геометрический титр антирабических антител, п=12

Контроль- 1 :4227

5 1 :5537

15 1 :6002

25 1 :10660

35 ' 1 : 19360

50 1 :14130

Как следует из таблицы 2, титры протективных нейтрализующих антирабических антител повысились после криорадиационной обработки в 1,3-4,6 раза. Наибольшее повышение титров антираби-ческих антител происходит при дозе 35 кГр.

Таким образом, в результате криорадиационной обработки значительно повышаются титры вируснейтрализующих антира-бических антител.

В литературе встречаются сообщения о подобном повышении титров антител в результате физического воздействия. Так, воздействие ультрафиолетового света на плазму усиливает протективную активность естественных антиэндотоксиновых антител при перитонитах [А.В. Аполлонии и др., 1994]. При ультрафиолетовом облучении плазмы происходит повышение титров антиэритроцитарных антител в 1,6-2,1 раза, титров антистафилококковых антител IgG класса в 2-16 раз и IgM антител в 2-4 раза [К.А. Самойлова и др., 1986].

Изучили также влияние криорадиационной обработки на титры специфических антител при хранении. Исследования показали, что после хранения при температуре (-78) 'С в течение 6, 9 и 18 месяцев повышенные титры антител к цитомегаловирусу в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов существенно не изменились. Проведение теста на ускоренное старение в отношении препаратов иммуноглобулинов (37 'С, 4 недели) по Европейской Фармакопее (2000) также подтвердило, что повышенный уровень титров антител к вирусам гепатита А, клещевого энцефалита, кори и микобактериям туберкулеза сохраняется, а наблюдаемые изменения не превышают 17 %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки при хранении 6 мес. при температуре (6±4) 'С практически не изменились.

Как свидетельствуют литературные данные, повышение нейтрализующих титров антител происходит вследствие повышения аффинности или авидности антител [Р.В. Петров и др., 1997, E.D. Getzoff et al., 1988, J. Drescher и R. Aron, 1999; W.P. Yang et al., 1995, H. Rollag, 1998; S. Romero-Steiner et al., 1999]. Поэтому следующим этапом исследований было изучение функциональных свойств антител авидности и аффинности. Полученные результаты представлены в таблицах 3, 4 и 5.

Таблица 3

Относительная аффинная величина (RHAV) lgG-антител-к экзотоксину коклюшного микроба в индивидуальной донорской плазме

Доза облучения (кГр) при (-78) »О1 [ 1 . ШАУ(М±50) " • п=5 Р относительно .контроля . Отклонение от контроля, • % *

Контроль 318,9+31,4 • - ■

5 334,3±43,8 >0,05 +4,8

15 349,5±50,3 1 • >0,05 - +9,6

25 366,2+25,9 >0,05 +14,8

35 476,1 ±29,8 <0,05 +49,3

50 569,3+69,2 <0,05 +78,5

Таблица 4

Относительная аффинность (ЯНАУ) 1дС-антител к нуклеокапсидному антигену вируса ГЛПС в препаратах анти-ГЛПС-иммуноглобулина

Доза облучения ИНДУ (М+вЭ), Р относительно Отклонение от

(кГр) при (-78) °С п=5 контроля контроля, %

»•Контроль 3365,2±14,2 - -

> • 5 3531,9±16,2 <0,05 +4,9

15 3660,6±78,1 <0,05 +8,9

25 3883,7+12,3 <0,05 +15,4

35 4199,7±99,8 <0,05 +24,8

50 4272,2±43,8 . <0,05 ■ +26,9

Результаты опытов показали тенденцию к увеличению индекса авидности и относительной аффинной величины специфических антител после криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов. Как следует из таблиц 3 и 4, повышение аффинности противококлюшных антитоксических антител и анти-ГЛПС-антител происходит при всех дозах облучения. Кроме того, выявили достоверную высокую корреляционную связь между относительной аффинностью антител к вирусу ГЛПС (г=0,99 при Р<0,01), коклюшному экзотоксину (г=0,91 при Р<0,01) и титрами соответствующих антител.

Таблица 5

Индекс авидности анти-ЦМВ-антител в препарате

антицитомегаловирусного иммуноглобулина «Меговир»

Индекс авидности, %

Контроль 5 кГр 15 кГр 25 кГр 35 кГр 50 кГр

65,7±0,7 69,2+0,1 (+5,3) 68,3+0,2 (+3,9) 56+0,6 (-14,8) 54+2,1 (-17,8) 49+4,1 (-25,4)

Примечание. Различия достоверны относительно контроля (Р<0,05), в скобках указан процент отклонений от контроля

Как следует из таблицы 5, индекс авидности высокоавидного антицитомегаловирусного препарата «Меговир» повысился при дозах 5 и 15 кГр; а при дозах 25, 35 и 50 кГр понизился.Корреляцию между относительной аффинностью и титром антител не выявили.

Проведенные исследования позволяют предположить, что одним из механизмов увеличения титров специфических антител при криорадиационной обработке является повышение аффинности этих антител. Вероятно, повышение аффинности зависит от изначального состояния антител (уровня аффинности) в препаратах иммуноглобулинов или донорской плазме. Изменение аффинности антител является причиной повышения силы связывания антитела с антигеном и, как следствие, наблюдается повышение титра антител. То есть высоко реагирующие в ИФА образцы донорской плазмы или препаратов иммуноглобулинов по сравнению со слабо реагирующими, содержат более аффинные антитела. Криорадиационная обработка, по-видимому, не влияет в значительной степени на повышение титров высокоавидных специфических препаратов иммуноглобулинов, поскольку они содержат более аффинные антитела. Из данных литературы известно, что специфические антитела имеют определенный «порог авидности», и дальнейшее увеличение авидности не." приводит к заметным улучшениям защитных функций [и. Foote, 1995; М. БаоИтапп, 1997; Ш. иэтдег, 1999], что подтверждается нашими исследованиями.

Наши исследования по аффинности антител согласуются также с экспериментальными данными; полученными в результате химических модификаций моноклональных антител. В работах Я.И. Мельниковой с соавт. (1997, 2000) было показано/что разные концентрации органического растворителя по-разному действуют на аффинность антител. Некоторые* концентрации' приводят к увеличению антигенсвязывающей активности антител, причем,

максимальное увеличение происходит именно с менее аффинным антителом Все эти изменения авторы связывали с тонкими информационными изменениями отдельных участков антител. Вероятно такие же изменения происходят при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулина

Дальнейшие исследования заключались в изучении влияния криорадиационной обработки на физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработки определили методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА34.

Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6

Молекулярно массовое распределение (ММР) препаратов иммуноглобулина человека нормального, п=5

ММР % Доза облучения (кГр) при (-78) *С

Контроль 5 15 25 35 50

А 1,8±0,2 1,8±0,1 1,94+0,1 2,15+0,2 3,3+0,3 3,1+0,2

д 16,3+0,5 18,1±0,3 20,02±0,3 21,64+0,4 20,42±0,5 20,1 ±0,3

М 78,1 ±0,5 77,8+0,2 76,9±0,9 75,5±0,1 74,56+0,4 75,2±0,1

Ф 3,8±0,8 2,3±0,1 1,13+0,2 0,71+0,1 1,72±0,1 1,6±0,2

Примечание. А-агрегаты,

димеры, М-мономеры, Ф-фрагменты.

Таблица 7

Молекулярно массовое распределение (ММР) препаратов иммуноглобулина против вируса клещевого энцефалита, п=5

ММР, % Доза облучения (кГр) при (-78) 'С

Контроль 5 15 25 35 50

А 0 0,89+0,1 0,89+0,2 0,55+0,1 0,42±0,1 0,47±0,1

Д 7,14±0,5 8,07+0,3 8,41+0,2 8,44±0,3 8,13±0,2 8,83±0,4

м 89,15±0,3 88,27+0,7 87,69±0,4 87,53±0,4 87,8+0,3 87,45+0,1

ф 3,71 ±0,2 2,77±0,5 3,01 ±0,3 3,48±0,5 3,64±0,6 3,25±0,2

Как следует из таблиц 6 и 7, во всех препаратах происходит увеличение содержания димеров. Анализ, полученных данных, показывает сильную корреляционную связь между уровнем антител к вирусу клещевого энцефалита и содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального (г=0,81; Р<0,05). Следовательно, причиной повышения титров некоторых специфических антител после криорадиационной обработки может быть димеризация антител. Известно, что димеризация моновалентных антительных

фрагментов увеличивает, примерно в 100 раз, константы ассоциации для взаимодействия с поливалентными антигенами Jekel et al., 1996].

С увеличением дозы облучения йаблюдали тенденцию к снижению количества мономерных форм. Увеличение содержания агрегатов наблюдали во всех препаратах иммуноглобулинов, но в пределах требований ФС-42-3874-99 (менее 10 %). Незначительная агрегация молекул IgG (до 3 %) после криорадиационйой обработки подтверждается и опытами, проведенными с использованием коммерческих иммуноглобулинов на жидкостном хроматографе высокого давления HPLC. Согласно требованиям ФС-42-3874-99, основная фракция мономеров вместе с димерами должна составлять не менее 85 %, полимеров не более 10 %, фрагментов не более 5 % от общего содержания белка в препарате. Следует отметить, что все указанные изменения молекулярных параметров иммуноглобулинов после крио-радиационной обработки находятся в допустимых пределах, предъявляемых Фармакопейной статьей к качеству внутримышечных иммуноглобулинов. Следовательно, изменения молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом в дозах 5,15,25, 35 и 50 кГр не являются существенными.

Анализ электрофоретических данных препаратов иммуноглобулина методом диск-электрофореза в ПААГе не выявил значительных изменений. Полосы облученного иммуноглобулина соответствуют фракциям контрольного необлученного иммуноглобулина, и только " фракции иммуноглобулина, обработанных в дозах З5'и 50 кГр имеют более размытый вид.

; 1 . _У Таблица 8 Содержание у-фракции в препаратах иммуноглобулина_

Доза облучения (кГр) при (-78) *С - .V '—^н— ---- . - -V, Содержание у-фракции, % -

Иммуноглобулин против ' вируса клещевого ! 1 энцефалита, (М±80), п=5 Иммуноглобулин человека нормальный, (М±8Р), п=5

. Контроль 99,7±0,3" 4 99,5 +0,5

5 - 99,2+0,2' г, 99,2±0,4

15 4 ; '> 98,3±0,1 98,8±0,2

• 25 97,1 ±0,1* 97,3±0,2*

35 > 93,6±0,3* ■ ' • 96,2+0,6*

50 91,4+0,3* 92,2±0,3*

Примечание. М - средняя величина, Эй - стандартное отклонение:

* - различия достоверны относительно контроля (Р<0,05)

Как следует из таблицы 8, при электрофоретическом разделении на ацетат-Целлюлозных пластинах с увеличением дозы облучения происходит уменьшение содержания у-фракции препаратов иммуноглобулина, эти изменения носили статистически значимый характер при дозах 25, 35 и 50 кГр. По требованиям Фармакопейной статьи, содержание у-фракции должно быть не менее 97 % Общего белка. Следовательно, дозы 35 и 50 кГр более значительно влияют на содержание у-фракции препаратов иммуноглобулина а дозы 5-25-кГр являются оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов

Полученные нами данные, при изучении различными методами исследований (гель-хроматография, диск-электрофорез, электрофорез на ацетат-целлюлозных пластинах) свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформационной структуре молекулы иммуноглобулинам препаратах иммуноглобулинов после криорадиа-ционной обработки. Ранее в исследованиях Р.Ф. Шангареевой с соавт. (2001, 2002) было показано, что криорадиационная обработка дозами 35 и 50 кГр не оказывает значительных изменений на конформа-ционную структуру молекулы иммуноглобулина G в донорской плазме. По данным А.Х. Купцова, В.И. Трофимова (1985) при криорадиа-ционной обработке в дозах 35 и 50 кГр не происходит заметного нарушения молекулярной структуры альбумина.-Подобное суждение может быть верным и для молекулы IgG. Тем не менее, некоторые изменения при больших дозах облучения (35 и 50 кГр), в частности снижение содержания у-фракции и более значительное понижение титров антител к вирусу гепатита В (38-49 %) позволяют предположить, что при этих дозах происходит частичная денатурация молекулы IgG в препаратах иммуноглобулина. Таким образом, для повышения титров специфических антител целесообразно проводить криорадиа-ционную обработку донорской плазмы, но не готовых препаратов иммуноглобулинов.

Как правило, эффекты модификации структуры белков с помощью химических агентов или физических факторов представляют собой частичную или полную потерю биологической активности. Литературные данные об активации функциональных свойств белковых молекул ограничены, неизвестны иммунохимические характеристики специфических антител [М. Steward et al., 1991; D. Chargeleque, 1995]. Поэтому объем имеющихся на сегодня данных о механизмах конформационных перестроек в иммуноглобулинах, не позволяет полностью объяснить результаты наших исследований, и выяснение

механизмов повышения титров антител требует дальнейших более углубленных исследований.

Полученные результаты позволяют заключить, что при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов происходит значительное повышение титров специфических антител к цитомегаловирусу, к вирусам гепатита А, ГЛПС, бешенства, клещевого энцефалита, кори, паротита, микобактериям туберкулеза и коклюшному экзотоксину. При этом изученные дозы криорадиационной обработки не влияют в значительной степени на молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов.

ВЫВОДЫ

1. Криорадиационная обработка донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр приводит к значительному (в 1,2-4,6 раза) повышению титров антител к ряду изученных вирусных и бактериальных антигенов.

2. Изменения титров антител зависят от дозы облучения, исходного уровня антител и специфичности антител.

3. На модели препаратов антирабического лошадиного иммуноглобулина в реакции биологической нейтрализации показано, что после криорадиационной обработки значительно повышаются титры протективных вируснейтрализующих антител (в 1,3-4,6 раза).

4. Криорадиационная обработка сопровождается повышением индекса авидности и относительной аффинности антител.

5. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработки в дозах 5-50 • кГр соответствуют требованиям Фармакопейной статьи к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения.

6. Оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов для повышения титров специфических антител являются дозы 5-25 кГр.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1: Атангулова Р.Г, Алсынбаев М.М , 'Нигматуллин Т.Г., Исрафи-лов А.Г., Трофимов В.И, Хубатуллин Р.Г. Титр антител к цитомегаловирусу в донорской плазме после криорадиационной обработки. IV съезд по-радиационным-исследованиям // Тез. докл-М., 2001 .-т.1 (секции ^.-^154.

2. Хубатуллин Р.Г, Алсынбаев М.М., Нигматуллин Т.Г., Трофимов В.И., Исрафилов А.Г., Атангулова Р.Г., Парамонов Д.В. Изучение сохранности иммуноглобулинов G и А* в плазме крови человека, подвергнутой обработке криорадиационным методом. IV съезд по радиационным исследованиям //Там же. - С.55.

3. Атангулова Р.Г, Шафеева Р.С., Нигматуллин Т.Г, Исрафилов А.Г. Специфическая активность антирабического иммуноглобулина после криорадиационной обработки // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке. Мат. Всерос. науч. конф , посвящ 105-летию Пермского НПО «Биомед». - Пермь, 2003,- С. 133-135.

4. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А.Г. Изменение титров * антител к цитомегаловирусу в донорской плазме после криорадиационной обработки в зависимости от исходного уровня антител //Там же. - С. 125-127.

5. Атангулова Р.Г., Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А Г. Титры антител в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом //7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино, 2003. - С. 86-87.

6. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А.Г. Криорадиационная обработка плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов как метод повышения активности антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов // Мат. межрегион конф. биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство». - Оренбург,

2003.-С.421 -424.

7. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Шафеева Р.С. Протективные свойства препаратов антирабического иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии. - Мат. Всерос. науч. конф. молодых ученых. - Уфа,

2004.-С. 128-129.

Атангулова Рамиля Гайсаровна

Специфические антитела в препаратах крови, обработанных криорадиационным методом

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск Р.К. Каримова

Подписано в печать 18.03.04 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Arial Суп». Отп. на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 376

РИО ФГУП сНПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат» 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472) 213-214

Актуальность проблемы. Применение в клинической практике иммунных препаратов направленного действия в настоящее время становится основным этапом развития трансфузиологии и службы крови [4, 27, 57, 59]. Увеличение объема выпуска препаратов крови достигается главным образом за счет увеличения объема перерабатываемого сырья, роста трудовых и материальных затрат и в значительно меньшей степени за счет совершенствования технологического процесса, повышения качества готовой продукции [39, 84].

Разработка и совершенствование технологий производства высокоэффективных препаратов из плазмы донорской крови, обеспечивающих вирусную безопасность и сохранение биологической активности является актуальной задачей [3, 17, 86, 148, 174, 150, 152, 180, 182, 203, 226, 227]. Одним из перспективных методов обеспечения вирусной безопасности донорской плазмы крови и ее препаратов считается способ криорадиационной обработки с программируемым замораживанием [47].

Данная работа является фрагментом исследований, проведенных по Программе Международного научно-технического центра и Консорциума наук о плазме (США) « Разработка метода и основ технологии инактивации вирусов путем радиационной обработки программно-замороженных препаратов крови».

Влияние гамма-облучения с программируемым замораживанием на структуру и свойства белков более подробно освещено в исследованиях донорской плазмы крови и ее препаратов: альбумина, концентрата фактора VIII, человеческого лейкоцитарного интерферона [22, 29, 61, 78 ].

В работах Шангареевой Р.Ф. с соавт. (2000, 2001) [12, 85] были определены основные подходы для отработки режима гамма-облучения, позволяющие сохранить нативность и физико-химические свойства белков плазмы крови. Было показано, что замораживание плазмы по специальной программе до температуры (-78) ° С с последующей радиационной обработкой в дозах 35 и 50 кГр, обеспечивающих надежную инактивацию всех возможных вирусов-контаминантов, не приводит к статистически значимым отклонениям нарушения состояния ее основных белковых фракций: альбумина, иммуноглобулинов G и А, церулоплазмина, липопротеидов высокой и низкой плотности. Установлено, что оптимальной дозой криорадиационной обработки плазмы донорской крови, при которой происходит наименьшее изменение ее основного белкового состава, является доза 35 кГр. Таким образом, влияние криорадиационной обработки на белковый состав донорской плазмы в основном изучен. Тем не менее, иммунобиологические свойства иммуноглобулина G после криорадиационной обработки оставались не исследованными.

Препараты иммуноглобулинов из крови человека и животных широко используются в медицине. Действующим началом препаратов иммуноглобулинов являются специфические антитела. Поэтому изучение влияния криорадиационной обработки на титры специфических антител, а также физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов представляет значительный научный и практический интерес.

Цель исследования. Оценить влияние криорадиационной обработки донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов на иммунобиологические свойства антител IgG класса.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние криорадиационной обработки в дозах 5-50 кГр на титры антител к вирусным и бактериальным антигенам в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов человека нормального и специфических.

2. Определить влияние криорадиационной обработки на протективные вируснейтрализующие титры антител в реакции биологической нейтрализации на животных (in vivo).

3. Исследовать функциональные свойства: авидность и аффинность специфических антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом.

4. Изучить влияние различных доз криорадиационной обработки на основные физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов.

5. Установить оптимальные дозы криорадиационной обработки, при которых физико-химические свойства молекул IgG соответствуют критериям качества препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного применения.

Научная новизна.

Впервые :

- установлено, что в результате криорадиационной обработки плазмы донорской крови и препаратов иммуноглобулина в дозах 5-50 кГр статистически достоверно и дозозависимо повышаются (в 1,2 - 4,6 раза) титры специфических антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов;

- показано, что в результате криорадиационной обработки происходит повышение (в 1,3-4,6 раза) вируснейтрализующих титров антирабических антител;

- выявлены особенности изменения функциональных свойств антител: тенденция к повышению авидности и аффинности в донорской плазме и препаратах иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом, установлена сильная корреляция между относительной аффинностью и титрами антител (к вирусу ГЛПС и коклюшному токсину);

- обнаружена корреляционная зависимость между содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального и титрами антител к вирусу клещевого энцефалита;

- установлено, что криорадиационная обработка не приводит к значительным изменениям молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов.

Практическая значимость работы.

По материалам исследования подана заявка №2003123647 на изобретение «Способ повышения специфической активности антител IgG класса».

Полученные результаты являются основой для создания технологии, направленной на повышение специфической активности препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток в производстве соответствующих препаратов крови. Установленная высокая корреляция между аффинностью и титрами антител позволяют рекомендовать метод криорадиационной обработки для повышения функциональной активности антител с дальнейшим использованием в качестве иммунохимических реагентов дианостических тест-систем, а также для производства специфических иммуноглобулинов, применяемых по жизненным показаниям.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Криорадиационная обработка донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр сопровождается повышением титров антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов (в 1,2 - 4,6 раза), при этом уровень повышения титров антител коррелирует с дозой гамма-облучения.

2. Криорадиационная обработка препаратов антирабического иммуноглобулина в дозах 5-50 кГр приводит к повышению (в 1,3-4,6 раза) протективных вируснейтрализующих титров антирабических антител.

3. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом, соответствуют требованиям, предъявляемым к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Повышенный уровень титров специфических антител в процессе хранения после криорадиационной обработки сохраняется в течение 1,5 лет (срок наблюдения).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV международном съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), Всероссийской научной конференции, посвященной 105летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003), научно-практической конференции «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), II Республиканском конкурсе молодых ученых (г.Уфа, 2003), Ученых Советах ГУП «Иммунопрепарат» (2003 - 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, принята заявка на изобретение Федеральным институтом патентной собственности.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (5 глав), заключения и выводов. Материал изложен на 139 страницах текста, содержит 20 рисунков и 23 таблицы. Библиографический список включает 229 источников (87 отечественных и 142 иностранных).

Выводы

Криорадиационная обработка донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5, 15, 25, 35 и 50 кГр приводит к значительному (в 1,2-4,6 раза) повышению титров антител к ряду изученных вирусных и бактериальных антигенов.

Изменения титров антител зависят от дозы облучения, исходного уровня антител и специфичности антител.

На модели препаратов антирабического лошадиного иммуноглобулина в реакции биологической нейтрализации показано, что после криорадиационной обработки значительно повышаются титры протективных вируснейтрализующих антител (в 1,3-4,6 раза). Криорадиационная обработка сопровождается повышением индекса авидности и относительной аффинности антител.

Молекулярные параметров препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработке в дозах 5-50 кГр соответствуют требованиям Фармакопейной статьи к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения.

Оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов для повышения титров специфических антител являются дозы 5-25 кГр.

Заключение

В последние годы все больше внимания уделяется разработке эффективных технологий инактивации патогенных агентов в плазме крови и ее препаратах, что привело к внедрению широкого диапазона процедур инактивации, которые обеспечили и биологическую полноценность препаратов. Одним из эффективных методов стерилизации препаратов крови от вирусов-контаминантов является метод криорадиационной обработки. Совместными исследованиями ученых НТЦ «Лекбиотех» (г. Москва), НПО «Иммунопрепарат» (г.Уфа) и НТЦ «Вектор» (г. Новосибирск) разработана технология криорадиационной обработки плазмы крови и получаемых из нее препаратов, обеспечивающая надежную инактивацию вирусов-контаминантов.

Анализ литературы свидетельствует, что вопросы сохранения специфической активности иммуноглобулина G, изменения титров антител при использовании методов криорадиационной обработки, практически не были изучены. Поэтому установление влияния криорадиационной обработки на титры специфических антител представляет значительный научный и практический интерес.

Проведенные нами исследования показали, что после криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 35 и 50 кГр титры антител к цитомегаловирусу, вирусам гепатита А, бешенства, к экзотоксину коклюшного микроба повышались в значительной степени. Для более детального изучения этого явления применили криорадиационную обработку в диапазоне доз облучения от 5 до 50 кГр. В результате криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов установили достоверное повышение титров антител при всех испытанных дозах облучения к цитомегаловирусу, вирусам бешенства, гепатита А, клещевого энцефалита, ГЛПС, паротита, кори, а также микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба.

Повышение титров специфических антител в большей степени происходило в индивидуальной донорской плазме и в меньшей степени в объединенной донорской плазме и препаратах иммуноглобулина. Так, изучение антитоксических противококлюшных антител показало, что в индивидуальной плазме при дозе 35 кГр повышение происходит на 114 %, при дозе 50 кГр на 205 %, в объединенной плазме и препаратах иммуноглобулинов повышение несколько меньше, на 50-80 % и 32-64 %, соответственно. Наибольшее повышение титров антицитомегаловирусных антител наблюдали в индивидуальной донорской плазме на 361-402 %, затем в объединенной донорской плазме на 114-204 % и в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 135-282 %.

Исследования показали, что повышение титров антител происходит во всех исследуемых образцах, но в различной степени. Процент повышения титров антител в препаратах иммуноглобулина человека выше, чем в специфических препаратах иммуноглобулина. Наибольшее повышение титров антицитомегаловирусных антител наблюдали в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 135-282 %, а в препаратах антицитомегаловирусного иммуноглобулина повышение отметили только на 53-88 %.

Титры антител к вирусу клещевого энцефалита в препаратах противоклещевого иммуноглобулина в результате криорадиационной обработки меняются незначительно в пределах (-13)-(+9) %, тогда как в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 19-154 %. Титры антител к вирусу ГЛПС в антиГЛПС-иммуноглобулине повысились всего на 533 %. Специфические иммуноглобулины имеют исходный титр выше, чем в препаратах иммуноглобулина человека нормального, возможно, этим фактом объясняется менее выраженный характер повышения титров антител. Известно, что, естественные циркулирующие антитела поливалентны и обладают меньшей аффинностью [70]. Следовательно, при получении препаратов иммуноглобулина человека нормального или специфического на основе таких антител, можно предполагать их более слабый протективный эффект.

Препараты иммуноглобулинов направленного действия содержат более высокие титры специфических антител, и эти антитела обладают более высокой аффинностью, чем антитела в препаратах иммуноглобулина человека нормального. Например, антицитомегаловирусный иммуноглобулин «Меговир» имеет индекс авидности (66 %) и содержит высокоавидные антитела.

Сравнение исходных титров исследуемых образцов (до облучения) показало, что повышение титров специфических антител зависит от исходного уровня антител: чем ниже исходный титр исследуемого образца, тем большее повышение титров антител происходит при криорадиационной обработке. С целью подтверждения зависимости титров антител при криорадиационной обработке от исходного уровня антител в исследуемом образце, провели обработку индивидуальной донорской плазмы с исходным низким, средним и высоким титром антицитомегаловирусных антител. Анализ полученных данных показывает, что в индивидуальной плазме с исходным высоким уровнем антител изменения были практически не существенны в пределах от (-4,5)- (+7,9) %, а в индивидуальной плазме с исходным средним и низким титром антител повышение было в значительной степени (Р<0,05). Наибольшее повышение титров антител наблюдали в индивидуальной донорской плазме с исходным низким титром антител от 11 до 134 %. При этом повышение титров специфических антител в результате криорадиационной обработки имеет линейную зависимость «доза-эффект». Коэффициенты корреляции (г), определяющие связь между дозой облучения и титрами антител составили более 0,9 при уровне вероятности Р<0,05, то есть являются достоверными.

В препаратах иммуноглобулина человека нормального повышение титров антител к вирусу гепатита А при дозах 5, 15 и 25 кГр также имеет характер линейной зависимости «доза-эффект», но дозы 35 и 50 кГр в меньшей степени повлияли на повышение титров антител к ВГА, чем дозы 15 и 25 кГр. Титры антител к вирусу гепатита В существенно не изменились ни в индивидуальной донорской плазме, ни в объединенной донорской плазме. Но в препаратах иммуноглобулина и в объединенной плазме с исходным высоким уровнем антител к вирусу гепатита В отметили значительное понижение при дозах 35 и 50 кГр от 16 до 49 %. Незначительное влияние криорадиационной обработки наблюдали при титровании препаратов иммуноглобулина человека нормального к вирусу краснухи. Изменения титров антител были в пределах от (-1,5) до (+7,4) %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и специфических препаратах антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки также практически не изменяются.

Таким образом, криорадиационная обработка избирательно влияет на титры антител к вирусным и бактериальным антигенам, то есть титры к определенным специфическим антителам меняются значительно, а титры других видов специфических антител существенно не меняются или понижаются в значительной степени при больших дозах облучения 35 и 50 кГр.

Влияние криорадиационной обработки на протективные вируснейтрализующие антитела изучали на препаратах антирабического лошадиного иммуноглобулина в реакции нейтрализации in vivo. В реакции биологической нейтрализации вируса бешенства антирабическим лошадиным иммуноглобулином на мышах установили, что титры протективных нейтрализующих антирабических антител повысились после криорадиационной обработки в 1,3-4,6 раза. Расчеты эффективной дозы иммуноглобулина показали, что доза 2,8 мкг способствует 50 % защите животных, эта же доза облученного дозами 25 и 35 кГр иммуноглобулина защищает 70 % животных. Таким образом, выживаемость животных при всех введенных дозах антирабического иммуноглобулина, облученного дозами 25 и 35 кГр, выше на 20 % при сравнении с контролем. Наши исследования согласуются с даннымиУап§ W.P. с соавт. (1995) [229], Usinger W.R.h Lucas А.Н. (1999) [223], из которых следует: чем выше авидность антител, тем меньшее количество антител необходимо для защиты от бактерий или вирусов.

Характер повышения титров антирабических антител и в реакции нейтрализации и в ИФА показал, что доза 35 кГр в большей степени влияет на повышение титров антител. Вероятно, более высокая доза облучения 50 кГр оказывает ингибирующее воздействие на антирабические антитела.

В литературе встречаются сообщения о подобном повышении титров антител в результате физического воздействия [32, 58, 68]. Известно, что воздействие ультрафиолетового света на плазму усиливает протективную активность естественных антиэндотоксиновых антител при перитонитах по данным Аполлонина А.В. с соавт.(1994) [58]. При ультрафиолетовом облучении плазмы происходит также повышение титров антиэритроцитарных антител в 1,6-2,1 раза, титров антистафилококковых антител IgG класса в 2-16 раз и IgM антител в 2-4 раза по данным Самойловой К.А. с соавт. (1986) [68].

Далее изучали титры специфических антител в процессе хранения после криорадиационной обработки. По требованиям ФС 42-0091-02 («Плазма для фракционирования») донорскую плазму хранят при температуре минус 30 "С и ниже. Исследования показали, что после хранения при температуре минус 78 °С в течение 6, 9 и 18 месяцев повышенные титры антител к цитомегаловирусу в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов практически не изменились. Проведение теста на ускоренное старение препаратов иммуноглобулинов (Европейская Фармакопея, 2000) также подтвердило, что повышенный уровень титров антител к вирусу гепатита А, к вирусу клещевого энцефалита, вирусу кори и микобактериям туберкулеза сохраняется, а наблюдаемые изменения не превышают 10-17 %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки при хранении 6 мес. при температуре хранения препаратов иммуноглобулинов (6±4) "С также существенно не изменились.

Как свидетельствуют литературные данные, повышение нейтрализующих титров антител происходит вследствие повышения аффинности или авидности антител [53, 113, 131, 197, 229]. Известно также, что эффективность нейтрализующей активности антител зависит от доступности и стабильности нейтрализующих эпитопов [225]. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение функциональных свойств антител авидности и аффинности. Результаты опытов показали тенденцию к увеличению индекса авидности и относительной аффинной величины специфических антител после криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов. Данные по изучению индекса авидности антител к цитомегаловирусу показали повышение этого индекса при дозе облучения 35 кГр, а при 50 кГр в некоторых изначально высокоавидных препаратах иммуноглобулинов отмечали понижение. Как известно, специфические антитела имеют определенный «порог» авидности, и дальнейшее увеличение авидности не приводит к заметным улучшениям защитных функций [129]. Антитела к поверхностным антигенам вирусов, антитела, реагирующие с антигенами бактериальных капсул, могут не достигать высоких значений авидности, и в этих случаях их протективная функция зависит от концентрации антител [100, 223].Так, повышение индекса авидности высокоавидного антицитомегаловирусного иммуноглобулина «Меговир» наблюдали при дозах 5,15 и 25 кГр, а при дозах 35 и 50 кГр отмечали понижение индекса авидности. Следовательно, криорадиационная обработка не влияет в значительной степени на повышение аффинности высокоавидных специфических препаратов иммуноглобулинов. Повышение аффинности противококлюшных антитоксических антител и аффинности анти-ГЛПС-антител отмечали при всех дозах облучения. Кроме того, выявили достоверную высокую корреляционную связь между относительной аффинностью антител к вирусу ГЛПС, коклюшному экзотоксину и титрами этих антител.

Проведенные исследования позволяют предполагать, что одним из механизмов увеличения титров специфических антител при криорадиационной обработке является повышение аффинности этих антител. Повышение аффинности зависит от изначального уровня антител (состояния аффинности) в препаратах иммуноглобулинов или донорской плазме. Таким образом, увеличение аффинности антител является причиной повышения силы связывания антитела с антигеном и, как следствие, отмечается повышение титра антител. То есть высоко реагирующие в ИФА образцы донорской плазмы или препаратов иммуноглобулинов по сравнению со слабо реагирующими, содержат более аффинные антитела. Наши исследования по аффинности антител согласуются с экспериментально подтвержденными данными, полученными в результате химических модификаций моноклональных антител. В работах Мельниковой Я.И. с соавт. (1997,2000) [6, 81] было показано, что разные концентрации органического растворителя по-разному действуют на аффинность антител. Некоторые концентрации приводят к увеличению антигенсвязывающей активности антител, причем, максимальное увеличение происходит именно с менее аффинным антителом. Все эти изменения авторы связывали с тонкими конформационными изменениями отдельных участков антител. Вероятно такие же изменения происходят при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулина.

Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработки изучали методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА34. Во всех препаратах наблюдали увеличение содержания димеров. Возможно, причиной повышения титров некоторых специфических антител после криорадиационной обработки является димеризация. Димеризация антител, как метод модифицирования АГ-АТ взаимодействий, имеет функциональное значение, так как в каждой из двух реагирующих молекул имеются два независимых мобильных сайта. Известно, что димеризация моновалентных антительных фрагментов увеличивает примерно в 100 раз константы ассоциации для взаимодействия с поливалентными антигенами по данным Jekel Р.А. (1996) [158]. Анализ, полученных нами данных, показал сильную корреляционную связь между уровнем антител к вирусу клещевого энцефалита и содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального (г=0,81; Р<0,05). Таким образом, повышение титров антител можно связать с димеризацией антител при криорадиационной обработке.

Образование димеров, может служить также критерием степени полезности использования препарата при лечении аутоиммунных заболеваний, так как было установлено, что препараты содержат антиидиотипические антитела [74].

С увеличением дозы облучения наблюдали тенденцию к снижению количества мономерных форм. Количество фрагментов в специфических препаратах иммуноглобулинов практически не изменилось, в препаратах иммуноглобулина человека нормального количество фрагментов понизилось. Увеличение содержания агрегатов наблюдали во всех препаратах иммуноглобулинов, но в пределах нормы (менее 10 %). Незначительная агрегация молекул IgG (до 3 %) после криорадиационной обработки подтверждается и более ранними опытами, проведенными с использованием коммерческих иммуноглобулинов на жидкостном хроматографе высокого давления HPLC[11]. Согласно требованиям Фармакопейной статьи на препараты иммуноглобулинов для внутримышечного применения [80], основная фракция мономеров вместе с димерами должна составлять не менее 85 %, полимеров не более 10 %, фрагментов не более 5 % от общего содержания белка в препарате. Следует отметить, что все указанные изменения молекулярных параметров иммуноглобулинов после криорадиационной обработки находятся в допустимых пределах, предъявляемым к качеству внутримышечных иммуноглобулинов.

Выяснили также, что антикомплементарная активность препаратов иммуноглобулина человека нормального понизилась до пределов, допускающих клиническое внутривенное применение. Возможно, при криорадиационой обработке происходит избирательная модификация Fc полисахаридной части иммуноглобулина, ответственной за связывание комплемента.

Анализ электрофоретических данных препаратов иммуноглобулина методом диск электрофореза в ПААГе не выявил значительных изменений. Полосы контрольного необлученного иммуноглобулина соответствуют фракциям облученного иммуноглобулина, хотя фракции иммуноглобулина при дозах 35 и 50 кГр, имеют более размытый вид. При электрофоретическом разделении на ацетат целлюлозных пластинах с увеличением дозы облучения отметили тенденцию к уменьшению у-фракции препаратов иммуноглобулина, эти изменения носили статистически значимый характер при дозах 25, 35 и 50 кГр. На электрофореграмме (рис.19) отмечаются следы концентрации иммуноглобулина на месте нанесения препаратов иммуноглобулина, вероятно, это связано с частичной агрегацией IgG при высоких дозах облучения 35 и 50 кГр. По требованиям Фармакопейной статьи, содержание у-фракции должно быть не менее 97 % общего белка. Следовательно, дозы 35 и 50 кГр более значительно влияют на структуру молекулы IgG в препаратах иммуноглобулинов, а дозы 5-25 кГр являются оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов.

Ранее в исследованиях Шангареевой Р.Ф. с соавт. (2000, 2001) [12, 85], Гелич JI.B. с соавт. (2002) [13] было показано, что криорадиационная обработка дозами 35 и 50 кГр не оказывает значительных изменений на конформационную структуру молекулы иммуноглобулина G в донорской плазме. Полученные нами данные, при изучении общепринятыми методами исследований также свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформационной структуре молекулы иммуноглобулина после криорадиационной обработки.

В исследованиях Купцова А.Х. (1985) [61] было показано, что при криорадиационной обработке в дозах 35 и 50 кГр не происходит заметного нарушения молекулярной структуры альбумина. Подобное суждение может быть верным и для молекулы IgG. Тем не менее, некоторые изменения при больших дозах облучения (35 и 50 кГр), в частности снижение у-фракции и более высокий процент понижения титров антител к вирусу гепатита В ( 38-49 %) позволяют предположить, что при этих дозах происходит частичная денатурация молекулы иммуноглобулина в препаратах иммуноглобулина. Таким образом, для повышения специфической активности антител целесообразно проводить криорадиационную обработку донорской плазмы индивидуальной или объединенной), но не готовых препаратов иммуноглобулинов.

Как правило, эффекты модификации структуры белков с помощью химических агентов или физических факторов представляют собой частичную или полную потерю биологической активности. Литературные данные об активации функциональных свойств белковых молекул ограничены. Неизвестны иммунохимические характеристики специфических антител [144, 215]. Поэтому весьма ограниченный объем имеющихся на сегодня данных о механизмах конформационных перестроек в иммуноглобулинах, не позволяют однозначно объяснить результаты наших исследований, и выяснение механизмов повышения титров антител требует дальнейших углубленных исследований.

Таким образом, полученные результаты позволили заключить, что при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов происходит значительное повышение титров специфических антител к цитомегаловирусу, к вирусам гепатита А, ГЛПС, бешенства, клещевого энцефалита, кори, паротита, а также к микобактериям туберкулеза и коклюшному экзотоксину. При этом изученные режимы обработки не влияют в значительной степени на молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов.

На сегодняшний момент отсутствует валидация методов контроля изменений биологических свойств антител в донорской плазме или препаратах иммуноглобулинов при вирусной инактивации, и наши исследования в этой области приближают к решению этих вопросов. Анализ, полученных нами результатов и актуальность проблемы обосновывают необходимость создания производственной технологии, направленной на повышение специфической активности препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток в производстве соответствующих препаратов крови, а также методов контроля возможных изменений антител в процессе инактивации вирусов.