Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка физико-химических и иммунологических основ получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека

ГОСКОМИТЕТ САНЭШЩНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСИТУТ _ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ .им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

КОСТРОВА Ольга Михайловна

УДК 612.017.12:57.083

РАЗРАБОТКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ИШОВОЛОГИШЖИХ ОСНОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИЮГЕРГБГЙЧНЗЮГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского при Госкомитете санэпиднадзора Российской Федерации.

На,учные^руководители: доктор биологических наук В.А. АЛЕППШН . доктор медицинских наук Н.Д. ЛЬВОВ

О ф и ц иальные оппоне н,т ы:

доктор биологических,наук, профессор К.Л. ШАХАНИНА

кандидат медицинских наук З.П. БЕЛКИН

Ведущее учреждение: Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится Л( .. 1993 года в часов

на заседании специализированного совета К 084.18.02 Московского научно-исследовательского института, эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского при Госкомитете санэпиднадзора РФ по адресу: 125212, Москва, ул. адмирала Макарова, 10.

С диссертацией иэхво ознакомиться в библиотеке Московского НЙИЭМ им. Г.Н. Габричевского при Госкомитете санэпиднадзора РФ.

Автореферат разослан .0. . Л^ХА-.".... 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических .наук

О.В. Котельникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в связи с ухудшением экологической обстановки, широким применением иммуносупрессив-ной терапии, а также вследствие распространения различных иммуно-дефицитов инфекционной природы и, в первую очередь, СПИДа, резко увеличилось число заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса. При этом участились случаи развития тяжелых форм герпетической мйфекции, сопровождающихся тяжелыми осложнениями, представляющими нередко угрозу для жизни больного. По данным ВОЗ инфекции, обусловленные ВПГ, как причина летальных исходов при вирусных заболеваниях, занимают второе место (15.8%) после гриппа (35.8Z) (Билл. ВОЗ, 1985, 1991).

Традиционные способы лечения герпетических инфекция включают применение различных хнмиопрепаратов, влияющих на репродукцию вируса, а также использование таких иммунобиологических препаратов, как интерферон и его индукторы, противогерпетические вакцины, различные иммуномодуляторы.

В последние годы в литературе появились данные о целесообразности использования для лечения, и, что особенно важно, для профилактики герпесвирусных заболеваний таких иммунобиологических препаратов, как иммуноглобулины человека. Уже показан протектив-ный эффект препаратов иммуноглобулинов человека при профилактике и лечении инфекций, вызываемых представителями сем. Herpesviridae - вирусом ветряной оспы-герпеса зостер и цитомзгаловирусами. При этом эффективными оказались.,, как препараты иммуноглобулинов направленного действия, обогаденные соответствующими вирусспецифи-ческими антителами, так и препараты нормальных иммуноглобулинов человека, предназначенные для внутривенного применения, позволяющего вводить пациентам требуемые количества соответствующих специфических антител. (Dituro I.G. et al., 1986; Goebell U. et al., 1987; Stienmuller D.R. et al., 1990; Ucinar S. et al., 1990).

В последние годы были получены предварительные данные о положительном действии внутривенно вводимых препаратов нормальных иммуноглобулинов человека при лечении инфекций, вызываемых ЕПГ (Habich Н., 1985; Erlich К. et al, 198?; Raiznann M.L., Faster

G.S., 1988). Полагают, что более эффективны!.! будет применение препарата специфического противогерпетического иммуноглобулина, обогащенного антителами к ЕПГ {Kohl S. et al, 1989; Протас И.И. и др., 1991), Однако в настоящее время промышленная выпуск подобного препарата не налахен. Это определяет научную и практическую значимость работы, посвященной разработке теоретических и экспе-риыенальных осзов промышленного получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка физико-химических и иммунологических основ 1 получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека.

Основные задачи исследования.

1. Широкомасштабное исследование распределения герпесспеци-фических антител в различных видах сырья, используемого для производства препаратов иммуноглобулина человека.

2. Выбор наиболее перспективных видов сырья.

3. Разработка оптимальных способов выделения противогерпети-ческих иммуноглобулинов из отобранного сырья.

4. Характеристика полученных препаратов иммуноглобулинов.

5. Изучение влияния препарата противогерпетического иммуноглобулина на аффинность герпесспецифичеких антител у больных с герпетическими инфекциями.

Научная новизна. Установлены закономерности распределения герпесспецифичеких антител в популяции населения России. Показано, что около 855 населения имеют повышенное содержание антител к ШГ.

Проанализировано содержание антител к ВПГ в различных видах сырья, используемого для производства препаратов иммуноглобулинов человека: в пулированных донорских и плацентарных сыворотках крови и в сыворотках крови индивидуальных доноров.

Экспериментально обосновано получение препарата противогерпетического иммуноглобулина человека на основе предварительно отобранных сывороток крови отт7ртит;уялт,и-»гг доноров с наиболее высоким содержанием антител к ВПГ.

Показана возможность использования в качестве дополнительного источника герпесспецифических иммуноглобулинов балластной

фракции III метода Кона. Экспериментально обосновано получение препаратов иммуноглобулина из балластной фракции III, обогащенного 3 и 4 подклассами IGG.

Исследовано содержание антител к ВПГ в коммерческих препаратах нормальных иммуноглобулинов человека. Показано, что около 7% серий препаратов иммуноглобулинов характеризуется повышенным в 3 - 6 раз содержанием антител к ВПГ.

Проведено изучение аффинности герпесспецифических антител у больных, с различными формами герпетических инфекций и у'здоровых людей. Исследовано влияние препарата противогерпетического иммуноглобулина на аффинность антител к ВПГ у лиц с герпетическими заболеваниями.

Практическая значимость. На основе предварительно отобранных сывороток крови индивидуальных доноров получен препарат протизо-герпетического иммуноглобулина, специфическая активность которого в 4 раза превышает противогерпетическую активность препаратов нормальных иммуноглобулинов. На получейный препарат составлена Временная фармакопейная статья и разработан проект программы Государственных испытаний клинической эффективности, которые утверждены Ученым Советом МНИИЗМ им.Г.Н.Габричевского.

Разработан способ получения препарата иммуноглобулина из балластной фракции III метода Кока. На данный способ оформлена заявка на авторское свидетельство. (Приоритетная справка N5045574).

Для профилактики и лечения герпетических инфекций предложено использовать коммерческие препараты нормальных иммуноглобулинов, содержание антител к ВПГ в которых в 3-6 раз превышает средние значения титров антител к ВПГ.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета "Иммунология и медицинская биотехнология" МНИ-ИЭМ им. Г.Н.Габричевского 30 марта 1993 года. Результаты исследований были доложены на конференциях молсзых ученых МНИИЭМ ем. Г.Н.Габричевского в 1988, 1991 гг., на конференции "Заболевания, обусловленные вирусом простого герпеса" кафедры кожных болезней ММА im. И.М.Сеченова и проблемой комиссии "Герпесзирусные инфекции" АМН СССР в феврале 1991 г.

Публикации. По темэ диссертации опубликовано 4 печатные работы. :

Основные положения, выносимые на защту:

1. Выявлены закономерности распределения герпесспепифических антител в различных видах сырья, используемого для производства препаратов иммуноглобулина человека.

3. Способ получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека.

3. Способ выделения иммуноглобулинов из фракции III метода

Кона.

4. Для профилактики и лечения инфекций, вызываемых ВПГ, предложено использовать предварительно отобранные коммерческие препараты нормальных иммуноглобулинов, содержание герпесспецифк-чеких антител которых в 3-6 раз превышает средние значения титров антител к ВПГ, установленные для препаратов нормальных иммуноглобулинов человека.

5.Результата определения аффинности герпесспецифических антител в сыворотках крови больных с герпетическими инфекциями к здоровых доноров.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на VV/ страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, Л2 рисунков, 1 график. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает ¿¿S источников как отечественных, так и иностранных авторов.

С0ДЕР2АН2Е РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы сыворотки крови 700 доноров;. 50 партий Аудированной сыворотки доноров; 150 партий пулированной плацентарной саворотки, полученные с Предприятия по производству бактерийных препаратов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского; из ШШИ скорой помощи иы.Н.В.Склифосовсого; с Областной станции переливания крови.

Сыворотки крови 15 больных с различными формами герпети-

ческих инфекция.любезно предоставленные Т.Б. Семеновой (Центральный кояно-венерологический институт им. В.Г. Короленко).

20 серий баластной белковой фракции, выделяемой при фракционировании сизоротки или плазкы крози по методу Кона (фракция III или осадок Б), полученные в цехе гамма-глобулина на Предприятии 1ШПИЭМ им. Г. Н.Габричевского.

120 серий коммерческих препаратов иммуноглобулина человека нормального, изготовленных на Предприятии ШИИЭМ им. Г.Н.Габричевского.

20 серий препаратов иммуноглобулина человека нормального, изготовленных на предприятиях Минска, Киева, Харькова, Казани.

Тестирование герпесспецифических иммуноглобулинов осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использовавшем двух коммерческих тест-систем: тест-системы, предназначенной для определения антител к ВПГ производства фирмы Tirion" (Швейцария) и тест-системы производства НПС "Еиосервис" при НИИ вирусных препаратов РАМН (BSC 42.130 ВС.87).

Определение вируснейтрализугацей активности противогерпети-ческиг антител проводили с использованием культуры тканей по стандартной методике.

Препарат противогерпеткческого иммуноглобулина человека получали по методу Кона в модификации ШИИЗМ ни. Г. Н. Габричевского в цехе гамма-глобулина на Предприятии МШЕЗМ за. Г.Н.Габричевского.

Изучение фракционного состава иммуноглобулинов проводили методом гельфилътрации на сефадексе G-2C0, уравновешенном солянокислым трисбуферным раствором pH 8.0, в колонке 2,5x100 см фирмы LKB (Швеция). Пробы собирали с помощью автоматической системы фирмы LKB (Швеция).

Изучение антигенного . состава препаратов иммуноглобулинов проводили модифицированным методом иммуноэлектрофереза (ИЭФ) по П.Г.Грабарз (1957) В соответствии с методическими рекомендациями сборника "Инструкции но общим методам контроля медицинских иммунобиологических препаратов", утверзденных приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83.

Определение электрсфоретичес::ой однородности препаратов иммуноглобулинов проводили по методу Лэммли (Laemali, 1970).

Количественное содержание подклассов IGG осуществляли методом радиальной кмаунода&фузии (РИД) по Манчини (Wanchihi G. et al, 1965) с использованием моноспецифических антисывороток к подклассам IGG производства фирмы "Nordic Immunological Laboratories" (Нидерланды).

Концентрацию белка в растворах определяли по поглощению ультрафиолетового света при 280 нм на спектрофотометре СФ-26, а также методом, основанным на биуретовой реакции, в соответствии с методикой, описанной в сборнике "Инструкции по общим методам контроля медицинских иммунобиологических препаратов", утвержденном приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83.

Определение аффинности противогерпетических антител проводили в соответствии с методикой, разработанной Luxton R.W. и Thompson E.J. (Luxton R.¥. и Thompson E.J., 1990).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по методам, рекомендованным Н.А.Плохинским, 1970 ,В.Е. Гмурма-ном, 1977.

РЕЗИЬТАта ИССЛЕДОВАНИЙ

При создании препаратов иммуноглобулинов направленного действия одним из наиболее существенных моментов является выбор оптимального метода анализа содержания данных специфических антител в исходном сырье и в конечном препарате. Поскольку для получения высокоэффективного препарата противогерпетического иммуноглобулина необходимо помимо количественного определения содержания герпесспецифичеких антител осуществлять также контроль их функциональной активности, мы проводили тестирование антител к ВИГ двумя методами: методам ВФА и при помощи реакции нейтрализации (РН), позволяющей определять вируснейтрализупцую активность данных антител.

Для выбора наиболее эффективной иммуноферментной тест-системы мы провели сравнительное изучение двух коммерческих тест-систем, предназначенных для выявления антител к ВПГ, различающихся формой сорбированного антигена: тест-системы производства фирмы "Virion" (Швейцария), антигеном в которой является очищенный и инакхивированный ВПГ, и тест-системы производства НЕС

"Биосервис", в которой в качестве антигена используются зараженные БПГ клетки Yero перевиваемой линии почек зеленой мартышки, при этом неинфшшрованные вирусом клетки служат контрольным антигеном.

Было показано, что обе тест-системы характеризуются высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью результатов. При этом тест-система производства НПС "Биосервис" была примерно в 3 раза более чувствительной по сравнению с тест-системой фирмы "Virion". Это может быть в определенной степени связано как с большей стабилизацией антигенной структуры вирусных белков при использовании в качестве антигена клеток, зараженных ВПГ, так и с большей доступностью при этом антигенных детерминант вируса для специфических антител. Однако, учитывая более высокую экономичность тест-системы фирмы "Virion", позволяющей тестировать вдвое большее количество образцов, было решено при исследовании большого количества различного биологического материала использовать именно эту тест-систему.В то же время ряд разделов работы, посвященный исследованию препаратов иммуноглобулинов, выполнялся с применением обеих тест-систем.

Следующим этапом работы явилось исследование содержания гер-песспецифических IGG в различных видах сырья, используемого для получения препаратов иммуноглобулинов человека с целью выбора наиболее оптимальных источников противогерпетичесхих антител. Было определено содержание противогерпетических IGG в 700 сыворотках крови индивидуальных доноров, а также в 150 партиях пулированных плацентарных гсывороток, и в 50 партиях пулированных донорских сывороток, полученных из разных областей Росссии, при этом каждая партия состояла в среднем из 20-30 индивидуальных сывороток.

Результаты анализа распределения антител к БПГ в сыворотках крови человека представлены на рис.1.

Рис.1. Распределение герпесспецифических антител б сыворотках крови человека, определенное методом ИФА в тест-системе фирмы "Virion": I - в пулировакных 'inn 2 - в индивидуальных*.

•■50

2

' 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 обратный титр

I Г I I I I | I I I i

1500 3200 6400 12800 25600 сыворотки

Как видно из представленных данных, 80-90% пулированных сывороток имеет значения титров антител к ВПГ от 1:3200 до 1:6400. В то же время, 7-9% сывороток обнаруживают несколько более высокое содержание герпесспецсфических иммуноглобулинов (более 1:6400). Надо отметить, что нами не было выявлено существенных различий в уровне антигел к ВПГ в сыворотках, собранных в северных, умеренных и более южных областях России. Вероятно, это объясняется практически повсеместным распространением герпетической инфекции," обуславливающей наличие з крови подавляющего большинства людей высоких концентраций проттаогерпетических антител.

При анализе сывороток крови индивидуальных доноров были обнаружены существенно большие колебания в содержании антител к ВПГ. При этом около 8% сывороток имели титры герпесспецифических 1С£ более 1:25600, что в 3-4 раза превышает средние значения.

Полученные нами данные, характеризующие содержание антител к

ВПГ в человеческой популяции, дополняют выявленные ранее закономерности распределения вирусспецифических иммуноглобулинов к другим представителям сем.НегреБУ1пс1ае: к вирусу ветряной оспы-герпеса зостер и к цитомегаловирусаы человека (ЮоЫап М.В. е! а1, 1984, 1986),

Ряд сывороток, различающихся между собой по содержанию антител к ВПГ, определенному методом ИФА. был затем исследован в реакции нейтрализации (табл.1)..

Таблица I. Содержание герпесспецифических антител в сыворотках крови индивидуальных доноров, определенное методом ИФА и в реакции нейтрализации.

N Титр антител к ВПГ Титр вируснейтрализущих

п/п в ИФА *) антител

1 2500 ± 300 17 ± 3

2 5100 ± 200 27 ± 5

3 9100 ± 200 33 ± 5

4 19200 ± 600 83 ± 13

5 32000 + 5000 133 ± 22

*) титры приведены в обратных величинах

Как видно из приведенных данных, сыворотки, имеющие более высокие титры антител к ВПГ, определенные методом ИФА, имеют также несколько более высокие значения титров вируснейтрализущих антител.

Таким образом, учитывая полученные данные, нам представляется целесообразным в качестве исходного сырья для производства препарат?, противогерпетического иммуноглобулина человека использовать предварительно оттитрованные сыворотки крови индивидуальных доноров с наиболее гысоким содержанием антител к ВПГ.

Следующий этап работы состоял в получении препарата противогерпетического иммуноглобулина человека из предварительно отобранных сывороток'крови индивидуальных доноров. С помощью иымуно-

ферментной тест-системы производства ШС "Биосервис" нами было отобрано 56 сывороток крови доноров с титрами антител к ВПГ около 1:64000. Отобранные сыворотки были объединены в 3 партии объемом по 5 л каждая. Препарат противогерпетического иммуноглобулина получали на Предприятии 1ШИИЭМ им. Г.Н.Габричевского путем обработки сывороток холодным этанолом по методу Кона. Были получены 3 серии препарата. Результаты определения специфической активности полученного препарата представлены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание антител к ВПГ в исходном сырье и в 3-х экспериментально-производственных сериях препарата противогерпетического иммуноглобулина человека. *)

N Препарат противо- Препарат

серии Исходное сырье герпетического нормального

иммуноглобулина иммуноглобулина

ИФА РН ИФА РН ИФА РН

1 64000 100 640000 800 160000 200

2 64000 200 1280000 800 160000 100

3 64000 100 640000 400 320000 200

М±ш 64000 130±20 850000*180000 660±110 210000±44000 170*30

*) титры прнЕЗдеш в обратных величинах

Изучение специфической активности препарата противогерпетического иммуноглобулина показало, что данный препарат обогащен герпесспецкфическини антителами, титр которых, определенный в ИФА, з 4 раза превышает средние титры антител к ВПГ в коммерческих препаратах нормальных ишукоглобулинов. Исследование препарата в реакцки нейтрализации такхе показало более высокие титры вируснейтрализувднх антител по сравнению с препаратами нормальных иммуноглобулинов (в 4 раза).

Изучение препарата протиБогерпеткческого кю.5уноглобулина к е-

тодом электрофореза в поли акрил амидном геле показало, что в данном препарате фракция иммуноглобулинов составляет около 97% от общего белка, что соответствует требованиям, предъявляемым к коммерческим препаратам иммуноглобулинов.

При определении антигенного состава полученного препарата методом ИЭФ было показано, "что препарат протавогерпетического иммуноглобулина состоит, в основном, из 1(Х1 и содержит лишь незначительные количества ЮА и. ЮМ.'

Методом гельфильтрации на сефадексе С-200 выявлено, что мономеры и димеры 103 в полученном препарате составляют около 92%, агрегаты ЮТ - не более ЗЯ, фрагменты ЮТ - около 5%.

Изучение стабильности препарата противогерпетического иммуноглобулина при хранении," проводимое с применением приема термического старения, показало, что данный препарат можно хранить без потери его специфической активности в течение 2 лет (таблица 3).

Таблица 3. Изучение стабильности препарата противогерпетического иммуноглобулина при хранении.

N Титр антител к ВПГ, определенный методом ИФА с использо-серии ванием тест-системы производства НПС "Биосервис"

О 1 месяц 37аС 2 месяца 37сС 3 месяца 37°С

1 1 : 640000 1 : 640000 1 : 640000 1 : 320000

2 1 : 1280000 1 : 1280000 1 : 1280000 1 : 640000

3 1 : 640000 1 : 640000 1 : 640000 1 : 640000

Таким образом, .па основе предварительно отобранных сывороток крови индивидуальных доноров, имеющих повышенное содержание гер-песспецвфических ИХ', нами был получен препарат противогерпетического иммуноглобулина, предназначенный для наружного и внутримышечного применения, соответствующий требованиям, предъявляемым к коммерческим препаратам нормальных иммуноглобулинов.

Однако донорская кровь становится' с каждая« годом все более

дорогостоящим видом сырья. Это определяет необходимость развития технология. Предусматривающих максимально полное использование данного источника сырья. Как известно, основным современным производственным методом получения дрепаратов иммуноглобулинов человека является метод Кона, включающий фракционирование сыворотки или плазмы крови этанолом при низких температурах и различных значениях рН и ионной силы раствора. При этом образуется ряд балластных фракций. Как было показано ранее.одна из этих балластных фракций - фракция III или осадок Б - содержит некоторую часть IGG (И.В.Борисова, 1976), что позволяет рассматривать ее как перспективный дополнительный источник иммуноглобулинов человека.

В связи с этим одной из задач диссертационной работы явилось изучение возможности использования осадка Б в качестве дополнительного источника сырья для производства препарата нротивогерпе-тического иммуноглобулина человека. Было исследовано содержание герпесспецифических IGG в 20 сериях осадка Б. Экстракцию иммуноглобулинов из осадка осуществляли таким образом, что 1 л экстракта соответствовал 2,5 л исходной сыворотки. Было показано, что осадок Б содержит герпесспецифлчехие IGG, средний титр которых при определении в иммуноферкентной тест-системе производства фирмы "Virion" составляет 4500 ± 400, что в 1,5 раз ниже средних титров антител к ВПГ в исходной сыворотке. Поскольку в процессе получения осадка Б и при проведении экстракции из него иммуноглобулинов осуществлялось концентрирование в 2,5 раза по сравнению с исходной сывороткой, мосно полагать, что при фра:щионировании сыворотки по методу Кона в осадок Б переходит около 20% герпесспецифических IGG.

Следующий этап работы состоял в разработке технологии получения препарата противогерпетического иммуноглобулина из осадка Б. Для этой цели была использована частично модифицированная нами схема получения комплексного иымуноглобулинового препарата (И.В.Борисова, 1989.). Основные стадии фракционирования представлены на рис.2 и заключаются в следующем:

1. Получение водного экстракта с 1Я-ным содержанием белка из осадка Б путем суспекднрозания 1 кг осадка в 10 л охлажденной апирогенной дистиллированной воды. рН смеси устанавливали 5,2. Не-

растворимые примеси удаляли центрифугированием.

2. Обработка полученного водного экстракта осадка Б хлороформом (из расчета 1% по объему) и декстрансульфатом (конечная концентрация 0,1%) с целью удаления балластных фракций, в том числе фракции липопротеинов.

3. Дальнейшая очистка и осаждение фракции IGG при помощи ступенчатого фракционирования полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был использован ПЭГ с мол. весом 6000 фирм "Serva" (Гермапия). Фракционирование проводили последовательно 2% и 6%-ым раствором ПЭГ из расчета по объему. Осадок удаляли фильтрацией через фильтры фирмы "Millipore" (США) с - 0,45. pH раствора .устанавливали 8,0.

Осуждение фракции иммуноглобулинов проводили при конечной концентрации ПЭГ 13%.

Полученный осадок иммуноглобулинов после промывания охлажденной апирогепЕой дистшшрованной водой, подкисленной до pH 5,0, растворяли в 0,15!.! NaCl до содержания белка 5%. После удаления нераствормшх примесей к раствору добавляли в качестве стабилизатора глюкозу до конечной концентрации 2%. После стерилизующей фильтрации через миллшгаровые фильтры (у - 0,2) препарат иммуноглобулинов разливали по ампулам и лиофялизировали. Было получено 5 экспериментальных серий препарат иммуноглобулинов.

Результаты изучения специфической активности препарата иммуноглобулинов, полученного из осадка Б, показали (таблица 4), что средние титры антител к БПГ в данном препарате, определенные методом ИФА в тест-системе ЯПС "Биосервис", составляют 1:256000, что несхолько превышает средние значения титров антител к ВПГ в препаратах нормальных иммуноглобулинов (таблица 6). Титры ви-руснейтрализупцих антител в препарате, полученном из осадка Б, также в 2 раза превышают средние титры вируснейтрализующих антител в препаратах норкальных иммуноглобулинов.

Рис.2 Схема получения препарата иммуноглобулинов из осадка Б.

ОСАДОК Б

С^спендирование в дистилированной воде

ПЕНТРИФУГАТ Хлороформ 1%, рН 5,5 Декстранс^льфат 0,1%

ПЕНТРИФУГАТ Полиэтиленгликоль М.В. 6000 27.

ПЕНТРИФУГАТ Полиэтиленгликоль М.В. 6000 67.

ПЕНТРИФУГАТ Полиэтиленгликоль М.В. 6000 13%

ОСАДОК

Промывание дистиллированной водой,

PU 5,2 Ра

Растворение в 0,15М NaCl

ПЕНТРИФУГАТ Глюкоза 2%, рН 7,2 Осветляющая и стерилизующая фильтрация

. ПРОТИВОГЕРПЕГИЧБСКИЙ IGG " IGG - 977.

При исследовании препарата иммуноглобулинов, полученного из осадка Б методом ИЭФ, выявляется интенсивная линия преципитации, соответствующая IGG, и следовые количества IGA и IGM.

Методом ЭФ в ПААГ было определено, что в данном препарате на долю иммуноглобулинов приходится около 98% от общего белка.

Методом гельфиьтрации на сефадексе G-200 обнаружено, что в исследуемом препарате мономеры и ликеры IGG составляют около 90%, на долю агрегатов IGG приходится около 4%, фрагменты IGG составляют около 6%. Таким образом, по составу и тшунохимкческой чистоте препарат'иммуноглобулинов, полученный из осадка Б, соответствует требованиям, предъявляемым к коммерческим препаратам иммуноглобулинов человека. *

Таблица 4. Определение специфической активности препарата иммуноглобулинов, полученных из осадка Б. «)

Титр антител к ВПГ, N определенный в ИФА

серии -:-

в исходном сырье в препарате

иммуноглобулинов

Титр вируснейтрали-зущих антител в

препарате иммуноглобулинов

1 16000 256000 400

2 16000 256000 400

3 8000 128000 200

4 32000 512000 400

5 8000 128000 200

М±т 16000 * 4000 250000 ± 64000 320 ± 40

*) титры приведены в обратных величинах

Одной из важнейших характеристик препаратов иммуноглобулинов является содержание в них различных подклассов ЮС. Нами было определено процентное содержание подклассов в экстракте осадка Б, в препарате иммуноглобулинов, полученном пз осадка Б, а такзе в пргпаратах коммерческих нормальных иммуноглобулинов, полученных по методу Кона. Определение проводили методом РИД по Манчзни (таблица 5).

Как видно из представленных данных, з препаратах иммуноглобулинов, полученных по методу Кона, снижено содержание 3 и 4 подкласса 1СЙ по сравнению с сывороткой крови. Подобные результаты бшш получены рэлзз и другкж исследователями ( БкУагП Р, 1986). В то та вргыя; в осадке Бив полученном из него препарате иммуЕОглобуллНоз процентное содержание данных подклассов увеличено. Подобное обогэдглиз 3 и 4 подклассами ГОЗ является преимуществом препарата ижуноглобулинов, полученного из осадка Б, по сравнении с коммерческими препаратами иммуноглобулинов, получен-

ными по методу Кона, поскольку известно, что при многих вирусных заболеваниях, в том числе при рецидивируицей герпетической инфекции, противовирусные антитела представлены, как правило, 1, 3 и 4 подклассами 1С£.

Таблица 5. Распределение подкласссов КК в препаратах иммуноглобулинов и в осадке Б, определенное методом РИД.

Подклассы 1(& {7.\

Образец -

1«П 1СС2 ¡¿СЗ ЮС4

Сыворотка крови 58,1 ± 0,8 28,1 ± 1,5 8,8 ± 0,7 5,1 ± 0,7

Осадок Б 60,0 ± 0,8 19,6 ± 1,3 8,6 ±0,7 11,6 ±. 0,8

Препарат имну- 59,4 ± 1,7 17,8 ± 1,9 11,4 ± 0,9 11,5 ¿0,8

ноглобулина,

полученный из

осадка Б • *

Препарат нормаль- 66,3 ± 0,8 29,0 ± 0,8 3,3 ± 0,4 1,4 ± 0,2 ного иммуноглобулина, полученный по методу Кона

Таким образом, на основе разработанной наш схемы из осадка Б был получен препарат иммуноглобулинов, содержащий антитела к ВПГ и обогащенный 3 и 4 подклассами 1(&. Принимая во внимание та, что данный препарат состоит более ^ чем на 95% из.103 ,и содеригт лишь следовые количества ЮА и ЮМ, можно предполагать, что после соответствущей обработки на его основе может быть .создан . эффективный препарат иммуноглобулинов, предназначенный для внутрйвен-

ного введения, который может быть использован для профилактики и лечения герпетических инфекций.

Однако нало отметить, что получение препарата противогерпе-ткческого иммуноглобулина человека из предварительно отобранных сывороток крови индивидуальных доноров, а также из балластного осадка Б сопряжено с определенными трудностями, связанными с необходимостью титрования большого количества донорских сывороток и проведением дополнительной очистки осадка Б при извлечении из наго иммуноглобулинов.. В связи с этим одной из задач диссертационной работы явилось исследование содержания герпесспецафичесгах антител з коммерческих препаратах нормальных иммуноглобулинов человека с целью выяснения возможности их использования для профилактики и лечения герпетических инфекций.

Было исследовано содержание антител к БОГ в 120 сериях препаратов иммуноглобулина человека нормального, произведенных Предприятием МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, а также в 20 сериях препаратов иммуноглобулина человека нормального, произведенных предприятиями Минска, Клева, Харькова, Казани. Все исследуемые препараты иммуноглобулинов были получены по методу Кона. Определение содержания антител к ВПГ проводили методом ИФА в тест-системе производства НПО "Биосервис". Следует отметить, что нами не было обнаружено значимых различий в содержании антител к ВПГ в препаратах иммуноглобулинов, произведенных в разных городах.

Результаты определения содержания антител к ВПГ в коммерческих препаратах иммуноглобулина человека нормального представлены на рис.3.

Как видно из полученных данных, большая часть исследованных препаратов имеет титры герпесспецифических антител от 1:80000 до 1:320000. В то же время около 7% препаратов тлеют титры боле?! 1:640000, что в 3-6 раз прекгпазт средине значения и соответству ег титраы антител к ЗПГ в препарате противогерпетнческого иммуноглобулина, получением из предварительно отобранных «лворег^л. крови индивидуальных доноров.

Было отобрано 10 серий препаратов иммуноглобулина человека нормального с титрами антител к ВПГ от 1:640000 до 1:1280000.

Рис.3. Распределение герпесспецифических антител в ческих препаратах нормальных иммуноглобулинов

%

-50

коммер-

40000 80000 160000 320000 640000 1000000 Обратные значения титров препаратов

Отобранные серии были исследованы в реакции нейтрализации. Для сравнения проводилось определение вируснейтрализущих антител в 10 сериях коммерческих препаратов нормальных иммуноглобулинов со средними титрами антител к ЕПГ. Результаты представлены в таблице 6

Было установлено,' что препараты иммуноглобулинов, имеющие титры антител к ВПГ, определенные методом ЕФА, 1:640000-1:1280000, также проявляли большую активность (в 4 раза) в реакции нейтрализации по сравнению с препаратами, имеющими в ИФА средние титры антител к БОГ. Отобранные серии препаратов иммуноглобулинов были переданы в НИИ трансплантологии и искусственных органов, в ЦКВИ км. В. Г. Короленко и в институт ревматологии для клинических испытаний.

В настоящее время известно, что во многих случаях герпетические инфекции развиваются на фоне высоких концентраций гер-песспецифичесхих антител, присутствующих в крови больного. Предполагают, что недостаточная эффективность гуморального иммунного ответа больного мохет объясняться как более низкой аффинностью противогерпетических антител у таких больных, обуславливающей образование легко диссоциирующих иммунных комплексов, так и частичной селективной недостаточностью гуморального ответа организма при герпетических инфекциях, выражающейся в неспо-

собности организма синтезировать антитела к определенным эпитопам вируса (На.зз1% А, 193?) .В соответствии с данными гипотезами роль препаратов иммуноглобулинов при герпетических инфекциях сводится как к замещении низкоаффинных вирусспецифических антител противогерпетическими аптитзлами с физиологически нормальной аффинностью, так и к предоставлению герпесспецифических антител, отсутствующих в организме больного.

Таблица 5. Содержание герпесспецифических антител в коммерческих препаратах нормальных иммуноглобулинов человека.

Серии препаратов со сред- Серии препаратов с высокими N ни,л титралш в ИФА») татрами в ИФА п/п -

ЯФА РЕ ИФА РН

1 160000 200 640000 800

2 160000 100 640000 800

3 320000 200 640000 800

4 80000 50 640000 400

5 160000 100 1280000 800

6 160000 100 649000 400

7 320000 400 12800С0 800

8 160000 100 640000 400

9 160000 100 640000 200

10 320000 200 640000 800

М±т 200000*25000 160±30 800000±80000 620*70

*) Приведены обратные значения титров.

В связи с вышеизложенным одной из задач диссертационной работы явилось изучение аффинности герпесспецифических антител в отношении ВПГ у больных с различными формами герпетической инфек-

ции и у здоровых доноров, а также исследование влияния препарата противогерпетического иммуноглобулина человека, полученного нами путем титрования коммерческих серий нормального иммуноглобулина человека, на аффинность антител к ВПГ в организме больных при лечении их данным препаратом.

Надо отметить, что препарат противогерпетического иммуноглобулина в большинстве случаев положительно влиял на общее состояние больного и выраженность характерных симптомов заболевания. Бри этом, как правило, наблюдалось увеличение периода ремиссии и более мягкое течение заболевания в период последующего обострения.

Определение аффинности антител проводили методом ПФА с использованием различных концентраций тиоцианата калия, вызывающего диссоциацию иммунных комплексов антиген-антитело.

Проведенные исследования подтвердили, что уровень антител к ВПГ в сыворотках крови больных практически не отличается от уровня противогерпетических антител в сыворотках здоровых доноров. При дальнейшем определении аффинности герпесспецифических антител было обнаружено, что по мере увеличения концентрации КЗСИ происходит постепенная диссоциация иммунных комплексов, образованных противогерпетическими антителами как больных, так и здоровых людей. При этом динамика разрушения шмунных комплексов, образованных противогерпетическими антителами больных людей не отличалась ни по своему характеру, ни количественно от динамики диссоциации иммунных комплексов, образованных герпесспецифичсскими ан-титела.чи здоровых лиц. Внутримышечные инъекции препарата противогерпетического иммуноглобулина, аффинность которого была сравнима с аффинностью герпесспецифических антител, присутствующих в крови больных и здоровых людей, несмотря на его выраженную клиническую эффективность, также не вызывали поежония уровня аффинности к ВПГ у больных с герпетическими инфекциями.

Проведенные исследования позволяют предполагать, что аффинность герпесспецифических антител не является решающим фактором, определяющим зффестивность гуморального иммунного ответа, развивающегося в организме при герпетической инфекции. Принимая во внимание необходимость дальнейшего исследования данного вопроса, шесте с тем кажется более вероятным, что именно частичная селек-

тивная недостаточность гуморального иммунного ответа больного является одной из основных причин малой эффективности всей популяции герпесспыхифических антител, синтезируемых в организме больного при герпетической инфекции.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны теоретические и экспериментальные основы получения препарата направленного действия-противогерпетического иммуноглобулина человека.

2. Выявлены закономерности распределения герпесспецифических антител в популяции населения России. Установлено, что около 8% населения имеет повышенное содержание антител к ЕПГ.

3. На основе отобранных сывороток крови индивидуальных доноров с повышенным содержанием антител к ВПГ получен и охарактеризован препарат противогерпетического иммуноглобулина, обогащенный герпесспецяфкческими антителами.

4. Показана возможность использования балластной фракции III (осадок Б), образующейся при фракционировании сыворотки крови по методу Кона, в качестве дополнительного источника герпесспецифических иммуноглобулинов.

§ 5. Разработана модифицированная схема выделения иммуноглобулинов из балластной фракции III и на ее основе получен и охарактеризован препарат иммуноглобулинов, обогащенный 3 и 4 подклассами IGG.

6. Исследовано содержание герпесспецифических антител з коммерческих препаратах нормальных иммуноглобулинов человека. Показано, что около 77- серий препаратов иммуноглобулинов характеризуются повышенным (в 3-6 раз) содержанием антител к ВПГ.

7. Исследована аффинность герпесспецифических антител в сыворотках больных с различными формами герпетической инфекции л здоровых доноров. Показано отсутствие значимых различий в аффинности антител к ВПГ у больных.л здоровых лиц.

Список опубликованных работ по теме диссерации:

1. Кострова О.М., Даргеева Т.А.Выделение подкласоз IGG человека с помощью гидрофобной хроматографии из сивор.гдж больных мл-

ело.'.'сп;// Тез. докл. конф. молодых ученых МНИИЗК им. Г.Н.Габрпчев-ского - 1988.- KPI - Раздел III.- i.' 8.- Публ.3044.

2 Луганская Е.Л., Пинегпн Е.В.,Алёшкик В.А., Кострова O.K. Индукция иммунорегуляторных клеток человека.с помошно различных субклассов человеческого IGG// Иммунология - 1990.-К 2.-C.28-3I.

3 Кострова 0.15., Львов Н.Д., Алёшкин В.А., Баринский И.Ф. Гамма-глобулины в профилактике и.терапии герпесвирусных инфекций// Вопросы вирусологии - I99I.-JÜ 3.-G. 182-187.

4 Кострова О.М. Иммуноферментное тестирование антител к вирусу простого герпеса в различных образцах биологического сырья. // Тез. докл. конф. молодых ученых МНИЙЭМ им.Г.Н.Габричевского -I99I-- МРЖ - Раздел IH.-Je 4-6.- Публ.1417.

\