Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноферментный анализ для определения антител к HAEMOPHILUS INFLUENZAE

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

им. И.И.Мечникова

рг Г) ОД-

_ . _ На правах рукописи

2 7 ВИЯ «97

КОЛМОГОРОВА Ольга Валерьевна

УДК: 576.8.097.2.001.5:576.851.46/214

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К HAEMOPHILUS INFLUENZAE

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакци и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ-

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Л.Н.Падюков ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ-

доктор биологических наук Кувакина В.И. кандидат медищшских наук Чулок Т.А. ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ-

Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи

Защита состоится "Z0" ¿^с^рл/^Л_199 7-г. на заседани

специализированного совета (Д 001.38.01) при НИИ вакцин сывороток им.И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064, г.Москва, Малы Казенный переулок, д.5а.

Автореферат разослан "/4 " ,jLK-^yvsJI_199 7-г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин : сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

s

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема изучения инфекций, вызываемых I.influenzae, до сегодняшнего дня остается актуальной. Это )öyсловлено прежде всего широким распространением заболеваний ге-юфильной этиологии (острые и хронические инфекции респираторного :ракта, воспаление среднего уха, менингит) (Montgomery J., 1990). йиболее подвержены гемофильным инфекциям дети, пожилые люди и патенты С иммунодефицитными СОСТОЯНИЯМИ (Robbins, 1973; Schlam Н, ЛП9) .

Диагностика гемофильных инфекций в настоящее время не являет-:я решенной проблемой. Частое носительство условнопатогенных мкроорганизмов, ассоциации различных видов бактерий, выявляемые от время заболеваний, а также раннее применение антибиотиков снимет диагностическую значимость бактериологических методов (кгедег 1., 1980). Выявление антигенов н.influenzae также не всегда информативно, поскольку не при всех формах патологии возможно их об-[пружение в сыворотке крови или других стерильных гладкостях макро-Фганизма (Burman l., 1994). В этом случае определение в сыворот-:ах крови больных антител к возбудителю обладает рядом преиму-[еств. Серологические методы позволяют установить этиологическую ■начимость бактерий, а также дают возможность более глубокого изу-:еш1я иммунного ответа во время развития инфекционного процесса

Yainanaka П., 1993).

Серологическая диагностика гемофильных инфекций связана со начительными трудностями. Эти трудности возникают прежде всего :з-за отсутствия видоспецифичных некапсульных антигенов н.influenae, представленных на всех штаммах микроорганизма (Murphy т., 987). В настоящее время при серологическом анализе используется пределение антител к капсульным полисахаридам бактерий

(Kristensen К., 1992). ОДНЭКО, уВОЛИЧОНИв ДОЛИ НеКЭПСуЛЬШХ форм выделяемых в настоящее время при гег/.офилышх инфекциях, диктую необходимость использования различных некапсулышх антигене:

Н.influenzae При ДИаГНОСТИКв (Claesson В., 1992).

В связи с этим, ЦЕЛЬЮ настоящего исследования было изучешк возмонагости использования различных антигенов н.influenzae Re-гликолипида грамотрицательных бактерий для шлмуноферментноп анализа антител у больных с инфекцией, вызванной н.influenzae.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следуюшп ЗАДАЧИ:

1. Выделить препараты различных антигенов н.influenzae i Re-ГЛИКОЛИПИДа.

2. Изучить состав и иымунохимические свойства получении; препаратов.

3. Разработать системы для иммуноферментного анализа на основе отдельных антигенных препаратов н.influenzae и Re-гликолипида.

4. Исследовать с помощью разработанных систем уровень антите. у здоровых детей разных возрастных групп, а также больных с различными фирмами инфекционных заболеваний, вызванных «.influenzae i другими условнопатогенными бактериями.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Уровень антител к некапсульным антигенам н.influenzae, определяемый в ИФА на основе суммарных препаратов дезинтегратов, является индикатором развития патологическогс процесса, связанного с этим возбудителем.

Антитела к белкам внешней мембраны н.influenzae у детей с хроническими заболеваниями респираторного тракта присутствуют i большей концентрации, чем у здоровых детей.

Уровень антител к Re-гликолипиду у детей с муковисцицозол значительно выше, чем у детей с хроническими заболеваниями респи-

заторного тракта и у здоровых детей.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Использование суммарных препаратов дезинтегратов в качест-зе антигенных препаратов адекватно при создании иммуноферментной системы для определения антител к некапсулышм антигенам

I.influenzae.

2. Способ создания иммуноферментной системы для определения знтител к некапсульнш антигенам н.influenzae.

3. Способ создания иммуноферментной системы для определения татител к Re-гликолшшду грамотрицателышх бактерий.

4. Способ создания иммуноферментной системы для определения штител К капсулыюму полисахариду н.influenzae типа ь.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработаш ш.эдуноферментные системы для определения антител к капсульнсму полисахариду типа ь ,i некапсулыгым антигенам н. influenzae. Апробашш систем показала ,ix высокую специфичность и чувствительность при анализе сывороток тетей с инфекциями респираторного тракта. Системы могут быть лспользованы для подтверждения гемофнлыгой этиологии заболеваний.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Отдельные фрагменты диссертационной работы Зыли изложены на конференции "Современные направления создания медицинских даагностикуглов" (Москва, 1990), xv международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), съезде врачей лаборантов (Москва, 19Э5), xxvi конференции скандинавского общества иммунологов (Гетеборг, 1995), viii международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, 1996), конференциях молодых ученых НИИВС игл.И.И.Мечникова (Москва, 198Э, 1990, 19994). .Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимической диагностики HIM ВС им.И.И.Мечникова РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация включает введение три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводи и список литературы. Работа содержит 162 страницы машинописногс текста, 12 таблиц, 26 рисунков. Список литературы содержит 20£ наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 4 штамма н.influenzae (капсульные типа ь 11/64 и 118 и бескапсульные 1599 и 2199), а также мутантны! штамм S.minnesota Re 595.

Для иммунохимических исследований применяли коммерческие антисыворотки кроличьи к шести известным серотипам н.influenzae (Difco, США), ослиную антисыворотку против Н.influenzae ТИПЭ I (fda, США), антисыворотки мышиные, полученные в ходе выполнена настоящего исследования, а также 20 сывороток крови взрослых доноров, 84 сыворотки крови здоровых детей и 284 сыворотки крови больных детей с заболеваниями респираторного тракта.

Суммарные препараты некапсульных антигенов н.influenzae получали замораживанием-оттаиванием и ультразвуковым разрушением. Препараты белков внешней мембраны н.influenzae выделяли с помощью методов, разработанных Murphy (1985) и carlone (1986). Препаратк капсульного полисахарида H.influenEae типа ь получали по методу Андерсона (1977). Выделение препарата Re-гликолипида проводили с помощью метода, разработанного Gaianos (1969).

В полученных препаратах определяли содержание бежа по методу Лоури (1951), нуклеиновых кислот по методу Спирина (1958), пентоэ орциноловым методом (Anderson р., 1976) и КДО - в реакции с тиобарбитуровой КИСЛОТОЙ (osborn М., 1963).

Иммунохимическую активность антигенных препаратов определяли

с помощью методов двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, ракетного нммуиоэлектрофюреза по Лоуреллу, иммуноблотинга, в реакщш торможения пассивной гемагглютинации (Фримель, 1979).

При разработке иммуноферментных систем бил использован твердофазный непрямой Еариант НФА. В качестве конъюгата применяли антитела против иммуноглобулинов g человека, кролика или мыши, ме-icinnie перокспдазой. Субстратом для пероксидазы слу;::ила перекись водорода, а индикатором ферментативной реакции Фтофенилендиамин.

Специфичность и чувствительность иммуноферментшх систем шрзделяли при помехи метода Giyn л. (1952).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе шпалшш работы б:тлн рззрабэтгпа :::-лупсфзр:'знт;2:е :нстс!"1 для определена сывороточных антител класса g против смпсулыгаго полисахарида ».influenzae типа ь, а тагг:е против 'окопсулышм антигенов на основе дезинтегратов н.influenzae и ¡ч-глпколипида.

I. Пммуноферуснтжй анализ для определения антител против капсульного полисахарида н.influenzae типа ь.

Эффективность проведения серологического анализа антител к' сдельным антигена;.! определяется главным образом качеством исполь-¡уемого антигенного препарата. На первом этапе создания кглунофер-юнтпой системы для определения антител против капсульного полиса-арида н.influenzae т:ша ь решалась задача получения очищенного умунохимически активного препарата полисахаридного антигена. Вы-елешю капсульного антигена проводили с помощью метода Андерсона 1977), основанного на осандении полисахарида цетавленом с после-ующей экстракцией его из осадка солевыми растворами возрастающей онной силы. В работе был использован штамм н.influenzae типа ь

11/64 из коллекции П'СК ш.Тарасовича. Химический анализ препарата (таблица I, проба 7) выявил низкое содержание риОозы - специфического компонента полисах^ща иЛшПиепя.ю типа ь и присутси>:.о прлмссей белков и нуклзшюшх кислот. Кроме того, сравнен;-.-;: п.л:у-кохимпческой активности полученного препарата и кожорноского препарата капсульного полисахариде. (Пастор Марье, Сранцин) с селинеи антисывороткой против п. influenzae типа ь в ракетном иммуно-электрофорезе позволило установить, что в выделенном препарате содержится всего 1,5,1 сшщгфчесгл активного шиксахарэдюго антиг«-на. Таким образом, приведенные данные позволяют сделать заключение о не эффективности метода Андерсона при выделении капсульного полисахарида Н.influenzae ТИПа Ь В НЗШИХ условиях. ОЧОВИДНО, TSKOi: результат может быть объяснен особенностями использованного ктем-ма, либо недостаточно подробным описанием метода б открытой лите--ратуре.

Таблица I.

Химический состав и активность препарата капсульного полисахарида н.influenzae Tiuia ь на разных стадиях его выделения

Ii проб, стадии выделе 1шя препарата Активность В РТПГА (МНД в мкг) Нуклеиновые кислоты (%) Белок (%) Пантоз^ {%)

1,осаждение ацетоном 2,осаждение цетавлоном 3, экстрагирование O.In iiaci 4,экстрагирование 0.2м iiaci 5,экстрагирование 0.3м Nací 6.экстрагирование 0.4м Haci 7,экстрапфование 2.0м Nací iУ^2 500+11 125+4 1.1+0.05 I.1+0.02 19+3 125+10 0.B0+U.08 0.30+0.02 0.60+0.03 0.16+0.03 0.30+0.04 0.65+0.05 0.81+0.07 9.6+0.i 7.5+0.4 4.0Ю.З 2.0+0.2 2.5+0.3 3.7+0.4 6.0+0.2 "2.45+1ПТС I.57+0.02 4.96ьО.Ос 6.70+0.04 6.10+0.ОС 6.30+0.03 1.701-0.1С

РТПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинацип МИД - минимальная нейтрализундая доза

С целью отработки оптимальной схемы получения иммунохимичеекк активного капсульного полисахаридного препарата с высоким содержанием рибозы, мы провели определение серологической активности I:

химического состава препарата на всех стадиях выделения по метода Андерсона (таблица I). Прсме:куточные образцы, получаемые на стадиях экстрагирования препарата 0,2М я О.ЗМ раствором н ci (проби 4 н 51 содорзэт максимальное среди проанализированных проб количество рибозн, па™.'евьг.с9 количество прга;.зсей другой химической природа, обладают пэгслснктеЗ нейтрализуйся дозой в реакции торможения пасснргой гемпгг.готлюиЕИ и проявляют изибольпую пммунохимическую пкятнзеть в poarauL': ракетного геслумсглсктропореза с сслиной гнтк-(лп-орохкой против п.influenzae типа ь. сзротгагапоя специфичность ::• гууяо.тгг.зпеской активности «ззбзшкх с'рагцср бчла цродзмонстри-rosana б Г?А с кродячкгм:! энтшгаороткггя против птэсти известных еоротнгов H.iniiuon- .с. лнтискгорсткэ против кзпеудкгого по.ихзха-

'•riroporrci ПР573Ш ДРУГИХ сероТИПОВ Н. ir.f 1иел:;ае .

Таким образом, пелуюшко дзлпко позволяют утверждать, что

при тсодпфпгашш метода Аидзрсоко, заключающейся в сокращении

гослзди:;:: зго зтйсоз (зкетпкцпл пг.спзрэтоз 0,-Т" и 2,С! ci),

tl

г.0г:.:07Н0 получение жлгушхг.'/дчесх: активных препаратов с високим еедзрлзнизм хапсулыюго полисахарида и.influenzae типа ь. Надо однако отметить, что выход препарата не велик. Бозко^о, оптимизация условий тявпрозлшя и, особенно, селекция ятагзла н. influenzae типа ь позволит увеличить выход препарата при использовании предложенного глетодз.

Так как возмогшая юлмунохимическая активность примесей, входящие«: в состав выделенного препарата, способна видоизменить интерпретацию получаемых в ИФА результатов, при создании ИФА для определения антител к копсулыгому полисахариду н.influenzae типа ь наш был использован не содержащий пршлесей полисахаридный препарат фирмы Пастер Мерье, применяемый для приготовления вакцины.

В модельных экспериментах с использованием кроличьей антиси-воротки против н. influenzae типа ь к сыворотки некрупного кролика были подобраны условия сорбции препарата и последующего проведения анализа. Показано, что оптимальным является сорбция конъ:игиро-ванного с полиэлектролитом антигешюго препарата в концентрации 12 мкг в мл фосфатного буферного раствора (рП 7.2) 18 часов при 4°С. Перед проведением анализа сенсибилизированные планшеты необходимо проинкубировать с фосфатным буферным раствором, содержащем 0.05Й твин-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Такие условия сорбции препарата и проведения ИФЛ позволяют достичь максимальной разницы активности сывороток иммунизированного и неиммунизированного кроликов при одновремешю относительно низкой активности сывороток неиммунизированного кролика и уровне неспецифических фоновых значений до 0.1 единиц оптической плотности.

Анализ активности референс-препарата с известной концентрацией антител против капсульного полисахарида н.influenzae типа ь позволил установить, что чувствительность анализа, проводимого в выбранных условиях, составляет 6 нг антител в мл, что сопоставимо с чувствительностью аналогичных коммерческих систем, выпускаемых западными фирмами.

Использование ИФА при диагностике инфекционных заболеваний предполагает четкую дифференцировку положительных и отрицательных результатов. При определении критериев оценки активности реакции сывороток крови был использован подход, заключающийся в выборе разведения исследуемого образца и границы между положительной и отрицательной реакцией, дающих максимальные значения чувствительности и специфичности анализа (Падюков Л., 1992). Исследование сывороток крови детей 6-12 лет с хронической пневмонией в стадии обострения гемофильной типа ь этиологии и детей той же возрастной

группы и с тем же заболеванием, но вызванным другими микроорганизмами позволило установить, что максимальные значения специфичности и чувствительности метода наблюдались при разведении сывороток 1:800 и при критерии оценки 0.45 единиц оптической плотности и составили 90% и 100% соответственно (рисЛ).

критерий 0.35 ед.ОП

критерий 0.45 ед.ОП

критерий 0.55 ед.ОП

разведение сывороток

Рис .1. Зависимость специфичности и чувствительности ИФА для определения антител к капсульному полисахариду II.influenzae b от разведения сыворотки и критерия оценки положительной реакции

1АМЫМ4Ы специфичности |......I чувствитетднос™

Значения специфичности и чувствительности иммуноферментных систем могут различаться в зависимости от анализируемых групп больных. Одними из основных причин этого, очевидно, являются возможные отличия в динамике и интенсивности антителообразовашш при некоторых формах инфекционного процесса и у детей разных возрастных групп. В связи с этим, нами была определена специфичность и чувствительность системы при анализе сывороток крови детей разных возрастов и с разными формами инфекционной патологии (табл.2).

Таблица 2.

Специфичность иммуноферментного анализа для определения антител К капсулыюму.полисахариду Н.influenzae типа ь.

Диагноз возраст (года) кол-во исследованных сывороток кол-во отрицательных реакций специфичность анализа, %

хронические заболевания респираторного тракта не гемофильной этиологии 3-6 6 6 100

хронические заболевания респираторного тракта не гемофильной этиологии 6-12 27 24 88,9+6,2

здоровые 3-6 22 22 100

здоровые 6-12 54 50 92,6+3,6

Всего 109 102 93,6+2,3

Были проанализированы сыворотки крови детей от 3 до 6 лет и от 6 до 12 лет с хроническими заболеваниями респираторного тракта и сыворотки крови здоровых детей тех же возрастов. Специфичность метода составила 100% у здоровых детей и детей с хроническими бронхолегочными инфекциями в младшей возрастной группе. В группах

детей от 6 до 12 лет этот показатель снизился и составил 93% в группе здоровых детей и 89% у больных. Как было показано выше при исследовании сывороток крови детей возрастом от 6 до 12 лет с хроническими заболеваниями респираторного тракта, вызванными капсуль-ными типа ь штаммами н.influenzae, чувствительность иммунофермент-пой системы составила 100%. Таким образом, представленные данные позволяют говорить о высокой специфичности и чувствительности разработанной иммуноферментной системы для определения антител к кап-сулыюму полисахариду н.influenzae типа ь у детей с хроническими бронхолегочными инфекциями.

2. Иммуноферглентная система для определения антител против некапсулышх антигенов н.influenzae.

Если при создании систем для серологической диагностики гемо-Гллышх типа ь инфекций выбор антигенного препарата не вызывает сомнений, то при подборе антигенов для анализа сывороток больных с заболеваниями, вызванными некапсульными штаммами, на сегодняшний день но существует однозначного решения. Отсутствие известных ви-цоспецифпчных некапсулышх антигенных структур делает не возможным лепользованке препарата какого-либо отдельного антигена I.influenzae. В этом случае возмо?сно, на наш взгляд, применение суммарных антигенных препаратов, таких как клеточные дезинтеграты, зыде легаше из аутоштамма, т. е.штамма, вызвавшего заболевание, либо 13 гетерологпчных штаммов. Возможность использования гетерологич-шх штатов обусловлена преобладанием небольшого количества штампов, циркулирунцих в определенных географических зонах и вызывающих основное количество заболеваний. Поскольку использование ауто-атамма является достаточно трудоемкой и дорогостоящей процедурой, лы остановили свой выбор на применении для исследования уровня антител против некапсульных антигенов н.influenzae дезинтегратов,

полученных из гетерологичных штаммов.

При создании иммуноферментной системы для определения антител против некапсульных антигенов на основе препарата дезинтеграта ге-терологичных штаммов было необходимо: разработать оптимальный метод разрушения клеток для последующего получения препарата, выбрать штаммы для его выделения, подобрать оптимальные условия сорбции препарата и проведения иммуноферментного анализа сывороток крови.

В литературе описано много способов разрушения бактериальных клеток. Однако, из-за особенностей строения поверхностных структур микроорганизмов различных видов они не являются универсальными. В связи с этим, при работе с клетками конкретного вида требуется проводить подбор адекватного метода их деградации. При выборе методов разрушения клеток н.influenzae для последующего получения препаратов дезинтегратов были проанализированы два способа: воздействие на клетки ультразвуком и замораживание - оттаивание. Ультразвуковую дезинтеграцию осуществляли при 22 кГц в течение 2,5 мин., поддерживая температуру в пределах 2-5°С. При применении метода замораживания - оттаивания клетки подвергали быстрому замораживанию при -40°С с последующим оттаиванием при комнатной температуре. Процедуру повторяли 8 раз. Эффективность разрушения клеток контролировали с помощью электронного микроскопирования. Показано, что ультразвуковое дезинтегрирование позволяет достичь разрушения большинства клеток н.influenzae, тогда как результатом действия замораживания - оттаивания является лишь "смывание" поверхностных клеточных структур. Таким образом, воздействие на клетки н.influenzae ультразвуком более эффективно по сравнению с замораживанием - оттаиванием в примененных режимах и приводит к более глубокой деградации клеток. Это позволило предположить, что в пре-

парате, полученном при ультразвуковом разрушении клеток, представлен более широкий набор антигенных структур. Поэтому мы остановили свой выбор на методе получения дезинтегратов клеток н.influenzae ультразвуковым разрушением.

Выявление антител, синтез которых был стимулирован различными штаммами н.influenzae, при помощи дезинтегратов предпологает присутствие в используемом препарате антигенов относительно часто представленных на распространенных на данной территории штаммах. Подбор штаммов для выделения дезинтегратов, в состав которых входили бы антигенные структуры с такими свойствами, был осуществлен на основании данных об иммунохимической активности дезинтегратов трех клинических изолятов (штаммы 118, 2191, 1599) и одного музейного штамма (11/64) н.influenzae в иммуноферментном анализе с сыворотками доноров. Использование сывороток доноров обусловлено тем, что у взрослых, как правило, имелся неоднократный контакт с н.influenzae и вследствие этого у них присутствуют антитела, синтез которых был стимулирован разными штаммами этого микроорганизма.

Предварительно в модельных экспериментах с использованием сывороток крови иммунизированных и неиммунизированных мыпгей была подобрана концентрация антигенных препаратов и условия их сорбции на полистироловые планшеты. Оказалось, что оптимальным является сорбция дезинтегратов в карбонат - бикарбонатном буферном растворе (рН 9.6) в концентрации 2 мкг/мл бежа, расчитанного по Лоури, на полистироловые планшеты в течение I ч при 37°С.

Анализ активности реакции сывороток крови доноров с ультразвуковыми дезинтегратами исследуемых штаммов в иммуноферментном анализе продемонстрировал, что наибольшее число сывороток крови с высоким уровнем антител выявляется при использовании пре-

паратов, выделенных из двух некапсулышх штаммов 2191 и 1599 (рис.2). Использование же смеси этих двух препаратов позволяет регистрировать в ИФА высокую активность всех анализируемых сывороток. Полученные данные позволяют предположить, что препараты де-зинтегратов двух штаммов содержат в своем составе антигены с высокой степенью штаммовой консервативности и использование их смеси в ИФА делает возможным выявление антител, синтез которых был стимулирован гетерологичными штаммами н.influenzae.

1.2

n 0.9 сэ

Q 0.С

О

0.3 0

III

• j* lh

О г*г •г* «to Ssfi Й <*

л Р!

¡4

11/64

1599 101

UO 1599 2191

номера штаммов H.lnfluenzae

Рис.2. Активность сывороток доноров с ультразвуковыми дезинтегратами H.influenzae в ИФА

Для исследования химической природы антигенов дезинтегратов, проявляющих иммунохимическую активность с антителами против гете-рологичных штаммов, был проведен анализ активности реакции в ИФА препарата дезшггеграта одного из выбранных штатов (2191), обработанного протеиназой К, с антисыворотками мышей против гомо- и ге-терологичных штаммов (рис.3). Для сравнения на графике показана активность реакции сывороток с препаратом обработанным и не обработанным ферментом. Активность реакции антисывороток с обработанным ферментом препаратом не отличалась от реакщш сывороток не-иммунизированных мышей. Очевидно, при использованной нами схеме проведения ИФА определяются антитела практически только к белковым

антигенам ».influenzae. Возможно, сенсибилизация планшетов в карбонат - бикарбонатом буферном растворе оптимальна для структур этой химической природы. Кроме того, полученные дагаше могут указывать на значимость антител против белковых антигенов микроорганизма при развитии иммунного ответа на введение животным клеток

Н.influenzae.

OD '192 1.G

1.2

0.0

0.4

Ы00 1:600 1:1600 1:3200 1:6400

разведение сывороток

Рис 3 Активность дезлнтсграта II.influenzae штаны 2191,

обработанного протенназой К, "с гомо- и гетерапогнчпыми мышиными антисыворотками в ИФЛ

антнсывороткн против Н.influenzae штамм:

11/04

11/04

2191

2191

1500

1G09

110

110

сыворотка неиымунизированной мыши

заштрихованные сиыволы-реакция сывороток с препаратом,

обработанным протенназой К не заштрихованные снмволы-реакция сывороток с препаратом, не обработанным протенпазой К

С целью выявления белков, иммунохимическая активность которых наиболее значима в суммарной активности препаратов дезинтегратов, был проведен сравнительный анализ активности в реакции иммуноблота сывороток крови детей больных хронической пневмонией, проявивших в ИФА выраженно положительную реакцию и слабо прореагировавших сывороток крови здоровых детей (рис.4, табл.3). В качестве антигена использовали препарат белков внешней мембраны штамма 1599, полученный нами- при использовании детергента саркозил по методу carlone (1986) и содержащий все основные белки внешней мембраны н.influenzae. Оказалось, что в сыворотках крови как больных, так и здоровых детей присутствуют антитела ко многим белкам внешней мембраны н.influenzae. Отличия касались концентрации антител, что оценивалось нами по интенсивности окрашивании отдельных полос. Кроме того, в сыворотках крови больных детей чащз присутствовали антитела к минорным белкам молекулярной массой 90, 52 и 43 кД. Надо отметить, что и в некоторых сыворотках крови здоровых детей выявлялись антитела к названным белкам. Таким образом, проведенное исследование не позволило выявить отдельные белки внешней мембраны, иммунохимическая активность которых определяет активность реакции сывороток крови больных с дезинтегратами в ИФА. Повышенная активность сывороток крови больных детей обуславливается большей концентрацией сывороточных антител к белкам внешней мембраны по сравнению с содержанием антител к тем же антигенам у здоровых.

Присутствие в сыворотках крови здоровых детей антител к не-капсульным антигенам н.influenzae является, вероятно, результатом формирования естественного иммунитета к условнопатогенным микроорганизмам вследствие их частого носительства в носоглотке детей. Это делает необходимым определение четкой границы между положи-

ЗД0Р0БЫЕ БОЛЬНЫЕ

РИС.4.

Реакция сывороток крови больных . и здоровых детей в иммуноблотинге с препаратом белков внешней мембраны н. influenzae штамм 1599.

(справа указана молекулярная масса стандартных белков)

Таблица 3

Активность реакции сывороток крови больных и здоровых детей с препаратом белков внешней мембраш н.influenzae штамм 1599 по данным иммуноблотинга.

м. м. Частота выявления {%)

кД

здоровые больные

(п=8) (п=12)

НО 100 92

90 12.5 83

76 100 100

52 25 67

43 37.5 92

37 100 100

16 100 100

тельной и отрицательной реакциями сывороток в имм/ноформентном анализе, которая позволит с высокой вероятностью выявлять сыворотки с повышенным вследствие развития иммунного ответа во время течения инфекции уровнем антител у больных по сравнению с фоновым уровнем у носителей.

Критерии оценки активности реакции сывороток в иммунофхзрмент-ном анализе на основе препаратов дезинтегратов двух иекансульшк штаммов определялись такие, как и для иммуноформентной системы для определения антител к капсульному полисахариду н.influenzae типа ь. Были проанализированы сыворотки крови больных с хронической пнвкдикзй в стада: обострения, вызванной кекапсулышки тта&камп

Н. influenzae, И С ТОМ £8 3000ЛЭВ8НП9М, КО ШЗЗаККЫМ ДРУГИМИ ШКрО-

организма:,«. Показано, что при разведении аналгпаууеквх сшюрою:: 1:800 и границе мз::ду полоштельшш и отрицательными реакциями 0.45 единиц оптической плстности специфичность и чувствительность анализа достигала максимальных значений.

Поскольку некапсульные ШТаММЫ II. influenzae ЯВЛЯЮТСЯ ОДНИМИ ИЗ наиболее распространенных этиологически: факторов при заболеваниях респираторного тракта у детей, целесообразным является определению антител к нскаисулышм антигенам именно при этих патологиях. Г, иммунофхэрментной системе для определения антител к некопсульшп антигена:.: н. influenzae были проанализированы сыворотки крови детей двух возрастных групп (от 3 до 6 лет и от 6 до 12 лет) больных хроническим бронхитом В стадии обострения, вызванным н.influenzae и другими микроорганизмами, а также хронической пневмонией в ста-дш1 обострения отдельно - гемофильной этиологии и с высевом только других микроорганизмов (табл.4, табл.5).

Таблица 4.

СкешЛгпюсть г-'лупоферментного анализа для определения антител к ископеулппхм антигенам нлпПиепгао.

Лнои.хсз возраст (года) кол-во исследованных СНВОрОТОК кол-во отрицательных реакций специфичность ана лиза, %

хроиичеекая п:;е::: :ония не геме^тлт.но:': этиологии 3-6 19 15 70,9+9,6

л ронпчеенея не ония не ге;.'оТ:Л.!п во!! этиологии 6-12 3.1 26 76,5+7 ,3

хронически ! Се, 'чхит не гемт;пл:_-чзй этиологии 6-12 22 91,7+5,7

здоров: :е 6-12 тг. 15 93,'-¿6,3

Всего 93 78 63,9+3, Б

Таблица 5. Чувствительность к:.";упо ферментного анализа для определения ЗНТПТСЛ К Ебкапсульншл оНТИГенал и. 1т1иепгае.

Диагноз 1 возраст 1(года) кол-во исследованных сывороток кол-во ¡10-лонительнцх реакций чувствительность анализа,%

хроническая пневмония ге::о1плыго;; этиологии 3-6 II 8 72,7+14,1

хроническая хьс! 'сипя гоно.'Хнлъпон этнологии 6-12 42 35 83,3+5,7

нроипческип оронхпт г е юЛтлыюЛ э тпо.хопи: 6-12 13 II 84,6+10,4

Всего , 66 54 81,8+4,7

Сугларнке значения специфичности и чувствительности в проанализированных грушах составили 84^' и 82;,; соответственно. Однако, эти показатели значительно отличались у больных с разными заболе-ватшми респираторного тракта и у детей разных возрастов. Специфичность метода при анализе сывороток крови детей 6 - 12 лет с хроническим бронхитом не гемофильной этиологии оказалась равной 92%, тогда как этот показатель в группе больных детей того же воз-

раста с хронической пневмонией составил 11%, а у детей младжей возрастной группы (от 3 до 6 лет) - 13%. Чувствительность анализа сывороток детей старшего возраста с хронически;.« бронхитами гемо-фильной этиологии также оказалась наибольшей (85Ä) по сравнению с сыворотками крови детей больных хронической пневмонией обеих возрастных групп (13% в младшей возрастной группе и 83Й в старшей). Таким образом, среди исследованных групп больных максимальные показатели специфичности и чувствительности при определении антител к некапсульным антигенам н.influenzae наблюдаются в группе детей 6 - 12 лет с хроническим бронхитом в стадии обострения. Однако, во всех проанализированных группах специфичность и чувствительность метода оказалась достаточно высокой, что делает возможным использование разработанной шлмуноферментной систем! ¿.ля определения антител к некапсульным антигенам н.influenzae на основе препаратов дезинтегрзтов двух нзкапсульных штаммов н.influenzae в качестве одного из методов подтверждения гемофильной этиолопш хронических заболеваний респираторного тракта.

3. Шлмуноферментный анализ для определения антител против г.с-глнколипида грамотрицательных бактерий.

Серологические мзтоды исследования позволяют не только в ряде случаев установить возбудителя заболеваний, но и дают возможность изучения иммунного ответа во время развития инфекционного процесса. Применение антигенных структур с межвидовой специфичностью позволяет анализировать закономерности гуморального иммунного ответа во время течения инфекций независимо от видовой принадлежности этиологических агентов. Преимущество использования таких антигенов очевидно при анализе серологических сдвигов во время течения полиэтиологичных заболеваний, вызываемых широким спектром ус-ловнопатогенных микроорганизмов.

У грамотрицателышх бактерий антигеном с межвидовой специфичностью является Re-гликолипид. В процессе исследования мы разработали иммуноферментную систему для определения антител к Re—гликолипиду и попытались оценить возможность ее использования при исследованиях иммунного ответа во время течения хронических заболеваний респираторного тракта. Проанализированы группы больных с хрошгаеской пневмонией и муковисцидозом, из мокроты которых высевались грамотрицательные бактерии (главным образом н.influenzae, p.aeruginosa, E.coii) и больные с теми же формами патологии, но с высевом только грамположительных микроорганизмов (в основном str. pneumoniae, S.aureus). В Группах бОЛЬПЫХ, ИЗ МОКРОТЫ КОТОРЫХ ВЫСевались грамположительные бактерии, положительные реакции наблюдались у 2 из 16 больных муковисцидозом и у II из 27 пациентов с хронической пневмонией (табл.6). Специфичность метода составила 88% и 59% соответственно. Повышенный уровень антител к не-гликолипиду в группах больных с теми же заболеваниями, но с высевом грамотрицательных бактерий, выявлялся у 36 из 44 (чувствительность 82%) и у 12 из 16 детей (чувствительность 75%) соответственно (табл.7). Необходимо отметить, что активность реакции сы-'вороток крови больных муковисцидозом была достоверно выше активности реакции сывороток детей с хронической пневмонией (0.65+0.05 и 0.45+0.03 единиц оптической плотности соответственно, р<0.05).

Таким образом, использование иммуноферментной системы для определения антител к Re-гликолипиду позволяет выявлять положительные серологические сдвиги в сыворотках детей при хронических заболеваниях респираторного тракта, что делает возможным ее использование при исследовании особенностей иммушюго ответа во время течения полиэтиологичных заболеваний, вызываемых грамотрицательшми бактериями.

Таблица 6.

Специфичность иммуноферментного анализа для определения антител к Re-гликолипиду грамотрицательных бактерий.

Диагноз возраст (года) кол-во исследованных сывороток кол-во отрицательных реакций специфичность анализа, %

муковисцидоз; из мокроты высевались грам-положительные бактерии 6-12 16 14 87,5+8,5

хроническая пневмония из мокроты высевались грамположительные бактерии 6-12 27 16 59,2+9,5

Таблица 7. Чувствительность иммуноферментного анализа для определения антител к Re-гликолипиду грамотрицательных бактерий.

Диагноз возраст (года) кол-во исследованных сывороток кол-во положительных реыций Чувствительность анализа, %

муковисцидоз; из мокроты высевались грам-отрицательные бактерии 6-12 44 36 81,8+5,8

хроническая пневмония из мокроты высевались грамотрицательше бактерии 6-12 16 12 75,0+11,2

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой и воспроизводимый способ получения иммунохимически активных суммарных препаратов некапсульных антигенов Н.influenzae.

2. Разработан ИФА для определения антител к некапсульным антигенам на основе суммарного препарата ультразвуковых дезинтегратов двух штаммов н.influenzae. Система обладает чувствительностью 82% и специфичностью 84%.

3. Разработана система ИФА для определения антител к капсульному голисахзриду н.influenzae типа ь, обладающая

специфичностью 94% и чувствительностью 100%.

4. Использование иммуноферментных систем на основе некапсулышх антигенов н.influenzae и капсульного полисахарида н. influenzae типа ь показало наличие положительных серологических сдвигов в сыворотках детей при хронических бронхолегочных инфекциях, что делает возможным использование систем в качестве дополнительных методов при диагностике инфекций, вызванных как капсулышми типа ь, так и некапсульными штаммами н. influenzae.

5. В сыворотках детей с гемофилыюй инфекцией и здоровых детей присутствуют антитела к белкам внешней мембраны н.influenzae, причем в сыворотках больных - в значительно большей их кощентра-цш. У больных детей также чаще определяются антитела к минорным белкам с молекулярной массой 90, 52 и 43 кД.

6. Разработан ИФА для определения антител к Re-гликолипиду грамотрицателышх бактерий. Анализ сывороток детей, проведенный с помощью разработанной системы, выявил наличие положительных серологических сдвигов в сыворотках детей при хронических заболеваниях респираторного тракта, что позволяет использовать систему при исследовании иммунного ответа во время течения полиэтиологичных "заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. "Г[ммук0ферментшй анализ для определения антител к Haemophilus influenzae серовара ь на основе бактериальных клеток". Колмогорова О.В., Каверина К.Г., Падаков Л.Н. ШШ, 1991, н8, стр.84-85.

2. "Бактериальные клетки Haemophilus influenzae В иммуноферментном анализе". Колмогорова О.В., Таранов В. А., Каверина К.Г., Падюков Л.Н. В сб."Современные методы

иммунохимической и молекулярнобиологической диагностики в медищше". 1992, Москва, стр.69-78.

3. "Antibacterial antibodies in patients with pulmonary diseases". Падюков Л., Колмогорова 0., Пугачева Н. В сб. "Abstracts of 12th European Immunology Meeting". Барселона, 1994, стр.391.

4. "Antibodies response of CF patients to respiratory

pathogens". Таточенко В., Уланова M., Колмогорова 0., Каширская Н., Шабалова Л., Падюков Л. Pediatric puimonoiogy, 1994, suppi.10, p.286.

5. "Antibodies to Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae and Re-glycolipid in children with CF". УлаНОВЗ M. , Колмогорова 0., Каширская H., Шабалова Л., Падюков Л. The European Respiratory Journal, 1994, v.7, suppl.18, p.1725.

6. "Antibodies to Re glycolipid in children with chronic pyelonephritis". Колмогорова 0., Падюков Л. scand. j. Immunol., 1995, V.42, p.626.

7. "Antibodies to Haemophilus influenzae non capsular antigens in children with chronic bronchopulmonary diseases". Колмогорова 0., Уланова M., Падюков Л. В сб."Abstracts of the 9th International Congress of Immunology ". 1995, стр. 597.

• 8. "Antibodies to outer membrane proteins of noncapsulated Haemophilus influenzae in cystic fibrosis patients". Pad^ukov L., Ulanova M., Kolmogorova O., Hahn-Zoric M., Strandvik В., Hanson L. Israel J. of Medical Sciences, 1996, v.32, suppl., p.S259.

9. "Antibodies to Re-glycolipid in children". Колмогорова 0., Уланова M., Кузнецова Е., Борисенко Ю., Костинов М., Падюков Л. В

Сб. "Abstracts of 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division", 1996, CTp.62