Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Влияние инсектицидов на иммунологическую реактивность животных

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САШГГ-ПЕТВРЕУРГСНИЛ ВЕГЗКШРНЬ'Я ИНСТИТУТ

На правах рукописи

СПЕРАНСКИЙ Вячеслав Викторович

УДК:619•612:017.1:615.285.7:615.91

влияние дасгавддов на шшологичаскую реактивность

Ж1В0ТНЫХ

Специальность 16.00.04 - Ветеринарная £?рмакологи1 у.

токсикология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора ветеринарных наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в Восточно-Сибирском технологическом институте, на кафедре биоорганической химии и Проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунохимии пестицидов

Научный рукодитель: профессор,доктор ветеринарных наук, В.Д.Соколов

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук,профессор Э.П.Зацепин

2. Доктор ветеринарных наук, профессор Ю.В.Конопатов

3. Доктор медицинских наук,профессор В.А.Лпшенко

Ведущее учреждение- Воронежский государственный аграрный

университет им .К .Д.Глинки Защита состоится "/<£ " декабря 1993 г. в "//" часов в Санкт-Петербургском ветеринарном институте в специализированном Совете Д120.20.02.

I

Адресс' института: 196084.Санкт-Петербург, ул.Черниговская,5 .С. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского ветеринарного института.

Автореферат разослан '/2« ноября 1993 г.

Учедай секретарь специализированного Совета кандидат ветеринарнчх наук М.В.Шустрова

ОВЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы эффективного н безопасного применения инсектицздов в ветеринарной практике постоянно явля ется объектам!; пристального внимания фармакологов и токсикологов. Одной из проблем являются оетаточше количества пестицидоь в кормах и окружающей среде, поражающие молодняк и снижающие продуктивность промименного стада.

В профилактической токсикологии, особенно при оценке безопасности применения инсектицидов в растениеводстве и животноводстве, неприемлемы критерии различия вредного и безвредного действия, основанные на явной патологии (воспалении, некрозе, гиперплазии). За последние годы при оценке действия химических веществ на организм животных рекомендованы методы иммунотокси-кологии.

О состоянии иммунной системы в условиях контакта с пестицидами сообщают 'Л.Г. Арестов (196а), А.Л.Костанян и В.А.Айрумян (1973), Ю.Б.Сафароэ и Ж.А. Алескеров (1973), ,j С ¿tzcci and f{ P-i!/>m/r:a. (IS75), Э.С.Евдокимов (1975;1980), Э.А.Кенигсберг (19(31) и Р.Ы.Рузыбакиев Ц9Ъ6).

Проблема остаточных количеств пестицидов в органах и тканях лактирующих :" : " и убойных животных особенно остра в связи с вццелением пестицидов с молоком, потребляемым молодняком. Воя-ыо;аю, это является одной из причин нарушения функции иммунной системы органов пищеварения у молодняка и снижения резистентности организма в целом.

Имеющиеся данные о фантах иммунодепрессканого действия инсектицидов выдвигают проблему безопасного использования химиче-склис средств защити животных.

Исследования в области биохимии метаболизма инсектицидов а растениях и организме животных свидетельствуют о многообразии

форм детоксикации, среди которых особое внимание обращают на коныогативныа механизмы взаимодействия метаболитов с клеточными структурами ( Ул^Й-ЯН, 1973; Т)о'1оо^Ь1Н.<1979).

Различие путей и кратности поступления инсектицидов, факты материальной и функциональной их кумуляции в организме, модуляция функции иммунной системы под влиянием ксенобиотиков указывают на необходимость определения механизмов формирования ответной реакции на данный вид ксенобиотиков. Современные достижения иммунологии создали предпосылки к изучению специфических реакций организма на инсектициды и их метаболиты.

Иммунологическая диагностика внедрения в организм инсекти-цвдов только делает лишь первые шаги. Разрабатываются методы иммунохимического анализа пестицидов в кормах и животных тканях, методы специфической иммунотерапии отравлений. Для дальнейшего развития исследований необходимо изучение антигенности инсектицидов, антителообразованая, участия иммунокомпетентшх клеток и органов в иммунном ответе. Особое внимание требует анализ функции иммунной системы животных, обработанных инсектицидами на фоне антигенной стимуляции. Актуальность изложенной ситуации высока в связи с тем, что в практике ветеринарии вакцинация-и дезинсекции животных часто сочетаются и неизвестны последствия сочетанного их влияния на иммунную систему обрабатываемого поголовья.

Работа является разделом научных направлений Проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунохимии пестицидов Восточносибирского технологического института по темам:

I. Специфические иммунологические реакции организма животных и человека при длительном потреблении пщи, содержащей ДЦТ или карбофос и их метаболиты.

'¿. Разработать рекомендации по оптимальным срокам вакцинации крупного рогатого скота против сибирской язвы в период профилактической дезинсекции и внедрить в хозяйствах Бурятии. Материалы по данному вопросу представить в Госагропром.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение токсического воздействия инсектицидов на иммунную систему животных, и исследование иммунной реакции, развивающейся в организме отравленных животных, направленной на нейтрализацию инсектицидов.

Достижение поставленной цели предполагает решение конкретных задач:

1. Установить в организме отравленных животных комплексы ДЦТ и карбофоса с белками организма.

2. Изучить динамику антител распознающих комплексы инсектицидов с белками, а также аутоантител, в- организме животных хронически получающих ДЦТ и карбофос с пищей. Охарактеризовать аутоиммунные реакции, развивающиеся в организме отравленных животных.

3. Определить токсическое действие инсектицидов в острых и хронических опытах на иммунную систему лабораторных и домашних животных. Установить группу серологических и морфологических показателей поражения иммунной системы инсектицидами.

4. Провести анализ влияния обработки животных инсектицидами на эффективность вакцинации против сибирской язвы. Предложить меры по предотвращении нежелательного действия инсектицидов на развитие иммунитета.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что при хроническом отравлении малыми дозами инсектицидов в организме животных образуются конъюгаты ДЦТ-белок и карбофос-белок. Они могут

бить обнаружены с помощьа специальных сывороток крови кроликов, специфичных относительно к карбофосу или ДЦТ. Прослежена динамика юг образования в печени, головном мозгу, скелетных мышцах. Впервые определено, что процесс образования коныогатов инсектицид-белок вызывает его специфическое антителообразова-ние к ним, к 90 и 120-му дню накапливаются антитела, реагирующие с коньюгатами инсектицид-блок или свободными инсектицидами. В сыворотке крови и органах животных длительное время получающих малые дозы инсектицидов наблюдается повышение содержания некоторых классов белков, что сопровождается появлением ауто-антител, т.е. развитием аутоиммунных реакций.

Выявлено иммунодепрессивное действие карбофоса при однократном накожном применении, в форме 0,5%-ной водной эмульсии, у животных одновременно иммунизированных вакциной СТИ. Обработка животных в тех же дозах спустя семь дней после вакцинации приводит к стимуляции иммунного ответа к сибиреязвенному антигену • в органах иммунной системы.

Результаты исследований позволили определить участие иммунной системы в метаболизме инсектицидов, что позволило использовать данные в разработке иммунохимических методов диагностики отравлений пестицидами и определить иммунодефицитнне состояния, вызванные дезинсекцией и вакцинацией у животных.

Научно-практическая значимость работы. Разработан способ синтеза и анализа коныогата ДДТ-белок, и апробирован метод синтеза коныогата карбофос-белок. Выявлены условия иммунизации кроликов коньюгатами инсектицид-белок при получении сывороток крови, содержащих антитела к инсектициду и его ко;дплексу с белком.Применение иммунной еыворютки позволяет выявить коныогаты иисекти-цид-белок, образованные сп-^ъ-- Установлена возможность исполь-

зодэпия коньюгил иисекгацид-белок в шщикашя» образования и цл*.куляции антител в сыворотке крови отравленных tKwiar-.

in основании дчдамс по ичмуиомодулиру!*пему дойстеио ю> • ¿о a, ua организм животных по покпптетям: перифзготеской кг - -

(; пнаг.-.пки, спе-ци¡лаеского шгентлкюбрааованял, способности к йкглаация макрофагов, Т/В соотношения лимфоцитов); структура тимуса и ¿ишфоуяп*: "^гстаоЯ ялоткос?* ктток

я ¿унщпспальшх зонах, характеризующих генерацию Т-лимфоцитов в тимусе, индуктивную фазу иммунного ответа и процесса созреваний Т и В-лимфоцитоа в соответствующих функциональных зонах органов-рекомендовано изменить схему применения вакцины СТИ и использования инсектицида в профилактике борьбы с эктопаразитами.

Внедрение результатов .тсстедоаан;::!. Материалы по mtnirc вяя-я;кя 1)ьа»ятпщ:дов карбофоса « гиподерят-хлорофоса m Çop'.v.ipo-a iisb кро-г.косибкпеязвениего ;п8<уштвта включены в гачестве Л"-uc.'iiwHitfi к "i»icva.«ieir.rj по применен;::: ;.:;:дкой внкцшк CJ"' прот,;." яиюГ и угзоргдены ГУВ Гоетгрепрома СССР 26.02.06

¡."ic-o/o.

Научные рекоиеедацин внедрены а практику ветеринарной службы Республики Буачтця.

Разработки по оценке хронического отравления' малнмп до:-1мп инсектиццдов зкличепы в методическое руководство: "Шоунотокси-кодоглчзская оценка пестицидов" В.В.Сперанский, Улан-Удэ,изд. ВСТИ,1993,86 с.

Па защиту выносятся следующие пояснения: I. Влияние хронического отравления животных инсектицидами (Mi' il карбофосом) на:

а) образование коныэгативных форм инсектицидов, с белками

6 -

¡ль <иа и в динамике <> »'¿¡Ф ;

б) специфическое антителообразование к коньюгату и инсектицидам;

в) аутоиммунные реакции в организме отравленных животных.

2, Влияние карбофоса на иммунологические показатели животных:

а) и условиях прот.юопараэитиршх обработок;

б). при формировании противосибиреяэвенного иммунитета.

Апробация работы.Материалы диссертации были доложены и обсуждены на :

- 9-ой научной конференции молодых сотрудников Института гигиены труда и проф.заболеваний МЗ Грузинской ССР им.Махви-ладзе, Тбилиси,1973г.;

- Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии, Москва,1974г.;

- Х-ом Всесоюзном съезде нефрологов, Минск,1974г.;

- УШ-ом Международном Конгрессе по защите растений,Москва, 1975 г.;

- Ш-ей Республиканской научно-практической конференции врачей Бурятии. Улан-Удэ,1975г.;

- 1У-ом съезде гигиенистов и санитарных врачей Грузии, Тбилиси, 1976 г.;

- Межлабораторном заседании Проблемной комиссии "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов", Киев, ВНИИГИНТ0ЯЗ,1985г

- Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы экологии в ветеринарной медицине", Воронеж,1989 г.;

- XII и ХШ-ых Пленарных заседаниях Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой, Воронеж,1986г Ташкент, 1990 г.;

- Бурятской Республиканской научно-производственной конферен-

ции:"Достижения ветеринарной наукн-производству", Улан-Удэ, 1989 г;

- Научно-производственной конференции:"Вопросы диагностики, лечения и профилактики болезней продуктивных животных",Улан-Удэ, 1990г.;

- Научной конференции морфологов Сибири и Дальнего Востока, Улан-Удэ,1990 г.;

Всесоюзной конференции:"Актуальные вопросы токсикологии,гигиены применения пестицидов в народном хозяйстве", Киев,ВНИИГИН-МС, 1990г.;

- П-ой научной конференции морфологов Сибири и Дальнего Востока, Улан-Удэ,1992 г.;

- 1-ом съезде иммунологов России. Новосибирск,1992 г.;

- Итоговых (ХХ,ХП,ХХУ1,ХХХП и ХХУШ-ой) конференциях научных работ профессорско-преподавательского состава Восточно-Спбирс-кого технологического института.

По тепе диссертации 40 печатных работ в центральных и республиканских ИЗД1НИЯХ.

Объем и структура рпбетн. Диссертация включает введение,обзор литературы, методы исследований, 3 главы экспериментальных исследований, заключение, выводы, список литературы, приложения. Работа изложена на 220 страницах машинописного текста, иллюстрирована ЗС таблицам!!,и рисунками, 7 графиками. Список литературы включает 252 библиографических наименования, в том числе 119 иностранных авторов.

- в -

i собственные исследования

Материалы и методы исследований. Эксперименты по иммунологическому анализу инсектицвдов проводили в Проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунохимии пестицидов кафедры биоорганической химии Восточно-Сибирского технологического института Минвуза РСФСР, на базе учхоза "Гурульбинское" Бурятского сельхозинститута, совхозов "Талецкий" и "Цолгинский" Бурятии.

В соответствии с поставленными задачами изучения проблемы влияния организма на судьбу инсектицида и действия инсектицида на структуру и функцию иммунной системы нами были избрани животные и методы исследования состояния белков в сыворотке крови и органах.

Проведенные исследования состояли из экспериментов с использованием:

- животных:крысы, массой 100-120 г питомника Рапполово; кролики породы "Шиншилла" Иркутского зоодитошшка весом 2-3 кг; мыши линии СВА питомника "Столбовая"; телята в возрасте 3-4-х месяцев, коровы дойного скота хозяйств Бурятии.

- инсектицидов: ДЦТ (п,п,-дихлордифенилтрихлорэтан) 10^-ний дуст; чистый препарат ДЦТ, полученный по методу Н.Н.Мельникова (1954). Карбофос 30,50 и 95^-ные концентрации эмульсий инсектицида, производства Тольяттинского завода Объединения "Куйбшевфосфор" и лаборатории Ш ВНИИХСЗР; гиподермин-хлоро-фос.

- вакцины С'Ш серии 144. Тобольской биофабрики.

Иммунологические исследования проводились на животных,при

оценке влияния:

а.хронического перорального отравления крыс дозами 1/100

¿Ц^ инсектицидов (для ДД1' ш/кг; для карбофоса 8 мг^кг но Ада). Хроническое отравление крыс проводили в течение 30,60, 90,120,160 и 1Ь0-дневного введения малых доз инсектицидов. По окончании указанных сроков животных убивали декапитацией, для анализов получали пробы сыворотки крови, печени, легких, почек, селезенки, головного мозга, скелетных мышц и сердца. И? органов получали подпо-солезке экстракты. Сыворотки крови и экстракты органов исследовались на содержание белка.

Экстракты органов, отравленных крыс подвергались электро-форетическому разделению и определению содержания белка во фракциях. Изменения антигенного состава органов определяли при постановке иммуноэлектрофореза с гетерологичной иммун-сыэороткой кролика к конзюгату инсектицид-белок.

Сыворотки крови подвергались электрофоретическому разделении а агаровом и г.олнакриламидиом гелях для определения соотношения белковых фракций и серологическому анализу циркулирующих антител к антигенам органов, тканей, коньюгатам инсектицид-бол ок, и гаптену (инсектициду). Определение антител проводили методом двойной диффузии в гель по Оухтерлани, методом иммуноэлектрофореза по Грабару в модификации Л.А.Зидьбе-ра и Г.И.Ао'елева, в реакции пассивной гельагглютинации, и реакции связывания комплемента.

При иммунохимическом анализе специфических реакций на инсектициды и их комплексы с белками, разработали и применяли методы синтеза коныогата карбофос-белок по Е.Й.Оп-(епо«)аг( 1970) и коныогата ДДТ-белок по Р.М.Мархваидзе, З.Ф.Еалдаевой и В.В. Сперанскому (1973), ректификацию выделенных и очищенных конь-огатов проводили методами гель-хроматографии и определением ультрафиолетового спектра соединений. В анализе использо-

вали синтезированные коньюгаты: карбофос-лошадиная сыворотка (к-л.с.); карбофос-бычий сывороточный альбумин (к-б.с.а.); карбофос-бычья сыворотка (к-б.с.), карбофос-куриная сыворотка (к-к.с.); карбофос-человечий сывороточный альбумин (к-ч.с.а) ДЦТ-лошадиная сыворотка (ДЦТ-л.с.); ДДТ-бычий сывороточный альбумин (ДЦТ-б.с.а); ДДТ-куриная сыворотка (ДЦТ-к.с.); ДД'Г-человечий сывороточный альбушш (ДЦТ-ч.с.а.).

Иммуногенные свойства полученных коньюгатов оценивали по схемам иммунизации кроликов П.Н.Косякова и сотр.(1955), Т.А. Коростелевой (1966) и И.Е.Ковалеву и сотр.(1977). Иммунные сыворотки к коныогатам инсектицид-белок испытыаались в анализах антигенной структуры экстрактов органов (печени, головного мозга<и скелетных мышц, крыс),отравленных инсектицидами.

Синтезированные искусственные антигены инсектицид-белок применялись для определения антител к гаптенам (инсектицидам) в циркулирующей крови животных на разных стадиях хронического отравления.

Иммунохимические исследования проводили в динамике хронического отравления животных.

б) однократного перорального отравления карбофосом в дозе 1/ИО ДЦ§о в опытах на мышах линий СБА оценивали функции пери-тонеальных макрофагов (по фагоцитарному показатели, фагоцитарному числу; интенсивности флуоресценции и миграционной активности макрофагов) и количеству антителообрг.эугацих клеток в селезенке. Оценку иммуномодулирующего эффекта карбофоса проводили в опытах на мышах, которых заражали вакцинным штаммом СТИ, а затем, спустя три дня, вводил*и карбофос. Контролем служили интактные животные и животные, зараженные вакциной СТИ.

в) однократной накожной обработке'О,5%-ной водной эмульсией карбофоса (путем купки животных), применяемой в ветеринар-

ной практике борьбы с эктопаразитами. Обработке подвергали «

овцематок и кроликов. Телят 3-4 месячных обрабатывали путем орошения поверхности тела из расчета 800-1ООО мл ш голову.

однократной обработкой гиподермин-хлорофосом на спину, путем полива вдоль позвоночного столба.

Влияние 0,Ь'$-ной водной эцульсии карбофоса оценивали в опмтлх на Ойцах, анализируя уровень противоткиневнх антител к антигенам органов животных и коныогату инсектицид-белок (к-б. с.а). Антитела определялись в реакциях связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и преципитации в агаровом геле. В опытах на телятах исследовали концентрацию иммуноглобулинов Зцй и Jj.il сыворотки крови, и антитела к коныогату инсектицид-белок. Для определения соотношения лимфоцитов, участвующих в иммунном ответе, исследовали методом Я'-роэеткообразо.чания относительнее и абсолютные концентрации Т- и В-лимфопитог< в периферической крови, и содержание Т м и Т-^ -клеток, содержащих рецепторы иммуноглобулинов .'/.} I/ - методом иммуноолект--рофпреза з аг.ароном геле исследовались концентрации сибиреязвенного антигена вакцины СГИ. Выявление концентрации антигенп л сыворотке крови и органах иммунизированных животных отражали состояние распределения и циркуляции антигена. Уровень воздействия накожной обработки карбофосом на иммунную гнете;,'.у з условиях формирования поствакцинальной реакции на сибиреязвенный штамм С1М исследовали по функциональной активности нейтро-филоа периферической крови по показателю повреждения нейтоофи-лов в реакции и> 1\1гс с антраксином. Уровень специфических антител на вакцину С'Ш определяли с помощью реакции непрямой гемагглотинации и реакции торможения кольцепреципита-шш. эффективность иммунизации вакциной СТН оценивали по про-тективным свойствам сыворотки, вводимой мышам и последующим

их заражением.

В опытах на кроликах исследованы структурно-функциональные состояния тииуса и лимфатического узла (предлопаточного), морфологическим анализом-соотношения функциональных зон и величин иммунокомпетентных клеток, входящих в их структуры. Измерения, проведенные на гистологических препаратах, при анализе функций органов и иммунной системы сводились к определении: массы органов, площади и объемов функциональных зон, количества различных популяций на единицу площади или зоны. Затем из функционально связанных параметров составлялись различные совокупности, которые позволяли судить о следующих процессах: миграции лимфатических клеток (изменения их количества в зоне с учетом генерации и распада); индуктивной фазе иммунного ответа (изменение количества лимфоцитов, активизированных лимфоцитов, бластов в местах проникновения антигена); трансформации Т- и В-клеток (баланс митозов и пикнозов, общая плотность клеток в Т- и В-зонах); созревание В-клеток (плазматическая реакция диссоциации герминтативных центров); созревание Т-лимфоцитов по характеру клеточных изменений в Т-зо-нах.

Всего во всех экспериментах по оценке иммунотоксичности инсектицидов исследовано: 1ЬЬ0 крыс, 12Ь кроликов, 156 мышей линии СьА. Клинические испытания действия инсектицидов на индукцию иммунного ответа к взеденной вакцине проведены на 105 телятах и 64-х коровах.

Полученные результаты подвергали статистической обработке по Стьюденту и с помощью непараметрического критерия Уилкок-с она-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТУ ЙССЛеЩОВАНИм

В предварительных исследованиях нами установлено, что хроническое пероральное отравление малыш дозами карбофоса и ДДГ вызывают у животных изменение содержания белковых фракций в сыворотке крови и экстрактах из органов;количественные изменения наблюдали во асех фракциях, однако наибольшие отмечен« в случаях с высокодиспорсшми медленнодочжущимиея белками. Статистически достоверные изменения нарастали в процессе длительности отравления. Периодичность наблюдаемых изменений указывала на возможное развитие аутоиммунных процессов а организме. .

Одним из факторов ивдукции аутоиммунных процессов химическими веществами является образование в организме коныогатов, способных отменять иммунологическую толерантность организма к собственным антигенам.

При определении образования т. ал~ коньгагированных форм инсектицидов мн применили моделирование процесса их синтеза • '1 ч1,с .

I. Синтез искусственных антигенов инсектицид-белок.

Нами разработан метод синтеза котаюгата ДДТ-лошадиная сыворотка (Ь.о.Сперанский в соавторстве,1973), апробирован и

развит метод синтеза ноньюгята карбофос-белок (по СсЛс•■ г ( 1970).

Анализируя физико-химические свойства ДДТ и карбофоса,можно отметить отсутствие высокореакционной способности исходи"-? структуры инсектицида, и для того чтобы получить химически реакционно способное производное ДДТ, которое вступало бч в соединение с белками, ввели в молекулу ДЦТ нитрогруппы о по-сляяупчгим их аминированием'и диазотированием, а в случае с

карбофосом препарат подвергали обработке с образованием ацил-производных и сочетанием их в ангидридпроизводные карбофоса.

Коныогат карбофос-белок был получен по методу Сы/енс? К д^.{1970). Содержание ковалентно связанного карбофоса определяли спектрофотометрически по различию концентраций введенного и непрореагироаавшего ангидрид-карбофоса. Полученный коньюгат подвергали гель-хроматографии на сефадексе С -25. выделенные и очищенные гель-хроматографией коныогаты карбофос-бычий сывороточный альбумин (б.с.а) и карбофос-человечий сывороточный альбумин (ч.с.а.) имели в ультрафиолетовом спектре, при 260 нм,промежуточное удельное поглощение, между удельным поглощением белка и ангидрида карбофоса, что свидетельствовало о новом удельном поглощении, характерное: для синтезированного коньюгата. Коньюгат карбофос-б.с.а содержал 27 молекул гаптена на молекулу белка, а коньюгат карбофос-ч.с.а-20 молекул гаптена на молекулу белка.

Синтез коньюгата ДДТ-белок проводили в четыре этапа :нитро- . вание, аминирование и диазотирование производных ДДТ и азосо-четание с белками сыворотки крови лошади, бычьего сывороточного альбумина (б.с.а.), белками сыворотки крови кур, человечьим сывороточным альбумином (ч.с.а). В процессе синтеза диа-зопроиеводного ДДТ проводили идентификацию промежуточных соединений; нитро-, амино- и диаэопроизводных ДДТ. Чистоту полученных препаратов и наличие группировок А0£ и определяли методом тонкослойной хроматографии и инфракрасной спектроскопии. Поскольку диазопроизводное может вступать в реакцию с несколькими аминокислотами, белками, то содержание ДДТ в коньюгате определяли по разности взятого в реакцию и непро-реагировавшего диазосоединения. Образованный в результате азооочетания коньюгат ДЦ'Г-белок отделяли от ниэкомолекулярной

фракции методом гель-фильтрации продуктов взаимодействия див-зосоединения ЛДТ с лошадиной сывороткои. Определены оптимальные условия сочетания ДДТ о различными белками-носителями. Анализ в' ультрафиолетовом спектре, в пределах 380-390 им, подтвердил образование ковалентной связи между молекулой белка идиазопроизводного ДДТ.

При сопоставлении полученных результатов синтеза кочъига-тоз ДДТ-балок и карбофос-белок выявлено,что процесс связывания протекает по-разному. Так, с увеличением количества вводимого в реакцию азосочетания диазопроизводного ДДТ содержание его в полученном коньвгате увеличивается. У карбофоса эта з>-кономерность не выявляется. На реакции коньвгации белков о ангидридом карбофоса оказывает влияние и состояние белка, вво димого в реакцкг. Использование свежих форм куриной и лошади ной сывороток крови повывало уровень связи карбофоса с белком. Яичннй альбумин фирмы " И^А/М/-" не вступал в реакция ацилиро-г,ания с ангидридом карбофоса, в то «о время при азосочетыши ДАТ с бычьим сывороточным альбумином конъшгат содержал самое большое количество остатков ДДТ.

И дальнейшем коиъвгаты инсектицид-белок использовались как реагент индукции антител к инсектицидам в организме иммунизируемых животннх,

2. Иимуногенные свойства соединения инсектицид-белок. Чтобы оценить способность инсектицидов индуцировать специфическое антителообразованив //?. к препарату, ми провели моделирование процесса.

»■звестио, что низкомолекулярные вещества при введении в организм, как правило, не вызывают образования антител к ним.

Иедукция антител к низкомолекулярным соединениям возможна только если они находятся в прочной связи с высокомолекулярным носителем и в оптимальных соотношениях гаптен-белок.

Для этой цели наш разработана серия коныогатов инсектицид-белок. Мшуноганше свойства коньюгатов карбофос-лошадиная сыворотка (к-я.с.)и карбофос-бычий сывороточный альбумин (к-б.с.а) оценивали после иммунизации кроликов.

Кролики подвергались иммунизации коньагатами карбофос-лошадиная сыворотка, карбофос-бычий сывороточный альбумин.

Использовались три схемы иммунизации; по И.А.Косякову и сотр.(1965)} по Т.А.Коростелевой (1966) и по и.¿.Ковалеву с сотр. (197';).

Схема иммунизации по Т.А.Коростелевой выбрана нами потому, что исследователь использовала при иммунизации коньюгаты,полученные методом аэосочетания с белками лошадиной сыворотки и человечьей сыворотки крови. Иммунизация по й.К.Ковалеву с сотр.(197?) избрана потому, что авторы использовали как диа-зотированные белки, так и коньюгаты, полученные методом аци-лирования.

Иммунные сыворотки крови кроликов подвергали иммунологическому анализу в реакциях преципитации в агаре, иммуноэлект-рофореза, реакциях пассивной гемагглютинации, реакции торможения пассивной гемагглютинации с рядом антигенов: карбофос-лошадиная сыворотка; лошадиная сыворотка (л.е.); карбофос-бычья сыворотка; бычья сыворотка (б.с.); карбофос-куриная сыворотка; куриная сыворотка (к.е.); карбофос-бычий сывороточный альбумин; бычий сывороточный альбумин (б.с.а.), карбофос-человечий сывороточный альбумин (к-ч.с.а) и гаптенами;карбофос; ангидрид карбофоса.

Антисыворотки к коньюгату карбофос-л.с. содержали антитела к гомологичному антигену. При определении специфичности антител к гаптену применяли коньюгаты, различающиеся по видовым свойствам белков-носителей, но имеющим общий гаптен-карбофос. Это позволило исключить взаимодействие иммунных антител к белку-носителю и выявить антитела к карбофосу.

Б реакции преципитации анткснворотки #76 и 84 от кроликов, иммунизированных конъюгатом карбофос-лошадиная сыворотка (к-л. е.), образовывали полосу преципитации с конъюгатом карбофос-человечий сывороточный альбумин (к-ч.с.а). Антисыворотка №1 в реакции преципитации образовывала полосу преципитации с конъюгатом к-б.о.а. Фракция .1<) 5 антисыворотки №1 при иммуно-злектрофоретическом разделении образовывала полосу преципитации с карбофосом.

Фракция сыворотки крови иммунного кролика №2 образовывала полосу преципитации с карбофосом в условиях иммуноэлект-рофорет»г-юского анализа.

Иногда сыворотки обладали слабой активностью, тогда животных подвергали реиммунизации антигеном карбофос-л.с. Так, ре-иммунизация кроликов по схеме иммунизации по Т.А.Коростелевой (1966) позволил®, получить антисыворотки, содержание антитела к карбофосу, коньюгату к-б.с.а.

При определении титр* гемагглютинирущих антител к коньюгату карбофос-лошадиная сыворотка (к-л.с.) выявился их низкий титр (1:80). В этом отношении более иммуногенными свойствам обладали коньюгаты карбофос-бычий сывороточный альбумин (к-б.с. а). Иммунизация кроликов по схеме И.Е.Ковалева и сотр.(1977) выявила высокие титры антител у 5 и 20 кроликов. Титры антител к гомологическому антигену были в пределах 1:512-1:2048. При

анализе специфичности антител s сыворотках крови постановкой реакции торможения пассивной геиагглотикацш установлено наличие антител к ангидриду карбофоса, антигенам печени крыс, отравленных карбофосом, белку носителю альбумину.

При определении антител к коньвгату карбофос-б.с.а в иммунных сыворотках кроликов проводили "истощение" последних белком-носителем (альбумином) в экспериментально подобранных дозах И адсорбции противотканевых антител эстрактами печени контрольных крыс. Эквивалентное соотношение, т.е.полное истощение антиеьшоротки бычьим сывороточным альбумином наблюдали при разведении альбумина Islô, когда 1,5 мкл раствора альбумина истощало 200 мкл иммунной сыворотки. При экспериментальном подборе эквивалентного соотношения между количеством антисыворотки и экстрактом печени отравленных животных было найдено оптимальное разведение антисыворотки, равное 1:4 и 1:16, т.е. 200 мкл антисыворотки истощается 0,003-0,006 мкл раствора белка печени.

Получение моноспецифических иммунных сывороток позволило определить антитела к коньшгату карбофос-б.с.а. Разведение моноспецифических сывороток в пределах от 1:2 до 1:128 выявили образование четких полос преципитации с антигеном при разбавлении сыворотки 1:16 или 1:32. Дальнейшее разведение сыворотки ослабляет формирование полос преципитации.

Аналогичным способом оценивались иммуногенные. свойства коньюгатов ДЦТ-белок.

Таким образом моделирование процессов иммунологической реак ции организма на поступление коньюгатов инсектицид-белок позволило выявить специфическое антителообразование к инсектициду и его коныогату с белком-носителем.

- 19 -

3. Динамика образования т уке ксньюгатов инсектицид-белок в органах крыс, хронически отравляемых инсектицидами

На начало наших экспериментов по выявлении аномальных антигенов в организме животных под влиянием ДЦТ и карбофоса имели ограниченную информации о связывании инсектицидов ¡п' -> и иммунологической реакции организма на образование подобных комплексов.

Используя метод синтеза искусственных антигенов инсектицид-белок, схемы иммунизации животных с целью получения реагентов (антитела иммунных сывороток) для диагностики антигенов, вызвавших образование антител, мы провели анализ антигенной структуры печени, мозга и мышц животных после хронического отравления ДЦТ и карбофосом.

Применение гетерогенной иммунной сыворотки крови к конъга-гату ДДТ-лошадинап сыворотка позволило установить образование аномальных антигенов в печени, головном мозгу и скелетных мышцах крыс, хронически отравленных ДДГ.

Предварительный анализ экстрактов органов в реакции преципитации по Оухтерлош с гетерогенной иммунной сывороткой выявил взаимодействие антигенов органов с антителами сиворотяи. Поскольку гетерогенная иммунная сыворотка кролика содержала полиспецифические антитела,' для исключения неспецифических реакций проводили "истощение" сыворотки крови кролика тканевыми антигенами нормальных органов крыс.

Для анализа качественного состава компонентов экстрактов органов крыс, отравленных ДЦТ, использовали метод иммуноэлект-рофореза в агаре. Эдектрофоретическое разделение экстрактов печени, мозга и мышц выявили фракции активно вступающие в пре-

ципитацию с антителами сыворотки крови |фолика. Так, в печени это белки, имеющие электрофоретическую подвижность альбуминов сыворотки крови, с< и -глобулинов и А-глобулинов; в головном ыозгу-это белки, обладающие подвижностью -глобулинов; в скелетных мышцах-белки с электрофоретичеекой подвижностью ^-и Д -глобулинов, иногда А-глобулинов.

На всех этапах хронического отравления крыс ДДГ в печени, в области белков с электрофоретичеекой подвижностью 4-н <4' глобулинов обнаружены фракции, вступающие во взаимодействие с гетерогенной иммунной сывороткой, содержащей антитела к гап-тену к коныогату ДЦТ-белок. Белки с электрофоретичеекой подвижностью альбуминов вступали во взаимодействие с гетерогенной иммунной сывороткой на 120 и 180-ые дни отравления животных. Однако число проб органов было невелико: 5 из 15. На 150-ые сутки отмечены зоны преципитации в области ^-глобулинов. При иммуноэлектрофоретическом анализе экстрактов головного мозга, при взаимодействии с гетерогенной иммунсыаороткой преципитирующие комплексы обнаружены в зоне белков с электрофоретичеекой подвижностью ¿г -глобулинов. Отмеченная активность к взаимодействию наблюдалась на всех стадиях отравления. В ряде случаев наблюдали полосы преципитации в зоне Л- и А -глобулинов, подобные свойства отмечены на 60,120 и 160-ые дни опытов.

Скелетные мышцы содержали аномальные антигены в зоне и, .£>,-глобулинов на всех этапах отравления и только на 150 сутки отмечено появление антигена с электрофоретичеекой подвижностью JLC-,ди -глобулинов в 100$ исследованных проб.

При анализе вкстрактов органов крыс, отравленных карбофосом, использовали гилериимуннуо сыворотку крови кролика к

кокьюгату карбофос-ч.с.а. В иммуноэлектрофоретическом анализе использовали "истепенную" сыворотку крови кролика.

предварительные исследования экстрактов печени, мозга ч мышц крыс, отравленных карбофосом в реакции двойной диффузии о гетерогенной иммунной сывороткой кролика, выявили слабую разрешающую способность метода иедикации аномальных антигенов на 30,120 и 160 сутки отрзвлешк. При шмуноодектрофоре-тическом разделении обнаружены три вида белков в органах» вступающих в реакции с гетерогенной иммунсывороткой. Первый белок, содержащий на поверхности инсектицид, обладал элект-рофоретической подвижностью -^-глобулинов. Второй белок, содержащий инсектицид, имел-электрофоретическута подвижность альбумина и ^-глобулина. Й третий- с подвижностью «(¿«Д-гло-булкноз. Эти белтга условно названы антиген 1,П и Ш и содержались только в органах отравленных »¡потных. В печени антиген I отмечен на вссх стадиях отравления. В мышцах антиген 1-только на I80 сутки отравления, а антиген Ш-на всех стадиях опита. Б головном мозгу антиген I отмечен только на 60-ые сутки, а антиген 1и-на всех стадиях отравления.

Следует отметить, что частота выявления аномальных антигенов возрастала до мере длительности хронического отравления инсектицидами и к ТЬО-ым суткам степень обнаружения антигонов, содержащих инсектициды, достигала у 75-100$ поголовья животных.

Таким образом, использование моноспецифических иммунных сывороток крови кроликов позволило выявить в органах образование ¿п»/»г комплексов инсектицид-белок, определить влияние длительности отравления на частоту образования аномальных антигенов.

-ж - .

4. Антителообразование у животных, подвергнутых длительному воздействию инсектицидов

Нами проведен анализ сывороток крови крыс, хронически отравленных инсектицидами. Исследовано антителообразование у животных после 30,60,90,120,150 и 180-дневного перорального отравления малыми дозами ДЦТ и карбофоса. На каждом этапе опытов использовали по 25-30 крыс, в качестве контроля использовали по 15 крыс.

Под влиянием хронического отравления инсектицидами отмечено, что реакции преципитации сывороток крови крыс с экстрактами их органов (печени, почек, легких, сердца, селезенки и скелетных мышц) возрастают по числу положительно реагирующих образцов крови. При иммуноэлектрофоретическом анализе сывороток крови полосы преципитации обнаружены в зонах .^-глобулинов (в случае 30- и 180-дневного отравления), на 60-ые сутки полосы преципитации определялись дополнительно в зоне с£, -глобулинов, к 90-цу дню отравлений ДЦТ преципитирующая способность сыворотки крови определена в зоне-глобулинов. После 120-дневного срока отравления ДДТ преципитирующие антитела определялись ь меньшем числе случаев исследованных проб. В реакциях преципитации в агаре сыворотки крови о экстрактами органов отравленных животных иногда образуют две полосы преципитации. После иммуноэлектрофоретического анализа таких сывороток полосы преципитации установлены в зоне ¿-.¡\у -глобулинов.

Сыворотки крови интактных крыс редко образуют полосы преципитации с экстрактами органов интактных животных. При иммуноэлектрофоретическом анализе таких сывороток полосы преципитации определяются в зоне Л, -глобулинов. Под влиянием хронического отравления инсектицидами возрастает число положительно реагирующих сывороток крови, взаимодийстзулцих с экстрактами

органов интактных животных. Это свидетельствует о наличии в сыворотках антител к нормальным антигенам органов.

при определении специфичности антител сывороток крови крыс, положительно реагирующих в реакции преципитации с экст-рактчмя органов отравленных животных (на 90-ие сутки отравления). были поставлены реакции с конъюгатами инсектицид-белок л чисямми препаратами. ири сод°.;дании в пчворотке кропи Ь г."'-белка не удается определить антитела к коньюгату инсектицид-белок, только после концентрирования сывороток по белку до 16 г % установлены полосы преципитации при взаимодействии с конъюгатами.

Постановкой реакции связывания комплемента выявили в сыворотках крови антитела, вступающие во взаимодействие с экст-

р*чтнми орг.чаои, кошлгатами ииссктанид-бслок (ДЦТ-белок, шр-бооис-белок) л ч-ют:,:^: препзраташ» ¡шсекгнцидоз.

ипред№.она г.'.ипмика образования антител к антигенам орга-)П,1 I почек;:, логкп:;, почек, селезенки, мозга, сердца и ске-Л'гпг-;/. ¡г..ц). ,од образовшшя аугоантител к ютигекш органон приходился на дни хронического отравления. Титр анти-

тел достигая 1:оу-1:Ь0. К этому периоду и приходился максимум числа сывороток крови, взаимодействующих с белками органов.

пике числа случаев положительно реагируоашх сизороток крови и макс.щума антнтелообразоиапия (на 90-ые сутки хронического отравления) исследованы сыворотки крови в реакциях с конъюгатами инсектиццц-белок. Сызоротки содержали антитела к ноньюгатам в титре до 1:И0, эти жэ сыворотки содержали антитела к инсектицидам к ДДТ (в 4 из Ь), к карбофосу (в 3 из б), титр их был в пределах 1:100-1:40.

Сыворотки крови отравленных инсектицидами крыс содержали

антитела к антигенам органов интактных крыс, титр их бил невысок 1:10-1:20. Число таких сывороток возрастало к 90-120-м дням хронического отравления.

Использованием реакции пассивной гемагглютинации по Бой-дену в модификации Ставитского определена динамика выявляемое«! антител к коньюгату инсектицид-белок в сыворотках крови крыс, отравленных инсектицидами. Максимальные концентрации антител выявлены в сыворотках 1фови крыс, отравленных ДЦТ в первые 30 дней, титр составлял 1:68, которые сохранялись в такой концентрации в течение последующих 60-ти дней, а затем концентрация их падала к 180-му дню. Концентрация антител к коньюгату карбофос-бслок была невысокой и составляла к 90-му дно 1:16-1:21. Количество положительно реагирующих с коныо-гатами сывороток крови крыс после отравления инсектицидами достигала максимум« (до 60% из числа исследованных) к 90-му дню опытов. Й случаях отравления крыс ДЦТ число положительно реагирующих с конызгатами было почти в два раза выше, нежели при отравлении карбофосом. Титр гемагглютинирующих антител к препаратам ДЦТ и карбофоса составлял к 90-му дню отравления 1:10-1:40.

Таким образом, хроническое отравление животных малыми дозами инсектицидов ивдудирует антителообразование и циркуляция антител в сыворотке крови. Антитела содержались двух видов: первые-распознающие инсектициды и их коныогаты с. белками, вто-рые-аутоантитела к органам.

- 25 -

5. Влияние карбофоса на иммунный статус животных

В опытах на 300 овцах был прояеден эксперимент по влиянию 0,5^-ной водной эмульсии карбофоса на развитие аутоиммунных реакций у животных, обработанных накожно, путем купки в ванной. Анализы проводили на 3, 7 и 30 сутки после обработки инсектици -дом. Определялись циркулирующие антитела в реакции преципитации в агаре, реакции связывания комплемента и реакции пассивной ге-магглютинации. Сыворотки крови овец, обработанных карбофосом,содержали противоорганные антитела (к экстрактам печени, легких и почек), Титр их был невисок: 1:Ю-Х:иО. Комплементсвязыввгащие и преципитирующие противоорганные антитела обнаружены у 32 из 120 овец. Эти же сыворотки в рдпе случаев давали положительные результаты обнаружения антител к антигенам, содержащим детермина -ту инсектицида. Обнаруженные антитела взаимодействовали с экс -трактами печени крыс, отравленных карбофосом. При постановке реакции пассивной гемагглютинацми и реакции преципитации в агаре в сыворотках пробы обнаружены антитела к конъюгату карбофос-бычий сывороточный альбумин. Контрольные сыворотки крови овец, не обработанных карбофосом, не вступали во взаимодействие с экст -рактами органов отравленных крыс и с конъюгатами карбофос-б.с.а.

Таким образом, под влиянием купки овец в 0,5%-ной водной эмульсии карбофоса образуются антигены с детерминантой инсекти -цида, циркулируют противоорганные антитела и антитела к комплексу инсектицид-белок. Полученные данные свидетельствуют о разви -тии аутоиммунных процессов, вызванных карбофосом.

Известно, что аутоиммунизация может быть одной из причин развития иммунодепрессивного состояния животных, в этой связи представляет интерес выявить уровень иммунного ответа на введе-

- 26 -

ние вакцинного штамма возбудителя.

. В опытах на кроликах выявлено, что 0,5%-ная водная эмульсия снижает показатель Т/В соотношения лимфоцитов в периферической крови. Т/В соотношение лимфоцитов одш из показателей механизма иммунного ответа, отражающий уровень кооперации иммунокомпетент-ных клеток, циркулирующих в крови. В случае с карбофосом наблю -даемое нами снижение показателя Т/В соотношения лимфоцитов обусловлено увеличением концентрации В-клеток, а содержание Т-кле -ток оставалось без изменений. Снижение показателя Т/В соотмоие -ния лимфоцитов наблюдалось на ? и 15 суиси после обработки, к 30 и 45-ым дням наблюдений отмечено резкое увеличение концентраций Т-лимфоц№гов, достигающих величин содержания В-клеток, но пока -эатель Т/В соотношения лимфоцитов так к не восстанавливался. Полученные данные выявили нарушения Т/В соотношений лимфоцитов в периферической кропи.

Третий компонент, участвующий в клеточной кооперации имму -некомпетентных клеток - макрофаг. Исследования на мышах линии СВА выявили, что отравление карбофосом в. дозе 1/20 ДЦдд ингиби-рует функции перитонеальных макрофагов. Во все периоды набдюде -ния: .3, 7, 16 и 30 дни откачены пониженные показатели: функцио -калькой активности лизосом макрофагов, по включению акридинового оранжевого; фагоцитарного числа - количеству поглощение частиц латекса; фагоцитарному показателю - проценту фагоцитирующее клеток от общего числа макрофагов; миграционной активности макрофагов под агаром.

При морфометрическом анализе тимуса кроликов, обработанных 0,5%-ной водной эмульсией карбофоса, выявлены признаки • наруше -ния генерации Т-димфоцитов основной функции органа. Под влиянием карбофоса на 3 сутки репродукция тимоцитов понижена в сравнении

с контролем; заторможена виутриорганная миграция (созревание ти-моцитов) - содержание тимоцитов в мозговом слое понижено в сравнении с контролем; усилена миграция из тимуса. На 10 сутки после обработки карбофосом репродукция тимоцитов достигла уровней контрольных, но сохранились низкие темпы созревания (по показателям внутриорганной миграции) тимоцитов, заторможен процесс миграции клеток из тимуса.

Карбофос вызпвает слабую инволюцию тимуса, орган находится в состоянии функционального иалрдаения, особенно к 10-ым суткам после обработки. Показатели объемной плотности иммунокомпетент -ных клеток в корковом и мозговых слоях снижены. Отмеченные факты свидетельствуют о критическом его состоянии в этот период.

Под влиянием карбофоса в предлопаточном лимфоузле не происходит увеличения массы органа, однако, отмечено увеличение объема функциональных зон, особенно полей плазматизации. Увеличение объемной плотности поле;! плазматизации сочеталось и с ростом плотности клеток в плоскости среза, при этом увеличена оОтемная плотность числа бластов, актипиропанных лимфоцитов, лимфоцитов, митоэоп. морфометрическчй анализ структуры лимфоузла позволил выявить, что пол влиянием карбофоса происходит плазматическая реакция. Так, на первые трое суток отмечен рост числа юных плазматических клеток и увеличение числа зрелых плазматических клеток, но к 1и~му дню число зрелых плазматических клеток снижается, а юных плазматических остается повышенным.

Суммируя факты влияния карбофоса на иммунную систему животных, можно отметить, что обработка 0,5^-ной водной эмульсией инсектицида вызывает признаки аутоиммунных процессов в организме.В сыворотке крови овец обнаружены противотканевыо антитела к экс -трактам печени, легких и почек, антитела к коныогату карбофос -

бычий сыворотоедшй альбумин, антитела к экстрактам органов от -равлекных крыс, содержа:®« детерминанту инсектиццца.Карбофосснижает показатель Т/В соотношения лимфоцитов за счет увеличения числа Б-клеток в первые 15 дней после обработки, что свидетель -ствует о дефиците иммунокоыпетентных клеток для формирования иммунного ответа. Инсектицид вызывает функциональную недостаточ -ность макрофагов. Обработка животных карбофосом подавляет гене -рации Т-лимфоцитов в тимусе, в лимфатическом узле отмечены при -знаки развития полей плазматизации: резкое увеличение числа иных плазматичэоких клеток, рост «юла зрелых плазматических клеток, а к 10-ым суткам их. снижение в сравнении с контрольной группой животных. В полях плазматизации наблюдается рост числа бластов, активированных лнм$оцитов, лимфоцитов. Все ото свидетельствует о . поликлональной активации щшунокоипзтентных клеток яри наруше -нии основной функция тимуса - генерации Т-лиыфоцигов.

б. Динамика иммунного ответа у кроликов на вшедшу СТИ

В качества контрольной группа юшотных при оценке иммунологической реактивности мы использовали кроликов» иммунизированшх вакциной СТИ. Иммунологическая реакция животных на вакцину СЯМ имела определенную динамику.

Применив метод определения Т/В соотношений лимфоцитов, не -обходимых для кооперации. при формировании иммунного ответа, установили, что вакцинный штамм СТИ при введении подкожно кроликам вызывает увеличение содарзшшя Т- и В-диыфоцитов (на ?-ой день), сохраняя показатель Т/В соотношений лимфоцитов на уровне контрольных. К 15-ым суткам соотношение Т/В лимфоцитов было оп -тимальным, обеспечивающим полный иммунный ответ.. В последующие сроки 30, 45 и 90-ые дни Т/В соотношение лимфоцитов характеризо-

валось как оптимальное. Изменения концентрации Т- и В-лимфоцитов крови кроликов под влиянием вакцины СТИ связаны с общими процессами, характерными действию вакцин на организм. Первоначальное увеличение содержания Т-розеткообразующих лиц$юцитов (Т-РОЛ) при общем увеличении числа лимфоцитов на 7-ые сутки (Краскина 11.А. и сотр., 198И).

Функциональную активность нейтрофилов крови кроликов исследовали в реакции повреждения нейтрофилов с аллергеном (антракси-ном) ¿л V4.trо . Реакцию нейтрофилов оценивали по амебоидной вы -ражеиности клеток, окрашенных по Хотчкинс в модификации Нарцис -сова (1970). Оценку влияния аллергена на нейтрофилы проводили подсчетом 100 клеток, учитывая в том числе и клетки, имею -щие псевдоподии. На основании опытных и контрольных показателей подсчитывали ицпекс повреждения нейтрофилов. Результаты пред -ставлены на рис.1.

Как следует из рисунка, ва1сцнна СТИ сенсибилизирует нейтрофилы периферической крови. Уровень сенсибилизации клеток сил различным в динамике ответа на антигенное раздражение. Максимальная реакция нейтрофилов иммунизированных 1гроликов наступала к 7-му дню и сохранялась до 2В дня. Затем снижалась к -15 дня. Та -ким образом, гиперчувствительность замедленного типа нейтрофи -лов, сенсибилизированных вакциной СТИ, имела яркую выраженность в течение 21 дня.

Иммуноэлектрофоретическим анализом сывороток крови и экс -трактов органов кроликов, иммунизированных вакциной СТИ, исследовано присутствие и распределение антигена. Установлено, что у иммунизированных кроликов сибиреязвенный антиген определяется до 21 дня в печени, почках, селезенке и регионарном лимфоузле, а в крови до 45 дня.

Л\

• \4

у " ч

-1—-'-1-,-1-I-1-*-1-

3 7 |'/ 21 ¿8 35 45"

Ани

в

*

- - - контроль --- СТИ

----- СТИ+7 дн. карбофос

- - СТИ+карбофос одновременно

Рис.1. Динамика изменений ивдакса повревдения нейтрофилов крови ишуниоированных и обработанных карбофосом кроликов (реакция ичпЬо с антраксином).

- ах -

При оценке противосибиреязвенного иммунитета у вакциниро -ванных 1сроликов использовали реакцию непрямой геыагглютиноции (РИГА) о зритроцитарными диагностикумами производства Казанского НИВИ, реакцию торможения кольцепреципитации по В.Ц.Цццыпову (1975). Иммунизации животных проводили вакциной СТИ Тобольской биофабрики в дозах и соответствии с "Наставлением по применению жидкой вакцины СТИ против сибирской язвы".

Результаты представлены на рис.2. Как следует из данных рис.2, пики иммунного ответа на вакцину СТИ наблюдаются на 7, 45 и 90 дни наблюдений.

При оценке специфичности антител использовали реакция торможения кольцепреципитации по В.Ц.Цццыпову (1975). Исследования на присутствие противосибиреязвенных антител проводили до вакцинации и на 3, 7, 15, 21 и 2й дни после иммунизации антигеном. Результата представлены на рис.3. Как видно из рис.3, пик титров антител у вакцинированных животных приходится на 14 день с последующим снижением.

Под влиянием вакцины СТИ в тимусе кролика к 3-им суткам после иммунизации наблюдаются: повышение репродукции тимоцитов (увеличение чилла митозов и активированных лимфоцитов); повышенная внутриорганная миграция (созревание тимоцитов), увеличение числа тимоцитов в мозговом слое и снижение численности в корковом; повышение миграции клеток из тимуса. На 10 сутки после вакцинации в тимусе обнаружены: пониженная репродукция клеток; по -нижение числа клеток мозгового слоя, что свидетельствует о тор -можении внутриорганной миграции или созревании тимоцитов; незначительном повышении пикноза и отсутствие эмиграции.

Вакцинация усиливает бластическую реакцию в тимусе, как одно из проявлений сенсибилизации организма и формирования гипер -

250

200

150

5 ¡00

« 3

50

7 15 30 45 60 ■ 75 до 1Ат

Рис.2. Изменения тигров гемагглютишрущих антител к вакцинному антигену СТО у кроликов, вакцинированных и обработанных карбофосом в различных сочетаниях

Примечание:--вакцинированные'СТИ;----вакцинированные и обработанные одновременно;

—*--обработанные' карбофосом за 2 дня до вакцинации;----обработанные карбофосом за 7 дней до вакцинации;-—4— вакцинированные, а затем спустя 2 дня обработанные карбофосом;——- вакцинированные, а затем спустя семь дней обработанные карбофосом.

■5 7 /// 21 ¿8 Анионы;,-)

Рис.З. Динамика изменений реакции торможения

кольцепреципитации сыворотки крови кроликов, вакцинированных и обработанных карбофосом

Примечание: о—о - вакцинированные СТИ;

А-----4 - вакцинированные и обработанные

карбофосом одновременно)

□ —о - вакцинированные и спустя семь дней обработанные карбофоссм.

- 34 -

чувствительности замедленного типа.

В периферическом, предлопаточном лимфоузле под влиянием введения вакцины резко увеличивалась масса органа. Резко возрастал объем функциональных зон, плотность клеток в плотности среза увеличивалась в 2-3 раза в сравнении с контрольными группами. Во всех функциональных зонах возрастала объемная плотность иммуно -компетентных клеток. Шчти все показатели лимфощшой структуры лимфоузла имели особенность в динамике: на 3 сутки после иммунизации они имели максимальные величины, а затем к 10 дню они снижались. Отмеченные факты свидетельствуют об ускорении созрева -ния Т-лкмфоцитов в .паракортикальной зоне лимфоузла и, как следствие, уменьшение количества бластов на 10 сутки. Высокие кон -центрации бластов в паракортикальной зоне к 3-им суткам после иммунизации являются особенностью блаетомогенной реакции при формировании гиперчувствительности замедленного типа. Формирование бластической реакции повышенной чувствительности замедленного типа наблюдается первые четверо суток после иммунизации.

Таким образом, под влиянием вакцинации в организме кроли -ков отмечено необходимое соотношение Т и В-лимфоцитов. При формировании иммунного ответа определена динамика гиперчувствительности замедленного типа у нейтрофилов периферической крови, сенсибилизированных сибиреязвенным антигеном; прослежена динамика ентителообразования к вакцинному штамму СТИ. Вакцинация повышает функциональную напряженность тимуса. Но к 10 суткам она спадает. Региональный лимфоузел в зоне введения вакцины имел повы -шенные показатели структуры органа. Наибольшие проявления наблюдались к 3-им суткам, к 10-ым они несколько снижались.

- 35 -

7. влияние сочеташой обработки карбофосом на динамику иммунного ответа у вакцинированных кроликов

|1редварительные исследования влияния гиподермин-хлорофоса телят на формирование первичного иммунного ответа к вакцине СТИ выявили противоречивые данные. Данные реакции непрямой гемагглю-тинации сывороток крови свидетельствовали о хорошем антителооб -рааовании. Иммунные сыворотки были получены от животных, вакци -нированных и обработанных гиподермин-хлорофосом в трех сочетаниях: обработка ипсектиццпом и спустя два дня вакцинация; обработка и вакцинация одновременно; вакцинация и через £ дня обработка инсектицидом. В качестве контроля использовались телята вак -цинированные.

11ри определении протективных свойств иммунных сывороток телят установлено, что сыворотки от животных, вакцинированных и затем обработанных спустя два дня гиподермин-хлорофосом, обладали повышенным защитным эффектом в организме мышей, зараженных культурой вакцинного штамма. Особенно это выражено на 15 сутки после вакцинации. Сыворотки крови телят, предварительно обработанных гиподермин-хлорофосом или одновременно о вакцинацией об -ледали пониженными превентивными свойствами в сравнении с вакцинированными.

Гиподермин-хлорофос при накожном применении у многократно иммунизированных коров не вызывал достоверной ингибиции специфического антителообразования и снижения превентивных свойств им -мунной сыворотки.

Отмеченные факты о состоянии напряженности противосибиреязвенного иммунитета привели к дальнейшему изучению состояния им -мунной системы первично иммунизированных животных и подвергнутых обработке инсектицнпами.

- 36 -

Эксперименты были проведены на кроликах, обработанных 0,5%-ной водной эмульсией карбофоса и иммунизированных вакциной СТИ в различных сочетаниях с обработкой. Напряженность противо -сибиреязвенного иммунитета у вакцинированных животных оценивали по титрам гемагглютинирухщих антител в сыворотках крови. Данные анализов представлены на рис.2. Как следует из данных рис.2, одновременная обработка карбофосом и вакцинация кроликов приводила к слабому антителообразованию, максимальный пик титров при -ходился на поздний срок - 15 день - в сравнении с контрольной группой (вакцинированных). Предварительная обработка кроликов инсектицидом (за 2 или 7 дней) до вакцинации подавляли антитело-образование.

Иммунизация вакциной СТИ и последующая затем спустя 2 или 7 дней обработка инсектицидом стимулировали антителообразование.

Обработка кроликов карбофосом спустя семь дней после вакцинации подавляла очищение органов от антигена. Антиген определял-ля в печени, почках, легких и крови до 35-го дня. При этом наб -людалось ускорение выведения антигена из селезенки и лимфоузла.

Специфичность противосибиреязвенных антител определили в реакции торможения кольцепреципитации (рис.3). Установлено, что одновременная о вакцинацией обработка карбофосом ослабляла спе -цифическое антителообразование к сибиреязвенному антигену. Об -работка карбофосом спустя семь дней после вакцинации временно задерживала антителообразование, Подобный эффект влияния инсекти -ццпа на индуктивную фазу иммунного ответа отмечен И в определе -нии индекса повреждения нейтрофилов - показателя гиперчувстви -тельности клеток, сенсибилизированных сибиреязвенны;.! антигеном (рис.1).

Мэрфометрический анализ структур тимуса у кроликов, обра -

ботанных одновременно вакциной и инсектицидом, свидетельствует о нарушении генерации Т-лимфоцктов в органе на 3 сутки эксперимента. Нвйлвдегатся пониженная репродукция тииоцитов, позднее их созревание и торможение эмиграции клеток на периферию. На 10-ые сутки отмечены признаки (функционального напряжения органа: ела -бая бдастическая реакция клеток, торможение эмиграции клеток и, возможно, слабая дифференцировка тимоцитов из-за недостаточного количества макрофагов.

У кроликов, обработанных карбофосом спустя семь дней после вакцинации отмечены повышенное содержание тимоцитов в органе , усиленная репродукция Т-лимфоцитов в корковом и мозговом слоях , при слабой миграции клеток из органа, Пикноз клеток в органе был незначительным, ниже контрольных.

При анализе предлопаточного лим[юузла кролика, обработанного карбофосом одновременно с вакцинацией, установлены нарушения структурно-функциональной перестройки при антигенной стимуляции. Б области герминативных центров наблюдали снижение плотности 1сле-ток в плоскости среза на I мм^, снижалась объемная плотность им -мунокомпетентньк клеток, участвующих в иммунном ответе. Иццекс герминатив1шх центров на 3 и 10-ые сутки эксперимента был стати -стически достоверно ниже, чем у вакцинированных. В паракортикаль-ной зоне на третьи сутки обработки карбофосом у вакцинированных кроликов отмечено снижение числа иммунокомпетентных клеток (бла -стов, активированных лимфоцитов, лимфоцитов, макрофагов, митоти-чески делящихся клеток), при снижении площади функциональной эо -ни. На 10-ые сутки наблюдали увеличение функциональной зоны, ко -личество клеток в плоскости среза зоны было на уровне контрольных. При определении объемной плотности зарегистрирован рост числа бластных клеток, митотически делящихся клеток и лимфоцитов. В по-

- за - •

лях плазматизации на третьи сутки снижено количество иммунокомпе-тентных клеток (бластов, активированных лимфоцитов, лимфоцитов, макрофагов и величина митозов). На 10-ые сутки хотя и происходит рост, да он на достигает величин, характерах для нормальной ре -акции на антиген.

Обобщая данные морфологической картины лимфоузла и тимуса у кроликов после одновременного применения вакцинации и дезинсек -ции можно отметить общую тенденция: снижение функций на 3 сутки и подъем на 10-ые, но они не достигают контрольных величин, харак -терных для вакцинированных животных.

Обработка кроликов спустя семь дней после вакцинации повышала активность тимуса и лимфатического узла. В тимусе увеличивался объем функциональных оон и содержание иммунокомпетентных клеток. В лимфатическом узле наиболее сильные изменения в сторону увеличения клеток отмечены в паракортйкалъной зоне и полях плаз -матизацш. Резко повышено в паракортикальной зоне содержание бластов, активированных лимфоцитов, лимфоцитов и мктотически деля -¡цихся клеток. В полях плазматизации увеличено содержание как юных, так и зрелых плаамоцитов. Все данные свидетельствуют о по -вышенном состоянии реактивности тимуса и лимфоузла под влиянием карбофоса у вакцинированных животных. Возможно, это является од -ним из факторов повышенного антителообразования и высоких превентивных свойств иммунных сывороток кроликов, вакцинированных, а затем спустя семь дней обработанных карбофосом.

В результате проведенных экспериментов на кроликах впервые было установлено, что обработка животных против эктопаразитов способна ослаблять формирование иммунного ответа к вакцинному штамму СТИ. Ингибирующий эффект карбофоса на формирование про -тивосибиреязвенного иммунитета отмечен в условиях предваритель -

Н011 или одновременной дезинсекции и последующей вакцинации. Об -раоотка кроликов карбофосом после вакцинации не приводила к ос-лаблечнл иммунного ответа организма на введение вакцины, а нао -борот, к повышению реакции. Ответная реакция сопровождалась як -тивацией лимфоидних структур тимуса и лимфоузла и усилением специфического антителообразования.

Экспериментальные исследования иммуномодулирующего дми* -вия инсектицида и вакцины О'Ш нашли подтверждение в клинических анализах крови телят, подвергнутых вакцинации и дезинсекции.

В. Влияние противопаразитарной обработки телят ОД'^-ной водной эмульсией карбофоса на формирование противо -сибиреязвенного иммунитета

У контрольную тенят и телят перед постановкой опита содер -кание Т- и Ь-лимроцитов имело оптимальное соотношений 1,сЬ. Пои влиянием карбофоса нарушалась циркуляция лимфоцитов в перифери -ческой кропи. На 3-й день после ооработки в крови Оыло резкои увеличение Т и ¿-лимфоцитов, особенно В-клеток. К 10-му дню ко -личество Т-ялеток продолжало возрастать, а содержание В-клеток снижаться. На 30-е сутки количество Т-клеток было в пределах величин контрольных животных, а В-клеток несколько снизилось.

При анализе субпопуляций Т-лимфоцитов отмечено увеличение Т -клеток на 3 сутки, на 10 сутки содержание оставалось вше контрольных. 1С 30-му дню концентрация Тм - снижалась, Т^. -клет -ки в течение всего опыта не изменялись существенно.

Карбофос увеличивал концентрацию иммуноглобулинов ЭдС и сиворотки крови телят на 3 и 10-ые сутки после обработки, а на 30-е - содержание их приходило к нормальным величинам.

)1од влиянием вакцины СТО в периферической крови происходят

- 40 - '

изменения в циркуляции лимфоцитов. Так, на 3 сутки содержание В-клеток возрастает, а Т-клеткк остаются в пределах нормы,К 10-му дню концентрации Т и В-клеток восстанавливаются, но к 30-му их содержание резко возрастает. Содержание Тм-клеток снижается к 3-му дню, но в последующие дни наблюдений оставались в пределах нормы. Ту- клетки оставались без изменений концентраций.

Вакцинация телят увеличивала концентрацию иммуноглобулина

во все сроки наблюдений, а содержание ОуМ к увеличению на 3 и 30 дни.

Вакцинация и одновременно обработка телят 0,5^-ной водной эмульсией карбофоса увеличивала концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови во все сроки наблюдений. Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов возрастало, особенно, резкий подъем концентрации Т^-клеток. Содергкание I и В-лимфоцитов возрастало в крови на 30-ые дни опыта.

Вакцинация и спустя семь дней обработка карбофосом телят усиливала циркуляцию лимфоцитов в периферической крови к 10-му дню наблюдений. Резко увеличивалась концентрация Т- и В-лимфоци-тов, возрастало содержание субпопуляций Т-лимфоцитов и иммуно -глобулинов и Зу М в крови. НА 30-ые сутки та же тенденция, но содержание иммуноглобулинов возвращалось к норме.

Анализ специфического актителообразования под влиянием вакцины СТИ позволил выявить подъем титров гемагглютининов в сыво -ротках крови иммунных животных на всех стадиях наблюдений. Так, на 3-ий день титр составил 1:58 + 13, на 10-й день 1:96 + 14. На 30-й день - 143 + 33. Одновременная вакцинация и обработка кар -бофосом снижали антителообразование к вакцинному антигену у те -ляг. Титры составили соответственно 1:22 + 6; 1:44 + 10и 1:4У+Ю.

Вакцинация и последующая через семь дней обработка карбо -

фооом вызывала у телят усиленное антителообразование. Титры ан -тнтел имели следующие величины к 10-му дня 1:124 + 24; к 30-му -

Одновременная обраСотка карбофосом вакцинируемых телят сникала в последующем титры циркулирующего сибиреязвенного антигена в сыворотке крови, а обработка телят инсектицидом после вакцинации ингибировала выведение антигена из крови. Так, концент -рация антигена у вакцинированных, телят к 30-му дню составляла 1:142 + 27, то у телят, вакцинированных к спустя семь дней обработанных карбофосом, титр антигена составил 1:419 + 25.

Сопоставляя выявленные факты антителоооразования.ш провели оценку превентивных свойств иммунных сывороток. Сыворотки крови животных вакцинированных и одновременно обработанных карбофосом проявляли слабую лротективную способность при введении мышам,за-раженним сибиреязвенной культурой СТИ, в сравнении с сывороткой телят, иммунизированных вакциной СТИ. Сыворотки крови иммунных телят, вакцинированных и спустя семь дней обработанных карбофосом, обладали более высоким протективным свойством в сравнении с вакцинированными.

11редварительная обработка телят карбофосом, а затем вакцинация не создавали иммунной сыворотки,обладающей высокой про -тективной активностью. Несмотря на наличие антител в сыворотке , такая сыворотка не обладала протективной способности) при введении ее мышам, зараженных вакцинной культурой СТИ.

Таким образом, проведенный клинический лабораторный анализ формирования иммунного ответа у телят, под влиянием вакцины СТИ и в условиях сочетанной обработки карбофосом позволил выявить те ке проявления иммунологической реактивности в динамике, что и у кроликов в эксперименте.

- 42 -ВЫВОДЫ

1. Получены коныогаты инсектицид-белок. Иммунизация кроликов конъюгатами инсектицид-чужеродный белок вызывает образова -ние антител к инсектициду. Сыворотка крови иммунных кроликов может быть ревгентом для выявления инсектицидов в организме отравленных животных.

2. Анализ экстрактов органов отравленных инсектицидами животных с помощью иммунной сыворотки выявил наличие коньюгиро -ванных форм пестицида с тремя группами белков.

3. При хроническом отравлении крыс карбофосом или ДЦТв сыворотках крови обнаружены антитела двух видов. Первый вид - антитела, распознающие инсектиццды или коныогаты последних с белками; второй вид - аутоантитела против белков крысы. Титр ан -тител достигал пика к 90-му дню опытов.

4. Однократное накожное воздействие карбофоса на животных в условиях иммунизации вакциной СТИ нарушает функции органов иммунной системы: снижает способность макрофагов к активации, изменяет Т/В соотношение лимфоцитов в периферической крови. При этом наблюдаются морфологические изменения нормального течения иммунного ответа на вакцину в предлопаточном лимфоузле и тимусе.

5. Иммунизация животных в условиях одновременной или предварительной обработки карбофосом приводит к низким уровням синтеза антител против возбудителя сибирской язвы и слабому формированию гиперчувствительности замедленного типа к сибиреяэвен -ному антигену.

6. Обработка животных карбофосом после иммунизации не уг -нетает, а в некоторых случаях стимулирует иммунный ответ.

7. При проведении иммунопрофилактических мероприятий про-

тив сибирской язвы необходимо учитывать эффекты сочетанного применения вакцины и инсектицида в защите животных.

1РШИЧВСНИЕ ПРВДОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использовать синтезы конъюгатов карбофос -белок и ДЦТ-белок и получение специфических иммунсывороток к ним как средства и способы диагностики хронических отравлений ука -занными инсектицидами.

2. Для оценки безопасности применения инсектицидов в вете -ринарной практике рекомендуется использовать морфометрический метод оценки структурно-функционального состояния иммунной систе -мы.

3. Специалистам, применявшим 0,5%-ную водную эмульсию кар -бофоса для борьбы с эктопаразитами животных, - необходимо учиты -вать, что препарат вызывает аутоиммунные реакции.

4. В целях профилактики срыва или слабого формирования про-тивосибиреязвенного иммунитета не допускать применения инсекти -цидов на животных до и в момент иммунизации вакциной СТИ. Мате -риалы влияния и,5%-ной водной эмульсии карбофоса на формирова -ние противосибиреязвенного иммунитета у животных включены в раздел 2.5 "Наставления по применению вакцины СТИ живой против сибирской язвы" (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 07.03.86).

5. Результаты исследований включены в методическое руководство "Иммунотоксикологическая оценка пестицидов" - Улан-Удэ,ВОТИ, 1993. - Ъо с.

6. Научное направление разработок диссертации развивается в Проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунохимии пестицидов Восточно-Сибирского технологического института Минвуза Р(Ж:Р: разработан иммуноферментный анализ карбофоса; способ им -

мунотерапии отравлений 2,4-Д; выпущены методические рекоменда -ции по иммунологической диагностике отравлений карбофосом и его производными; проводится иммунологический скрининг пестицидов ; разрабатываются методы детоксикации остаточных количеств карбо -фоса в пищевом сырье мясо-молочной и пищевой промышленности; исследуются подходы к иммунокоррекции имыунодефицитных состояний, вызванных пестицидами.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУШШВАННЫХ ПО ТЕДЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сперанский В.В. Состояние проблемы остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах // Материалы ХП-ой научной кои£е -ренции ВСТИ: секция химикс-технологичаская. - Улан-Удэ, 1973. -С.59-62.

2. Будаева Р.Л., Сперанский В.В. Антитела-преципитины при действии ДЦТ // Там же. - С.62-Ь5.

3. Будаева P.A., Сперанский В.В., Хуцяанова Ji.Ji. Исследования иммунозащты в организме при действии пестицидов. // Tar.i же. - С.69-73.

4. Сперанский В.В., Будаева P.A., лунданова Ji.Ji. Исследование электрофоретических фракций белков сыворотки при действии палых доз ДЦТ // Там же. - С.74-76.

5. Сперанский В.В., Балдаева З.й., Хунданова J;Ji. Злектро-форетический анализ солерастворимых белков тканей при поступле -нии в организм малых доз ДДТ // Там же. - C.76-ÜO.

6. Балдаева 3.«., Сперанский В.В, Антигенные изменения в тканях при действии ДОТ // Там же. - C.bO-ü4.

7. Мархваидзе Р.И., Балдаева З.Ф., Сперанский В.Б. О кошю-гации ДДТ с белками // Там же. - С.84-Ъ7.

ö. йархваццзе Р.И., Сперанский В.В., Ьалдаева ЗЖ Химича -

ский анализ ДДТ в тканях животных // Материалы ХЛ-ofl кон-

ференции Bü'üi; секция химико-технологическая. - Улан-Уда, G.Ö7-89.

9. Сперанский В.и., Будаева P.A. Об антителообрааовании ь организм:; крыс, получиьла ДДТ // '¿'.териалы 1Л-ой научно!! кон -фирснцод ЫОЛЦИЫХ научных сотрудников. 24 октября 1973. - Тбили -он — Тбилиси, НИИ оанитярми и гигиена им. Г.м.Натадэе, IW3.

С.61-62.

10. Сперанский В.В., Ьалдаева 3.J}., Мархиаидэе Р.И. Изменения белков печени крыс, получивших ДДТ // Там же. - С.оЗ-о5.

11. Сперанский В.В. 0 распределении ДЦ'Г в органах и тканях// Биохимические и технологические процессы в пищевой промышленно -сти. - Улан-Удэ, Бурятское книжное издательство, 1974. - C.9-II.

12. Сперанский ß.ß,, Хуцпчнова Ji.Ji, Об аномальных анткге -пах печени при хроническое действии малых доз пестицидов // da -те риалы Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии, часть й. - <л., Ib'M. 0.7I-7.i.

J3. Спвранскии u.B. л обнаружения антител при хроническом отравлении инсектицидами // адториалы 1-го Всесоюзного съезда нефрологов. - 1-'5шс>£, 1074. - C.IbO.

l'-i, Сперанский В.Ь. Об иммунологических свойствах комплексов инсектицид-белок // Тезисы докладов советских участников УШ Международного конгресса по защите растений. - М., I975.-C.1о5-13о.

io. Сперанский З.В., Ьалдаева З.ш. Методы иммунологии в диагностике отравлений пестицидами // Материалы 3-ей республикан -ской научно-практической конференции врачей Бурятии. - Улан-Удэ, 1У/6. - C.'lü0-403.

10. Сперанский В.В., Мархваидзе Р.И., Лаврентьев Ы.Б.Элект-

рофоретическая характеристика белков головного мозга крыс при . хроническом отравлении ДДТ // Том же. - С.404-408.

17. Будаева P.A., Сперанский В.В. Об антителах преципитинах при хроническом отравлении карбофосом // Биохимические и техно -логические процессы в пищевой промышленности, вып.2. - Удан-Удэ, Бурятское книжное издательство, 1979. - С.50-51.

18. Баддаева З.Ф., Сперанский В.В. Об аномальных антигенах, образующихся в головном мозгу крыс, получавших карбофос // Там же. - С.52-53.

19. Сперанский В.В. Иммунологический статус при токсическом действии карбофоса в эксперименте // Гигиена применения, токси -кологил пестицидов и клиника отравлений / Сб.научных трудов, выпуск 12-ый. - И., 1981. - С Л 60-161.

20. Сперанский В.В. Иммунотоксикология пестицидов // Тезисы докладов ХХУ1 научной конференции ВСТИ. - Улан-Уда, 1987. - С.27.

21. Баханова В.В., Сперанский В.В. Исследование функций пе-ритонеальннх макрофагов линейных мышей при антигенной стимула -ции и действия пестицида // Тезисы докладов ХХУЫ научной конфе -ренции ВСТИ: секция химия и химическая технология. - Улан-Удэ , 1989. - С.15.

22. Сперанский В.В., Дашиев Д.Д., Цыдылов В.Ц. Влияние карбофоса на формирование поствакцинального иммунитета // Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы экологии в ветеринарной медицине. 25-29 октября 1989. - i.i., 1989, -С.49-51.

23. Олейникова И.И., Сперанский В.В. Структура вилочковой железы кроликов, подвергнутых вакцинации и обработке против эктопаразитов // Материалы научной конференции морфологов Сибири и Дальнего Востока, 8-9 июня 1990 г., вып.5-ый. - Улан-Удэ, 1990. -

С. 64-65.

24. Сперанский В.В., Олейникова И.И. Соотношение популяции лимфоцитов периферической крови животных при обработке инсекти -цидом в условиях вакцинации // ¡методические рекомендации научно-практической конференции "Вопросы диагностики, лечения и профи -лактики болезней продуктивных животных". - Улан-Удэ, lüi'O.-C.Iü--17.

25. Олейникова И.И., Сперанский В.В. Некоторые данные о структуре и функциях иммунокомпетентных клеток животных, иммунизированных вакциной СТи и обработанных карбофосом // Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы / Тезисы докладов .'¡и Пленарного заседания Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой. 23-24 октября 1990, Ташкент. - М. ,1990.

26. Сперанский И.В., Олейникова Ii.И. Клинический иммуноло -гический анализ напряженности противосибиреязвенного иммунитета у крупного рогатого скота в условиях дезинсекции // Там «е. -C.I25-I2b.

27. Сперанский В.В., Цьщыпов В.Ц., Олейникова И.И. Влияние карбофоса на напряженность противоинфекционного иммунитета // Актуальные вопроси токсикологии, гигиены применения пестицидов и полимерных материалов в народном хозяйстве / Тезисы докладов всесоюзной конференции, Киев, 30-31 октября 1990. - Киев, 1990.

- С.64.

2и. Сперанский В.В., Олейникова И.И. Иммунотоксикологичес -кое действие карбофоса на вакцинированных животных // Тезисы докладов I съезда иммунологов России 23-25 июня 1992 г. - Новоси -бирск, IS92. - С.454-105.