Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Специфические антитела к морфину при хронической опийной интоксикации и их диагностическое значение

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НАРКОЛОГИИ

Г, и Он

Па оравах рукописи

" АИР т

УДК 616:89—008.441.13—07: 616.153.1-078.33-074

ПАРШИН Алексеи Николаевич

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К МОРФИНУ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ опит юн ИНТОКСИКАЦИИ И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Специальность 14.00.45 — наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата меднцпнеких паук

Москца 1994

Работа выполнена в Институте медико-биологических проблем кариологии (директор — член-корр. РАМН, профессор И. П. Анохина) Государственного научного центра наркологии МЗ России (директор — профессор А. Г. Врублевскнн).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук II. Б. Гамалея

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б. М. 'КОГАН, доктор медицинских наук С. Б. ПЕРШИН

Ведущее учреждение: Научный центр психического здоровья РАМН.

Загнпта диссертации состонтся <l../$...»........û^f..............1994 г.

с ............ часов на заседании Специализированного совета

Д 07450.0 i при Государственном научном центре наркологии МЗ РФ (г. Москва, 121921, пер. М. Могильцевский, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ наркологии.

Автореферат разослан «.. /г..»...^....... ...1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

О. Ф. ЛЬВОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблеш. В настоящее время и в нашей стране, и за рубежом употребление наркотических веществ с немедицинскими целями продолжает расти. Хорошо известно, что хроническая интоксикация наркотиками приводит к выраженным нарушениям на соматическом, нейро-гуморальнсм и психо-социальном уровне. Несмотря на противоречивые и несистематизированные данные о влиянии злоупотребления наркотиками на иммунную систему [Плецитый К.Д..Давыдова Г.В. 1989], вовлеченность последней в развитие наркомании как заболевания не вызывает сомнений. Этот факт хорошо укладывается в современные представления о роли иммунной системы в регулировании гомеостаза.

Изучение и осмысление реакций иммунной системы на хроническую интоксикацию наркотическими веществами должно помочь в решении принципиальных проблем наркологии, указать возможные пути адекватной диагностики и лечения наркоманий.

На сегодняшний день существует довольно много работ, посвященных изучению клеточного звена иммунитета при употреблении наркотических вещесчв, и имеется немалое количество обзоров существующей литературы по этому вопросу {Плецитый К.Д.Давыдова Т.В., 1989; Yahya Ii.D. .Watson R.H., 1987]. Менее изученной является реакция гуморального звена иммунитета. В большинстве работ указывается на повышение уровней сывороточных иммуноглобулинов У опийных наркоманов[Heathoote J., Taylor К.В., 1981]. И практически не изученным остается вопрос о существовании и роли специфических антител к наркотическим веществам, хотя в экспериментах на животных была продемонстрирована их индукция. (Ringle D., Herndon В., 19753-

Будучи наименее изученным, этот вопрос является в то же время одним из наиболее важных и интерзсшх. Выработка специфических антител в ответ на хроническую интоксикацию означает включение главного эфакторного механизма иммунохимической функциональной системы гомеостаза. Появление специфических иммуноглобулинов мокэт существенно менять фармакокинетику препарата, а также служить вакнкм диагностическим признаком,, имеющим большое практическое значение.

Сегодня основным объективным лабораторным методом исследования наркоманов является токсикологическая экспертиза, основанная на определении в биологических средах непосредственно наркотического вещества, которое в организме активно метаболи-

зируется и через непродолжительное время уже не определяется. Что касается опиатов, то возможности их определения в моче ограничены 24-48 часами после последнего приема, при определении в крови это время еще меньше. К тому же токсикологическая экспертиза лишь констатирует факт употребления наркотика, но не характеризует его как патологический процесс. Все это в свете ненаказуемости употребления и добровольности лечения сникает диагностическую ценность вышеописанных методов.

Выработка специфических антител может свидетельствовать о декомпенсации классических путей метаболизма наркотика в случае его запредельного поступления в организм и вовлечении системы иммунитета в подаераание гомеосгаза. Уровень этих антител может характеризовать степень ыейро-хишческого дасстресса и размер участия иммунной системы в его компенсации.

Таким образом, очевидно, что роль специфических антител в патогенезе наркомании представляется безусловно важной, а факт обнаружения их повышенного уровня может стать объективной и информативной характеристикой злоупотребления наркотическими веществами.

Использование стандартного методического подхода, основанного на применении твердофазного иммуноферыентного анализа (ИФА) для определения специфических антител к опиатам' позволит обойтись без дорогостоящего оборудования. А его широкое применение в диагностике СЯВДа и гепатита дает реальную возможность быстрого, нэ требующего больших материальных затрат, внедрения на базе исшльзувдегося оборудования. Кроме того, возможность визуального учета реакции делает этот метод еще более доступным для самого широкого применения в медицинской практике.

Несомненный научный и практический интерес этой проблемы послухил основанием для проведения настоящей работы. Цель и задачи. Цельи настоящей работы было изучение образования специфических антител к опиатам и возможности использования этого факта в диагностике хронической интоксикации опиатами, разработка рутинного метода на основа иммуно-ферментноло анализа и его практическое внедрение.

Для дост;а:оы;я этой цели необходимо было решить следувдие задачи:

I. Изучить условия образования и специфичность антител к морфшу при хрогшчоской интоксикации опиатами у »азотных к человека.

2. Разработать твердофазный иммуиоферментный анализ с применением пероксидазы хрена для диагностики хронической опийной интоксикации, исследовать его Чувствительность и специфичность с использованием груш сравнения (другие вида наркоманий, инфекционные и аутоиммунные заболевания), привести характеристики метода в соответствие с государственными и международными стандартами.

3. Разработать вариант диагностического теста для визуального учета результатов на основе р-лактамазы.

4. Сравнить методические варианты теста, провести матема-тико-статистический анализ, разработать критерии диагностики и инструкции по практическому применению.

5. Разработать всю необходимую для практического внедрения техническую документацию, создать на ее основе опытную партию наборов реактивов для определения антител к опиатам. Провести . предварительные, межведомственные и медицинские испытания.

Научная новизна. Впервые показано, что реакция иммунной системы развивается преимущественно по Т-независимому типу при возможном решающем участии макрофагов.

Впервые продемонстрирована возможность использования факта выявления антител к опиатам в сыворотке кро-ри для диагностики хронической опийной интоксикации и разработан метод определения антител к опиатам в сыворотке крови на базе твердофазного иммуноферментного анализа, а также вариант теста с использованием р-лактамазы и создан набор реактивов для иммунофврментяого анализа антител к опиатам в сыворотке крови человека, не имеющий аналогов ни в наией стране, ни за рубежом. Проведено сравнительное изучение вариантов теста между собой и с разработанным в Италии методом определения морфина в волосах.■

Создан специфический коныогированный антиген морфин-бедок по оригинальной методике, и проведено сравнение его с известными аналогичными антигенами.

В экспериментах на кявотных изучена зависимость индукции специфического гуморального иммунного ответа от интенсивности п длительности хронической наркотизации.

Практическая значимость результатов исследования. Результаты изучения реакции гуморального иммунитета при хронической опийной интоксикации могут помочь в пониманда патогенетических механизмов развития наркомании, открываю? возможности новых

а

подходов к оценке тяжести заболевания, эффективности лечения к критериев излеченности, ь такте иммунологическим методам лечения.

Разработанный диагностический тест приспособлен к возможностям практического здравоохранения и может быть внедрен ь широкую медицинскую практику. Методические подходы, разработанные для решения данной задачи, могут быть использованы для изучения возможной индукции образования специфических антител другими низкомолекулярными веществами, в том числе наркотическими. Созданный набор реактивов может быть использован в наркологических клиниках, при диспансерном наблюдении, на станциях переливания крови, а также при профилактическом обследовании различных контингентов населения и врачами других специальностей для исключения наркомании.

Внедрение. Получено авторское свидетельство на изобретение £1807420. Разработанный метод использовался в 17 наркологической больнице г.Москвы, в Гематологическом научном центре МЗ РФ, на станции переливания кропи г.Подольска. КаСор реактивов "Ыорфоскрин" просел предварительные, межведомственные и медицинские испытания. Результаты испытаний были долоиены на заседании комиссии по радиоишунным и иммуноферментным наборам реактивов Комитота по новой медицинской технике Министерства здравоохранения №. Резениом комиссии набор реактивов рекомендован к промышленному выпуску.

Апробация работы. Тема диссертации утверадена на заседании Проблемной комиссии. ГКЦ наркологии МЗ РФ от 16.02.1990г. (протокол З-з). Основные материалы и положения диссертации доложены л утверждены на мэжлаОораторной конференции института медико-сиологических проблем наркологии (протокол Й14 от 12.П.19Э2Г). Основные материалы исследований были такг;з доложены на: Всесоюзной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным препаратам" (Ростов на Дону 1990г.), совещании по вопросам профилактики иаркотизма, (Москва 1991г.); семинаре "Иммунохимичэские подхо^-ды в диагностике хронической наркомании" (Верона, Италия, 1931г.); I Всероссийском съезде иммунологов, (Новосибирск 1992г.) "

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 16-2 страниппх машинописного текста и состоит из введения, 4 глав,

выводов я приложения. Список литературы включает 186 источников, з том-числе 54 отечественных и 132 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 12 рисунками, актами испытаний: набора реактивов для определения антител к опиатам в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ • В основу работы положены результаты обследования 158 (Зольных опийной наркоманией, 49 больных эфедроуовой наркоманией, 134 потребителей гашиша, 31 потребителя седативно-снотворных препаратов, 10? больных алкоголизмом. Контрольную группу составили здоровые, главным образом, доноры крови, общим числом 526 человек.

Для изучения специфичности разработанного диагностического теста были обследованы слэдувдиэ группы сравнения: , _ больные ревматоидным артритом (16 человек), системной красной волчанкой (26), вирусным гепатитом (67), туберкулезом легких (20), психическими растройствами (31), а также группа беременных из 48 человек. Обследованные лица были в возрасте от 20 до 50 лет.

Материалом для исследования содержания специфических антител к морфину у людей служила венозная кровь.

Материалом для исследования служила также кровь мышей и крыс, посла хронической наркотизации морфином по различным схемам путем подкожных иньекций. Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора. Кровь отбирали при декалитации, а 2 случае динамического наблюдения из хвоста.

Для исследования уровня штител к морфину в сыворотке крови применяли разработанный наш метод с использованием некоторых реагентов, специально синтезированных в лаборатории. В его основе лежат стандартные методические подходы использования ферментных меток в иммуноанализе 1Иммунофермэнтнкй анализ., 1383.]. За основу был взят метод твердофазного аммунофэрмватного анализа с разделением компонентов (гетерогенный ИФА).Принцип данного методического подхода состоит в использовании меченных ферментом антивидовых антител для индикации специфического взаимодействия ыевду антигеном и антителом на твердой фазе. Для сенсибилизации твердой фазы был

специально синтезирован коныогкрэваннкй антиген мэрфаи-б&лок го оригинальной методике. В качестве антивидовых антител меченных пероксвдазой /р-лш использовали комерческк? препараты, антитела мэчонпис £-лактамгзой получали специально.

Статистическая обработка результатов исследования. Всо получешше результаты обрабатывали ' с помскыз методов вариациошюй статистики,[в.ю. Урбах, IS75; к.л. Лобациая, IS78; И.Г. Лаврова, IS84.]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Синтез коньнгированного антигена иорфин-Зелэк. Морфин плохо сорбируется на твердой фазе, кроме того, при такой сорбции могут закрываться участки молекулы, необходимые для специфического взаимодействия с соответствующими антителами. Поэтому первой задачей, которую необходимо было решить, стало получение адекватного антигена, отвечающего следующим основным требованиям: он должен хорошо сорбироваться на полистироле; максимально соответствовать предполагаемому антигену, образующемуся In vivo; обладать высокой специфичностью к при этом обеспечивать хорошую эффективность выявления.;

Белковые молекулы вполне отвечают этим требованиям. Поскольку предполагается, что в организме морфин коньюгирован с альбумином, то, в гервую очередь, при создании искусственного антигена ь качестве носителей были исследованы различные альбумины (человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, своальбумин). На основе этих белков были синтезированы коньюгаты с морфином по 3-му, 6-му и 2-му положении молекулы морфина [Й.Е.Ковалев, О.Ю.Полевая, 1985.)

Всеми эти.« антигенами проводили сенсибилизацию поли стироловых планшетов для исследования сывороток наркоманов в твзрдофаспзм шогунофераентном анализе на предает выявления специфических антител к морфину. Сколько-нибудь значимых результатов получено на было. Большинство исследованных сывороток достоверно не отличалось от контрольных значений в пуло донорских сывороток.

^удовлетворительные результаты применения альбуминов заставили искать другие пути для решения поставленной задачи В этом направлении были исследованы различные антигены с

б

использованием белков и полипеотидов в качестве носителей. Работа велось в направлении поиска возмсмгостсй оптимизации технологии и характеристик искуственнаго антигена примени-толыю к реиению конкретной задачи и в результате била разработана оригинальная методика синтеза конъюгировашгаго антигена. Связь осуществляли через молекулу бензойной кислоты, которая,' с одной стороны, обеспечивала жесткость положения молекулы морфина, а с другой: стороны, оставляла доступными активные центры молекулы для взаимодействия с антителами. Кроме того особенности методики позволили добиться практически 1ССЖ Быяода по белку, что делает данный подход высоко технологичным и пригодным для промышленного производства.

Получите антивидовых иммуноглобулинов иечешмх ß-ЛЕКтаиазой.

В традиционном пероксидазном варианте твердофазного ИФА использовали готовые коммерческие хоныогаты, осуществляя периодически контроль их качества и определяя рабочее разведение. Однако для создания деаавого общедоступного теста, позволяющего проводить визуальный учет результатов реакции, был выбран в качестве метки фермент - ß-лактамаза.

3 своем выборе мы руководствовались следующими соображениями: во-первых, в качестве субстрата при учете этой реакции можно использовать пенициллин и йод-крахмальный реагент в качестве индикатора, а характерной особенностью йодометри-ческого титрования является лавинообразное накопление продукта реакции. Результатом этого является достаточно резкий переход от темно-синего цвета к полному обесцвечивают раствора, что удобно для визуального учета результатов. Во-зторих, данная фэрмент-субстратная ситома дешева и экологически безвредна, что выгодно отличает ее от пероксидазной системы в которой используется ортофенилендаамин, обладающий канцерогенным действием. Конъюгации осуществляли одноэтап-шм методом с использованием глютарового альдегида по методике [Voller А., Bartlett А., Bidwell D.E., 1978.] С некоторыми модификациями. Для получения коныэгата использовали кроличьи иммуноглобулины против IgfJ человека производства НИИ микробиолоим им Н.Ф.Гамалеи, подвергавшихся дополни-

тедыюй очистке [Антитела.Методы. ,т.1, 1991.] , и препарат пеницшшшаза производства НИН антибиотиков, г.Москва.

В качестве субстратной смеси для данного фермента обычно используют смесь, содержащую бензилпеницшшш, желатин, крахмал, йод и йодад калия в фосфатном буфере.Чтобы упростить прцедуру приготовления реагента была предложена оригинальная субстратная смесь, использование которой нисколько не ухудшало качество анализа.

Далее была проделана работа по определению оптимальных условий проведения анализа и повышения качества реагентов не пути от экспериментальной методики к коммерческому набору реактивов, отвечающему государственным и международным стандартам.

I Испытание опытной партии набора реактивов для определения антител к иорфиызг в сыворотке крови человека методом гашунофершктного якалаза.

На основе полученных результатов была создана опытная партия наборов реактивов для ИФА антител к опиатам.' Набор успешно прошел предварительные испытания в лаборатории иммунохимии ГНЦ наркологии, на основании чего были назначены межведомственные испытания, которые он такке выдераал. После этого по поручению производственно-технического управления Минздрава РФ. была проведена серия медицинских испытаний набора в Научном центре психического здоровья РАМН, Гематологическом научном центре, 17 наркологической больнице.

Результаты испытаний были доложены на заседании Комиссии по радиоикмунным и иммуноферментным наборам реактивов Коште та по новой технике Минздрава РФ. Решением комиссии набор реактивов рекомендован к промышленному выпуску (протокол Но2 от 27 апреля 1992г).

Итогом проделанной работы такке явилась разраОотка всей необходимой нормативной документации по производству и применению набора реактивов для определения антител к опиатам: медико-технические требования, технологический регламент, технические условия ТУ 42-3-60-92, инструкция по применению. Всо документы утверадены Минздравом РО.

Роль шнуноглобулгаов' б и М классов в гут/оральном шшугаюц отзете на хрскнчесиув опийнув интоксикация.

При рассмотрении общего уровня иммуноглобулинов по отдельным классам согласно литературным и собствешшм данным момго сказать, что для опийной наркомании характерно повышение уровней иммуноглобулинов, главным образом 1р}1 (более чем в 2 раза) и некоторое увеличение и 1вА. В значительной мере такое увеличение 1вМ видимо связано с многократными внутривенными.иньемдовш наркотика. Юг1еоо 1973-1 При определении специфических антител класса в в МФА с,использованием коньюгированного антигена морфин-белок лишь в отделышх сыворотках удалось достоверно определить наличие соответствующих антител, но средние- значения в группе наркоманов не отличались от таковых в группе здоровых и других группах

сравнения (таб.1) ИФА специфических антител класса, М-т. Таблица 1

Группа. п ОП Разброс данных

I. Больные опийной наркоманией 25 0,18-0,02 0,08-0,38

2. Здоровые 17 0,22-0,03 0,08-0,44

3. Больные алкоголизмом 15 0,19*0,03 0,07-0,44

4. Больше Еирус- 20 0,24*0,03 0,06-0,44

ным гепатитом !__

Однако в аналогичном случае при определении 101 ситуация сложилась по-другому.(табл.2) в этом случав получено значительное повышение оптической плотности в груше опийных наркоманов по сравнению с группой здоровых (практически в 2 раза), а также и в сравнении с другими исследованными группами.

Эти результаты послужили основанием для выбора в качестве диагностического показателя уровень специфических антител класса М.

ИФА специфических антител 1еМ класса, • Таблица 2

Группа обследованных п ОП Разброс данных

I. Больные опийной наркоманией 67 0,73±0,04 Р<0,001*' 0,48+0,99

2. Здоровые 45 0,33*0,02 0,28+0,48

3. Больше эфедроно-вой наркоманией 10 0,43-0,02 0,3840,48

Больные 4. алкоголизмом 51 0,зе±0,01 0,29+0,47

ьолышэ 5. аллергией 12 0,43*0,02 0,35+0,51

6. Потребители седа-тивно-снотворных препаратов II 0,36±0,01 0,35+0,48

» сравнение с группой здоровых.

Специфичность определяемы! аптател изучали в реакции тормоэгения связывания с коньюгированныы антигеном морфин-белок в ингибиторном ИФА. Для сравнения были выбраны следующие вещества: кодеин, как наиболее близкий по своей структуре, и два вецества, которые значительно отличаются от морфина по форме внешних электронных облаков, но также обладают наркотическим действием, - эфедрин и фенобарбитал. Полученные результата представлены в таблице 3. Для отдельных сывороток константа (Ка) по морфину колебалась от 1*Ю4 до Как видно пз этих данных, морфин и ^кодеин, как и ожидалось, имеют близкие Ка. и хотя эти значения относительно невысоки, они тем не менее на три-четыре порядка превышают Ка,. полученную в реакции тормозения эфедрином и фенобарбиталом, следовательно мы вправе говорить о специфичности определяемых антител. Кроме того, в отдельных сыворотках . удалось выявить антитела с Ка 1*10а-1*Ю9М-1, однако наиболее характерными и, следовательно имеющими большее диагностическое значение, являются антитела с низкой Ка. Это хоро-. ¡по согласуется с тем, что в сравнении с имеют, как правило, более низкую аффинность.

Таблица 3

Оценка специфичности антител к морфину у наркоманов в ингибиторном ИФА

Ингибитор 1С50 Ка ( М-1)

пг/мл м

I. Морфш-гидрохлорид 2 »10® 6,2*10~е 1,6*Ю5

2. Кодеин 4*105 1,3*10""6 7,5*105

3. Эфедрин гидрохлорид . 1*Ю9 6,0*10"3 1,7«102

4. -Фенобарбитал 1.1010 4,3»Ю~2 2,3»Ю1

Нас интересовал вопрос о том, какую роль в специфическом взаимодействии между 'антигелом и коньюгированным антигоном играет антигенная детерминанта, образованная морфином, и каков вклад белкового носителя. Для решения этого вопроса провели сравнительное исследование уровней антител, определяешь в лунках сенсибилизированных коньюгированным антигеном, и параллельно, в лунках сенсибилизированных белком, прошэд-шш такую К9 химическую обработку, как при коньпгоции его с морфином (таб. 4).

Таблица 4

Средние значения ОП в ИФА антител класса Ы на твердой фазе сенсибилизированной коньюгированным антигеном морфин-белок(Ы-Б), белком носителэм(Б) л без АГ.

Группа оОслэдов. М-Б Б боз АГ

Больные опийной наркоманией(п=38) 0,668+0,043 Р<0,0001* 0,167+0,024 Р<0,01* 0,156+0,024 Р<0,001*

Здоровые (п=32) 0,234+0,010 0,090+0,005 0,059-70,003

Больше алкоголизмом (п=15) 0,282+0,018 р<о,ог* .Р<0,001а* 0,053+0,007 Р<0,001* Р<0,01** 0,050+0,008 Р<0,02

Потребители гвсиза (п=27) 0,260+0,032 Р<0,С001** 0,089+0,017 Р<0,02*' 0,088+0,019 Р<0,05ое

Больные вирусным гепатитом (п=20) 0,273+0,01Э ?<0,0001** 0,107+0,008 0,076+0,007 Р<0,05гг:

решатонгошм артритом 20) 0.265+0,028 Р<0,0001** 0,101+0,030 0,058+0,007.' Р<0,01г*

в сравнение со здоровыми, »» с больными опийной наркоманией.

Потто 38 сывороток опийных наркоманов .было исследовано 5 групп сравнения, в том числе: здоровые , потребители гаши-иа, больные- алкоголизмом, больные ревматоидным артритом, больше вирусным гепатитом. Выявлено более чем двухкратное увеличение оптической плотности в ИФА при исследовании сывороток опийных наркоманов на коныогированном антигене, по сравнению с другими группами обследованных; в этой группа отмечено увеличение ОП и на белкё-носителе, хотя абсолютные значения в этом случае были значительно шшэ: 0,57 у опийных-наркоманов в отличии 0,23 у -здоровых на коныогированном антигене и соответственно 0,17 и 0,09 на белке-носителе. К тому ке, если сравнить последние значения с полученными'на полистироле, нэ экранированном коныогатом или белком, -то ш увидам, что они очень близки. Поскольку сорбция антител на полистирола ягляется неспецифической, то очевидно, что увеличение оптической плотности в ИФА сывороток опийных наркоманов на белке-носителе отракает общее повышение уровня характерное для данной группы.

Индукция образования специфически антитол к корфану в модельных экспериментах на пшотных.

Возможность, образования специфических антител в ответ на введение коньюгированного с белком морфина у пшоишх хороио изучена.' Имеется немало убедительных данных об обнаруташш специфических антител после, подкожной имплантации капсул с морфином ила при совместном введении его с адьюаятом 4рейн-да. В данном случае, целесообразно было использовать модели,' по возмоаяосгя приближающиеся к реальной ситуации в случае опийной наркомании. Ккыш словам!, необходимо было получить гуморальный ответ* иммунной системы в результате хронической наркотизации животных.

3 первой модели использовали -крыс линии Вистар. 20-яя-ьо'птпх в течении трех месяцев получали ежедневно по Юмг/кг морфина гидрохлорид;' в виде внутряоршишнх пкьекций. 10 кл~ вотных по аналогичной схеме получали: физиологический раствор. В иммуиофэрмонтном анализе специфических антител к морфину выявить ко удалось.

Другая модель была отработана на мшах. Применили йчлее высокие дсзн и частоту корфана, но курс иаркотиза-

ции был короче. 60 мышей в течении первой недели получали два раза в день возрастающие дозы морфина от 1йгг/кг до ЮОмг/кг в виде подкожных иньекцй. В течении второй недели они получали по ЮОмг/кг, также два раза в день. А 30 контрольных животных получали физиологический раствор по той же схеме.'К концу эксперимента получили выраженные эффекты наркотизации, но достоверного повышения ОП в ИФА антител к морфину обнаружено не било.

В следующей схеме увеличили возрастание дозы до' 140мг/кг и продолжительность наркотизации до 4 недель. При установлении' диагностического порога в два стандартных отклонения по отношению к среднему значению ОП в сыворотках контрольных кивотных (вероятность события 95,5%),были получены следующие результаты: 12 животных из 33, подвергнутых наркотизации по этой схеме, реагировали выработкой специфических антител к морфину, что составило 36,4%. Даже если рассматривать среднее значение ОП в общей статистической совокупности наркотизированных животных, то оно достоверно превышает среднее значение в контрольной группе. У ыорфинизировашых животных 0,63+0,10, против 0,44+0,05 у контрольных (Р<0,05). При рассмотрении статистической совокупности положительных сывороток, достоверность среднего повышения ОП резко возрастет: 0,91+0,26 для положительных и 0,44+0,10 для контрольных ' сывороток ' (Р<0,0001).

С целью подтверждения полученных результатов и дальнейшего изучения- этого явления аналогичная схема наркотизации морфином была применена к крысам самцам линии Вистар. Опытные животные были разделены на 4 группы. Первая группа обследована через две недели наркотизации, вторая через четыре недели, третью группу тестировали через месяц после прекращения морфинизашш и четвертую через два месяца. Контрольные животные получали иньекции физиологического раствора. Выя. влено заметное повышение ОП как в случае 2-недельной, так и 4-недельной наркотизации по сравнению с контрольной группой. Специфичность определяемых антител к морфину подтверждали в сравнительном анализе на твердой фазе, сенсибилизированной коньюгировангшм антигеном морфин-белок и параллельно белком носителем.- Различия имели достоверный характер. Повышенный

уровень антител сохранялся в течении двух месяцев после последней вдьекщш наркотика.

Частота положительных результатов анализа специфических антител к морфину в сыворотках морфинизированных животных составила 52,4 и 45,5% в группах с 2- и 4-недельной наркотизацией соответственно. Положительным считали результат, пре-' вышаюций среднее значение в контрольной группе на два стандартных отклонения.

Специфичность антител изучали в экспериментах по тормо-.-кению в ингтбиторном ИФА. 1СЕОдля морфина и кодеина составили соответственно 6,2*10"^*и 2,0«10_4М, a Ka 1,6*103М"1 и з —I

5,0*10 м , что оказалось примерно на I порядок шкелчем-у людей.

Подводя Итог экспериментам на гмвогных' и наблюдениям сделанным при обследовании больных наркоманией можно сказать, что последняя из опробованных схем наркотизации определенно приводит к появлению специфических антител примерно у половшш гивотных, что согласуется с результатами полученными у людей. Однако в случае подкожной имплантации капсулы с морфином швотшм образование таких антител происходит практически в JOOS случаев. В данной ситуации вокруг капсулы образуется инфильтрат внутри которого продолетгтельное время существует высокая концентрация морфина, которая в сочетании ' с прясутствупцго/и здесь нейтрофхлами и макрофагами, а также белками воспаления, создает оптимальные условия для активация молекула морфина и образования коньвгированного.антиге-• на. В работе Ковалева И.Е. и Тожшяа В.A. CIS89J была продемонстрирована возможность обр830ваш!я коныэгата морфян-белок в иккросомзлькой системе печени, однако нойтрофилы и макрофаги обладают ке менее мощдой порекисной ситемой, спо- . собкой к активации морЗвна. ¡{рога .того именно макрофаги, специализируется на процессипгв и представлении антигена В-клоткем, т.е. запускают т-независший ответ. .

■ На ноя взгляд' именно макрофагам : принадлежит решающая роль в"образовании коньюгата морфин-белок in vivo, поскольку только., с этих позиций можно ' объяснить преимущество капсульной . формы введения морфина в опюшешш индукции, вьмуиного ответа.

Наряду с этим, при хронической сппйной интоксикации имеются Есе признаки преимущественного развития имушого ответа по Т-независимому Т1шу. Это угнетение Т-клеточного иммунитета, инволюция тимуса, гиперплазия надпочечников, нарушение соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры Шлецитый К.Д., Давыдова' Т.В. 1989) и отсутствие переключения B-клеток с продукции низкоаффинных Igji на синтоз высоко аффинных IgG.

Специфичность диагностического теста осковакного на определении антител к опиатам.

На основании результатов, полученных в экспериментах на животных, можно было ожидать, что длительность введения, регулярность, высокие'дозы - это те.условия, которые способствуют образованию специфических антител к наркотику. Причем повышенный уровень этих антител поддерживается, по-крайней мере, в течении двух месяцев. И действительно, когда из общей группы обследованных больных опийной наркоманией были отобраны сыворотки наркоманов, систематически употребляющих опиаты в течении 3-10 лет, с давностью последнего приема наркотика не более 2-х месяцев, процент положительных результатов поднялся до 74,3+7,4% (в общей группе наркоманов он составлял 48,1+4,9%), Р<0,01.

Исследование уровня антител у наркоманов в условиях стационара и после выписки показало их достаточную стабильность 'на протяжении 4-8 недель после последнего приема наркотика. Наиболее высокий уровень антител регистрировали обычно через неделю после последнего приема, что, вероятно, было связано с- выведением наркотического вещества из организма и высвобождением специфических антител из иммунных комплексов.

Для реиения вопроса о специфичности предлагаемого теста, основанного на определении уровня антител к морфину в сыворотке крови, в плане диагностики опийной наркомании было проведено широкое сравнительное изучение различных групп ла-■дей с другими заболеваниями, а такие' здоровых.

В группу больных опийной наркоманией были включены лица, употреблявшие наркотические препараты ошатной природа, главным образом, кустарно приготовленные из мака. Ее сотавп-ли 106 человек, средний возраст которых сыл 31,2+1,1 года, общая длительность наркотизации 7,2+0,9 лет, а давность пос-

ледеего введения препарата составляла 75,8+30,4 дней.

Груша больных эфедроновой наркоманией состояла, из 38 человек, употреблявших внутривенно кустарно приготовленные производные эфедрина - эфедрой и первитин. Средний возраст в этой группе - 30,7+1,4 года, общая длительность наркотизации 3,0+0,5 года, а давность последнего введенния наркотика 19,6+3,9 дней. В груше потребителей гашиша было 87 мукчин, употреблявших каннабиноиды. Средний возраст составлял. 29,0+0,9 лет, обшая длительность наркотизации'- 7,5+0,6-лет,' давность последнего приема наркотика -•2,9+0,3 года. '

Груша потребителей седативно-снотворных препаратов (бензодиазепины и барбитурата) включала 16 мужчин, средний возраст которых составлял 31,4+1,7 года, длительность- употребления - 8,2+1,8 года, а давность последнего приема ток-сикоманических препаратов была 17,0+5,6 дней.

В группу больных алкоголизмом вопли 45 мукчин во второй стадии заболевания, средний возраст которых составлял 33,5+1,8 года, длительность заболевания - 12,4+1,5 года. На момент забора крови больные находились вне абстинентного синдрома.

Кроме этого, было обследовано 526 доноров. Это были мужчины в возраста 29+1,1 лет.

Для учета возмогших лопю-пологаггельных результатов про~-еэли такгэ тестирование групп больных инфекционными, аутоиммунными и психическими заболеваниями, а также группу беременных. Сюда вошли болышэ В1фус1шм гепатитом - 47 человек," больше туберкулезом легких - 20 человек; больше ревматоидным артритом -16 человек; больные системной красной волчанкой - 26 чмовок; больные психически,и расстройствами -28 человек. Все обследованные были мутоты в возрасте от 20 до 50 лет. И группа беременных женшш (-в том числе с патологией беременности) состояла из 48 человек.

Для сравнения результатов иммунологического тестирования исследуемых сывороток был использован:относительный показатель - процент повышения оптической плотности в ИФА на коныогированном антигене морфин-белок по отношению к отрицательному контролю. В качестве отрицательного контроля .ис-пользовзли равнообъемную смесь 30 сывороток здорйвых, лио-

г:

фильно висушонную и хранившуюся при 4°С. Как видно из представленных в таблице 5 данных, средние значения процента повышения оптической плотности в4 ИФА антител к морфину в группе опийных наркоманов с высокой степенью достоверности отличались от таковых в груше здоровых (Р<0,0001). Другие группы обследованных также с большей или меньшей степенью достоверности отличались от групп опийных наркоманов, хотя были выбраны групгш традиционно даюаие высокий процент локнополо-яительных реакций при обследовании иммунологическими методами.

'Интересны®!, в плане еще одного доказательства специфичности теста определения антител к морфину, являются результаты по изучению кинетики ферментативной реакции в случае использовашя антивидовых иммуноглобул1шов, меченных (3-лактамазой (рис.1). При исследовании сыворотки донора кривая зависимости оптической плотности от времени представляет собой практически прямую линию, что не характерно для специфической ферментативной реакции. В случае исследования сыворотки опийного наркомана была получена отчетливая кривая, характерная для ферментативной реакции.

Таким образом,'-полученные результаты позволяют сделать заключение.что метод диагностики опийной интоксикации, основанный на определении антител к опиатам, является достаточно специфичным и результативным, особенно в случае длительного употребления, когда процент положительных результатов достигает 75. .

Сравнительная характеристика методических вариантов определения антител к иорфину с использованием Р-лактаиазы и пероксидазы в качестве ферментных меток для ИФА.

Для сравнения трех разработанных нами методических вариантов определения антител к морфину было проведено параллельное тестирование 82 донорских сывороток в лаборатории профилактики СШДа и вирусного гепатита Гематологического научного центра РАМН. Проводили одновременное исследование методом твердофазного ИФА с использованием антивидовых антител, меченных (3-лактамазой (визуальный и инструментальный варианты учета результатов отдельно) и меченных пероксидазой (только инструментальный учет). В результате визуального

Средние значения уровней антител класса М к коньюгированнсму антигену морфин-Солок в группах,обследованных, М+м.

1 Число обслед. Уровень Р<,сравнение с группой опийных наркоманов

I. Больше опийной наркоманией 105 29,7*2,8 0,0001"

2. Здоровые 44 2,3*2,2

3. Больше эфедро-повой наркоманией 38 15,5*3,3 0,01 1 ( 1 1

4.Потребители гашиша 87 | 6,5-1,6 \ 0,0001

5. Потребители седа-тпЕШ-снотворных препаратов • 16 -9.1*3,6 0,0001

6; Болышо алкоголизмом 45 -4,9*2,4 0,0001 - • - 1

7. Больные психичесю ми расстройствами I- 28 9,8*3,6 0,01 .

8- Вольные ревматоид ним артритом 16 7,4*3,9 0,01 1

9. Больные системной красной волчанкой 26 9,9*5,0 0,002

10.Больные вирусным гепатитом 47 5,4*2,9 0,0001 1 . !

II.Больные туберкулезом 1 20 '7,3*3,9. . 0,002 ' 1

12. Бе ремешше ' | 48 10,9*3,5 0,001 |

» - сраЕнзние с группой здоровых

¡лактамазный тест в динамике!

И

минуты

««=»»■■=■ сыворотка наркомана сыворотка донора

Рисунок I

тестирования с использованием р-лактомазпой метки 7 сывороток из 02 били отнесены к разряду положительных, \р них только 5 были подтверждены в инструментальном варианте теста. И,наконец, только 4 из 5 сывороток, признаных положи-тельными в 0-лактамазном тесте, были подтверждены перокси-дазным методом. Отсюда можно сделать вывод, что4 р-лактамазный тест рассчитан на некоторую гипердиагностику по сравнению с пероксвдазным вариантом, на этом основании он . может быть рекомендован для скринингового обследования боль--них контингентов. Все отрицательные результаты, полученные (З-лактемазшм методом, были подтверндены пероксидазным, на основании чего ш можем говорить о высокой подтверждаемое™ и сопоставимости результатов анализа.

Сопоставление тялгунологического тестирования с результатам! токсикологической экспертизы, основанной на определении иорЗлиа в волосах.

Разработанный в Италии метод определения морфина в волосах практически является единственным токсикологическим тестом, позволяющим проводить диагностику в отдаленные после последнего употребления наркотика сроки. Тагам образом, представляло интерес - сопоставление диагностики, основанной на реакции гуморального иммунитета, с результате!,® токсикологического анализа. ' .

Эту работу проводили совместно с институтом судебной мэ-дицшш Веронского университета (Италия), где впервые был разработан данный метод Шат1да М-, Т^Иаго Р., Ро1ев1 С., • ег а1., 1985.; ГазНаго Р., Саг11 С., Сг1з1юГог1 , ег а1., 1988.3. Для определения антител к морфину использовали перо-ксидазный вариант теста.

В результате токсикологического исследования во всех образцах волос наркомаков были обнаружены опиаты в количествах, превышавшее пороговые значения (0,07пг/мг). В группь здоровых лиц все результаты были отрицательными.

■ При исследовании уровня.специфических антител все отрицательные результаты, полученные при токсикологическом анализе, были подтверждены. В группе наркоманов 16 из 25 были определзны как положительные, что составило Полное . совпадение отрицателыых результатов еда раз подтвердило еы-

сокую специфичность диагностики, основанной на выявлении антител к опиатам.

ВЫВОДЫ

1. На основе твердофазного иммуноферментного анализа разработан метод определения специфических антител к морфину

• в сыворотке крови с использованием двух индикаторов: пероксидазы хрена и |3-лактамазы.

2. Для хронической опийной интоксикации характерно достоверное повышение уровня антител к морфину класса КЗ, определяемому по связыванию с коньюгированным антигеном морфин-белок, в 50% случаев.

3. Специфическая роакция иммунной системы на хроническую опийную интоксикацию развивается преимущественно по Т-независимому типу. Наиболее характерным является повышение уровня специфических антител М-класса, имеющих относительно низкую аффинность.

4. Индукция иммунного ответа опиатами зависит от дозы и длительности наркотизации, а также от способа введения наркотика.

5. Длительное (от 3 до 10 лег), регулярное употребление наркотиков опийной' группы при давности последнего приема не более двух месяцев, сопровавдается повышением уровня антител к морфину в 75% случаев.

6. Повышенный уровень антител к морфину, определяемый разработанным методом, в сыворотке крови здоровых людей встречается не более чем в Ъ% случаев, что свидетельствует о высокой специфичности теста.

7,.Вариант иммуноферментной тест-системы с использованием р-лактамазы в качестве ферментной метки имеет относительно низкую стоимость, дает возможность визуального учета результатов роакции и не содержит токсичных реагентов. Все это делает его доступным для широкого практического применения.

8. Результаты медицинских испытаний опытной партии набора реактивов для определения антител к морфину в сыворотке крови человека свидетельствуют о высоких аналитических и эксплуатационных качествах набора и позволяют использовать его для диагностики хронической опийной интоксикации.

СПИСОК РАбСТ ОГОШКОВАШНХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Роль иммушюй системы в формировании резистентности к психотропным- препаратам.//В кн.: Биологические основы чувствительности к психотрошшм препаратам./ Тез. докл. Всес. конф. Ростов на Дону, 1990.- с.10.(В соавт.с Н.В.Гамалея.)

2. Выявление антител к морфину в сыворотках больных' опийной наркоманией с помощью твердофазного иммуноферментно-го анализа с р-лактамазой.// Вопросы наркологии. - 1991. .- . $3. - . с.10-13. (В соавт. с Н.Б.Гамалея, М.И.Лэви,.-Э.И.Елагиной.)

3. Иммунологическая диагностика наркоманий.// В кн.: Материалы совещания по вопросам профилактики наркотизма." М., 1991. - с.20-33. (В соавт. с Н.Б.Гамалея.)

4. Способ диагностики злоупотребления опиатами.// Авт. св-во JSI807420, 1990. (В соавт. с И.П.Анохиной, Н.Б.Гамалея, А.Г.Врублевским.)

5. Разработка иммуноферментной тест систош для выявления хронической интоксикации опиатами.// В кн.: Тезисы докладов I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992. -c.IOI. (В соавт. с Н.Б.Гамалэя, С.И.Гронниновым, Р.Уразляевой.) <

, ' 6. Immune-response to opiates: new .findings In heroin addicts ' Investigated by гсеапз or an original enzlffle teunoasaay & morphine determination m hair.// .Life Sciences, 1993. -82..- vol.53. - p.99-105 . Co-auth. N.Carnaleya, F.Tagliaro, A.Vrublevslcll.

7. Induction о 1 antibodies to morphine during chronic morphine treatment in rodents & opiate addicts.// Drug and Alcohol Dependence, 1993. - vol.32. - Jit. - p.59-64. Co-auth. N.Ganaleya, S.Tronniicov, D.Yusupov.