Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Роль антител к нейромедиаторам в механизмах формирования опийной зависимости

РГб од

ГОСУДАРСТВЕННЫЕ НАУЧНЫп ЦЕНТР НАРКОЛОГИИ

министерства здравоохранении российской федерации

IIa прапах рукописи

УДК 616.153.9G-02: (i 15.212.7:54 7.94 3]--036.12-092:012.017.1]

ТРОШШКОВ Сергей Пшшозпч

РОЛЬ АНТИТЕЛ К ПЕИРОМЕДНАТОРАМ Б МЕХАНИЗМАХ ФОРМИРОВАНИЯ OnnÎÏITOÏÏ ЗАВИСИМОСТИ

Специальность 14.00.45 — наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена б лаборатории иммунохимия Института медипо-бпологичоекпх проблем наркологии (директор — члеп-корр. РАМП, профессор II. П. Алехина) Государственного научного центра наркологии МЗ РФ (директор — профессор А. Г. Врублевскшг).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук II. Б. ГАМАЛЕЯ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, члеп-корр. РАМИ Л. Ф. ПАНЧЕИКО,

доктор медицинских наук, профессор А. А. ЗОЗУЛЯ

Ведущее учреждение: ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В. II. Сербского.

Защита диссертации состоится «............»..............................1994 г.

п ............ часов на заседании специализированного совета

Д 074.50.01 при Государственном научном центре наркологии Минздрава РФ (Москва, 121921, пер. М. Могильцевский, д. 3).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке ГНЦ наркологии.

Автореферат разослан «............»........................1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических паук О. Ф. ЛЬВОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследовапия. К настоящему времени в мировой литературе накоплено достаточно много сведений об участии иммунной системы в формировании отдельных проявлений опийной зависимости. Совокупность результатов исследований, проведенных группой американских ученых под руководством N. Dafny (19831989) по изучению влияния различных видов иммуно'модуляции (интерферона, циклоспорина А, иммуносулрессорных доз гамма-излучения) на выраженность симптомов спровоцированного налоксоном абстинентного синдрома у зависимых от морфина крыс, позволила им сформулировать гипотезу о существенной роли в этих проявлениях интактной иммунной системы. Эксперименты по изучению влияния восстановления нормального функционирования иммунной системы у облученных крыс на выраженность абстинентного синд- . рома подтвердили эту гипотезу и показали важное значение для - v экспрессии основных симптомов опийной абстиненции специфических лимфовдных клеток и клеточных факторов, присутствующих в лимфоидной ткани (Dafny et al., 1989).

Среди механизмов, посредством которых иммунная система может влиять на процесс Армирования опийной зависимости, следует отметить реакцию организма на введение морфина в виде выработки специфических к наркотику антител. Повышение связывания радиоактивно меченного морфина сыворотками кроликов после . повторных внутривенных инъекций солей морфина или подшивания под кожу капсул, содержащих морфин, отмечено в работах Ringle-и Herndon (1972,1973), а также Вегапек и соавторов (1974,197б>. В экспериментах на животных было показано, что антитела к морфину способны связывать наркотик в кровяном русле и достаточно^ долго его там удерживать, препятствуя проникновению последнего' в мовг и взаимодействию со специфическими рецепторами (Вегко-witz et al. ,1974; Hill et al. ,1976). С этими механизмами свя>-вано, вероятно, наблюдаемое у животных с высокими концентращде-ями таких антител снижение фармакологических эффектов вводшо-го морфина (Bei~kowltz,Spector, 1972; Miller et al. ,1975; И.E. Ковалев и соавт., 1979). С другой стороны, морфин, связанны» а-кровяном русле с антителами, особенно низкоаффинными, представляет собой депо-форму препарата с пролонгированным эффектом. .

Влияние антител к морфину на проявления физической зави-

симости было неоднозначным (Bonese et al. ,1974; Klllian et al., 1978; И.Е. Ковалев и соавт. ,1981). Толерантность животных к наркотику в присутствии антител, как правило, повышалась (НЕ. Ковалев и соавт. ,19?S; С.Е. Шткалова, 1983).

Антитела к морфину низкой и высокой специфичности были выявлены также в повышенных количествах у больных опийной наркоманией (М.А. Мягкова и соавт. ,1989; О. ¡0. Полевая и соавт. , 1990; Н.Б. Гамалея, 1990; Gamaleya et al. ,1993).

Имеющиеся данные убедительно показывает, что низкомолекулярные химические соединения, например морфин, многократно попадающие в организм извне, могут индуцировать синтез циркулирующих антител, специфически связывавших эти вещества и снижающих их биологическую активность. Появление антител сопровождается образованием клонов лимфоидных клеток, способных связывать соответствующие соединения (морфин, дигоксин) (И.Б. Ковалев, 0. Ю. Полевая, 1985), как результат присутствия на их поверхности специфических рецепторов иммуноглобулиновой или иной природы.

Можно полагать, что подобный механизм защиты является универсальным и может работать в случае веществ как экзогенного, так и эндогенного происхождения.

С помощью различных иммунологических методов (реакций микропреципитации, пассивной гемагглотинации, поглощения комплемента, иммуноферментного анализа) удалось обнаружить антитела к биологически активным веществам эндогенного происхождения как у здоровых, так и больных рядом заболеваний.

Данные литературы о присутствии антител к основным нейро-медиаторам (дофамину, норадреиалину, серотонияу) в крови клинически здоровых людей и лабораторных животных противоречивы. Одним авторам не удалось обнаружить такие антитела (Todd, Cia-ranello,1985; A.B. Мартынешо и соавт., 1985), тогда как другие сообщили об их выявлении (A.C. Закс, A.A. Быкова. 1979). Вшкюе' значение для обнаружения у здоровых людей антител к эндсуенньм биорегуляторам (например, простатдандину) имеет, вероятно, то обстоятельство, что большая их часть находится в составе иммунных комплексов (О.П ГЬлевая, ЕЕ. Крупник, 1988).

Повышенные уровни свободных антител к иейрошдкатораы с большим постоянством обнаружены при многих формах неврологи-

ческих и психических заболеваний, в том числе алкоголизме. Все эти заболевания имеют три характерные особенности: 1) деструктивные процессы в тканях мозга, 2) нарушения центральных ней-ромедиаторных систем, 3) расстройство функции гемато-энцефали-ческого барьера (Р.Н. Крыжановский, С.Е Магаева,1990). В экспериментах на животных и in vitro была продемонстрирована способность антител к нейромедиаторам нейтрализовать биологические эффекты последних.

С другой"стороны, группой отечественных исследователей род руководством В. А. Евсеева и Е. А. Громовой было показано, что искусственное повышение уровня антител к нейромедиатору реротонину в крови в результате иммунизации животных конъюга-уом серотонина с белком оказывало существенное влияние на уровень медиатора не только на периферии, но и значительно снижа-. до концентрацию серотонина и его метаболита 5-ОИУК в коре, пе-*. реднем мозге, стволе и концентрацию дофамина в гипоталамусе, сопровождаясь при этом модуляцией поведенческих реакций (JL А. Башарова й соавт. ,1988; ЕВ. Вобкова и соавт. ,1988,1989). Продемонстрированная в серии работ возможность подавления влечения к алкоголю и алкогольной зависимости посредством иммунизации животных конъюгатом серотонина с белком связана, по мнению авторов, с изменением содержания нейромедиаторов в гипоталамусе, где находятся так называемые "центры наслаждения". Был предложен новый подход к терапии алкоголизма, основанный на иммунном связывании нейромедиаторов специфическими антителами. Такое связывание может иметь преимущество перед фармакологической коррекцией как более физиологическое, естественное, о чем свидетельствует спонтанное образование антител к нейроме-диаторам (В. А. Евсеев, 1990). Использование иммунных реакций имеет также и то преимущество, что их интенсивность обычно возрастает при повторном введении антигенов за счет ме/анизмов иммунологической памяти.

Основываясь на теории единства основных патогенетических механизмов алкоголизма и наркоманий и на стержневой роли нарушений центральных нейрбмедиаторных, особенно катехоламиновых, систем в патогенезе различных форм зависимости (И.П. Анохина и соавт. ,1990) , можно полагать, что изучение роли антител к , нейромедиаторам в механизме формирования опийной зависимости будет иметь важное научно-практическбе значение. Литературных

- 5 -

данных по этой проблеме мы не выявили.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение феномена образования антител к нейромедиаторам у людей и животных, его роли в патогенезе опийной зависимости и оценка возможности экспериментального использования таких антител для повышения устойчивости животных к развитию физической зависимости от морфина.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1) разработать методы выявления лимфоидных клеток, способных связывать нейромедиаторы, и антител к нейромедиаторам;

2) изучить наличие в селезенке морфинизированных животных лимфоидных клеток,, несуцда на своей поверхности рецепторы к нейромедиаторам;

3) исследовать уровни антител к дофамину, норадреналину, серотонину у животных в процессе формирования морфинкой'зависимости в эксперименте и у больных опийной наркоманией;

4) изучить возможность защитного действия активной иммунизации животных конъюгатами нейромедиаторов с белком, проведенной до начала морфинизации, в отношении основных проявлений опийной зависимости (тяжесть абстинентного синдрома, толерантность к морфину);

5) исследовать возможность применения активной иммунизации животных конъюгатами нейромедиаторов с белком, проведенной на фоне уже сформировавшейся зависимости, для снижения пристрастия к морфину и ослабления тяжести зависимости..

Научная новизна.

Впервые установлено явление индукции в селезенке морфинизированных животных лимфоидных клеток, способных связывать нейромедиаторы в результате присутствия на их поверхности соответствующих рецепторов. Обнаружен впервые факт образования повышенных количеств антител к нейромедиаторам в процессе формирования опийной зависимости у экспериментальных животных и исследована его динамика Выявлены обратные корреляции уровней антител к нейромедиаторам с показателями тяжести опийной зависимости, свидетельствующие о защитной роли таких антител в механизмах формирования зависимости. Показана наибольшая значимость в формировании устойчивости к развитию опийной зависи-

. * - б -

мости антител к норадреналину. Впервые показано, что целенаправленное повышение уровней антител к нейромедиаторам в результате активной иммунизации животных конъюгатами нейромедиа-торов с белком до начала хронической морфинизации способствует более легкому течению синдрома отнятия морфина. Предварительная иммунизация конгюгатом серотонина с белком приводила к широкому спектру благоприятных эффектов, однако практически не влияла на такое проявление.морфииной зависимости как нарастание толерантности. Иммунизация конъюгатами дофамина и, особенно, норадреналина с белком препятствовала выработке толерантности к морфину. Впервые доказана возможность ослабления пристрастия к морфину в результате активной иммунизации крыс конъюгатами нейромедиаторов с белкоы, проведенной на фоне сформировавшейся зависимости.

Практическая ввачишють результатов исследования. Разработаны методы для выявления антител к нейромедиаторам с применением пассивной гемагглюгинации и иммуноферментного анализа Возможность эффективного вмешательства в течение морфииной зависимости у экспериментальных животных с помощью антител к нейромедиаторам открывает принципиально новый подход к терапии опийной наркомании.

• Положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны методы, позволяющие выявлять: а)лимфоидные клетки, связывающие нейромедиаторы, в селезенке экспериментальных животных; б)антитела к нейромедиаторам в крови людей и экспериментальных животных. -

2. В процессе формирования опийной зависимости у экспериментальных животных и больных опийной наркоманией образуются повышенные количества антител к нейромедиаторам. Одновременно в селевенке животных зарегистрированы лимфоидные клетки, способные связывать эти нейромедиаторы.

3. Антитела к нейромедиаторам играют защитную роль в механизмах формирования опийной зависимости.

4. Активная иммунизация крыс конъюгатами нейромедиаторов с белком, проведенная до начала хронической морфинизации, способствует более легкому течению синдрома отнятия морфина

б. Активная иммунизация крыс конъюгатами нейромедиаторов с белком, проведенная на фоне сформировавшейся зависимости, способствует ослаблению потребления и предпочтения морфина

6. Выработка активного иммунного ответа на нейромедиатор-ные антигены является новым экспериментальным подходом для повышения устойчивости животных к развитию физической зависимости от морфина.

Публикация результатов исследования и апробация работы.

По теш диссертации опубликовано 9 работ, в том числе в материалах первого съезда иммунологов России (Новосибирск, 1992), в материалах республиканского совещания психиатров-наркологов (Москва,1993), в материалах международной конференции (Гродно,1993). Результаты исследования доложены и обсуждены на межлабораторной конференции ГНЦ наркологии (1993). Работа прошла апробацию на конференции ГЩ наркологии и на заседании проблемной комиссии ГНЦ наркологии 4 февраля 1994 г. , протокол N б.

Объем и структура работа. Диссертация излояйна на страницах машинописного текста и состоит из введения, главы, посвященной обзору литературных данных, главы с общей характеристикой материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственных исследований, главы с обсуждением полученных результатов и выводов. Библиографический указатель включает названий, в том числе отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.

иатеарналы и методы исследования.

Материалом исследования явились экспериментальные животные (400 голов) и пробы венной крови людей (129 человек).

В работе использован комплекс иммунологических, иммунохи-ыических и физиологических методов.

А. Группа иммунологических и иммунохимических методов включила: ' 1. методы синтеза конъюгированных антигенов нейромедиато-ров и морфина с белками,

2. методы выявления лимфоидных клеток, несушцх рецепторы

к иейроыедиаторам и морфину (метод иммунных розеток), '

3. методы выявления антител к нейромедиаторам и морфину . (иммуноферментный анализ, реакция пассивной гемагглю-тинации),

4. методы иммунизации животных конъюгированными антигенами.

К Группа физиологических методов включила:

1. создание моделей морфинной зависимости (при внутривен-

4 - 8 -

ном и пероральном введении наркотика), ' 2. методы оценки выраженности абстинентного синдрома, толерантности, пристрастия.

Все результаты, полученные в работе, обработаны с помощью методов вариационной статистики (ЕЕ Урбах, 1975). Для ряда измерений п вычисляли среднюю арифметическую, среднюю квадра-тическую ошибку отдельного измерения, дисперсию измеряемой величины, среднюю квадратическую ошибку среднего арифметического. Достоверность* различий между сравниваемыми величинами определяли при помощи t-критерия Стьюдента Сравнение двух выборочных долей вариант проводили с помощью ^-преобразования и вычисления u-критерия Фишера. Для оценки связи между количественны)® признаками вычисляли коэффициент корреляции г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Образование антител к иеЯроиедиагоран в знспсричеотальвоЯ подели морфтшой зависимости у крыс, а также в естественных условиях наркотизации у людей.

Мэделирование хронической опийной интоксикации проводили на беспородных белых крысах курсом в/брюшинных инъекций морфина гидрохлорида в течение 2-х и 4-х недель в возрастающих дозах от 10 до 100 мг/кг веса. Крыс, морфинизированных в течение 4 недель, наблюдали также через месяц после прекращения инъекций морфина

Известно, что морфин оказывает неблагоприятное воздействие, на лимфоидные органы, уменьшая массу тимуса и селезенки и приводя к значительному уменьшению клеточного состава этих органов (Lefko*itz, Chiang,1975; Gungor et al. ,1980; Bryant et al. ,1987). В экспериментах по хронической морфинизации крыс нами подтверждена эта закономерность. Показано также, что на протяжении последующей отмены наркотика в течение месяча происходит восстановление веса органов иммунной системы, но не количества в них мононуклеарных клеток. В связи с этим нас и№-тересовало состояние специфического иммунного ответа к нейромедиаторам как веществам, играющим ведущую роль в патогенезе наркотической зависимости, на фоне общего угнетающего воздействия морфинизации на лимфоидные органы.

В селезенке морфинизированных животных обнаружено возрастание количества антигенспецифических РОК в ходе морфияиза-

ции. Через месяц после отмены инъекций морфина происходила нормализация уровня лимфоцитов, несущих рецепторы к нейромеди-аторным антигенам (рис.1).

Рис. 2 демонстрирует увеличение в ходе морфинизации доли животных, в сыворотках которых присутствуют антитела в титрах 1:20 и выше, и снижение практически до нормальных значений частоты выявления антител черев месяц после отмены наркотика.

Специфичность выявляемых антител оценивали в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Антитела, выявленные по связыванию с тем или иным эритроцитарным антигеном, имели наибольшее сродство к соответствующему нейромедиатору-ингибитору. В целом следует отметить, что антитела к нейроме-диаторам были низкоаффинными.

С целью выяснения возможности образования в повышенных ' количествах антител к нейромедиаторам у людей были обследованы больные опийной наркоманией (44 человека), алкоголизмом (36 человек),доноры (29 человек). Обследованная группа больных опийной наркоманией отличалась высокой частотой обнаружения таких антител (табл.1). Наиболее высокие титры, зарегистрированные В этой группе, были": К ДА-Б 1:40, НА-Б 1:80, 5-ОТ 1:160 и М-Б 1:80. Между уровнями антител к трем медиаторныы антиге-. нам установлена тесная связь (г-0,84 и выше). Достоверные положительные корреляции выявлены также между уровнями антител к медиаторам и морфину.

Можно полагать,что появление высоких уровней антигенспе-цифических клеток и антител, способных связывать нейронедиато-ры, оказывает существенное влияние на течение опийной зависимости. Проверке этой гипотееы было посвяирно дальнейшее исследование.

Оценка уровней аптитал в ввйроив&юторш у арыс . с раахячвой степевъв устойчивости в фораароишва «

зашсвюсти от дорфша Проведено сопоставление уровней нейроыедиаторов (ДА, НА,. 5-ОТ) к антител к ниы в плааые крови в группах крыс с различ- • ными длительностью введения шрфина и степенью выраженности морфинной вавискшсти. Одна группа крыс получала инъекции морфина в течение 2 недель, начиная с 10 мг/кг и заканчивая дозой 50 иг/кг веса. Другую группу крыс морфшдазировали в течение 4 недель в дозах, постепенно возрастающих от 10 до 70 мг/кг.

' - 10 -

Экспериментальные животные уже на этапе 2-недельного тестирования демонстрировали поведенческие признаки синдрома отмены опиатов такие как птоз, скрежет губами, гиперактивность, встряхивание передними лапами и головой, а таюге менее специфические признаки - усиление двигательной и исследовательской активности, уменьшение количества реакций чистки. Тя-зкесть абстиненции была недостоверно выше в группе 4-недельной морфинизации. .Суммарный показатель тяжести абстиненции составлял 5,94+-0,51 у крыс после 2-недельной морфинизации и б,25+-0,74 у крыс после 4-недельной морфинизации.

По выраженности абстинентного синдрома всех морфинизиро-ванных в течение 2 или 4 недель крыс разбили на две подгруппы: устойчивых к развитию зависимости животных (суммарный показатель тяжести абстиненции СПА < 4) и чувствительных с СПА » б. . Таблица 2 показывает, что устойчивые к развитию морфинной 8а- • висимости крысы характеризуются существенно более высокими уровнями антител к нейромедиаторам, чем неустойчивые. Более того, при помощи корреляционного анализа у крыс после 4-не-дельной морфинизации установили достоверное отрицательное соотношение титров антител к дофамину, норадреналину и серото-нину с СПА. Уровни антител к норадреналину и, в еще большей степени, серотонину положительно коррелировали с процентным изменением веса тела у крыс после 2-недельной морфинизации.

. Между титром антител к норадреналину и процентным изменением латентного времени облизывания лап на горячей пластине в группе крыс, морфинизированных 2 недели, определена достоверная отрицательная корреляция (г—0,58; п-15; р<0,05). Сходные результаты получены также в другом эксперименте с 2-недельной морфинизацией крыс. Выработка толерантности к морфину (снижение показателя дВД находилась в прямой зависимости от количества антител к норадреналину. Между этими параметрам:! установлена сильная обратная корреляция (г—0,95; п-8; р<0,01). У двух крыс из десяти в группе, характеризовавшихся отсутствием антител к норадреналину, толерантность к морфину а результате проведенной морфинизации не развилась.

Выявленные соотношения говорят о том, что показатели зависимости у морфинизированных крыс тем ниже, чем выше у них уровни антител к нейромедиаторам. Наиболее значимые корреляции обнаружены в случае антител к норадреналину. Эти данные cor-

ласуются с полученными наш результатами тестирования крыс, генетически предрасположенных и устойчивых к развитию морфин-ной зависимости. Устойчивость сочеталась с достоверно более высокими уровнями антител к норадреналину.

Участие антител к; нейромедиаторам в механизмах формирования зависимости связано,, вероятно, с модулирующим их влиянием на уровни соответствующих медиаторов как на периферии, так и в структурах мозга, что было продемонстрировано в ряде работ (Л.А. Башарова и соавт. ,1988; ЕЕ Бобкова и соавт. ,1988). Зарегистрированная нами нормализация к концу ¿-недельной морфинизации концентрации норадреналина в плазме крови была связана с индукцией антител к норадреналину (г—0,36; п-33; р<0,05). Что касается дофамина, то, несмотря на возрастание к концу . 4-недельной морфинизации уровня соответствующих антител (на 49+-12 X.), содержание медиатора в крови оставалось повышенным. Этот факт может свидетельствовать о достаточно высоком подъеме концентрации дофамина (что соответствует современным представлениям об изменении обмена катехоламинов при развитии зависимости) для возможной коррекции его уровня, в том числе с участием иммунных факторов.

Полученные результаты свидетельствуют об участии антител к нейромедиаторам и морфину, индуцируемых в процессе 2- и 4-недельной морфинизации у крыс, в механизмах формирования зависимости от морфина, носящем черты адаптационного характера. Влияние предварительной ¿иггявной иичунтацтз ковъвгатаия вейрочедиаторов с белишгн на вейрофнзнохогичеыхо я веВрохииическхе показатели синдрома отхопи у хронически шрфшшэированных крыс.

■ Основной задачей этого фрагмента исследования было изучение влияния предварительной индукции антител к нейромедиаторам (дофамину, норадреналину и серотонину) при активной иммунизации животных на последующую выработку зависимости от морфина и толерантность.

На основе анализа данных предварительной серии экспери-. ментов наш была выбрана с хека иммунизации, позволяющая за 3 недели с малой антигенной нагрузкой (17 иг/кг) получить опти-' мальный уровень антител к нейромедиаторам.

Через неделю после третьей иммунизации крькГам провели курс 14-дневной морфинизации путем внутрибрюшнных инъекций морфина

* - 12 -

гидрохлорида в 0,5 мл физиологического раствора два раза в сутки с 12-часовым интервалом между инъекциями, 'начиная с дозы 10 от/кг веса животного, которую увеличивали каждые три дня на 10 мг/кг до конечной дозы 50 мг/кг.

Поведение животных оценивали в "открытом поле" на всех этапах эксперимента (0 - до начала иммунизации, 1 - после курса иммунизации, 2 - после курса морфиниэации до 'введения на-локсона, 3 - после отмены действия морфина налоксоном).

С целью оценки возможного патологического'воздействия на поведение животных самого процесса иммунизации мы провели сравнение исследованных поведенческих параметров. Полученные данные говорят о том, что сам процесс иммунизации не оказывает влияния, которое существенно усугубляло бы их физиологическое состояние, и примененный подход имеет право на использование в. эксперименте.

Предварительная иммунизация крыс медиаторными антигенами частично предотвратила резкое повышение горизонтальной двигательной активности, отмеченное в морфинизированной неиммунизи-рованной К(м) группе после введения налоксона.

Синдром отмены у морфиниэированных крыс показал снижение количества умываний, что могло отражать общий "дискомфорт" животных (рис.3). Наиболее выраженным нормализующий эффект был в случае иммунизации конъюгатами ДА и НА с белком. Иммунизация конъюгатами 5-ОТ-БСА и ПА-ВСА привела к снижению количества отряхиваний, свидетельствовавшему об ослаблении абстинентного синдрома Иммунизация НА-ЕСА способствовала наиболее значительному снижению скрежета зубами, тогда как достоверное ослабление гиперактивносги отмечено в группе 5-ОТ-БСА (рис.4).

Динамика веса крыс в процессе морфиниэации показана в табл.3. Представленные данные демонстрируют существенное снижение показателя изменения веса в сравнении с неморфинкзиро-ванным контролем К во всех группах морфинивированных животных кроме группы, предварительно иммунизированной 5-ОТ-БСА.

Хроническая морфинизация крыс привела к достоверному снижению порога болевой чувствительности в группах Щм) и 5-ОТ-БСА (табл.3). Выраженное замедление выработки толерантности к морфину отмечено в группах, иммунизированных катехоламиновыми конъюгатами.

Отмеченные эффекты предварительной иммунизации на нейро-

физиологические проявления синдрома отмены имели под собой закономерную нейрохимическую основу. В плазме крови было зарегистрировано выраженное снижение концентрации свободных форм дофамина и норадреналина в группах крыс, иммунизированных конъюгатами катехоламинов с белком, и серотонина в группе 5-0Т-БСА.

Таким образом, результаты оценки влияния предварительной иммунизации нейромедиаторными антигенами на проявления морфин-ной зависимости подтвердили защитную роль специфических иммунных реакций в виде выработки антител к нейромедиаторам и анти-генспецифических лямфоидных клеток и показали перспективность такого подхода для повышения устойчивости животных к развитию физической зависимости от морфина

Нсслеховшшо плитпш активной шхуштащш коиыоеатами исйрочсдиагороо с бел;сшш. врокедошюй на фоне сСоринро-давгейся ааяисииости, па пристрастие к норфипу и нейрофизиологические показатели снидроча отиепи

Формирование зависимости к морфину у крыс проводили путем внутрибрюшинных инъекций морфина гидрохлорида 2 раза в сутки с 12-часовым интервалом в возрастающих дозах от 5 до 40 мг/кг веса в течение 10 дней. Затем тавотных переводили на принудительное питье 0,1% раствора морфина в 5Z растворе сахарозы в течение 3 недель и 0,05% раствора морфина в 2,5Z растворе сахарозы в течение последующих 2 недель. В результате проведенного тестирования в условиях свободного выбора меаду раствором морфина в сахарозе и раствором сахарозы в конечной концентрации принудительного курса поения отобрали 25 животных, потреблявших морфин в дозах от 76 до 217 ыг/кг/сутки (с коэффициентом предпочтения 0.56+-0.03) для дальнейших исследований. Дяя сравнения отметим, что интактные крысы, тестированные аналогичным образом в двухпоилочном тесте, потребляли морфин в дозах от 4 до 17,2 мг/кг/сутки. Коэффициент предпочтения составил при этом 0,14-1—0,04.

Отобранных животных разбили на группы по 5 крыс в каждой. В трех группах крыс в условиях свободного выбора была проведена активная иммунизация конъвгатами нейромедиаторов с БСА (ДА-Б, НА-Б и 5-ОТ-В) по схеме: вторая инъекция - через 2 недели после первой, а третья - через 1 неделю после второй. Одну группу крью иммунизировали белком-носителем.

Результаты влияния иммунизации на потребление морфкпа в исследованных группах крыс представлены на рис.5. Для крыс, . иммунизированных конъюгатами катехоламинов с белком, характерно значительное снижение потребления морфина при свободном выборе по сравнению с неиммунизированной группой К(м) уже в течение второй недели после первой иммунизации. Потребление мор- ■ фииа в группе крыс, иммунизированной 5-ОГ-БСА, снижалось мед- •' леннее, однако после второй иммунизации приблизилось к значениям у 2-х первых групп. После третьей иммунизации зарегистрирован подъем потребления морфина с приближением к уровню К(м) группы во всех иммунизированных группах, что, очевидно, связано с увеличением общего объема потребляемой жидкости.

Динамика предпочтения кивотныш раствора морфина отражена-на рис. 6. По сравнению с К( м) группой предпочтение морфина снижалось иммунизацией нейромедиаторяыш антигена!,да после второй и, особенно, третьей инъекции иммуногеяа

Исследование основных показателей поведения хронически морфинизированных крыс после проведения курса иммунизации в условиях свободного выбора раствора морфина дает основание для заключения, что-иммунизация, проведенная на фоне уже развившейся морфинной зависимости, оказывает менее благоприятный эффект на поведенческие проявления абстинентного синдрома, чем иммунизация, предшествовавшая введению морфина., Что, однако, могло быть следствием оценки тяязсти синдрома отнятия наркотика в период наблпдавкегося восстановления его потребления при свободном выборе в конце иммунизационного курса.

Совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о целесообразности применения активной иммунизации крыс конъюгатами нейромедиаторов с <"елком на фоне сформированной . зависимости для снижения потребления- и предпочтения морфина •'

В Ы В О Д.Ы '

1. Установлены факты индукции в селезенке морфинизированных животных лкмфоидяых клеток, способных связывать нейромеди-аторы в результате присутствия на их поверхности соответствующих рецепторов, и образования повькгенных количеств антител к -нейромедиаторам в процессе морфинизации. у экспериментальных животных и больных опийной наркоманией. • • '' ■

- 15 -

2. Антитела к иейромедиаторам норадреналину, дофамину и серотонину обладают защитной функцией в механизмах формирования опийной зависимости, о чем свидетельствует обратная связь уровней этих антител с суммарным показателем тяжести абстиненции и снижением вера тела экспериментальных животных.

3. Генетически детерминированная устойчивость крыс к развитию опийной зависимости сочетается с более высоким уровнем антител к норадреналину.

4. Целенаправленное повышение уровней антител к кейромедиаторам в результате активной иммунизации животных до начала хронической морфинизации способствует более легкому течению синдрома отнятия. Наиболее выраженный протективный" эффект наблюдался в случаях иммунизации крыс конъюгатами НА-Б и 5-ОТ-Б. Иммунизация катехоламиновыми конъюгатами приводила к задержке развития у животных толерантности к наркотику.

5. Доказана возможность ослабления потребления и предпочтения животными раствора морфина в результате активной иммунизации конъюгатами норадреналина, дофамина и серотонина с белком, проведенной на фоне сформировавшейся зависимости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. D.Yu. Rusakov, E.V. Borlsova. S. I. Tronnlkov, UN. Kuznetzova, - A. G Verettnskaya, N.B. Gamal e y a, S.K. Sudakov. Biochemical resistance to development of morphine-dependence m rats: biogenic amines, its receptors and antibodies. Drug Alcohol Depend.-1992.-Vol. 30.-P. 289-292.

2. С.И. Тронников, ЕВ. Гамалея, А.Г. Веретинская, Е.Е Борисова, С. К. Судаков, И. IL Анохина. Образование антител к .морфину и кейромедиаторам у морфиниэированных крыс. Бвд.8ксп. биол. и мед.-1992.-т. CXIV.-N 12.-С. 624-626.

3. ЕЕ Гамалея, К. А. Мондрус, C.ÏL Тронников, Е. П. Горнкова, Р.Е Еремина К вопросу о механизмах участия иммунной системы в патогенезе опийной зависимости. Волр. наркологии. -1992. -N 3-4.-С. 113-115.

4. ЕЕ Гамалея, А.Н. Паршин, С.И. Тронников, P.P. Ураэ-ляёва. Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления хронической интоксикации опиатами. Tes. докладов I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1932 г.-С. 101.

. . 6. С.И. Тронников,. А,Г. Веретшекая, ЕЕ Гамалея,

l.t К Кузнецова. Роль антител к нейромедиаторам в адаптации ор-. ганизма к хроническому воздействию морфина Там же. -С. 483.

6. N. В. Gamaleya, A.N. Parshin, S.I. Tronnikov, D. V. Yu-supov. Induction of antibodies to ¡norphine during chronic morphine treatment in rodents and opiate addicts. Drug Alcohol ' Depend. -1993. -Vol. 32. -P. 59-64.

7. JLA. Башарова, В. А. Евсеев, Л. А. Ветрилэ, E А. Трекова, Н.Б. Гамалея, А. Г. Веретинская, С. К Тронников. Индукция: ауто-антител к серотонину и катехоламинам у хронически морфинизиро-ваяных крыс с проявлением абстинентного синдрома. Бюл. эксп.. биол. И иед.-1S93.-т. CXV. -N 5.-С. 469-471. ' -

8. С. И. Тронников, И Б. Гамалея, Д. В. Юсупов.. Реакции им-мушгай системы на хроническое введение ливотнкм шрфина В 'кн. :• Вопросы мэдико-социашюй реабилитации больных алкоголизмом и. паркоманией. -LL -1993. -С. 161-164.

9. С. II Тронников, Н.Н Гамалея. Влияние активной иммунизации крыс конъюгатами кейроиедиаторов с белком на пристрастие it морфшу. Материалы меадународной научной конференции. -Грод-

* но. -1993. -ч. 11. -С. 369-370.

Рис.1 Содержание антигенспецифических РОК в селезенке морфинизированных крыс 350-1-

300

250

'200-

150-

100-

/

\

"о 2 ~ Г~Т

срок морфинизации (нед.)

\

х

\

1 нес.

ремиссия

Сравнение с исходным уровнем (ж Р/ 0,06; *х Р£ 0,01; *** Р/ 0,001)

100

80 H

60H

Рис.2 Частота обнаружения антител с титрами 1:20 и выше

40 4

20 4

0 2 .. • 4 срок морфинизации (нед) *

ДА

—i— НА

—zîs-

5-ОТ

—ЕЭ—

M

\

-1-

1 KSCi

рзниссия

200

150-

Рис.3 Влияние иммунизации на проявления абстинентного синдрома

8<

100-

50-

груминг .

Сравнение, с К(м) группой (100%)

отряхивания

Рис. 4 Влияние имнунизагщи на пгоявления абстинентного синппона

Сравнение с К(м) группой (100%)

lZZj К

К(м)

К-Б

5-ОТ-Б

wm

ДА-Б

ешз

НА-Б

Рис. 6 Предпочтение раствора морфина по отношению к группе К(м)(100%)

120 -

100 -

0 12 Сравнениз с К{н) группой

4 иммунизация (над,)

Таблица 1

Частота обнаружения антител к антигенам морфина и нейро-медиаторов в сыворотке крови здоровых доноров, больных опийной наркоманией и алкоголизмом в титрах 1:20 и выше (2)

Обследо-' ванная группа Число . обследованных Частота обнаружения антител к :

М-Б ДА-Б НА-Б 5-ОТ-Б

Здоровые доноры '29 6,9+-4,8 3.4+-3.4 3,4н~3,4 3.4+-3.4

Больные опийной наркоманией 44 43,2+-7,б р<0,001 26.0+-6.5 р<0,05 47,7+-7,5 р<0,СЮ1 47,7+-7,б р<0,001

Больные алкоголизмом 36 1 13,9+-5,8 Зб,1+-е,о р< 0,001 25.0+-7.2 р<0,001 13,9-1-5,8

Сравнение р группой адоровых доноров (методом ?-преобразования)

' 1; j • • • ' Таблица 2 ."

Уровни антител к нейрЬмедиаторам (в ед. OID, показатели тяжести абстинентного синдрота и нарастания толерантности к морфину в группах устойчивых "и неустойчивых к развитию

морфинной зависимости крас . •

Группы крыс Уровни антител к Суммарный показатель абстиненции (усл. ед) Изменение веса тела (дХВ) Измэпёнке патентного времени отдергивания"лап (лхт>.

ДА НА 5-0Т

Устойчивые (п-13) 0,65-0,11 0,62-0,10 0,54-0,09 3,23*0,26 7,03-4,43 -54,21- Q.48,

Неустойчивые (п-14) 0,40-0,03 0,33-0,04 0,34-0,03 8; 93-0,54 -3,59-5,91 -63.13-10, £5

Сравнение показателей в группах, Р < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,001

Таблица 3

Влияние хронической шрфинизации на вес и болевую чувствительность крыс

Группа крыс Показатель изменения веса- ((В2-ш;/В1)х100Х Показатель изменения латентого времени облизывания лап: ((Т2-Т1)/Т1)*100Х

К 8,7+-1,8 (п-14,Р<0,005**) —

К(м) 2,4+-0.8 (п-14,Р<0,005*) -42.1+-7.7 (п-12)

К-БСА(м) -2,0+-1,5 (П-8, Р<0,001*, Р<0,01**) -23,1+-12,7 (п-8) .

Б-ОТ-БСА(м) 4.9+-1.5 (п-11) -42.6+-10.7 (п-10)

ДА-БСА(ы) 0,б+-2,4 (П-7,Р<0,02*) 0,3+-11,3 (п-7,Р<0,01**, Р<0,02***)

НА-БСА(М) ; -0,4+-2,1 (|ь11,Р<0,005*) -13.4+-13.6 (п-10)

„Сравнение о группой: К - *, К(м) - **, б-ОГ-БСА(м) - ***