Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноферментный анализ антител к наркотикам и нейромедиаторам

РГБ ОД.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ .. МОСКОВСКИЙ БАУЧШ-ЙССЛЕЛОВАТЕЛЬСКИЙ ШСТШТ ЭПИДЕШШШ И МИКРОБИОЛОГИИ ни. Г.Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ПАНЧЕНКО ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

ИММУНОФЕРШШШ АНАЛИЗ АНТИТЕЛ К НАРКОТИКАМ И НЕИРОМЕДИАТОРАМ

14.00.36 - Аллергология и зммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте физиологически активных веществ РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

М. А. Мягкова

Официальные оппонента: доктор биологических наук,

профессор Б. В.Пинегин кандидат медицинских наук Т. К. Лопатина

Ведущая организаций: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится " " _ 1994 г. в - час.

на заседании Специализированного Совета К-084.18.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗРФ по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан " " _ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета дохтор биологических наук

Н. Т. Тихонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Изучение нарушений иммунной системы при фонической интоксикации психотропными препаратами и. создание на )Той основе новых ишунохимическта методов анализа, используемых в шагностике наркомания, является актуальной задачей иммунохимии. В шрвую очередь, это связано с. тем, что в Россия и за рубежом фодолжает расти уровень употребления наркотических вешеств с 1емедицинскимн целями, что требует своевременного .выявления лиц, |Лоупотреблящих наркотиками для исхорения этого заболенвания.

В настоящее время за рубежом наиболее широко используются ¡ммунохммические методы определения интоксикации наркотиками. К ям относятся радиоиммуноанализ, гомогенный иммувоферментный и им-¡унофлуоресцентный анализ. Бее перечисленные способы предполагают рименение специального дорогостоящего оборудования.

В нашей стране для выявления наркотиков- используются, как равило, физико-химические методы (тонкослойная и газохидкостная роматография), которые трудоемки и длительны по времени сполнения, требует предварительной обработки анализ1фу емд бразцов. В последние годы разработаны и высокочувствительные вердофазные иммуноферметные методы определения опиатов, арбитуратов, каннабяноляов, производных эфедрина. Эти способы яализа уже опробированы и нашли применение в ряде наркологических яспансеров. ■•-•-•- ...

Однако, все перечисленные выие иммунохимичесхие методы яализа, используемые для диагностики наркоманю! я основанные на 1ределении наркотика нот его метаболита, имеют существенный здостаток, поскольку позволяют диагностировать интоксикации элько в течение нескольких суток с момента принятия препарата, гот факт связан с метаболизмом наркотических соединений и быстрым гаедением их та организма.

В литературе имеются немногочисленные данные о влиянии психо-уотшш. наркотических веаеств на иммунную систему животных и щей, прежде всего на гуморальные факторы иммунитета. Так, при гутривенном введении наркотиков часто отмечают повышение уровня вороточных иммуноглобулинов С1д). Эти факты мозено объяснить как оультат хронической антигенной стимул.там:;, В эксперименте кз вотных показано, что длительное введение им морфина стимулирует крови образование иммуноглобулинов, связываниях зтс соединенна

- г -

.'D. А. Ringle. 1972 г./. Сведения о характере изменения гуморального. имиунятега у людей, злоупотребляющих наркотиками и психотропными препаратами весьма разрознены. Так, у людей, злоупотреблявших героином, антитела против морфина были выявлены в • работе /М.Е.Weksler et al. , 1973 г./ только у, 1% обследованных больных, а в исследовании /1.1.Ryan et al., 1972 г./ у i0'4 наркоманов. В последнее время появились данные об изучении механизмов гуморального иммунитета в ответ на введение наркотических веаеств, связанного с образованием специфических антител к этим соединениям. Результаты такого исследования открывают принципиально новую/ возможность для диагностики интоксикации психотропными препаратами. В связи с этим, становится актуальной задача разработки новых иымунохиыических методов выявления специфических антител к наркотикам.

Анализ современных литературных данных показывает, что механизм иммунологической защиты организма на введение наркотика изучен недостаточно хорошо. Известно, что нейромедиаторы моноашновой и ошюидной природы являются теми гуморальными факторами, которые способны при повышении их хонфентрацин и избыточной активации привести к развитию иммунорегуляторного дисбаланса/B.F.Roy, 1955 г., В.О.Jankoyic, 1989 г./

'С' другоЗ стсрснн, в настоящее время выполнены исследования,"' свидетельствуйте _ наличии в организме здорового человека Ig, связывании ряд эндогенных биорегуляторов и называемых естественными антителами - е-АТ /W.Mahana et al., 1988 г./. При патологических процессах происходит изменение нормального уровня е-АТ, которое связано, как правило, с нарушением метаболизма того или иного эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания. Вот почему, большой интерес представляет обнаружение и изучение роли е-АТ к ряду нейромедиагоров, изменение метаболизма которых имеет место при наркомании у людей. К ним относятся, в первую очередь,' соединения моноаминовой и ощоидной природы. Исследования по выявлению и изучению свойств е-АТ к данным нейромедиаторам позволяет создать новые иммунохимические методы анализа, как для изучения механизма иммунопатологии на наркотики, так а для диагностики наркомании.

Цепь и задачи исследования. Цель данного исследования заключается в , разработке эффективных 'вариантов твердофазного иммуноферментного анализа специфических штггзя к наркотическим

веществам и нейромедиаторам моноакиновой и опиоидной природы для диагностики хронической интоксикации психотропными препаратами.

В соответствии с поставленной целью определены следугше задачи исследования:

- осуществить синтез иммунохимических реагентов - новых кокьс-гированных антител, содержащих в своем составе производные опиатов, каннабиноидов и зйедрина, а также эндогенные нейромедиаторы (биогенные амины и ошовдные пептиды), используя при этом в качестве макромолекулярного носителя Оеяковус и полимерную матрицу;

- разработать иммуноферментные методы определения антител к наркотикам Сопиатам, каннабияоидам и эфедрину); оценить возможность их использования в диагностике наркомания;

- провести исследование по выявлению антител к эндогенным биорегуляторам (опиоилным пептидам и биогенным ашшам) .-участвупиш в патогенезе заболевания наркоманией и разработать твердофазный иммуноферментный метод определения данных иммуноглобулинов в сыворотке крови человека;

- выделить с помощью аффинной хроматографии антитела к опиоидным пептидам С/з-эндорфину, дерморфину) из сыворотки крови больных опийной наркоманией и доноров и исследовать их иммунохмшческие свойства;

.. . - провести .сравнительный анализ содержания .специфических антител к психотропным препаратам и эндогенным биорегуляторам в выворотке крови доноров и больных наркоманией твердофазным йммувоферментным методом; оценить диагностическую значимость разработанных вариантов иммунофермеятного анализа определения антител х наркотикам и нейромедиаторам для выявления интоксикации психотропными препаратами.

Научная новизна работы. Разработаны методы получения новых соньсгатов психотропных веаеств с белковым и полимерным носителем. Синтезированы искусственные антигены . на иолтаерноИ матрице, годерхашие в качестве галтена опиаты, опиоидные пептида, биогенные шины.

Разработан твердофазный метод иммуноферментного анализа «явления антител к опиатам, препаратам .эфедрина и каинабиноидам; жреаелена диагностическая значимость предложенных способов для ¡рименения в медицинской практике.

В сыворотке крова доноров и Сольных наркоманией установлено наличие антител к эндогенным нейромедиаторам Сбиогенным аминам и опиоиднш пептидам). У больных наркоманией, но сравнению с донорами, обнаружено изменение уровня антител к перечисленным выше эндогенным биорегуляторам, участвующим в патогенезе заболевания. На основе проведенных исследований разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови людей. Показана возможность их использования в диагностике заболевания. С помощью данных методов установлена тесная взаимосвязь между уровнем образования антител к моноамшам, опиоиднш пептидам и длительностью употребления психотропного соединения.

Разработан новый метод получения иммуносорбентов для аффинной хроматографии; впервые из сыворотки крови доноров и больных наркоманией выделены антитела к нейромедиаторам Ср-эндорфину, дер-морфину) и исследованы их иммунохимические свойства.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты по созданий новых методов иммунодерментного анализа психотропных препаратов имеют важное значение для практического использования в диагностике наркомании. Так, иммуноферментные тест-систеш для определения антител к опиатам, препаратам эфедрина и каннабиноидам используются в наркологических клиниках" страны. На способ диагностики опийной парке .идии получен патент Сприоритетная справка N 4947040).

Определена диагностическая значимость иммуноферментного анализа выявления антител к опиатам, препаратам . эфедрина и каннабиноидаы в крови наркоманов, позволяюдая объективно •подтвердить <£ает хронического употребления наркотических веиеста спустя 2-4 месяца с момента их последнего попадания в организм.

На базе Иаститута физиологически активных вецеста РАЙ постоянно проводится методическая школа по обучению врачей из наркологических центров" России новым методам диагностики наркомании.

Результата по разработке синтеза иммуносорбента для выделения антител к опиоиднкм пептидам являются перспективными для .использования в практическом здравоохранении при создании технологии получения селективных сорбентов в экстракорпоральных методах лечения наркомании.

< . _ _ с _

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработать: прнншшиальх! поьыь аегсль: диагностики наркомании, связанные с определением специфических антител к наркотическим и психотропным веществам, которые кож;¡о попользовать в качестве объективного теста на злоупотребление наркотиками.

2. Обнаружено наличие в сыворотке крови человека антител к нейромедиаторам ыоноаминовоЯ и опиоидной природы. Выявлено увеличение уровня антител к данным биорегуляторам при формировании зависимости к наркотикам. Разработаны методы анализа определения антител к эндогенным нейромедиаторам, участвующим в патогенезе заболевания.

3. Установлена тесная взаимосвязь между уровнем образования антител к моноаминам, опиоидным пептидам и длительностью употребления наркотика. Совместное использование разработанных им-муноферментных методов анализа определения антител к наркотическим веществам и эндогенным нейромедиаторам является дополнительным подтверждающим тестом для диагностики интоксикации психотропными препаратами.

Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены на межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН Спротокол N 1 от 24 июня 1994 г.). Основные результаты исследования были также доложены на П Всесоюзном, симпозиуме.. "Иммунобиотехнология-91", Проблемы технологии производства иммунофермеятных диагностикумов и их применение в здравоохранении САдлер, 1991 г.). I Российском съезде, иммунологов СНовосибирск, 1992 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи, получен 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения С 7 глав), выводов и списка литературы (102 источника). Работа содержит таблиц и

рисунков. Материалы измложены на страницах машинописного

текста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

В работе использованы следующие биохимические л химические реагенты: коньюгата овечын антител против Хдв и 1дМ человека, меченные пероксидазой хрена (31дгаа), лизоцик, овальбумин (Бёгуа),

30 У. перекись водорода, о-фенилендиамин, изобутилхлорформиат, твин-20, водорастворимый карбодиимид, пентафгорфенол, гексамети-лендиамин (Aaersham). Полинитрофенилакрилат и модифицированный поливинилпирралидон (ИБХ РАН, г. Москва; ИБС РАН, Ст-Петербург). .

Морфин, эфедрин, ¿^'-тетрагидроканнабинбл*предоставлены кафедрой токсикологической химии Медицинской Академией им. И. М. Сеченова. Адреналин, ворадреналнн, дофамин, серотонин, гнстамин, »-зндорфин, энкефалины (Sigma), дерморфин и его аналоги (ИБХ РАЮ.

Основными материалами исследований были образцы сыворотки крови больных опийной, эфедроновой и гашишной наркомании с различной продолхительностью злоупотребления опиатами, препаратами эфедрина в ¿ь.'-тетрагидроканнабин'ола, представленных 17-ой наркологической больницей г.Москвы, Всероссийским научным центром по наркологии г. Москвы, Грузинским- центром по наркологии г. Тбилиси При проведении иммунохинических (серологических) исследований в качестве контрольных образцов использовали сыворотки здоровых доноров, или их пул, полученные из Всероссийского научного гематологического центра г.Москвы.

Для проведения биохимических и иммунохимических исследований применяли следующие.методы:

. 1. Хроматография способом гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-10 и 6-25 /Л. А.Остерман, 1985/ с использованием хроматографнческой системы фирмы Pharmacia.

2. Аффинная хроматография на специально полученном сорбенте на основе макропористого аминопропилированного стекла (МПС-1000. ИБХ РАН). Белок в растворах аффинко выделенных антител определяли методом Lowry. Оптическую . плотность растворов белков регистрировали спектрофотометрически на приборе Pye Unicam PU 86-10.

3. . Имыуноферментный анализ проводили на полистирольных планшетах фирмы Hune (Дания). Учет результатов ИФА осуществляли на спектрофотометре "Multiskan" (Flow Laboratories) при 432 нм.

Обработку цифровых данных проводили методами вариационной статистики и корреляционного анализа. Для расчетов использовали пакет прикладных статистических программ "Stat" фирмы IBM (СЕА), реализованный на персональном компьютере IBM PC/XT (США).

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 1 Получение реагентов для иммуноферментного анализа определения антител х наркотикам и нейромедиаторам

Для разработки твердофпэных иммуноферменттп методов определения специфических антител к наркотикам и нейромедиаторам в качестве реагентов необходимо било синтезировать коньюгированные антигены наркотических соединений, биогенных аминов, катехоламинов и опиоидных пептидов с белками и полимерами и исследовать их иьыунохимическме характеристики. Синтез конъюгатов наркотических препаратов - морфина, эфедрина и ¿\'-тетрагядроканнабинопа осуществляли исходя из специально полученных гаптенов - производных морфина, эфедрина и ¿ъЛтетрагидроханнабияола, содерхаиих спейсер с карбоксильной группой. Для синтеза конызгированных антигенов .биогенных аминов и опиоидных пептидов была выбрана полимерная матрица, позволявшая исключить химическую модификацию лабильных яейромедиаторов и использовать ковапентное связывание с макромолекулярным носителем с полным сохранением структуры данных биорегуляторов.

1.1. Получение коньюгированных антигенов морфина, эфедрина и ¿>Лтетрагидроканнабинола с различными белками.

Исходные гаптены 6-0-темисухцинат морфина С 6-0-ГСМ) и 3-0-кабоксиметил морфин (3-О-КММ) синтезированы из морфина и янтарного ангидрида СВ.Н.Winner et al., 1972) и из морфина и хлоруксусной кислоты IS.Spector, 1972) соответственно. Гаптен, используемый для коньюгатов с препаратами эфедрина - d, 1-эфедрин- или эфедрон-Н-3-пропионовую кислоту получали из производного эфедрина СЭ) С J. V. Find lay et al., 1981). Гаптен, на основе которого были синтезированы коньюгаты, содержание s своем составе производное каннабияоидов, был получен реакцией азосочетаяия л'-тетрагидро-каннабинояа и диазониевой соли п-аминобензойной кислоты С/^'-ТТЮ. Коньюгаты морфина, эфедрина и каннабиноидов с белками Совальбумином-Ова, лизоцимом-Лиз) были синтезированы двумя способами: по методу смешанных ангибридов С метод СА) и с помощью водорастворимого карбодиимида Сметод КДИ). В реакциях ковалентного связывания исходных реагентов (модифицированного гаптена и белка) использовали их различные молярные соотношения, в результате чего

были получены КА. содержащие разное количество наркотика - гаптена на моль белка-носителя СТа^пица 1).

Таблица 1

Характеристика полученных коньюгированных антигенов

НИ : Конны>гирован- : Соотношение гаптена-белок : Метод

КА : ный антиген : вводимых в ре- содержание ran- : синтеза

: : акцию соедине- : тена в' КА после :

: : ннй (моль/моль): синтеза :

: : :СыОЛЬ/МОЛЬ) :

Морфин-Лиз 14 1 И СА

2. 6-0-ГСМ-0ва 10 1 3 Ш

з. 6-0-ГСМ-0ва 14 1 И кди

4. 3-0-КШ-0ва 7 1 2 ш

5. 3-0-КММ-0ва 10 1 5 ш

К 3-0-КШ-0ва 14 1

7. Эфедрнн-ОЁа . 3 1 2 кди

8. Эфедрин-Ова 6 1 5 кди

9. Эфедрин-Ова 14 1 И кди

10. Эфедрин-Ова 3 1 2 кди

11. г^МТК-Ова 20 1 12 СА

12. ¿¿>'-ТТК-0ва " * 5 1 ' ' • • ' 3 ' СА ■

Полученные коныггированные антигены выделяли гельхромато-графией и дапсе на основании данных спектрофотометрического анализа СУ.Д.Каверзнева, 1966 г.; A.F.S. A. Habeeb, 19SS) проводили определение количества молей гаптена, ковалентно связанного с белком.

1.2. Синтез коньюгированных антигенов наркотических веаеств с позл.мерами.

При разработке методов синтеза КА, используемых для выявления специфических антител к наркотикам в сыворотке крови больных наркоманией, необходимо учитывать фактор влияния структуры белка-носителя на результаты анализа. Вот почему, следующий этап работы связан с получением искусственных, антигенов на основе полимерной матрицы, применение гторых в иммуноанализе позволяет определять антитела, связывагияеот напосрслсгпеняо с гаптенон, ■ исключая белок-носитель. Метод селам« новых аяти- •. нов основан яа реакции

конденсаций толиС4-яитрофения)акрилата, т.е. полностью активированной полиакриловой кислоты с аминогруппам, либо присутствующими, либо последовательно введенными в молекулу гаптена. Данный способ-синтеза является универсальным и позволяет обеспечить заданную молекулярную массу КА и варьировать состав и соотношение яигандов-гаптенов, включаемых в искусственный антиген.

Кроме того, для разработки методов выявления антител к опиатам были синтезированы искусственные антигены на основе сополимера Н-винилпирралидона с Я-гияроксифгалимидным эфиром акриловой или кротоновой кислоты.

Синтез конъюгированных антигенов на основе полимерной матрицы осуществляли с предварительной модификацией гаптена. Так, на рисунке 1 представлена схема получения коньюгатов полиС4-нитрофе-нялЗакрзшата с морфином. Для этого использовали 6-0-ГСМ или 3-0-КММ. Далее этерифицировали карбоксильные группы производных морфина с помощью пентафторфенола и полученные эфиры вводили во взаимодействие с гексаметилендиамином. Затем производили конденсацию полученных соединений с полиС4-нитрофенил)акрилатом, осуществляя контроль за количеством присоединившихся молекул морфина. Получаемые антигены содержали 15-20% замещение полимерной матрицы молекулами гаптена через спейсер по третьему-З-окси-карбонилметил-морфин-полимер СЗ-М-П) или шестому-6-гешсукщшат-морфин-полимер Ш-М-П) положению молекулы.

0 О

6-0-ГСК-С-ОН ' ■ ^-гсм-с-ш-МЛ

о

Б-О-ГСМ-С-Мн^с-МН»

О-^-О-^НОг б-^К-СМ-Нл/^Н^-НМ-С^

'ис. 1. Схема синтеза конъюгированных антигенов морфина на полинитрофенилакрилате. Синтез конъюгированных антигенов из производных эфедрина и ^'-тетрагидроканнабинопа осуществляли аналогичным образом, ачиная с предварительной этерификашш, уже имеющейся в этих

веществах карбоксильной группы, пентафторфенолом. Далее, к получение активированным эфирам эфедрона и л'-тетрагидроканнаби-нола добавляли избыток бифункционального реагента - гексамети-лендиамина. Модифицированные подобным образом галтены легко вступает в реакцию конденсации с 4-полинктрс!|енЕлахрилатом. Были синтезированы коньвгаты зфедрона и- .с^-тетрагидроканнабинола. содержание 10-15 молей лиганда на моль полимерной, матрицы.

1лл разработки иммуноферментного метода анализа определения антител к опиатам были приготовлены реагенты, позволившие установить более детальное влияние структуры полимерной матрицы, ее молекулярной массы на результаты анализа. С этой целью были синтезированы конъюгированные антигены морфина с различными сополимерами винилпирралидона с кротоновой кислотой и с аллиламином. В качестве исходных галтенов для синтеза новых антигенов использовали те же самые,- описанные выше, производные морфина (6-0-ГСМ и 3-0-КМЮ, содержащие спейсер со свободной аминогруппой. В результате проведенной конденсации были получены конъюгированные антигены, различающиеся структурой и массой. В случае синтеза КА на основе сополимера винилпирралидона с кротоновой кислотой и с N-гидроксифтальимидным эфиром кротоновой кислоты СВП-КК-ГФИ-КЮ она составляла 68000, а при синтезе КА с сополимером ВП с КК. с п-кротоноиланинофенолом й алиламином она равнялась 11000 и ,0000 соответственна.

1.3. Получение коньюгированных антигенов нейромедиаторов: до-фак?иа, норадреналина, адреналина, серотонина, гистоми-на, дерморфвда, энкефалинов на полинитрофенилакрилате.

Для синтеза КА нейромедиаторов применяли разработанный ранее принцип получения искусственных антигенов т полимерной матрице. КА нейромедпаторов синтезировали путем конденсации биогенных аминов Ссаротонина, гистамина, норадреналина, адреналина, дофамина и ряда опиоидных пептидов) дерморфина и его аналогов, а также Leu- и Met-энкефалинов с 4-полинигрофенилакрилатом. Использование полиыатной матрицы, содержащей предварительно активированные карбоксильные группы в виде п-нитрофекилового эфира, позволило в мягких условиях получить синтетические антигены моноаминов и пептидов, сохраняя практически - без изменения структуру исходных галтенов. Получено- три вида ког^югато^, содержащих полностью замеленную галтенов матрицу, 50*.' идоют/одяш* молекул гаптена к

ней, либо 10-15/£ связанных молекул лиганда с полимером.

2. Иммуноферментный анализ определения антител к нарко— тическим препаратам и выявление его диагностической значимости

Следующий раздел диссертационной работы посвящен разработке высокочувствительного ИФА для выявления антител к опиатам, препаратам эфедрина и ¿уЧгетрагидроканнабинола сыворотке крови наркоманов и выявлению диагностической значимости определения уровня антител к наркотикам для создания новых методов анализа, используемых в дальнейшем в диагностике наркоманий.

При разработке твердофазного ИФА выявления антител к гаптенам мы проводили оптимизацию условий выявления антител на каждой стадии анализа. Во-первых, было исследовано влияние концентрации раствора антигена, используемого для сорбции, на выявление антител. Во-вторых, были изучены условия сорбции иммуноглобулинов С С1дО и М классов С1дМ) из сыворотки крови человека. В-третьих, были выбраны параметры выявления комплексов АГ-шшуноглобулины сыворотки. Цель этих исследований заключалась в подборе таких параметров ИФА, которые обеспечивали бы наибольшее повышение уровня 0С<32 в ИФА для пула сыворотки крови наркоманов над уровнем оптической плотности, регистрируемой в ИФА, для нормальной сыворотки. В результате были найдены следующие условия проведения ИФА (таблица 25.

Таблица 2

Условия проведения ИФА выявления антител к опиатам, ¿ьЛтетра-гидроканнабинолу, эфедрону в сыворотке крови людей.

гисоируемые

' КА .таптен-белок/

концентра-: разведе-ция раст- : ние сы-всра КА : воротки ДЛЯ сорб- : ЦИИ,МКГ/МЛ:

сорбируемый: концентра

КА : ция т>аст-

/гаптен- : вооа КА

белок/ •• для сорб-

: ции,мкг/мл

разведение сыворотки

1. Морфин-Ова, 1:4 2 1:100 7. ¿\Э-ТГК-0ва,1:3 5 1: 100

2. Морфин-Лиз, 1:14 10 1:100 8. Л -ТГК-Л 1 1: 100

3. 6-М-Л 1 1:400 9. 6-0-ГСМ-

4. 3-М-П 1' 1:400 БП-алпил- 1,5 1 : 1600

5. Эфедрон-Ова, 1:3 5 1:100 ами н 10.з-о-кмм-

6. Эфедрон-П 2 , 1:100 ВП-аллил- 6 1 : 200

амин

Сравнительный анализ данных, представленных в таблице 2 показал, что использование антигенов на полимерной матрице по сравнению с коньюгированными антигенами' на белке имеет ряд' преимуществ при .проведении ИФА выявления антител к опиатам, препаратам эфедрина и каннабиноидам. Так, использование полимерных конъюгатов позволяет иммобилизовать на планшет^ антиген в меньшей, по сравнению с КА на белке, концентрации, а такке работать при более высоком разведении сыворотки. Эти факторы способствуют выявлению специфического взаимодействия антител с антигеном к снижению уровня неспецифического фона.

При выборе оптимальных условий проведения ИФА выявления антител к опиатам оказалось, что использование КА сополимеров Н-виниллиралидона с кротоновой кислотой и ее производными, сходными по структуре, но различающимися по молекулярной массе ,(68000 и 11000), титрование в ИФА не позволило установить четкой пропорциональной зависимости между концентрацией антигена и разведением сыворотки. Поэтому в дальнейшем данные антигены не были использованы в Шк выявления антител к опиатам.

2.1. Разработка ИФА определения антител к опиатам эфедрину и Лэ-тетрагидроканнабинолу в высоротке крови больных на^Г'ч.имей * ' "

Создание твердофазного иммуношермектного анализа выявления антител к опиатам проводила на основе синтезированных конъюгиро-ванных антигенов - производных морапна ка оелкоьой и полимеркой матрице.

Как видно из данных, приведенных на рис.2, достоверно повышенный уровень иммуноглобулинов наблюдается в группе больных опийной наркоманией по сравнению с группой доноровв среднем в 70% случаев.

Известно, что существуют данные, свидетельствующие о том, что специфичность антжорфиновых антител индивидуальна для каждого больного и направлена к разным участкам молекулы гаптена. Вот почему на следующей этапе работы в ЙФА выявления таких антител использовали не один, а два антигена, отличающихся тем, что моле-ла галтена присоединена к молекуле махромолекулярвого носителя ло разным участкам к через разные связующие "ыостигаГ-цепочки атомов углерода:. б-О-ГСгНЬл м З-О-ККл-Ова (табл.1). Это позволяет; увеличить выявление достоверно по^иг^Сйо:.-. уровня антител в

10 ■■

0,52 0,6 0,68 0,76 0,84

N

ю Т

доноры

больные опийной наркоманией.

0,92 1,0 03)

492

0,44 0,52 0,6 0,68 0,76

492

Рис. 2. Уровень специфических иммуноглобулинов, связывающих конъсгат морфин-белок, выявленных ИФА. А - 1дМ; Б - 1д0; N - количество образцов. Массив гистограммы 35 значений.

сыворотке крови наркоманов по сравнение с донорами до 80%. При проведении сравнительного эксперимента по определении против морфина в сыворотке тсрови опийных наркоманов и доноров на основе использования в ИФА КА, различается как природой макромолекулярного носителя, так и местоположением галтеновой связи (это - морфин-Лиз, б-М-П и 3-М-П) получены следующие

результаты. Применение КА б-М-П по сравнению с первоначально использованным в ДОМ белковым антигеном морфин-Лиз 7 позволяет выявить повышенный уровень Ig к морфину у большего Сна 10%) количества больных опийной наркоманией. Использование КА З-М-П расширяет возможности ИФА, так как повышение уровня антиопиатных антител обнаруживается дополнительно eise в 5-8% случаев, причем в тех образцах сыворотки крови больных наркоманией, в которых не установлено увеличение уровня антител при использовании в анализе конъюгатов морфин-Лиз и 6-М-Л. Таким образом, совместное использование в ИФА антигенов 6-Н-П и З-М-П для определения антиопиатных антител в сыворотке крови человека, позволяет выявить повышение уровня Ig к морфину у 90% больных опийной наркоманией, что может служить основанием для применения данного метода в диагностике заболеваний наркоманией.

Совместное использование антигенов, содержащих морфин, ковалентно связанный с полимерной матрицей (сополимером К-виниллирралидона с аялилашщомЗ как по шестому, так и по третьему положению молекулы гаптена, позволило повысить выявление уровня антител к •■ морфину у больных опийной наркоманией по сравнению с применением в ИФА белковых конъвгатов в среднем лишь до 87%. Для унификации разработанных методов твердофазного ишуноферментвого анализа мы использовали искусственные антигены, полученные'на-основе 4-полинитрофенилакрилата.- ■ . -

Аналогичная работа была выполнена при разработке ИФА определения антител к производным эфедрина и л9-тетрагидроканнабино-ла в сыворотке крови больных гашишной и эфедроновой наркоманией.

Таблица 3

Результаты ИФА выявления антител к эфедрину и лэ-тетрагидро-каннабинолу у больных наркоманией

Группа больных эфедроновой наркоманией

Коньюгиро-:больные с повышенным ванный : уровнем Ig в %

антиген : igG ; IgR •

Эфедрин-Ова 8 54

Эфедрин-П 40 72

: Группа больных гашишной наркоманией

: Коньюгиро-:больные с повышенным : ванный :уровнем 1д в X

: антиген : Гд5 ! 1дН

.^'-ТГК-Ова 28 53

^'-ТТК-П 32 67

Как видно из результатов, представленных в таблице 3. использование в ИФА конъюгированныз антигенов на полимерной матрице позволяет увеличить процент выявления лиц с достоверно повышенным уровнем по сравнению с донорами.

2.2. Определение диагностической значимости разработанного Шк определения антител к наркотикам.

Для выполнения работы обследовали несколько групп больных наркоманией и группы здоровых доноров С200 чел.), не имевших контакта с наркотиками. Первую наиболее обширную группу (более 500 человек) составили лица с достоверно установленным фактом злоупотребления опиатами, но без детальных анамнестических и клинических данных.

Вторую группы составили больные опийной наркоманией (27 человек), поступивших в клинику добровольно, т.е. в этом случае высока объективность анамнестических данных. Все больные этой группы утверждали, что употребляют опиаты.

С помощью разработанного ИФА- установили, что в первой группе опийных наркоманов более 80% (р < 0,001) больных имеют достоверное превышение порогового уровня антиопиатннх антител. Такой высокий процент выявления больных с повышенным' "уровнем антител даже при отсутствии точных клинических данных о стаже наркотизации свидетельствует о высокой диагностической значимости разработанного ИФА, как дополнительного теста для подтверждения факта злоупотребления описатамк.

• Для второй группы больных был проведен анализ уровней антител как к морфину, так и к эфедрину (таблица 4).

Важно отметить, что больные опиатной группы, давшие положительную реакцию не только на опиаты,-но на опиаты и эфедрин отрицали потребление наркотических производных эфедрина. Выявление у таких больных специфических антител к эфедрину, вероятно, свидетельствует о том, что они употребляли смесь наркотических веществ. Более того, эти факты подтверждены и клиникой протекания абстинентного периода у этих больных. Следовательно, можно предположить, что торговцы наркотиками разбавляют опийный раствор более дешевым в производстве перветином или эфедрином, что приводит к формированию нового типа опийно-эфедриновой наркомании.

Таблица Ч.

Содержание 1д, связыващих конъюгаты морфина СА) и эфедрина СБ) во второй группе больных наркоманией и доноров

Вольные

1 0,973 + 0,710 16.

2. 0,815 + 0,540 17.

3. 1,090 + 0,651 18.

4. 0,910 + 0,471 19.

5. 1,107 + 0,562 20.

6. 0,856 + 0,570 21.

7. 0,827 + 0,629 22.

8. 0,918 + 0,612 23.

Э. 0,521 0,923 + 24.

10. 0,496 0,951 + 25.

11. 1,049 + 0,942 т 26.

12. 0,655 + - 0,828 . 27.

13. 0,805 + 0,876 +

14. 0,760 + 0,915 + Хср±

15. 0,973 + 1,923 +

0,918 + 0,512 0,493 0,577 0,500 0,485 0,456 0,536 0,463 0,411 0,323 + 1,008 + Доноры п 0,523 + 0,030

Зс 0,732

0,974 +

0,520

0,684

0,439

0,654

0,532

0,646

0,654

0,562

0,551

0,653

0,519

0,626+0,031 0,810

Примечание: "+" отмечены ОВ^ в ИФА для сыворотки крови нарко"-

манов, имевших достоверно повышенное содержание 1д к

данному антигену, т.е. больше X + 3<г .

ьр

Таким образом, исследование уровней антител к наркотическим" препаратам открывает новые возможности для диагностики наркоманий. Во-первых, определение содержания таких антител способствует выявлению факта хронического злоупотребления наркотиками в отдаленный период после последнего приема наркотика. Этот метод может быть особенно необходим, когда нет четких клинических признаков заболевания и имеются сомнения в диагностике наркомании. Во-вторых, выявление антител к наркотикам дает возможность уточнить состав употребляемых препаратов. В-третьих, этот метод может , быть дополнительным тестом для выявления приема наркотика в клинике и объективизация клинической оценки эффективности проводимой терапии.

- 17 -

3. Иммуноферментный анализ определения антител к моноаминовым и опиоидным ней роме диаторам При разработке ИФА выявления антител к дофамину, серотонину, гистамину, адреналину, норадреналину и апиоидам были использованы конъюгированные антигены с различным замещением полимерной матрицы гаптеном. Такое разнообразие синтезируемых КА обусловлено тем, что при выявлении антител к любому из . перечисленных выше нейромедиаторов на первом этапе мы исследовали влияние структуры искусственного антигена на полноту связывания в ИФА с гетерогенной популяцией 1д, присутствующих в сыворотке крови больных и доноров.• В результате обнаружено, что конъюгаты с 10-15% замещением полимерной матрицы нейромедиаторов являются пригодными для определения популяции специфических 1д, различающихся как силой связывания с антигеном, так и концентрацией в каждой индивидуальной сыворотке человека.

3.1. Определение с помощью ИФА е-АТ к моноаминам в сыворотке крови наркоманов и доноров ' При обследовании сыворотки крови здоровых доноров с помощью твердофазного ИФА, нами впервые были обнаружены 1д класса 6 и М, связывающиеся с коньюгатами эндогенных низкомолекулярных биогенных аминов.

Таблица 5.

Иммуноферментный анализ содержания 1дМ, связывающих биогенные амины, в группе доноров и больных с зависимостью к наркотикам

Биогенные амины

Значбния оптической плотности в

доноры

Дофамин

Норадреналин

Адреналин

Серотонта

Гистамин

~0,'48о + 0,024

0,788.+ 0,021 0,605 + 0,011 0,354 + 0,015

0,422 + 0,021

больные опийной .яаркиманлэй

— 0,771 ¿0,019 р < 0,01 0,807 +0.027 .0,592 +.0,014 0,738 + 0,025 р < 0,01 0,802 + 0,002

ИФА СОЙ 492) :больные гашишной :наркоманией

0,750 ± 0ДИГ ■ р < 0,01 0,794 + 0,030 0,569 + 0.117 0,660 + 0,021'

0,792 + 0,040

Как видно из представленных результатов, у больных опийной наркоманией в среднем по группе по сравнению с донорами, наблюдается увеличение уровня 1дМ, связывающих дофамин и серотонин. В группе больныхс гашишной зависмостью выявляется достоверное повышение уровня 1дМ, специфичных только для дофамина, содержание 1дМ, связывающих адреналин и норадреналин не отличалось от нормы.

Полученные результаты по увеличению уровня 1д подтверждают данные об участии дофаАгаергичесхой и серотонннергической систем в развнтш! наркотической зависимости. Прием . наркотика ведет к повышенному ьыбросу биогенных аминов, которые в свою очередь оказывают влияние ка синтез специфических 1д. . способных выполнять компенсаторную функцию.

3.2. Определение с помощью ИФА е-АТ против опиоидных пептидов в сыворотке крови наркоманов и доноров

С помощью разработанного варианта ИФА впервые было установлено в сыворотке крови доноров наличие 1д, связывающихся с низкомолекулярными опиоидными пептидами. Проведенный сравнительный анализ содержания 1д х опиоидам в группах доноров и больных опийной наркоманией показал, что уровень 1дб остается практически одинаковым у всех обследованных лиц. Результаты по выявлению 1дМ, связывающих опиоидные пептиды у доноров и больных наркоманов, •представлены в таблице 6.

. . . .... ... ... . . Таблица 6.

Данные ИФА содержания 1дМ к опиоидным пептидам у донороз и больных наркоманией

Опиоидные пептиды : значения оптической плотности в ИФА

при 492 нм

доноры ■ ! больные опийной : наркоманией

£-ЭНДОрфИН 0,588 + 0,021 . 0,673 + 0,024

Ме1-энкефалия 0,670 + 0,026 0,810 + 0,044

Ьеи-энкефалин 0,505 + 0,025 0,603 + 0,068

дерморфин 0,737 + 0,017 0,941 + 0,032

0-А1адерморфин 0,519 + 0,015 0,606 + 0,021

Как следует из полученных данных, у больных опийной наркоманией, в среднем по группе, наюлюдается специфическое увели-

чение уровня 1дМ, связываниях дерморфнн. Содержание 1дМ к р-эндор-фину и энкефалинам яе отличалось от нормы.

4. Исследование иммунохимических свойств антител к р-эндорфину, дерморфину, выделенных из сыворотки крови доноров и больных наркоманией Выделение антител к опиоидным лепт дам впервые проводили из сыворотки крови наркоманов и доноров с помощыз синтезированного иммуносорбента.

В число обследуемых лиц вошли больные опийной наркоманией, в сыворотке крови которых содержались антитела к морфину и больные полинаркоманиеЯ, имеющие в сыворотке крови антитела, как к морфину, так и к эфедрину. После проведения хроматографии нами были выделены из сыворотки крови больных и здоровых лиц антитела к Э-эндорфину и дерморфину 5 и М класса.

Причем ТО'/, доноров имели антитела к А-эндорфияу 1д6 класса, а остальные, как 1д5, так и 1дМ. В случае антител против дерморфина в сыворотке крови присутствовали в основном 1д6, а в единичных случаях 1дб и 1дМ антитела. При исследовании изотопического состава антител против опиоидных пептидов, присутствующих в сыворотке крови опийных наркоманов было обнаружено, что • у 30% обследованных опийных больных • выделены 1дМ антитела,, а у остальных, как 1дМ, так и 1д6 антитела против ?-эялорфина.-

Из каждой сыворотки крови опийных наркоманов хроматографиро-ваны акгидерморфиновые антитела,. относящиеся I б ч II классу. Для больных полинаркомаяией также в равной степени характерно наличие 1дв и 1дМ антител к опиоидным пептидам.

Далее для всех исследуемых образцов антител против олИоидных пептидов определили константу • аффинности. В результате было установлено, что у 50'/, доноров КА для антител к р-эндорфину составляет величину 108-109М~1 для 1дМ и 109-1010Н~1 для 1д5. Для оставшейся половины доноров КА не удалось рассчитать. Для всех антидерморфиновых антител, выделенных из сыворотки крови доноров КА также не бала рассчитана, что, вероятно, связано с наличием в сыворотке здоровых доноров популяции низкоаффииных антител к данным антигенам. Для'больных наркоманией величина КА колебалась в широком диапазоне л составляла 107-1011Н_1 для. 1дИ и Ю^Ю^Чг1 для 1дб антител к э-эндорфину; в случае дерморфина эта величина составляла 106-109М-1 для ГдН в 1С9-1С101Г1 для 1до.

Напее ялл рсех исследуемых образцов антител к оппопдам была изучена специфичность связывания с некоторыми лигандами опиатных рецепторов, имевших сходную с р-эндорсрином физиологическую активность СЬеи, Ме1-энкефалмны, дерморфин, е-эндорфин, морфюО. В результате установлено, что все сыворотки крови индивидуальны по своей специфичности, но тем не менее в каждой сыворотке крови донора присутствует популяция антител С или М класса, обладающая перекрестным связыванием С10-3550 хотя бы с одним лигандом .д-опиа-тного рецептора. Этот факт, по нашему мнению, связан с наличием общих детерминант, участвующих в связывании с ^-опиатным рецептором и узнаваемых антителами к опиоидным пептидам.

Для группы обследованных наркоманов характерно увеличение специфичности антител к р-эндорфкву и дерморфину и отсутствие перекрестных реакций с другими лигандами (г-опиатных рецепторов.

Обобщение результатов по иммунохимическому исследованию антител к опиоидным пептидам свидетельствует о тесной связи систем гуморального иммунитета и отюидных пептидов. По мере развития наркотической зависимости, с появлением антител к экзогенному наркотику Сэфедрину, морфину) изменяется по сравнению с донорами и изотопический состав соотношения 1дб и ГдМ антител к эндогенному .р-эндорфину л дерморфину, .происходит, увеличение холичества_ больных содержавдх IдМ антитела. Кроме того, по мере развития заболевания, увеличения в сыворотке крови эндогенных опиоидов, увеличивается специфичность антител к э-эндорфину и дерморфину, способных избирательно связываться с опиоидньми пептидами, предохраняя организм от патогенного воздействия.

5. Диагностическая значимость выявления антител к • наркотикам, биогенным аминам, опиоидным пептидам у больных наркоманией На основании результатов, полученнных в нашем исследовании, установлено, что у больных наркоманией наблюдается повышение уровня 1д, связываюаих наркотики, в то же время у них происходит повышение уровня 1дМ к некоторым энд ■ ^енным соединениям, таким как опиоилные пептиды, биогенные амины. На следующем этапе работы необходимо было установить диагностическую значимость метода ИФА выявления уровня 1д к перечисленным выше наркотикам и биорегуляторам. ....

Анализ результатов ИФА определения антител к нейромедиаторам в сыворотке крови наркоманов показал, что достоверное повышение уровня антител к морфину сопровождается, в первую очередь, повышением уровня антител к опиоидам, в частности, к дерморфину.

При исследовании уровня 1д, связывающих биогенные ■ амины, обнаружено, что в группе больных с повышенным уровнем 1д к морфину, увеличение уровня 1д к моноаминам зависит от длительности заболевания. Гак, в таблице 7 представлены данные, показывающие, что при стаже наркотизации до 5 лет (в наблюдении 9 человек) повышение уровня 1д к одному из антигенов отмечено у б человек, при стаже наркотизации от 8 до 17 лет Св наблюдении 8 человек) увеличение уровня 1д к одному антигену отмечено только у одного человека, а у 7 пациентов наблюдалось повышение уровня 1д уже к двум и более антигенам.

Таблица 7

Результаты ИФА содержания 1д к биогенным аминам в группе

больных наркоманией с различным стажем наркотизации

Группа больных со стажем ~ наркотизации от 1 до 8 лет

• Время : Исследуемые антигены

наокоти-: серо-: гис-: норад-: доф-зации : то- та- : рена- : амин Сгод) : НИН :МИН :ЛИН :

1 3

3 +

5 3 2

1 + 3

6

юуппа больных со стажем наркотизации от 8 до 17 лет

-время : Исследуемые антигены ..

наркоти- серо- гис- нооад-; ДОф-

зации то- та- рена- : амин

(год) НИН мин ЛИН :

- - - 13 - + - -

- - 10 + + +

- - 17 - - - +

- + - 8 + - + +

г + - 10 + + + +

- - - 13 + + - -

- - - 10 + -

- - - 9 + + + +

+

Примечание: знаком отмечены больные, в сыворотке крови которых наблюдалось достоверное повышение уровня 1д к данному антигену.

Эта факта свидетельствуют о том, что системы биогенных аминов и опиоидных пептидов по разному участвуют в патогенезе наркомании. Опиоидная система, в первую очередь, реагирует на развитие заболевания и только спустя некоторое время можно обнаружить изменения в системе биогенных аминов. Обе эти системы за счет изменения-содержания нейромедиаторов осуществляют, регуляцию физиологических процессов, направленных на адаптацию организма к изменяющимся условиям внутреннего и внешнего окружения. Увеличение уровня 1д к нейромедиаторам на определенном этане развития наркомании оказывает защитное компенсаторное действие и регулирует функцию этих систем.

Выявление уровней этих 1д твердофазным ИФА может быть использовано в клинике наркомании: во-первых, для подтверждения факта злоупотребления наркотиками и, во-вторых, для установления длительности употребления наркотических препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Получены иммунохимические реагенты для разработки твердофазных методов иммуноферментвого анализа специфических антител к наркотическим веществам и эндогенным нейромедиаторам. Синтезированы конъюгированные антигены морфина, эфедрина, каннаби-ноидов с лиэоцимом и овальбумином. Разработаны методы получения искусственных' антигенов на' полимерной матрице,' содержащих' 'в качестве гаятена: опиаты, опиоидные пептиды, катехоламияы, гистанин и серотонин. Доказана универсальность разработанной схемы синтеза для получения коньюгатов низкомолехулярных соединений.

2. Разработан твердофазный иммуноферментнкй метод выявления антител к наркотическим веществам (опиатам, препаратам эфедрина и каннабиноидам) в сыворотке крови людей. Доказано диагностическое

и прогностическое значение выявления антител к наркотикам для определения интоксикации данными веществами (патент N 4947040).

3. Обнаружены в сыворотке крови людей естественные антитела к нейромедиаторам (опиоидным пептидам, катехоламинам, гистамину и серотонину). Установлено повышение уровня естественных антител к данным биорегуляторам у больных наркоманией по сравнению с донорами. Показана эффективность анализа таких антител для решения задач диагностики наркомании с поыоаью разработанного иммуноферментного метода.

4. Из сыворотки крови доноров и больных наркоманией аффинной хроматографией выделены антитела к опиоидным пептидам: э-эндорфину и дерморфину. Установлено, что по мере развития заболевания у больных наркоманией происходит изменение свойств антител к опиоидным пептидам: возрастает их специфичность и увеличивается в кровотоке содержание высокоаффинных антител IgM класса.

5. Показано, что совместное определение антител к наркотическим веществам и эндогенным нейромедиаторам в сыворотке крови больных с помощью разработанных методов иымуноферментяого анализа позволяет устанавливать сроки качала употребления препаратов и является надежным подтверждающим критерием диагностики заболевания наркоманией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зефиров Н. С., Полевая О.Ю., Мягкова М.А. , Панченко О.Н. Антигены для определения антиопиатных антител // Заявка на авторское свидетельство N 4947040, положительное решение от 22.04.92 г.

2. Мягкова М. А., Полевая 0. Ю., Панченко 0. Н. Иммуяоферментный метод выявления иммуноглобулинов у больных с наркотической зависимостью // 1 Российский сьезд'иммунологов." - Новосибирск. Тез. докл. - 1932. - с.31.

3. Мягкова М. А., Панченко 0. Н. йммунохимические свойцства антител к Э-эндорфину у больных с наркотической зависимостью// Иммунология. - 1993. - N S. - с. 19-23.

4. Полевая 0. Ю., Брюн Е. А., Мягкова М.А., Панченко О.Н., Копоров С. Г. Выявление диагностической значимости твердофазного ИФА уровней антител к опиатам и препаратам эфедрина в клинике наркомании // Вопр. наркол. - 1993. - И с, - с. 18-21.

5. Полевая О.Ю.., Брюн Е.А., Мягкова М. А., Панченко О.Н. Копоров С. Г. Иммуноглобулин, связывающие опиовдные пептида, биогенные амины и опиаты у больных наркоманией // Вопр. наркол. - 1993. N 2. - с. 20-23.