Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунополипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин

На правах рукописи

Толчева Елена Викторовна

СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИИ ИММУНОЛИПОСОМЫ и ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ДОКСОРУБИЦИН

14.00.14 - ОНКОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2007

Работа выполнена в ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов) и в Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (директор -академик РАН В.Т. Иванов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Барышников А.Ю. кандидат химических наук Суровой А.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бочарова O.A.

доктор химических наук, профессор Каплун А.П.

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗСРРФ

Защита состоится 2007 г. часов на заседании диссертационного

Совета (К.001.017.01) ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН.'

Автореферат разослан « /5~у> Ut&Jrtttf 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

Введение

Актуальность проблемы

Использование липосом для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов - цитостатиков является одним из перспективных направлений в медицине. Применение цитостатиков для лечения онкологических больных часто сопровождается токсическими осложнениями, обусловленными поражением быстро обновляющихся, с высоким темпом пролиферации клеток (в первую очередь костного мозга, эпителия желудочно-кишечного тракта, сердечной мышцы, почек и др.). Данные, накопленные специалистами за последние годы, подтверждают способность липосом транспортировать лекарственное средство, снижать его токсическое действие, увеличивать терапевтический эффект.

Для обеспечения направленного транспорта липосом к клеткам-мишеням было предложено модифицировать поверхность липосом различными лигандами, способными специфически связываться с антигенами или рецепторами на поверхности клетки. Выбор лиганда зависят от антигена/рецептора, экспресснрованного на поверхности клетки, куда необходимо доставить липосомы. В качестве векторных молекул могут выступать, например, моноклональные антитела (МКА) или их фрагменты (РаЬ'-фрагменты МКА), пептиды, факторы роста, углеводы, гликопротеины, лиганды к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней и др. Липосомы, к поверхности которых присоединены МКА или ЕаЬ'-фрагменты МКА, назвали иммунолипосомами.

Согласно литературным данным, присоединение лиганда к поверхности липосомы осуществляется посредством одной из трех реакций, которые являются достаточно эффективными и избирательными. Это реакция между активированными карбоксильными группами и аминогруппами, в результате которой образуется амидная связь; реакция между пиридилдитиолами и тиолами, в результате чего образуются дисульфидные связи; реакция между малеимидными производными и тиолами, в результате которой формируются тиоэфирные связи. Кроме того, для присоединения лигандов к липосомальной поверхности может быть использован метод нековалентного связывания -через образование комплекса биотип - авидип/стрептавидин. Все перечисленные методы требуют предварительной модификации лиганда, что может снижать его специфическую активность. Методы ковалентного присоединения, не требующие предварительной модификации лиганда, являются предпочтительными, так как значительно упрощают процесс получения «адресных» липосом, делая его одностадийным. К таким методам относится присоединение лиганда, содержащего МН2-группу, к п-нитрофениловому эфиру ПЭГ-липидного коньюгата или к цианурхлоридной производной ПЭГ-липидного

коньюгата. Однако конечный выбор метода присоединения определяется доступностью активированной липидной или полиэтиленгликоль-липидной производной и молекулярными особенностями лиганда.

В связи с вышесказанным, актуальной задачей является разработка методики получения активированного полиэтиленгликоль-липидного коньюгата и создание на его основе универсальной конструкции «адресных» липосом, позволяющей в одну стадию присоединять к концам цепей полиэтиленгликоля на поверхности липосом лиганды, содержащие аминогруппы (например, белки или пептиды), без их предварительной модификации.

Цель исследования

Целью исследования являлось создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунологической специфичности и цитотоксической активности иммунолипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин.

Задачи исследования

1. Разработать методику получения активированного ПЭГ-лшшдного коньюгата.

2. Подобрать условия присоединения лигандов (циклического RGD-содержащего пептида, моноклональных антител IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату.

3. Получить 1С080-нммунолипосомы и проверить их специфическую активность в системе in vitro.

4. Получить иммунолипосомальную форму доксорубицина, а также проверить иммунологическую специфичность и цитотоксическую активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Научная новизна исследования

Разработана методика получения активированного полиэтиленгликоль-липидного коньюгата. Подобраны условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату. Отработана методика получения 1С080-иммунолипосом и проверена их специфическая активность в системе in vitro. Получена иммунолипосомальная форма доксорубицина. Проведено тестирование иммунологической специфичности и цитотоксической активности полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Практическая значимость исследования

Разработанная технология получения «адресных» липосом на основе п-нитрофенилкарбонил-ПЭГ-липидного коньюгата может использоваться для любых

лигандов, содержащих аминогруппу. Метод получения «адресных» липосом из «классических» липосом или пространственно стабилизированных липосом, основанный на встраивании лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в липосомальный бислой, дает возможность встраивать множество различных лиганд-ПЭГ-липидпых коыьюгатов в предварительно приготовленные липосомы, содержащие различные лекарственные препараты. Этот метод не требует разработки отдельной технологии производства направленных липосом для каждого из множества лигандов в сочетании с лекарственным препаратом.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы прошла 28 декабря 2006 года на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории химико-фармацевтического анализа, лаборатории химического синтеза, лаборатории синтетических противоопухолевых веществ, лаборатории лучевых методов лечения опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Материалы работы были представлены на V Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2124 марта 2006 г.) и на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 14-17 марта 2006 г.) По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 156 источников. Материалы диссертации изложены на 109 страницах машинописного текста и включают 44 рисунка и 6 таблиц.

Материалы и методы исследования

Получение HO-PEG3ooo-OrnSt2.

HO-PEGîooo-Om-Stî синтезировали твёрдофазным методом в ручном варианте путём наращивания цепи с С-конца на Tenta Gel PAP смоле (RAPP Polymere), нагрузка составила 0.22 ммоль/г. Для временной защиты а- и е-ИНг-группы аминокислоты использовали флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc). Аминокислоту diFmoc-Om и стеариновую кислоту присоединяли последовательно к полимеру через образование

бензо-триазолового эфира в присутствии карбодиимяда. Для активации 1 экв. аминокислоты использовали 1,2 экв. HOBt и 1 экв. DIC. Отщепление HO-PEG-Om-St2 от смолы проводили TFA, содержащей 1% TMBS, в течение 2 часов (из расчета 5 мл смеси на 1 г смолы). HO-PEG3ooo-Om-St2 высаживали охлаждённым диэтиловым эфиром. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDITOF/TOF Bruker.

Получение pNP-PEGjoorOrn-St3.

Для получения pNP-PEG3ooo-Orn-St2 1 экв HO-PEG3ooo-Orn-St2 растворили в безводном хлороформе (из расчета 1 мл на 75 мг), к которому добавили 4 экв п-нитрофенилхлорформиата, растворенного в безводном хлороформе (из расчета 0.4 мл на 16 мг), и 4 экв триэтиламина. Реакцию вели во льду при постоянном перемешивании. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Продукт реакции высаживали из реакционной смеси охлаждённым диэтиловым эфиром. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

Получение cRGDJK-PEG3ooo-Orn-St>

Циклический пептид cRGDfK. был получен в группе А.Ю. Сурового (лаборатория

Химии пептидов, ИБХ РАН). Полученный пептид был охарактеризован методом HPLC и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

Для получения cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 1 экв pNP-PEG3ooo-Om-St2 (19.1 мг) растворили в 3 мл DMF и инкубировали с 1.2 экв HOBT, растворенным в DMF, в течение 15 мин. Затем 1.5 экв. cRGDfK (4.5 мг) растворили в 1 мл DMF и добавили его к раствору pNP-PEG3ooo-Om-St2 Реакцию вели при постоянном перемешивании при комнатной температуре. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Об окончании реакции судили по исчезновению пятна от pNP-PEG3ooo-Orn-St2 в реакционной смеси. По окончании реакции растворитель удаляли на роторном испарителе при 60' С. Далее реакционную массу растворяли в воде и лиофилизовапи.

Полученный продукт cRGDfK-PEG3ooo-Om-St2 выделяли из реакционной смеси двумя методами: методом гель-фильтрации на носителе Sephadex G-25 и диализом (MWCO 12-14,000 Da). Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker. Полученный cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 был охарактеризован с помощью аминокислотного анализа.

Подбор условий присоединения антител к активированному ПЭГ-липидному конъюгату (pNP-PEG-Lipid).

Для подбора оптимальных условий реакции присоединения моноклональных антител использовали коньюгат PNP-PEG3400-DOPE, полученный и охарактеризованный в лаборатории профессора В.П. Торчилина (Северо-Восточный университет, Бостон, США).

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NalICOj буферном растворе добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0. Реакционную смесь инкубировали в течение 24 часов при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колопке Shodcx PROTEIN KW-804 (8.0mm*300mm) (Shodex, Япония) с использованием системы для ВЭЖХ (Hitachi, Япония). Детекцию осуществляли при длине волны 220 нм. Для подбора оптимальных условий реакции исследовали влияние температуры, молярного соотношения белок/pNP-PEG3400-DOPE, рН реакционной среды, влияние концентрации антител и PNP-PEG3400-DOPE на образование целевого продукта - ICO8O-PEG3400-DOPE.

Получение ICOSQ-PEGifm-Orn-Stj.

Антитела IC080 (меченные CF или немеченые), растворенные в 0.1 М NaHCQj

буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 2 мг/мл), добавляли к pNP-PEGjooo-Om-St2, растворенному в 5 мМ Na-цлтратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0. Мольное соотношение 6enoK/pNP-PEG3ooo-Orn-St2 составило 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.8 в течение 24 часов при 4'С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом гель-проникающей хроматографии на колонке Sepharose CL-4B (15.0mm*385mm) (Sigma, США) с использованием системы для детектирования (LKB, Швеция). Детектирование осуществляли при длине волны 220 нм.

Анализ полученного копьюгата ICOSO-PEGswo-OrnSti с помощью флуорескамина.

К 50 мкл исследуемого образца приливали 200 мкл буферного раствора, содержащего 0.1 М №28407* ЮН2О и 0.15 М NaCl, рН 8.3. К полученному раствору добавляли 83.4 мкл раствора флуорескамина в ацетоне (концентрация 3 мг/мл) и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество свободных аминогрупп определяли по интенсивности флюоресценции в диапазоне длин волн испускания (Хи^и,) от 400 нм до 600 нм при длине волны возбуждения (^смют) 390 нм (спектрофлюориметр Сагу Eclipse, Varían, Австралия).

Приготовление липосом.

Липосомы были приготовлены из следующих липидов: PC, Chol, mPEGjooo-DSPE (мольное соотношение липидов составило 2:1:0.15 соответственно) или PC, Chol, mPEG2ooo-DSPE и DOPE-CF (мольное соотношение компонентов 2:1:0.15:0.03). Для этого липидную пленку суспендировали в буферном растворе, содержащем 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, pH 7.4. и озвучивали, затем пропускали последовательно через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 и 100 нм (Nuclepore) посредством мини-экструдера (Avanti Polar Lipids). Размер полученных липосомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размера частиц (Coulter N4+ MD Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, Канада). Общая концентрация липидов составляла приблизительно 11.4 мг/мл, размер полученных частиц был 119±10 нм.

Таблица 1. Липидный состав флюоресцентно меченых пэгилированных липосом.

Лппнд Мол. вес, г/моль Конц., мг/мл Конц., моль/мл % мол.

PC 760.09 7.37 9.7*10"6 63.3%

Chol 386.7 1.88 4.85*10"6 31.6%

mPEGMoo-DSPE 2787.49 2.13 0.764*10"4 5.0%

CF-DOPE 1095.36 0.016 0.015*10"" 0.1%

1 = 11.40 2 = 15.33*10"6

Аналогичным методом получали флюоресцентно меченые липосомы, содержащие PC, Chol, mPEG2ooo-DSPE и DOPE-CF (мольное соотношение компонентов 2:1:0.15:0.03).

Получение ICOSO-илшунолипосом.

Пространственно стабилизированные анти CD5 — иммунолипосомы получали путем встраивания антитело-ПЭГ-липидного коньюгата в липосомы. Для этого эквивалентные объемы реакционной смеси CF-IC080-PEG3ooo-Orn-St2 и предварительно приготовленных пэгилированных липосомы инкубировали в течение ночи при 4'С при постоянном перемешивании. Несвязанные молекулы антител удаляли посредством диализа (диализные мешки, MWCO 300 Юа) против буферного раствора, содержащего 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, pH 7.4 при 4*С при постоянном перемешивании. Удаление свободного белка проверяли методом гель-фильтрации на носителе Sepharose CL-4B. Размер полученных иммунолипосом составил 140± 10 нм.

Аналогичным методом получали флюоресцентно меченые липосомы, содержащие IC080-PEG3ooo-Orn-St2 (липосомы мечены с помощью DOPE-CF).

Определение количества белка, связанного с липосомальной поверхностью.

Количество флюоресцентно меченого белка, связанного с поверхностью липосомы, определяли по интенсивности флюоресценции с помощью спектрофлюориметра Hitachi F-2000 (Hitachi Instruments, Япония) в присутствии тритон Х-100, ширина щели составила 5 им, длины волн возбуждения и испускания соответственно 494 нм и 518 им.

Проверка специфической активности анти CDS-ишгунолипосом методам реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ).

Способность антител, связанных с поверхностью пространственно стабилизированных липосом, специфически связываться с антигеном CD5; проверяли на клеточных линиях MOLT-4, Jurkat, Raji и на клетках периферической крови здоровых доноров по стандартной методике реакции поверхностной иммунофлюоресценции.

Клетки анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).

Непрямая реакция поверхностной шшунофлуоресценции.

Для проведения непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции использовали баранью антисыворотку против иммуноглобулинов мыши, меченную FITC (производство НПЦ «МедБиоСпектр», Москва). Реакцию проводили по стандартной методике. Клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии.

Прямая реакция поверхностной шшунофлуоресценции.

Для проведения прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использованы МКА, меченные карбоксифлюоресцеином (CF). Реакцию проводили по стандартной методике, клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии.

Метод конкурентного связывания.

С целью ингибировать связывание иммунолипосом с клетками, клетки инкубировали в течение 30 мин с избытком немеченых МКА 1С080 (200 мкл). В качестве отрицательного контроля клетки инкубировали в течение 30 минут с 200 мкл МКА анти CD20 (против В-клеточных антигенов). Затем к клеткам добавляли 20 мкл флуоресцентно меченых иммунолипосом и инкубировали 30 мин в темноте при 4'С. После этого клетки дважды отмывали PBS от несвязавшихся антител, ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формалина, и анализировали методом проточной цитофлюориметрии.

Получение липосом, нагруженных доксорубицином.

Для этого приготовили липидную пленку следующего состава: PC:ChoI:mPEG2ooo-DSPE (мольное соотношение липидов составило 2:1:0.15 соответственно) (Табл. 2).

Приготовленную липидную пленку суспендировали в 1 мл буферного раствора, содержащего 250 мМ сульфата аммония (N114)2804, рН 5.5., озвучивали и пропускали через поликарбонатные мембраны.

Таблица 2. Липидный состав немеченых пэгилированных липосом.

Лнпид Мол. вес, г/моль Конц., мг/мл Конц., моль/мл % мол.

PC 760.09 14.74 19.4*10"* 63.35%

Chol 386.7 3.76 9.7* 10"6 31.65%

mPEG2ooo-DSPE 2787.49 4.32 1.55*10"6 5.0%

£ = 22.82 £ = 30.65*10"6

Полученные липосомы диализовапи против раствора, содержащего 150 мМ NaCl. Общая концентрация липидов составляла 22.82 мг/мл, размер полученных частиц был 110±5 им. К 1 мл липосомальной дисперсии (концентрация липидов 22.82 мг/мл) добавляли 1 мл раствора доксорубицина в воде (концентрация 5 мг/мл) из расчета 0.2 мг доксорубицина на 1 мг липидов и инкубировали в течение 1 часа при 60'С. Невключившийся доксорубицин удаляли диализом.

Количество доксорубицина, включившегося в липосомы, определяли по оптической плотности раствора при длине волны 480 нм с помощью спектрофотометра Hitachi U-1500 (Япония) в присутствии 90%-ного изопропанола, содержащего 0.075 М HCl.

Получение 1С080-иммунолипосом (на основе ICO80-PEG-Orn-St3), нагруженных доксорубицином.

Коньюгат ICO80-PEG-Om-St2 встраивали в липосомы, нагруженные доксорубицином согласно методике, описанной выше.

Проверка цитотоксического эффекта 1С080-иммунолиносом, нагруженных доксорубицином, с помощью МТТ-теста на клеточных линиях Jurkat и RajL

Клетки в концентрации 5 х 104 клеток/мл засевали в 96-луночные круглодоиные планшеты и инкубировали с препаратами 24 ч. За 6 час до окончания инкубации в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ (концентрация 5 мг/мл, Sigma, США). По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об/мин в течение 2-3 мин. Супернатант осторожно отбирали, вносили в каждую лунку по 200 мкл ДМСО, клетки ресуспендировали и инкубировали 10 мин при 37°С, после чего

немедленно определяли оптическую плотность раствора формазана с помощью спектрофотометра Titerteck Multiscan МСС/340 (Flow Lab., США) при длине волны 530 нм.

Результаты

Получение лиганд-полиэтилепгликоль-липидного коньюгата.

Получение гидроксиполиэтиленгликоль-№[дистеароил-орнитип].

Традиционный химический синтез липидов и их производных часто представляет

собой трудоемкую задачу, связанную с несколькими стадиями синтеза и очисткой промежуточных соединений. Твердофазный метод синтеза пептидов, предложенный Меррифилдом еще в 1963 году, в настоящее время находит свое примепепие при синтезе других классов органических соединений. Так, группой Сурового АЛО. в 1999 г. был предложен твердофазный метод для полного химического синтеза катионных липидов с целью системного изучения структурно-функциональных связей. При этом варьировались многие параметры, включая гидрофильную, спейсерную, якорную и гидрофобные группировки. На основании этого был разработан простой и оригинальный метод получения полиэтиленгликоль-лнпидного коньюгата твёрдофазным способом на основе орнитина в качестве гидрофильной группировки.

Синтез осуществляли в ручном варианте путём наращивания цепи с С-конца на Tenta Gel PAP смоле (RAPP Polymere). Преимуществом данного метода является простота выделения и очистки получаемого продукта. Наличие полиэтиленгликоля, присоединенного к смоле, делает синтез гидроксиполиэтиленгликоль-//-[дистеароил-орнитин] (HO-PEG-Om-Stz) простым двух стадийным процессом. Первая стадия заключается в последовательном присоединении к смоле орнитина и стеариновой кислоты, а вторая - в снятии готового продукта со смолы. Полученный продукт HO-PEG-Orn-Sti характеризовали методом масс-спектрометрии. Ожидаемая молекулярная масса составила 3679 Да. Молекулярный йон, соответсвующий искомому соединению, являлся доминирующим при масс-спектрометрическом анализе.

Получение п-нитрофенилкарбонил-гидроксиполиэтиленгликоль-№[дистеароил-орнитин].

Активированный РЕОзооо-липидный коньюгат (в данном случае — п-нитрофениловый эфир ПЭГ-липпда) получали обработкой исходного HO-PEG-Orn-Stî 10-ти кратным избытком п-нитрофенилхлорформиата (Рис. 1).

Реакцию вели в присутствии эквивалентного количества триэтиламипа. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем (Silica gel 60 F254, Merck, Germany) до исчезновения исходного реагента в смеси (HO-PEG-Om-Stj),

9

для проявления пластин использовали водный раствор бромфенолового синего и раствор аммиака, который позволяет детектировать рМР-группу. В условиях реакции п-нитрофенилхлорформиат частично гидролизуется с образованием неактивного п-нитрофенола. Тем не менее, использование большого избытка п-нитрофенилхлорформиата позволяет проводить реакцию до конца.

о о

но-РЕО-НН-С-^Н-КН-С/^ЧУЧ/^УХ^ЧА/ р2

2 ii

о

+

О 0 0

II II II

noj -/QVo-c - o-peo-nh-c-^h-nh-c/

fH2

p2

ch.-nh-c' 1 II

o

Рис. 1. Схема реакции получения pNP-PEG-0rn-St2.

Получение nmaHd-PEGma-Orn-Sti

В нашем исследовании в качестве векторных моделей были использованы

моноклональные антитела ICO-80 против антигена CD5 и циклический пептид RGDfK,

направленный к интегриновым рецепторам эндотелиальных клеток сосудов опухоли.

Из литературных данных известно, что антиген CD5 экспрессирован на всех этапах

дифференцировки Т-лимфоцитов. Антиген CD5 найден также на собпопуляции В-клеток.

Известно, что антиген CD5 интернализуется после связывания с антителом. Это может

способствовать проникновению липосомы в клетку и, тем самым, доставке

лекарственного средства во внутриклеточное пространство. Известно, что антиген CD5

экспрессирован на В-лимфоцитах при хроническом В-лимфоцитарном лейкозе и на Т-

лимфоцитах при остром Т-клеточном лейкозе. Таким образом, 1С080-иммунолипосомы,

нагруженные лекарственным препаратом, могут быть использованы при лечении этих

заболеваний.

Известно, что рост опухоли сопровождается образованием новых кровеносных сосудов (ангиогенезом). На поверхности эндотелиальных клеток активированных сосудов среди прочих белков экспрессированы интегрнновые рецепторы оуРз и avPs. Они

обеспечивают адгезию эндотелиальных клеток к внеклеточному матриксу через А^-йу-Авр (КОР) последовательность. Вследствие этого 1ШО-липосомы могут применяться для избирательной доставки лекарственных препаратов к интегриновым рецепторам эндотелиальных клеток сосудов опухоли.

Получение сЯаЦ/К-РЕвзооо-Огп

Пептидил-ПЭГ-липид получали присоединением рЫР-РЕО-Огп^г по Неаминогруппе лизина циклического пептида с1ЮОПС. П-нитрофенильную группу дополнительно активировали гидроксибензотриазолом (Рис. 2). Реакцию вели в N. N -диметилформамиде. Недостатком данной реакции является гидролиз рЫР-РЕО-Огп^г с образованием неактивного НО-РЕО-Огп^г, который проходит одновременно с присоединением лиганда к ПЭГ-липиду. При значении рН среды, близком к нейтральному, скорость гидролиза рЫР-РЕО-Огп^г сопоставима со скоростью аминолиза (присоединения лиганда к ПЭГ-липиду). При щелочных значениях рН реакция протекает преимущественно с образованием лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата, поэтому рН реакционной смеси подтитровывали до значения 8-9 добавлением необходимого количества диизопропилэтиламина. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Об окончании реакции судили по исчезновению пятна от рМР-РЕОзооо-От^г в реакционной смеси. Реакционную смесь анализировали методом ТСХ.

унг

i— чорпс —| +

й Я А

м°г —\( У)—О—с-о-РЕа-кн-с-сн-ин-г

Ц р,

сн.-ин-с'

2 II

о

я я

n11 -с-о-рео-мн-с-с^-мн-с > г-ЯОППС—I

I П рг

СНг^Н-С' 2 II О

Рис. 2. Схема реакции получения с!ЮОЛС-РЕО-Огп-812.

Благодаря наличию липидной составляющей молекулы сИОООС-РЕОзооо-Огп^г способны формировать липидные везикулы в воде, что позволило выделить из реакционной смеси и очистить пептидил-ПЭГ-липидный коньюгат посредством диализа

против воды. В качестве альтернативы cRGDfK-PEGjooo-Orn-Stz был выделен из реакционной смеси при помощи гель-проникающей хроматографии на Sephadex G-25. Выделенный методом диализа и гель-фильтрации продукт cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 был охарактеризован аминокислотным анализом и методом масс-спектрометрии. Молекулярный йон, соответсвукмций искомому соединению, являлся доминирующим при масс-спектрометрическом анализе. Аминокислотный анализ показал, что в исследуемом образце (cRGDfK-PEGjooo-Om-Stj) присутствуют аминокислоты Asp, Gly, Phe, Orn, Lys, Arg в эквивалентных количествах.

Подбор условий присоединения антител к активированному ПЭГ-липидному коньюгату

Одной из особенностей присоединения белков к активированному ПЭГ-липидному коньюгату является необходимость использовать водные буферные растворы для проведения реакции. Применение органических растворителей, таких как N,N-диметилформамид, приведет к нарушению пространственной структуры и потере биологической активности белка.

О

DOPE----СН2СНг0-С-0-<^5> "NOI

+

NHj-Antibody

pH 8.5-9.5 О

[DOPE------CHjCHî-O-C^NH-Antlbody

Рис. 3. Схема реакции присоединения МКАIC080 к PNP-PEG3400-DOPE.

Присоединение МКА IC080 проводили как это представлено на схеме (Рис. 3). Контроль за ходом реакции осуществляли при помощи гель-проникающей ВЭЖХ на колонке Shodex Protein KW-804. Об образовании продукта судили по наличию или отсутствию на хроматограмме пика, выходящего сразу после «свободного» объема колонки (время выхода пика составляло 6 мин.). Подбор условий реакции присоединения антител к активированному ПЭГ-липидному коньюгату и аналитические хроматограммы реакционных смесей приведены в таблице 3.

В результате проведенных экспериментов были подобраны условия реакции присоединения МКА IC080 к PNP-PEG3400-DOPE, а именно:

молярное соотношение PNP-PEG3400-DOPE/ICO8O 40:1;

концентрация PNP-PEG3400-DOPE 2.24 мг/мл;

концентрация IC080 2.0 мг/мл;

рН среды 8.8; температура реакции 4"С.

Таблица 3. Условия проведения реакции присоединения моноклональных антител к pNP-PEG3<oo-DOPE. ___

Концент рация pNP-PEG3400- РЕ (мг/мл) Концен трация ICO-80 (mAb) (мг/мл) Моляр ное соотно шепие pNP-PEG-РЕ/ mAb РН реакцио иной смеси Температ УРаСС) Анализ реакционной смеси методом гель-проникающей ВЭЖХ на колонке Shodex Protein KW-804

0.56 1.0 20:1 8.26 4 1 1:: 1 ^ i

0.56 1.0 20:1 8.26 20 1 ! ;; ( L

1.12 1.0 40:1 8.26 4 1 i: i LL

1.12 1.0 40:1 8.8 4 1 „ ! .. ! .. 1 L

2.24 2.0 40:1 8.8 4 1 1:: . Ц S , i

Получение 1С080-РЕа3ооо-Огп-812.

Моноклональные антитела 1С080 присоединяли к рМР-РЕвзооо-От^г согласно схеме, представленной на рисунке 3. Антитела инкубировали с р№-ПЭГ-липидом (молярное соотношение рМР-ПЭГ-липид/1С080 1:40) при 4'С при постоянном

перемешивании в течение 24 часов. Концентрация рКР-ПЭГ-лшщц и IC080 составила 2.24 мг/мл и 2.0 мг/мл соответственно. Значение pH реакционной смеси - 8.8. Контроль за ходом реакции получения IC080-PEG3ooo-Om-St2 осуществляли при помощи гель-проникающей хроматографии на колонке Sepharose CL-4B.

Анализ количества свободных аминогрупп в молекуле белка до и после конъюгации с pNP-PEG-Orn-St2

Флуорескамин - гетероциклический дион, который вступает в реакцию с первичными аминогруппами с образованием флюоресцирующего продукта. При этом инкубация флуорескамина с аммиаком не приводит к образованию флюоресцирующего продукта. Флюоресценция раствора, содержащего белок и флуорескамин, пропорциональна количеству свободных аминогрупп в молекуле белка.

Было показано, что после связывания антитела с ПЭГ-липидным коньюгатом, количество свободных аминогрупп уменьшается примерно на 17%. При этом инкубация антител с неактивированным ПЭГ-лилидным (HO-PEG-Om-St2) коньюгатом не изменяет количество свободных аминогрупп в молекуле белка. Сами соединения, pNP-PEG-Orn-St2 и HO-PEG-Orn-St2, при инкубации с флуорескамином не образуют продуктов, способных к флюоресценции.

Получение 1С080-нммунолнпосом, нагруженных доксору биципом.

Получение липосом, нагруженных доксорубицином.

Включение доксорубицина в липосомы осуществляли с помощью ионного

градиента сульфата аммония. Для этого к липидной пленке, суспендированной в буферном растворе, содержащем сульфат аммония, добавляли раствора доксорубицина из расчета 0.2 мг доксорубицина на 1 мг липидов и инкубировали в течение 1 часа при 60*С. Температура, до которой необходимо нагревать липосомы для включения лекарственного препарата определяется Тф„ липидов, образующих липосомальную частицу. Температура должна быть выше Тф„. При Т > Тф„ липидный бислой переходит из состояния «геля» в состояние «жидкий кристалл», что облегчает прохождение молекул лекарства через липосомальный бислой. Нейтральная молекула доксорубицина, попав во внутрь липосомы, приобретает положительный заряд и остается там в виде соли — гидрохлорида доксорубицина. Невключившийся в липосомы доксорубицин удаляли диализом.

Количество доксорубицина, включившегося в липосомы, определяли по оптической плотности раствора при длине волны 480 нм. Концентрация доксорубицина в липосомах -1.2 мг/мл, что составляет 95% от теоретически возможного.

Получение 1С080-иммунолипосом и определение количества молекул антител, присоединенных к поверхности одной липосомы.

«Адресные» липосомы могут быть получены либо посредством присоединения лигандов к поверхности липосомы, либо посредством встраивания лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в предварительно приготовленные липосомы. Встраивание лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в лилосомальный бислой делает условия присоединения лиганда к ПЭГ-липидному коньюгату независимыми от условий приготовления липосом и нагрузки лекарственного препарата в липосомы и позволяет оптимизировать отдельно условия этих двух стадий. Кроме того, согласно литературным данным, скорость выхода лекарственного препарата из «адресных» липосом, полученных путем встраивания лиганд-ПЭГ-липидных коньюгатов в предварительно приготовленные липосомы, а также их способность связываться с клетками-мишенями, цитотоксический и терапевтический эффекты сопоставимы с аналогичными параметрами для «адресных» липосом, полученных традиционным присоединением лигандов к липосомальной поверхности.

А

|!Е|_ 1КГ-»ГГ 6Аи551АМ ООТЩВтЮЯ Б щ. тт-игт ед^ин шэтмвипом

100 | 100

80 во

60 60

« « 1 ■

20 - 20 I

0 1 к «" 1,

10 20 50 100 200 500 1К 10 20 50 100 20О 500 1К

0)эт. (пт) -> Сна.и (пт) ■>

КЕ1. У01.-1№Т СЛиЗЭГЛМ отыви-пои

100

80

60

«

20

0 •

10 20 50 100 200 500 1К

1)1эт (пт) ->

КН. УОи-т бАи551АН 015ТЫВ1ЛКЖ

100

80

60

40 .

1

о

10 20 50 100 200 500 1К

01ат (пт)->

Рис. 4. Средний размер частиц и распределение частиц по размерам для немодифицированных липосом (А) и для 1С080-иммунолипосом (Б).

В связи с этим было решено получать анти С05-иммунолипосомы путем встраивания 1С080-ПЭГ-липидного коньюгата в предварительно приготовленные липосомы. Встраивание 1С080-ПЭГ-липидного коньюгата в предварительно приготовленные липосомы проводили посредством простой инкубации мицелл, образованных 1СО80-РЕОз400-ООРЕ, с липосомами.

Размер полученных липосомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размера частиц. Средний размер полученных немодифицированных липосом составил 119±10 нм (Рис. 4), а средний размер 1С080-

иммунолипосом - 126±12 нм. Количество молекул антител, приходящееся на одну липосому, составило 55±5.

Проверка специфической активности 1С080-иммунолнпосом, нагруженных доксорубицином, в системе in vitro

Проверка специфической активности анти CDS-иммунолипосом с помощью реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ).

Для проверки специфической активности антител, связанных с поверхностью

липосом, были использованы клеточные линии MOLT-4 (Т-лимфобласты, острый

лимфобластный лейкоз), Jurkat (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз), Raji (В-

лимфоциты, лимфома Беркитта) и клетки периферической крови здоровых доноров.

1 Cells MOLT4

2 FAM-SL

3 FAM-ICO0O-SL

Рис. 5. Анализ специфического связывания анти CD5- иммунолипосом с клетками MOLT4 методом проточной цитофлюориметрии: 1 — неокрашенные клетки MOLT4, 2 -связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), SL-CF, 3 -связывание с клетками пространственно стабилизированных иммунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к белку), CF-IC080-SL. А — сравнительная гистограммная характеристика, где по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции, по оси ординат — количество клеток. Б - сравнение средней интенсивности флюоресценции.

Обнаружено, что полученные нами иммунолипосомы специфически связываются с CD5+ клетками (Рис. 5,6). На рисунке 5 показаны результаты флюоресцентного окрашивания клеток с помощью иммунолипосом, в которых метка расположена на молекуле белка. На рисунке 6 показано окрашивание клеток иммунолипосомами, у которых флюоресцентная метка присоединена к поверхности липосомы. Специфичность связывания иммунолипосом с клетками проверили методом блокады CDS-рецептора немечеными антителами IC080. Оказалось, что блокирование рецептора препятствует связыванию иммунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином, с клетками (Рис. 7). Кроме того, присутствие избытка немеченых моноклональных антител анти CD20 В-лимфоцитов человека не препятствует связыванию иммунолипосом. Не происходит

связывание с клетками контрольных пэгилированных липосом, не содержащих моноклональные антитела (Рис. 5,6,7).

1 Cells MOLT4

2 FAM-SL

3 IC080-SL-FAM

10° «' юг ю3 ю4

Рис. 6. Анализ специфического связывания анти CD5- иммунолипосом с клетками MOLT4 методом проточной цитофлюориметрии: 1 - неокрашенные клетки MOLT4, 2 -связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), SL-CF, 3 -связывание с клетками пространственно стабилизированных иммунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином (флюоресцентная метка присоединена к липиду), IC080-SL-CF. А - сравнительная гкстограммиая характеристика, где по оси абсцисс -интенсивность флюоресценции, по оси ординат - количество клеток. Б - сравнение средней интенсивности флюоресценции.

Рис. 7. Анализ конкурентного связывания анти С05-иммунолипосом с клетками МОЬТ4 методом проточной цитофлюориметрии: 1 - неокрашенные клетки, 2 -связывание с клетками пространственно стабилизированных иммунолипосом, меченных карбоксифлюоресцеином (СР-1С080-ЗЬ), 3 - связывание флюоресцентно меченых иммунолипосом с клетками в присутствии избытка немечепых антител 1С080, 4 — связывание флюоресцентно меченых иммунолипосом с клетками в присутствии избытка немеченых антител СОЮ, 5 - связывание с клетками пространственно стабилизированных липосом, меченных карбоксифлюоресцеином(СР-ЗЬ).

Анализ способности 1С080-иммунолипосом избирательно связываться с СВ5-антигеном на поверхности лимфоцитов периферической крови здоровых доноров показан на рисунке 8. Среди популяции лимфоцитов периферической крови 65 - 70 % лимфоцитов являются С05+ (Рис. 8 Б). Было показано, что иммунолипосомы связываются с 65 - 70 % лимфоцитов периферической крови донора. В анализируемых образцах периферической крови присутствовало 62,5 % Т-лимфоцитов (Рис. 8 В). На рисунке 8 Г видно, что

иммунолипосомы не связываются с гранулоцитами, что также доказывает селективность связывания 1С080-иммунолипосом с клетками, на поверхности которых экспрессирован антиген CD5.

Рис. 8. Анализ специфического связывания анти CD5- иммунолипосом с клетками периферической крови здоровых доноров методом проточной цитофлюориметрии: А -распределение клеток крови в зависимости от их размера (лимфоциты, моноциты, гранулоциты), Б — гранулоциты, окрашенные флюоресцентно мечеными иммунолипосомами, В - неокрашенные клетки (лимфоциты), Г - лимфоциты, окрашенные CD5F, Д и Е - лимфоциты, окрашенные флюоресцентно мечеными иммунолипосомами.

На рисунке 9 представлен результат специфического окрашивания клеток Jurkat анти С05-иммунолипосомами. Анализ показал, что анти С05-иммунолипосомы связываются с 92 % клеток, при этом МКА CD5F также окрашивали 92 % клеток Jurkat. Полученные данные коррелируют с литературными данными о фенотипе клеточной линии Jurkat.

Б §

s | ¡8

и >§ 8

Ж:

FLt-H

Ж ¡"о

а-'

ю° ю* ю2 ю3

FL1-H

IF

Рис. 9. Анализ специфического связывания анти CD5- иммунолипосом с клетками Jurkat методом проточной цитофлюориметрии: А - неокрашенные клетки, Б - клетки, окрашенные CD5F, В и Г - клетки, окрашенные флюоресцентно мечеными иммунолипосомами.

FL1-H

Рис. 10. Анализ специфического связывания анти CD5- иммунолипосом с клетками Raji методом проточной цитофлюориметрии: А - неокрашенные клетки, Б и В - клетки, окрашенные флюоресцентно мечеными иммунолипосомами.

Способность 1С080-иммунолипосом специфически связываться с CD5+ клетками проверяли на CD5- клеточной линии Raji. На рисунках 10 Б и В видно, что иммунолипосомы не связываются с CD5- клетками Raji, что также доказывает избирательность связывания 1С080-иммунолипосом с клетками, на поверхности которых экспрессирован антиген CD5.

Таким образом с помощью реакции поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) показано, что полученные 1С080-иммунолипосомы селективно связываются с антигеном CD5, экспрессированным на поверхности клеток MOLT4, Jurkat и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. При этом отсутствует связывание иммунолипосом с клетками Raji и гранулоцитами периферической крови здоровых доноров.

Проверка цитотоксического эффекта 1С080-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином, с помощью МТТ-теста на клеточной линии Jurkat

Для оценки способности 1С080-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином, избирательно доставлять лекарственный препарат к клеткам-мишеням, исследуемые образцы инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4 'С. После этого клетки отмывали и оставляли в С02-инкубаторе при 37 'С и 5% ССЬ на 24 ч. Инкубация липосомальных образцов с клетками в течение 1 ч при 4 "С является необходимой и достаточной для специфического связывания антител с антигеном на поверхности клеток-мишеней. В то же время инкубация при 4'С позволяет избежать неспецифического связывания липосом с клетками.

Рис. 11. Цитотоксический эффект лекарственного препарата доксорубицин на клеточной линии ,1игка1. По оси абсцисс - концентрация доксорубицина в образцах, добавленных к клеткам линии .Гигка!, мг/мл; по оси ординат - количество живых клеток, %.

На рисунке 11 представлены результаты МТТ-теста на клеточной линии Jurkat. Как видно из рисунка, цитотоксический эффект, проявленный включенным в IC080-иммунолипосомы доксорубицином, бьш примерно в два раза выше цитотоксического эффекта доксорубицина, включенного в ненаправленные липосомы, но немного меньше цитотоксического эффекта свободного доксорубицина. Таким образом, включенный в иммунолипосомы противоопухолевый препарат доксорубицин обладает большим цитотоксическим эффектом, чем включенный в ненаправленные липосомы доксорубицин. Это объясняется способностью иммунолипосом селективно доставлять лекарственный препарат к клеткам-мишеням. Цитотоксический эффект, наблюдаемый при инкубации клеток с доксорубицином в течение 1 ч при 4"С с последующей отмывкой препарата, оказался сравним с цитотоксическим эффектом пустых липосом и иммунолипосом.

Выводы

1. Разработан оригинальный и простой метод получения полиэтиленгликоль-липидного коньюгата твердофазным способом на основе орнитина в качестве гидрофильной группировки, заключающийся в последовательном присоединении к смоле орнитина и стеариновой кислоты и снятии готового продукта со смолы. Наличие полиэтиленгликоля, присоединенного к смоле, делает синтез гидроксиполиэтиленгликоль-7У-[дистеароил-орнитин] простым двух стадийным процессом. Преимуществом данного метода является простота выделения и очистки получаемого продукта.

2. Подобраны условия (концентрации исходных компонентов, рН среды, температура реакции) получения лиганд-полиэтиленгликоь-липидных коньюгатов для направленной доставки липосом к клеткам-мишеням. Предложенный метод позволил в одну стадию присоединять лнгаиды, содержащие аминогруппы (например, белки или пептиды), к концам цепей полиэтиленгликоля на поверхности липосом, используя его амфифильную производную - п-нитрофенилкарбонил-полиэтиленгликоль-фосфатидилэтаноламин.

3. Предложенный метод позволяет присоединять несколько десятков молекул антител к липосоме диаметром 100 - 200 нм с сохранением их специфической активности. Этот метод применим не только для присоединения белков и пептидов к полиэтиленгликоль-липиду, но и лигандов другой природы, нерастворимых в водной среде, с целью получения «адресных» полиэтиленгликоль-липидных коньюгатов.

4. Сконструированы иммунолипосомы, содержащие на дистальных концах цепей полиэтиленгликоля моноклональные антитела IC080, направленные против антигена CD5. 1С080-иммунолипосомы селективно связываются с CD5+ клеточными линиями MOLT4, Jurkat и Т-лимфоцитами периферической крови здоровых доноров, но не

связываются с В-клеточной линией Raji и гранулоцитами. Коньюгация антител с липидом не повлияла на их способность специфически связываться с CD5+ клетками. 5. 1С080-иммунолипосомы, нагруженные доксорубицином (концентрация доксорубицина 1.2 мг/мл), обладают большим цитотоксическим эффектом при тестировании на CD5+ клеточной линии Jurkat, чем нагруженные доксорубицином ненаправленные липосомы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кортава М.А., Палкина Т.Н., Толчева Е.В., Заботина Т.Н., Полозкова А.П., Орлова O.JI., Шпрах З.С., Суровой А.Ю., Барышников А.Ю. (2003) Подходы к созданию иммунолипосом на примере доксорубицина. Российский Биотерапевтический Журнал, Т.2, №1, С.6.

2. Стойлова Т.Б., Толчева Е.В., Егорова Н.С., Суровой А.Ю. (2003) Пэгилирование пептидов и липидов. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов: Тезисы стендовых сообщений, С.96.

3. Толчева Е.В., Кортава М.А., Палкина Т.Н., Егорова Н.С., Стойлова Т.Б.,Суровой А.Ю., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. (2005) Анти CD5 - иммунолипосомы: модификация пэгилированных липосом отечественными моноклональными антителами ICO-80. Российский Биотерапевтический Журнал, Т. 4, № 1, С.19.

4. Толчева Е.В., Барышников А.Ю., Оборотова Н.А., Кортава М.А., Барышников К.А., Монгайт Д, Левченко Т.С., Торчилин В.П. (2005) Анти CD5-иммунолипосомы как транспортная система для направленной доставки лекарственных препаратов к CD5+ клеткам. Российский Биотерапевтический Журнал, Т.4, №4, С.38-43.

5. Толчева Е.В., Оборотова Н.А. (2006) Липосомы как транспортное средство для доставки биологически активных молекул. Российский Биотерапевтический Журнал, Т.5, №1, С.54-61.

6. Sawant R.M., Hurley J.P., Salmaso S., Kale A., Tolcheva E., Levchenko T.S., Torchilin V.P. (2006) «Smart» drug delivery systems: double-targeted pH responsive pharmaceutical nanocarriers. Bioconjugate Chemistry, V. 17, P. 943-949.

Подписано в печать 02.03.07 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 149 . Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохииа РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы

Известно, что лекарственные препараты, применяемые в традиционных формах, лишь ограниченно и медленно проникают в клетки через барьер биологических мембран, а после попадания в организм нередко разрушаются за счет действия различных защитных систем, что уменьшает желаемый терапевтический эффект. Эти проблемы в ряде случаев затрудняют применение или же делают невозможным медицинское применение многих весьма эффективных препаратов.

Основной задачей экспериментальной и клинической химиотерапии является доставка лекарственного препарата как можно ближе к опухолевой клетке. Оптимальным вариантом является доставка лекарства внутрь клетки опухоли. Еще в конце XIX века немецкий бактериолог Пауль Эрлих предложил термин "волшебная пуля", подразумевающий химиопрепарат, который находит в организме и избирательно убивает клетки-мишени без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели является разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевых препаратов.

Использование липосом для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов - цитостатиков является одним из перспективных направлений в медицине. Применение цитостатиков для лечения онкологических больных часто сопровождается токсическими осложнениями, обусловленными поражением быстро обновляющихся, с высоким темпом пролиферации клеток кроветворных и иммунокомпетентпых органов (в первую очередь костного мозга, эпителия желудочно-кишечного тракта, сердечной мышцы, почек и др.). Кроме того, малое непосредственное влияние на опухолевый рост также ограничивает использование цитостатиков в свободном виде. Данные, накопленные 3 специалистами за последние годы подтверждают способность липосом транспортировать лекарственное средство, снижать его токсическое действие, увеличивать терапевтический эффект [5;7].

Для обеспечения направленного транспорта липосом к клеткам-мишеням было предложено модифицировать поверхность липосом различными лигандами, способными специфически связываться с антигенами или рецепторами на поверхности клетки. Выбор лиганда зависит от антигена/рецептора, экспрессированного на поверхности клетки, куда необходимо доставить липосомы. В качестве векторных молекул могут выступать, например, моноклональные антитела (МКА) или их фрагменты (Fab'-фрагменты МКА), пептиды, факторы роста, углеводы, гликопротеины, лиганды к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней и др. Липосомы, к поверхности которых присоединены МКА или Fab'-фрагменты МКА, назвали иммунолипосомами [19].

На протяжении последних 20 лет не ослабевал интерес ученых к липосомальным системам доставки лекарственных препаратов, что позволило добиться значительных успехов в этой области науки. На сегодняшний день известен целый ряд «адресных» липосомальных систем доставки, способных специфически связываться с антигеном/рецептором на поверхности клетки-мишени. Так, например, были получены иммунолипосомы, избирательно действующие, на клетки головного мозга [60], легкого [67], молочной железы [63], ВИЧ-инфицированные клетки [54;83;84], клетки иммунной системы [46], а также на другие клетки-мишени. Однако, ни один лекарственный препарат на основе иммунолипосом или других «адресных» липосом не разрешен еще для клинических испытаний.

Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе иммунолипосом является стратегически важным, поскольку это позволит решить многие задачи, связанные с направленной доставкой лекарственных веществ. Хотя иммунолипосомы - это сложная биохимическая система, создание и разработка которой требует участия специалистов из многих областей науки, есть надежда, что иммунолипосомы займут достойное место среди лекарственных препаратов.

Цель исследования

Целью исследования являлось создание конструкции иммунолипосомы и изучение иммунолипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин.

Задачи исследования

1. Разработать методику получения активированного ПЭГ-липидного коньюгата.

2. Подобрать условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату.

3. Получить 1С080-иммунолипосомы и проверить их специфическую активность в системе in vitro.

4. Получить иммунолипосомальную форму доксорубицина, а также проверить иммунологическую специфичность и цитотоксическую активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Научная новизна исследования

Разработана методика получения активированного полиэтиленгликольлипидного коньюгата. Подобраны условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело IC080) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату. Отработана методика получения 1С080-иммунолипосом и проверена их специфическая активность в системе in vitro. Отработана методика получения иммунолипосомальной формы доксорубицина. Проведено тестирование иммунологической специфичности и цитотоксической активности полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.

Практическая значимость исследования

Разработанная технология получения «адресных» липосом на основе пнитрофенилкарбонил-ПЭГ-липидного коньюгата является универсальной для любых лигандов, содержащих аминогруппу. Получение «адресных» липосом путем встраивания лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в липосомальный бислой дает возможность встраивать множество различных лиганд-ПЭГ-липидных коньюгатов в предварительно приготовленные липосомы, содержащие различные лекарственные препараты. Этот метод не требует разработки отдельной технологии производства направленных липосом для каждого из множества лигандов в сочетании с лекарственным препаратом.

Часть I. Обзор литературы

Выводы

1. Разработан простой метод получения полиэтиленгликоль-липидного коньюгата твердофазным методом на основе орнитина в качестве гидрофильной группировки.

2. Подобраны условия присоединения моноклональных антител IC080 к активированному ПЭГ-липидному коньюгату в водном буферном растворе: молярное соотношение pNP-PEG-Lipid/IC080 40:1; концентрация pNP-PEG-Lipid 2.24 мг/мл; концентрация IC080 2.0 мг/мл; рН среды 8.8; температура реакции 4°С.

3. Показана возможность присоединения нерастворимых в водной среде лигандов на примере циклического RGD-содержащего пептида. Подобранные условия проведения реакции в органическом растворителе: молярное соотношение pNP-PEG-Lipid/cRGDfK 1:1.5; концентрация pNP-PEG-Lipid 6.4 мг/мл; концентрация cRGDfK 4.5 мг/мл; рН среды 9.0; температура реакции 20°С; применимы не только к пептидам, но и к лигандам другой природы, нерастворимым в водной среде.

4. Получены иммунолипосомы, содержащие на дистальных концах цепей полиэтиленгликоля, моноклональные антитела IC080, направленные против антигена CD5:

Мольное соотношение липидов PC : Choi: mPEG2ooo-DSPE 2:1:0.15 Общая концентрация липидов (моль/л) 15.31x10-6

Средний размер частиц (нм) 126 ± 12

Концентрация белка (мг/мл) 0.3

Количество молекул антител, приходящееся на одну липосому 55 ± 5 Специфическая активность полученных 1С080-иммунолипосом проверена в системе in vitro на клеточных линиях MOLT4, Jurkat, Raji и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

5. Получены 1С080-иммунолипосомы, нагруженные доксорубицином (концентрация доксорубицина 1.2 мг/мл). Цитотоксическая активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина проверена в системе in vitro на клеточных линиях Jurkat и Raji. Показано, что включенный в иммунолипосомы доксорубицин обладает большим цитотоксическим эффектом, чем включенный в ненаправленные липосомы доксорубицин.

Заключение.

На сегодняшний день ряд лекарственных препаратов в составе «классических» и пэгилированных липосом применяется в клинике. Первоначальный успех, достигнутый в работе с липосомальными формами различных лекарственных препаратов, послужил толчком для дальнейших научных исследований. Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе «адресных» липосом является стратегически важным, поскольку это позволило бы решить многие задачи, связанные с направленной доставкой биологически активных молекул. Известно, что до сих пор в клинике нет ни одного препарата на основе иммунолипосом. Это может быть связано как с трудностями промышленного получения таких препаратов, с условиями их хранения так и с множеством других причин. В связи с этим разработка простых и универсальных методов присоединения лигандов различной природы к поверхности липосом или к ПЭГ-липиду представляет практический интерес. Таким образом, развитие липидных систем доставки связано с разработкой простых методов получения лиганд-ПЭГ-липидных коньгатов и с поиском новых лигандов.

Согласно литературным данным, присоединение лиганда к поверхности липосомы осуществляется посредством одной из трех реакций, которые являются достаточно эффективными и избирательными. Это реакция между активированными карбоксильными группами и аминогруппами, в результате которой образуется амидная связь; реакция между пиридилдитиолами и тиолами, в результате чего образуются дисульфидные связи; и реакция между малеимидными производными и тиолами, в результате которой формируются тиоэфирные связи [63]. Также существуют другие подходы, например, образование карбаматной связи посредством реакции между п-нитрофенилкарбонильной группой и аминогруппой [147]. Кроме того, для присоединения лигандов к липосомальной поверхности может быть использован метод нековалентного связывания - через образование комплекса биотин - авидин/стрептавидин [127]. Методы ковалентного присоединения, не требующие предварительной модификации лиганда, являются предпочтительными, так как значительно упрощают процесс получения «адресных» липосом, делая его одностадийным. К таким методам относится присоединение лиганда, содержащего NH2-rpynny, к п-нитрофениловому эфиру ПЭГ-липидного коньюгата или к цианурхлоридной производной ПЭГ-липидного коньюгата.

Однако конечный выбор метода присоединения определяется молекулярными особенностями лиганда.

Вторым, не менее важным аспектом получения «адресных» липосом является выбор лиганда. Известно, что в качестве векторных молекул, направляющих липосомы к клеткам-мишеням, могут выступать: ♦♦♦ молекулы антител ♦♦♦ Fab'-фрагменты молекул антител ♦♦♦ пептиды ❖ углеводы ♦♦♦ гликопротеины лиганды к рецепторам на поверхности клеток-мишеней, то есть, по существу, любая молекула, способная специфически распознавать и связываться с антигеном или рецептором на поверхности клетки-мишени. Выбор лиганда определяется местом назначения лекарственного препарата или другой биологически активной молекулы, включенной в липосому и полностью зависит от цели работы.

Часть II. Собственные исследования Глава 1. Материалы и методы исследования.

1.1. Материалы.

L-a-фосфатидилхолин (PC, egg, chicken) (Avanti Polar Lipids), холестерин (Choi) (Sigma), 1,2-дистеароил-зп-глицеро-3фосфатидилэтаноламин-Л'-[метокси(полиэтиленгликоль) (MW 2000)] (mPEG2ooo-DSPE) (Avanti Polar Lipids), доксорубицин (Sigma, USA), флуорескамин (Sigma, USA), сукцинимидный эфир 5-(и-6)-карбоксифлюоресцеина (Carboxyfluorescein, succinimidyl ester) (CF) (Molecular Probes, USA), 1,2-диолеоил-5п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-ЛЦкарбоксифлюоресцеин) (DOPE-CF) (Avanti Polar Lipids), 1,2-диолеоил-5п-глицеро-З-фосфатидилэтаноламин-Л^п-нитрофенилкарбонил (полиэтиленгликоль (MW 3400)] (pNP-PEG3400-DOPE) (Northeastern University, Boston, MA, USA), смола Tenta Gel PAP (RAPP Polymere, Germany), diFmoc-Orn (Calbiochem-Novabiochem, Germany), стеариновая кислота (Sigma, USA), iV-гидроксибензотриазол (Calbiochem-Novabiochem, Germany), диизопропилкарбодиимид (Fluka, USA), диметилформамид (Химмед, РФ), диметилсульфоксид (Sigma, USA), п-нитрофенилхлорформиат (Fluka, USA), триэтиламин (Fluka, USA), хлороформ (Химмед, РФ), дихлорметан (Химмед, РФ), трифторуксусная кислота (Fluka, USA), триметилбромсилан (Fluka, USA), диэтиловый эфир (Химмед, РФ), хлорид натрия (Химмед, РФ), хлорид калия (Химмед, РФ), натрий фосфорнокислый дизамещенный (Химмед, РФ), калий фосфорнокислый монозамещенный (Химмед, РФ), натрия цитрат (Химмед, РФ), iV-[2-hydroxy-ethyl]piperazine-./V-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) (Sigma, USA), циклический пептид cRGDfK (лаборатория Химии пептидов, ИБХ РАН, РФ), моноклональные антитела ICO-80 (анти CD5) (НПЦ МедБиоСпектр, РФ), моноклональные антитела анти CD20 (IC0180) (НПЦ «МедБиоСпектр», РФ), клеточная линия MOLT-4 (Т-лимфобласты, острый лимфобластный лейкоз) (American Type Culture Collection, Manassas, VA), клеточная линия Jurkat (Т-лимфобласты, острый

43 лимфобластный лейкоз) (ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН), клеточная линия Raji (В-лимфоциты, лимфома Беркитта) (ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН).

1.2. Методы.

1.2.1. Получение HO-PEG-Orn-St2.

1.2.1.1. Присоединение От и St. Acid к Tenia Gel PAP смоле (RAPP Polymere).

HO-PEG-Orn-St2 синтезировали твердофазным методом в ручном варианте путём наращивания цепи с С-конца на Tenta Gel PAP смоле (RAPP Polymere), нагрузка составила 0.22 ммоль/г. Для временной защиты а- и £-ЫН2-группы аминокислоты использовали флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc). Аминокислоту diFmoc-Orn и стеариновую кислоту присоединяли последовательно к полимеру через образование бензо-триазолового эфира в присутствии карбодиимида. Для активации 1 экв. аминокислоты использовали 1,2 экв. HOBt и 1 экв. DIC.

Для присоединения аминокислоты к смоле 5 экв (по отношению к количеству активных групп на смоле) Fmoc-защищённой аминокислоты растворили в 3 мл DMF и инкубировали с НОВТ в DMF в течение 15-30 мин для активации карбоксильной группы diFmoc-Orn. Смолу Tenta Gel PAP (1 г, 0.22 ммоль активных групп на смоле) инкубировали в DMF в течение 1 часа для набухания, затем инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2x30 мин. и промывали DMF 8><5 мин. Затем к смоле добавляли раствор активированной Fmoc-аминокислоты в DMF, раствор рН-зависимого индикатора бромфенолового синего в DMSO, DIC. Содержание непрореагировавших аминогрупп контролировали визуально по окрашиванию рН-зависимого индикатора бромфенолового синего (добавляли из расчета на 1000 моль NH2-rpynn - 1 моль индикатора). Конденсация проходила в течение ночи. Желтое окрашивание индикатора свидетельствовало об отсутствии свободных NH2-rpynn и о завершении реакции. Далее смолу промывали DMF 8x5 мин. и инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2x30 мин. (для снятия защитных Fmoc-групп с Огп), после чего смолу снова промывали DMF 8х5 мин.

Для последующего присоединения 10 экв стеариновой кислоты (из расчета 5 экв кислоты на каждую NH2-rpynny смолы) растворили в 4 мл DMF и инкубировали с НОВТ в DMF в течение 15-30 мин для активации карбоксильной группы. После этого к смоле добавляли раствор активированной стеариновой кислоты, раствор рН-зависимого индикатора бромфенолового синего в DMSO, DIC. Конденсацию вели при комнатной температуре в течение 5-7 часов. Далее смолу промывали DMF 8Х5 мин. и инкубировали в 50% растворе пиперидина в DMF 2><30 мин. (для полного удаления индикатора бромфенолового синего), после чего смолу снова промывали DMF 10x5 мин. и 8x5 мин. ЕЮН. Смолу высушивали под вакуумом, следы растворителя удаляли с помощью лиофильной сушки.

1.2.1.2. Отщепление HO-PEG-Orn-St2 от смолы Tenta Gel PAP.

Отщепление HO-PEG-Orn-St2 от смолы проводили TFA, содержащей 1 % TMBS, в течение 2 часов (из расчета 5 мл смеси на 1 г смолы). HO-PEG-Orn-St2 отфильтровывали от смолы, смолу промывали 5 мл TFA, содержащей 1% TMBS, и 10 мл TFA (100%) или DCM 2x3 мин, слив собирали. Растворитель частично удаляли на роторном испарителе и высаживали продукт охлаждённым диэтиловым эфиром (из расчёта 10-12-кратного избытка эфира по объёму), отфильтровывали и промывали 2 раза эфиром для удаления остатков TFA. Растворитель удаляли под вакуумом, для полного удаления диэтилового эфира использовали лиофильную сушку. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

1.2.2. ПолучениеpNP-PEG-Orn-St2.

Для получения pNP-PEG3ooo-Orn-St21 экв HO-PEG-Orn-St2 растворили в безводном хлороформе (из расчета 1 мл на 75 мг), к которому добавили 4 экв п-нитрофенилхлорформиата, растворенного в безводном хлороформе (из расчета 0.4 мл на 16 мг), и 4 экв триэтиламина. Реакцию вели во льду при постоянном перемешивании. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Продукт реакции высаживали из реакционной смеси охлаждённым диэтиловым эфиром (из расчёта 10-12-кратного избытка эфира по объёму) и промывали 2 раза эфиром для удаления п-нитрофенилхлорформиата. Растворитель удаляли под вакуумом. Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

1.2.3. Получение cRGDfK-PEG30oo-Orn-St2.

Циклический пептид cRGDfK был получен в группе А.Ю. Сурового (лаборатория Химии пептидов, ИБХ РАН). Полученный пептид был охарактеризован методом HPLC и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker.

Для получения cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 1 экв pNP-PEG3ooo-Om-St2 (19.1 мг) растворили в 3 мл DMF и инкубировали с 1.2 экв НОВТ, растворенным в DMF, в течение 15 мин. Затем 1.5 экв. cRGDfK (4.5 мг) растворили в 1 мл DMF и добавили его к раствору pNP-PEG3000-Om-St2. Реакцию вели при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Контролировали рН реакционной смеси с помощью универсальной индикаторной бумаги, рН подводили диизопропилэтиламином до значения 8-9. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2. Об окончании реакции судили по исчезновению пятна от pNP-PEG3ooo-Orn-St2 в реакционной смеси. По окончании реакции растворитель удаляли на роторном испарителе при 60° С. Далее реакционную массу растворяли в воде и лиофилизовали.

Полученный продукт cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 выделяли из реакционной смеси двумя методами: методом гель-фильтрации на носителе Sephadex G-25 и диализом. Для выделения продукта лиофилизованную реакционную смесь растворили в 2 мл воды и разделили на две части. При хроматографическом разделении реакционной смеси (для этого к 1 мл реакционной смеси добавили 1 мл 0.2 М СН3СООН) элюцию вели 0.1 М СН3СООН со скоростью 1.3 мл/мин, объем колонки составил 171.5 мл. Собранные фракции анализировали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии. cRGDfK-PEG3ooo-Oni-St2 элюировался сразу после свободного объема колонки. Фракцию, содержащую cRGDfK-PEGjooo-Orn-St2, лиофилизовали.

При выделении продукта реакции методом диализа к 1 мл реакционной смеси добавили 1 мл буферного раствора, содержащего 10 мМ Hepes и 280 mM NaCl, рН 7.4, и поместили в диализный мешок (MWCO 12-14,000 Da). Реакционную смесь диализовали против Н20, при этом из реакционной смеси был удален непрореагировавший пептид cRGDfK и другие низкомолекулярные компоненты смеси. Чистоту выделенного cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 контролировали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии. Очищенный продукт лиофилизовали.

Качество полученного продукта оценивали методом ТСХ в системе Х:М:У = 90:18:2 и масс-спектрометрии на установке Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker. Полученный cRGDfK-PEG3ooo-Orn-St2 был охарактеризован с помощью аминокислотного анализа.

1.2.4. Гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Гель-проникающая ВЭЖХ проводилась на колонке Shodex PROTEIN KW-804 (8.0mm*300mm) (Shodex, Япония) с использованием системы для ВЭЖХ (Hitachi, Япония). Условия проведения анализов: буферный раствор А - 100 мМ ЫаНгРОд буферный раствор, содержащий 150 мМ Na2S04, рН 7.0; буферный раствор Б - деионизованная Н20. Колонку промывали буферным раствором Б, уравновешивали буферным растворм А. Элюцию проводили буферным растворм А. Скорость элюции 1.0 мл/мин. Детекцию осуществляли при длине волны 220 нм.

1.2.5. Подбор условий присоединения антител к активированному ПЭГ-липидному коньюгату (pNP-PEG-Lipid).

Для подбора оптимальных условий реакции присоединения моноклональных антител использовали коньюгат pNP-PEG3400-DOPE, полученный и охарактеризованный в лаборатории профессора Торчилина В.П. (Северо-Восточный университет, Бостон, штат Массачусетс, США).

1.2.5.1. Влияние температуры.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHCCb буферном растворе, рН 8.3 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 0.56 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE 1:20. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 в течение 24 часов при 4°С и при 20°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.2. Влияние молярного соотношения белок/рИР-РЕОзмгВОРЕ. Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 8.3 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к pNP-PEG34oo-DOPE, растворенному в 5 мМ Ыа-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE составило 1:20 и 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.3. Влияние рН реакционной среды.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация pNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл). Мольное соотношение белок/pNP-PEG3400-DOPE 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.2 и 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.5.4. Влияние концентрации антител иpNP-PEG^oo-DOPE.

Моноклональные антитела IC080, растворенные в 0.1 М ЫаНСОз буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 составила 1.0 мг/мл и 2.0 мг/мл), добавляли к PNP-PEG3400-DOPE, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0 (концентрация PNP-PEG3400-DOPE составила 1.12 мг/мл и 2.24 мг/мл соответственно). Мольное соотношение белок/р№>-РЕОз4оо-ООРЕ 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2.6. Получение IC08()-PEG3m-D0PE.

Антитела IC080 (меченные CF или немеченые), растворенные в 0.1 М NaHC03 буферном растворе, рН 9.0 (концентрация IC080 2 мг/мл), добавляли к pNP-PEG3ooo-Orn-St2, растворенному в 5 мМ Na-цитратном буферном растворе, содержащем 150 мМ NaCl, рН 5.0. Мольное соотношение белок/р№-РЕОз4оо-ООРЕ составило 1:40. Реакционную смесь инкубировали при рН 8.8 в течение 24 часов при 4°С при постоянном перемешивании. Образование продукта контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

I.2.7. Приготовление липосом.

Липосомы были приготовлены из следующих липидов: PC, Choi, mPEG2ooo-DSPE (мольное соотношение липидов составило 2:1:0.15 соответственно). Для этого в круглодонной колбе готовили смесь из растворенных в хлороформе липидов согласно протоколу (Табл. 3, 4), растворитель удаляли на роторном испарителе. Полученную липидную пленку суспендировали в буферном растворе, содержащем 5 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, рН 7.4. и озвучивали в течение 20 минут при слабом нагревании, затем пропускали последовательно через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 и 100 нм (Nuclepore) посредством мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) [22]. Размер полученных липосомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размера частиц (Coulter N4+ MD Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, Канада). Общая концентрация липидов составляла приблизительно

II.4 мг/мл, размер полученных частиц был 119±10 нм.