Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина

На правах рукописи

шг-

004608135

Тазина Елизавета Владимировна

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА

14.04.01 - технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

4 КЮН 2910

Москва-2010

004608135

Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опух>. Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологичес научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН).

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Оборотова Наталия Александровна Барышников Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна Саканян Елена Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских i Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова РАМ]

Защита диссертации состоится « 2Д » (ЯЛ^Ч-О— 2010 г. в \ 4 часо заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Mockobi медицинская академия имени И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 121 г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицине библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 117 г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « 20 » ¿о-Ф—Х- 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

ш

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, в состав которых входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени.

С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина актуальны исследования по созданию термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °С. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с нагревом токами сверхвысокой частоты (СВЧ-нагревом) - I-II фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы.

В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН совместно с МИТХТ им. М.ВЛомоносова разработана модель термолипосомального доксорубицина, однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы. Данная работа посвящена оптимизации состава, технологии производства и разработке методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Цель и задачи исследования. Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.

2. Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.

/

3. Подобрать криопротекгор, разработать режим лиофилизацш термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат i количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологически: исследований.

4. Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом < доксорубицином.

5. Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизации и изучить стабильность в процессе хранения.

6. Провести оценку биологической активности лиофилизированноп термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro i in vivo.

Научная новизна исследования. Разработан состав и технология производств лиофилизированного термолипосомального доксорубицина. Изучено влияни различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до i после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры -18 °С Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Разработан! методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомальног доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубици термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг> Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одног года при температуре -18 °С. В биологических экспериментах показано, чт термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладав большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Создан новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивног противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vrv выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцие доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведен стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат да приготовления раствора для инъекций 0,7 мг».

В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы не производятс: Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для леченк онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого Kpyi отечественных пациентов, повысив тем самым лекарственную безопасность страны.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные форм лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионально: образования провизоров.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (2426 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 1719 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (25 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).

Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.

Положения, выносимые на защиту:

1. Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.

2. Методики химико-фармацевтического анализа: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.

3. Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре -18 °С.

4. Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результате! собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы i приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержа 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, : том числе 278 - на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований 1. Получение термолипосом с инкапсулированным доксорубицином (Докс-ТЛ)

В результате проведенных экспериментов разработаны следующие прописи Докс-TJI:

Пропись 1 на 40 мл:

Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)

Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC)

Дистеароилфосфатидклэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) Холестерин (Chol)

105,28 мг

12,60 мг

0,90 мг 1,24 мг

Пропись 2 на 40 мл:

Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)

Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC)

Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) Холестерин (Chol) я-токоферола ацетат (g-TA)

S липидов 120 мг

103,98 мг

12,44 мг

0,88 мг

1,22 мг 1,48 мг

£ липидов 120 мг

Доксорубицин 16 мг Доксорубицин 16 мг

Молярные соотношения компонентов термолипосомальной мембраны: Пропись 1 - DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 = 9 :1:0,2 : 0,02; Пропись 2 - DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 : a-TA = 9 :1 : 0,2 :0,02 :0,2. Весовое соотношение препарат: суммарные липиды составляло 0,13 :1.

Для получения пустых термолипосом (TJI) использовали метод обращения фаз. Липиды (1,2-дипальмитоил-.го-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-.$л-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), Lipoid GmbH, Германия), 1,2-дистеароил-5л-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль (DSPE-PEG-2000) и холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США) растворяли в хлороформе. В случае прописи 2 с целью предотвращения окисления липидов добавляли а-токоферола ацетат. Органический растворитель упаривали под вакуумом до образования липидной пленки. Высушенную липидную пленку гидратировали раствором сульфата аммония при постоянном перемешивании и нагревании до 50 °С. Образовавшуюся дисперсию мультиламеллярных везикул (МЛВ) экструдировали через поликарбонатные мембраны Nuclepore (Whatman, Великобритания) с размером пор 200 нм при температуре 50 °С с помощью мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США).

Доксорубицин (Доке), ОАО ОНОПБ (Россия) загружали в TJI против градиента сульфата аммония. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при двадцатикратном разбавлении термолипосомальной дисперсии 10 мМ буфером HEPES (К-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота), AppliChem GmbH (Германия) с криопротектором - 4 % сахарозой (рН 8,4).

Свежеприготовленную дисперсию Докс-TJI подвергали стерилизующей фильтрации под давлением через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм (Pall Corporation, США). Для стабилизации Докс-TJI проводили их сублимационную сушку. Анализ среднего диаметра везикул и оценку их распределения по размерам проводили с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).

3 2,5 2 1 /! 1 ■ 1 — 10 мМ буфер НЕРЕв с 4 % сахарозой (рН 8,4) ~ ~ ТЛ, разбавленные водой .....................ТЛ, разбавленные 10 мМ буфером НЕРЕв с 4 % сахарозой (рН 8,4) ^"■Дисперсия термолипосомального Доке

О 1,5 • ■ ■ '¡1

1 - , 1 1

0,5 п 1 ■ 2 3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Время, с

Рис. 1. Гель-фильтрация образцов пустых ТЛ, 10 мМ буфера HEPES с 4 % сахарозой и

Докс-ТЛ.

Термолипосомальную дисперсию Доке очищали от не включившегося в везикулы препарата методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации) с целью количественного определения содержания цитостатика в дисперсии и оценки эффективности его инкапсулирования в TJI. На хроматшрафическую колонку С 10/20, заполненную сефадексом G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция), наносили 1 мл дисперсии Докс-TJI. В качестве элюента использовали 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции составляла 0,3-0,4 мл/мин. Процесс очистки контролировали с

помощью детектора UVis-920 и рекордера REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), фиксировавшего разделение в виде пиков. На выходе из колонки получали три фракции (рис. 1): I фракция - очищенный термолипосомальный Доке (первый пик на рис. 1), II фракция - буфер HEPES с 4 % сахарозой (второй пик на рис. 1); III фракция - не включившийся в везикулы Доке (третий пик на рис. 1). Видно, что термолипосомальный Доке начинал сходить через 16-20 мин после нанесения на колонку, 10 мМ буфер HEPES с 4 % сахарозой выходил спустя 39-42 мин, а не включившийся в везикулы Доке - через 59-60 мин. Процесс гель-фильтрации термолипосомального Доке в целом занимал около 1 ч 30 мин-1 ч 40 мин.

2. Количественный анализ Докс-TJI

Содержание Доке в ТЛ определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (PCO) Доке при длине волны 252 ± 2 нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов Докс-TJI и PCO Доке проводили относительно 95 % этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.

Содержание Доке (X, мг) рассчитывали по формуле: '-о

где D - оптическая плотность раствора образца; Д, - оптическая плотность PCO Доке; С - величина разбавления образца; С„ - величина разбавления PCO Доке; а - навесю PCO Доке, мг.

Эффективность включения Доке в TJI (В, %) вычисляли по формуле:

D, • Q • V,

В= D • С • V 100% (2)'

где D, - оптическая плотность раствора фракции с очищенным термолипосомальньп Доке; D - оптическая плотность раствора исходной термолипосомальной дисперсиг С, - величина разбавления фракции с очищенным термолипосомальным Доке; С величина разбавления исходной термолипосомальной дисперсии; Vj - объем фракции очищенным термолипосомальным Доке, мл; V - объем исходной термолипосомально дисперсии, нанесенной на колонку, мл.

3. Изучение противоопухолевой активности Докс-TJI in vitro и in vivo

Изучение биологической активности свободного Доке и Докс-ТЛ проводили i культурах клеток меланомы В-16 мышей и V-79 китайского хомячка. Критериям активности служили снижение скорости роста клеток (оценка - по степени конверси красителя АламарБлю, который при метаболизме в клетках меняет цвет с синего i красный) и степень сохранения ими способности к неограниченному делени

(образованию макроколоний, рассматриваемому как критерий выживаемости клеток). Препараты вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 115 мкг/мл Доке, а в суспензию клеток V-79 китайского хомячка — в дозе 10 мкг/мл Доке. Клетки с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °С или 42,5 °С.

Исследования in vivo проводили на меланоме В-16 и солидной карциноме Эрлиха линии ELD, привитых мышам в мышцу голени за 8 дней до начала эксперимента. В день опыта диаметр растущей опухоли голени составлял 7-9 мм. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных, контрольная - из 8-10 животных. Свободный Доке и Докс-TJI вводили мышам в ретроорбитальный синус из расчета 9 мг/кг Доке и 4,5 мг/кг Доке. Локальную гипертермию (ГТ) голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате и начинали через 20 мин после введения животным препаратов в случае меланомы В-16, а в случае карциномы Эрлиха - через 10-12 мин, 15-20 мин и 3540 мин после введения препаратов. Продолжительность ГТ составляла 30 мин при 43 °С. Наблюдение за животными состояло в измерении габаритных размеров опухолей, которое проводили трижды в неделю в течение нескольких недель после лечения, и фиксации момента гибели животных. Динамику роста опухоли в разных группах животных рассчитывали как отношение средних габаритных объемов опухоли в день измерения (Vt) к объемам в день начала эксперимента (V„).

Критерием оценки противоопухолевой активности препаратов служило торможение роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывали по формуле:

V - V

_____контроля 1 опыта _„„

ТРО % =----100 % (3),

контроля

где V - средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах соответственно, на конкретный срок.

Выживаемость животных (Sa, %) в каждой группе вычисляли по формуле:

Nd

SA=-rr--100% (4),

где Na - количество выживших животных в группе на конкретный срок; N0 - общее количество животных в группе.

Результаты исследований

1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания Доке в термолнпосомалыюн лекарственной форме

Процедура разработки спектрофотометрической методики количественного определения действующего вещества в лекарственной форме включала следующие основные этапы:

1. Изучение спектра поглощения электромагнитного излучения действующим веществом в спиртовом растворе, определение максимумов поглощения и их интенсивности, выбор рабочей длины волны.

2. Проверка соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера.

3. Выбор рабочих концентраций исследуемых растворов, при которых оптическая плотность составляет 0,2-0,7 единиц.

4. Изучение влияния вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы, на спектральные характеристики действующего вещества.

Оптическую плотность спиртовых растворов субстанции Доке и Докс-ТЛ измеряли в диапазоне длин волн от 200 нм до 600 нм. Полученные спектры поглощения показаны на рис. 2.

X, НМ

Рис. 2. Спектры поглощения спиртовых растворов субстанции Доке и Докс-ТЛ.

Как видно из рис. 2, спиртовые растворы субстанции Доке и Докс-ТЛ имели шесть максимумов поглощения в области от 200 нм до 600 нм при следующих длина: волн: 234 нм, 252 нм, 288 нм, 480 нм, 496 нм и 532 нм.

В качестве аналитической выбирали длину волны, на которой пик Доке был наиболее выраженным и узким. Такой пик отмечали при длине волны 252 нм.

Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции Доке при 252 нм соблюдалась в интервале концентраций от 1,21 мкг/мл до 30,88 мкг/мл, а для спиртового раствора Докс-ТЛ - в диапазоне концентраций от 1,45 мкг/мл до 30,96 мкг/мл. Оптическая плотность спиртовых растворов находилась в пределах 0,2-0,7 единиц при концентрации Доке 5-16 мкг/мл.

При изучении влияния вспомогательных веществ на оптические характеристики раствора Доке установили, что вспомогательные вещества в соотношениях, соответствовавших составу лекарственной формы, практически не влияли на поглощение Доке и не мешали его спектрофотометрическому определению.

Содержание Доке в свежеприготовленной термолипосомальной дисперсии, которое рассчитывали по значениям оптической плотности, измеренной при длине волны 252 ± 2 нм, составляло 0,388 ± 0,002 мг/мл, относительная ошибка среднего результата (ё) не превышала 0,52 %.

В процессе исследования была проведена валидация методики количественного определения содержания Доке в TJI по следующим характеристикам: правильность, повторяемость (сходимость), воспроизводимость, специфичность (селективность) и линейность. Для проведения градуировки методики измеряли оптическую плотность модельных смесей с разными концентрациями Доке при длине волны 252 ± 2 нм.

Результаты количественного определения Доке в модельных смесях, а также в лекарственной форме описывались линейной зависимостью у = 0,00139 + 0,04324х с коэффициентом корреляции R = 0,99927.

2. Разработка методик хроматографического определения Доке, лнпидов и сахарозы в составе термолипосомальной лекарственной формы

2.1. Хроматографическое определение Доке и липидов в Докс-TJI

Качественный анализ термолипосомального Доке методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в следующих системах растворителей:

- хлороформ - метанол - вода (60:30:5), (65:25:4), (75:25:4) и (80:20:3);

- хлороформ - метанол - концентрированный аммиак (60:35:5), (60:40:1) и (65:25:4);

- хлороформ - метанол - вода - концентрированный аммиак (90:54:5,5:5,5);

- хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота - вода (50:25:8:4), (25:15:4:2), (60:50:1:4), (80:20:14:6) и (90:40:12:2);

- хлороформ - ацетон - метанол - ледяная уксусная кислота - вода (6:8:2:2:1).

На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» 10x10 см (Россия) и «Silica gel 60 F 254» 10 х 20 см (Merck KGaA, Германия) наносили по 20 мкл образцов Докс-TJI и стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС). Пластину с нанесенными пробами проявляли парами йода. Пятна липидов идентифицировали по желтой или желто-коричневой окраске, а пятно Доке - по характерной красно-розовой окраске.

Методом ТСХ установили, что лиофилизированные Докс-TJI по составу не отличались от свежеприготовленных Докс-TJI и не содержали примесей или каких-либо

л

продуктов деградации, кроме действующего и вспомогательных веществ, что служило качественной характеристикой для оценки стабильности лекарственной формы.

Во всех исследованных системах растворителей липиды (БРРС и ВБРС) имели близкие значения и при хроматографировании Докс-ТЛ определялись одним пятном.

Наиболее четкое разделение липидов и Доке в составе лекарственной формы наблюдали в системах растворителей хлороформ - метанол - концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота-вода (25:15:4:2). Предел обнаружения липидов в указанных системах составил 1,0 мкг. Предел обнаружения Доке в системе хлороформ - метанол - концентрированный аммиак (65:25:4) составил 1,0 мкг, а в системе хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота-вода (25:15:4:2) - 0,5 мкг. Холестерин и 08РЕ-РЕС-2000 содержались в термолипосомальной лекарственной форме в очень маленьких количествах, и поэтому в данных хроматографических системах не обнаруживались. Сахароза при проявлении парами йода также не давала никаких пятен на пластинках.

Наименее удачной оказалась хроматографическая система хлороформ - метанол -вода, в которой липиды и Доке в составе лекарственной формы не разделялись.

Хроматографическое определение Докс-ТЛ в системах хлороформ - метанол -концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота - вода (25:15:4:2) показано на рис. 3-4.

1^=0,44

(ДО

t i 3 4 $

Рис. 3. ТСХ Докс-TJI на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе хлороформ -метанол - аммиак (65:25:4):

1 - Докс-ТЛ; 2 - DPPC (52 мкг); 3 - DSPC (6 мкг); 4 - Доке (7 мкг); 5 - Доке (7 мкг) + DSPC (6 мкг).

Рис. 4. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «йогЫТ!» в системе хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота - вода (25:15:4:2):

1 - Докс-ТЛ; 2 - ОРРС (52 мкг); 3 - ОБРС (6 мкг); 4 - Доке (7 мкг); 5 - РРРС (52 мкг) + ОБРС (6 мкг).

2.2. Хроматографическое определение сахарозы в Докс-ТЛ

Анализ Докс-ТЛ на наличие сахарозы проводили в системах растворителей 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота - метанол — вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт - ацетон - эфир - вода (7:7:2:4). На линию старта хроматографической пластинки

«Sorbfil» или «Silica gel 60 F 254» наносили по 5 мкл образцов Докс-TJI, пустых ТЛ и СОВС. Хроматограммы проявляли раствором 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты. Пятна сахарозы идентифицировали по сиреневой или черно-фиолетовой окраске.

Хроматографическое определение сахарозы, Докс-ТЛ и пустых ТЛ на пластинках «Sorbfil» и «Silica gel 60 F 254» в системах растворителей 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота - метанол - вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт - ацетон - эфир -вода (7:7:2:4) показано на рис. 5-6.

К. = 0.56

/

\/ . (

I : < 4-

Рис. 5. ТСХ Докс-TJI и TJI на пластинке «Sffica gel 60 F 254» в системе 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота -метанол - вода (10:5:3:2):

1 - Сахароза (9,5 мкг); 2 - ТЛ (47,5 мкг); 3 - ТЛ (9,5 мкг), 4 - Докс-ТЛ (47,5 мкг); 5 - Докс-ТЛ (9,5 мкг).

Рис. 6. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе изопропиловый спирт - ацетон - эфир - вода (7:7:2:4):

1 - Сахароза (19 мкг); 2 - Сахароза (9,5 мкг); 3 - Докс-ТЛ (19 мкг), 4 - Докс-ТЛ (9,5 мкг).

Как видно из рис. 5-6, в данных системах растворителей пятна Докс-ТЛ по форме и окраске соответствовали пятнам СОВС. Доке не мешал хроматографическому определению сахарозы в лекарственной форме. Предел обнаружения сахарозы в системе 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота - метанол - вода (10:5:3:2) составил около 0,5 мкг, а в системе изопропиловый спирт - ацетон - эфир — вода (7:7:2:4) - около 0,9 мкг.

3. Оптимизация технологии получения и состава Докс-ТЛ

3.1. Выбор оптимального липидного состава Докс-ТЛ

Для выбора оптимального липидного состава термолипосомальной мембраны изучали шесть составов ТЛ. Критериями выбора являлись: эффективности

инкапсулирования Доке в ТЛ и размеры везикул. Полученные результаты представлснь в табл. 1.

Таблица 1

Эффективность включения Доке в ТЛ разных составов и размеры везикул

№ Состав ТЛ Молярное соотношение Включение Доке в ТЛ, % Диаметр везикул, им

1. DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 : а-ТА 9:1:0,2:0,02:0,2 94,0 170 ± 15

2. DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 9:1:0,5:0,1 87,7 160 ±9

3. DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 9:1:0,75:0,2 85,7 149 ±7

4. DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 9:1:1:0,3 57,8 170 ±6

5. DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 9:1:1,2:0,4 60,8 184 ± 10

6. DPPC : DSPC : Chol 7:2:1 66,9 183 ±8

Как видно из табл. 1, при увеличении количества холестерина и ПЭГ в составе термолипосомальной мембраны степень инкапсулирования Доке в везикулы снижалась, размеры частиц при этом менялись незначительно. В свежеприготовленные ТЛ, содержавшие DPPC : DSPC : Chol в молярном соотношении 7:2:1, включилось около 67 % Доке, а спустя 15 ч включение препарата увеличилось до 72,5 %. Включение Доке в везикулы, содержавшие DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 : а-ТА в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02:0,2, составило ~ 94 %. Следовательно, данный состав является наиболее оптимальным для получения термочувствительной липосомальной лекарственной формы Доке.

3.2. Выбор оптимального соотношения препарат: суммарные липиды для загрузки Доке в везикулы

Проводилась сравнительная оценка эффективности загрузки Доке в ТЛ с молярным соотношением компонентов мембраны DPPC : DSPC : Chol: DSPE-PEG-2000 = 9:1 : 0,2 : 0,02 и разными весовыми соотношениями препарат: суммарные липиды, а также оценка агрегационной устойчивости полученных Докс-ТЛ при комнатной температуре. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Включение Доке в ТЛ при разных весовых соотношениях препарат: суммарные липнды, размеры везикул и их агрегационная устойчивость

Весовое соотношение препарат: суммарные липиды Концентрация Доке в дисперсии ТЛ, мг/мл Включение Доке в ТЛ, % Диаметр Докс-ТЛ, нм Агрегационная устойчивость Докс-ТЛ, дни

0,13 1 0,4 94,3 163 ±9 7-8

0,20 1 0,6 91,9 158 ±9 7

0,30 1 0,9 93,6 165 ±10 3-4

0,40 1 1,2 93,5 170 ±5 3

0,50 1 1,5 88,6 210 ±5 2

0,60 1 1,8 86,0 180 ±9 2

0,70:1 2,1 82,8 181 ±10 образование осадка в процессе загрузки Доке в ТЛ

Как видно из табл. 2, включение Доке в ТЛ оставалось высоким при весовых соотношениях препарат: суммарные липиды от 0,13:1 до 0,70:1. Однако агрегационная устойчивость Докс-ТЛ заметно снизилась при увеличении весового соотношения препарат: суммарные липиды от 0,30:1 до 0,70:1. Поэтому для получения агрегационно устойчивого препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Доке в везикулы рациональнее использовать весовые соотношения препарат: суммарные липиды 0,13:1 и 0,20:1.

3.3. Изучение влияния размеров ТЛ на включение Доке

Размер везикул определяет их поведение в живых системах, а также влияет на стабильность липосомальных препаратов во время хранения. В данном исследовании изучали влияние размеров ТЛ на включение в них Доке. Наблюдения проводили в течение трех суток после получения термолипосомальной дисперсии с препаратом.

Результаты оценки эффективности инкапсулирования Доке в ТЛ-200, полученные после экструзии через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм, и ТЛ-100, полученные после последовательной экструзии через мембраны с размером пор 200 нм и 100 нм, представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, включение Доке в свежеприготовленные ТЛ-200 и ТЛ-100 было довольно высоким (от 86 % до 89 %). На вторые и третьи сутки после приготовления включение препарата в ТЛ-200 увеличилось на 3,0 % и 4,0 % соответственно. В то же время, включение Доке в ТЛ-100 на вторые и третьи сутки уменьшилось на 1,2 % и 2,6 % соответственно. Исходя из этих данных, предположили,

что Доке вытекает из более мелких везикул с течением времени. Таким образом, для получения стабильного препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Доке в ТЛ экструзию ТЛ рациональнее проводить через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 нм.

Таблица 3

Размеры везикул и включение Доке в ТЛ-200 и ТЛ-100

Первые сутки Вторые сутки Третьи сутки

ТЛ Размер Включение Размер Включение Размер Включение

Докс-ТЛ, нм Доке в ТЛ, % Докс-ТЛ, нм Доке в ТЛ, % Докс-ТЛ, нм Доке в ТЛ, %

ТЛ-200 159 ±8 89,3 160 ±7 92,3 162 ±7 93,3

ТЛ-100 124 ±5 88,7 125 ±4 87,5 129 ±7 86,1

3.4. Выбор оптимального криопротектора для замораживания и лиофилизации термолипосомального Доке

Изучалось влияние различных криопротекторов на включение Доке в свежеприготовленные, замороженные и лиофилизированные ТЛ, а также на размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Размеры везикул и эффективность включения Доке в свежеприготовленные, замороженные, лиофилизированные ТЛ

Криопротектор Свежеприготовленные Докс-ТЛ Докс-ТЛ после замораживания Докс-ТЛ после лиофилизации

Диаметр везикул, нм Включение Доке в ТЛ, % Диаметр везикул, нм Включение Доке в ТЛ, % Диаметр везикул, нм Включение Доке в ТЛ, %

2 % сахароза 150-160 90 150-165 70 165-173 49

4 % сахароза 164-173 87 165-185 86 165-175 74

10% сахароза 175-189 94-95 - - 184-192 52-53

3,7 % сахароза + + 0,4 % коллидон 160-176 95 — - 160-170 77

1,9 % сахароза+ + 1,3 % мочевина 156-170 86 153-170 59 154-400 52

3 % декстран 10 000 150-156 67-70 165-400 агрегация Докс-ТЛ 192-600 агрегация Докс-ТЛ

4 % глюкоза 164-177 75 155-170 68 164-174 47

2 % ПЭГ 2000 147-157 77 148-155 57 185-900, до 1900 агрегация Докс-ТЛ

2 % сахароза + +1 % декстран 40 000 150-170 80 140-153 62 154-167 27

2 % сахароза + + 1 % ПЭГ 2000 152-168 74 - - 185-194 45

Из табл. 4 видно, что разные криопротекторы и формообразователи (коллидон) влияли на эффективность инкапсулирования Доке в TJI до лиофилизации и особенно после лиофилизации, а также на размеры везикул. После замораживания и лиофилизации наименьшее количество Доке вытекало из ТЛ с 4 % раствором сахарозы, поэтому данный криопротекгор был выбран как оптимальный для замораживания и лиофилизации термолипосомального препарата.

4. Разработка режима лиофилизации Докс-TJI

Для стабилизации Докс-TJI в процессе хранения разрабатывали методику их лиофилизации, при этом исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки термолипосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение Доке в ТЛ.

На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания) от +20 °С до -50 °С и постепенное замораживание препарата на полках до -40...-45 °С с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6-8 ч. Изучение стабильности дисперсии при низкой температуре показало возможность краткосрочного замораживания и хранения препарата при температуре -18 °С.

В процессе масштабирования технологии получения термолипосомальной лекарственной формы Доке провели 15 сушек, при этом исследовали режимы сублимационной сушки с разным временем выдержки препарата при низкой температуре, с разной скоростью и продолжительностью сушки, а также различной температурой и продолжительностью досушивания продукта. Установили, что уменьшение температуры досушивания препарата с +20 °С до +15 °С не влияет на основные показатели качества лекарственной формы, поэтому в дальнейшем досушивание проводили при температуре +20 °С в течение 3 ч. После всех сублимационных сушек отмечали снижение эффективности инкапсулирования Доке в ТЛ на ~ 8-19 %. В наименьшей степени препарат вытекал из везикул при использовании следующего режима: постепенный нагрев полок от -50...-55 °С до 0 °С со скоростью 45 °С/ч, а затем нагрев от 0 "С до +20 °С со скоростью 5-6 °С/ч. Данный режим сублимационной сушки выбрали как оптимальный для получения лиофилизированного термолипосомального Доке.

Изучение влияния различных физико-химических факторов на включение Доке в лиофилизированные ТЛ показало, что после сублимационной сушки из ТЛ вытекало до 19% Доке независимо от растворителей, использовавшихся для регидратации

лиофилизата, рН растворителя, времени регидратации, а также буферов для получети исходной термолипосомальной дисперсии. Размеры частиц в процессе сушки 1 последующей репздратации лиофилизата соответствующим растворителем практичесю не менялись. В дальнейшем для регидратации лиофилизата выбрали 5 % изотонически) раствор глюкозы как наиболее подходящий растворитель.

5. Стандартизация лнофилизированной термочувствительной липосомалыю< лекарственной формы Доке

Согласно требованиям ГФХ1 к препаратам для инъекций выбрали следующи> критерии качества лнофилизированной термолипосомальной лекарственной формв Доке: описание, растворимость (регидратация) и время растворения в растворителе дл: инъекций, подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, рН потеря в массе при высушивании, количественное определение и однородност дозирования. На основе данных критериев разработали проект ФСП на препара' «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора да инъекций 0,7 мг» и провели контроль качества шести наработанных серий препарат (071007, 081007, 091007, 130108, 140208, 150408) по выбранным критериям. Эти сери заложили на хранение при температуре -18 °С для установления срока годности Результаты анализа лекарственной формы через полгода и один год хранена представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что после одного года хранения в морозильной камере пр] температуре -18 °С серии 130108,. 140208 и 150408 препарата полности соответствовали критериям и параметрам качества, указанным в ФСП. Серия 091007 н соответствовала требованиям ФСП по критерию потеря в массе при высушивание которая через год увеличилась на 1,59 %. Серия 071007 препарата не соответствовал требованиям ФСП по критериям потеря в массе при высушивании, которая увеличилас на 1,64 %, и средняя масса содержимого флакона (0,100 г вместо 0,088-0,098 г по ФСП' Серия 081007 после одного года хранения при температуре -18 °С соответствовал требованиям ФСП по всем критериям качества, хотя потеря в массе при высушивании данном случае увеличилась на 1,36 %.

Таким образом, срок годности серий 071007, 081007 и 091007 препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора дл инъекций 0,7 мг» составил полгода, а серий 130108, 140208 и 150408 - один год. Химико-фармацевтические исследования срока годности серий 130108, 140208 и 150408 препарата продолжаются.

Таблица 5

Результаты оценки качества препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора

для инъекций 0,7 мг»

Критерии качества Пределы по ФСП Срок хранения Серия препарата

071007 | 081007 | 091007 130108 | 140208 150408

Описание Сухая пористая масса красновато-розового цвета.

Растворимость (регидратация) Образование термолипосомальной дисперсии красновато-розового цвета после добавления к содержимому флакона 2 мл 5 % глюкозы и интенсивного встряхивания в течение 2 мин.

Подлинность Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора Докс-ТЛ характеристических максимумов при длинах волн: 232 ± 2 нм, 252 ± 2 нм, 288 ± 2 нм, 480 ± 2 нм, 498 ± 2 нм, 530 ± 2 нм. Доке, липиды и сахарозу в составе лекарственной формы определяли с помощью ТСХ, при этом на хроматограммах отсутствовали дополнительные пятна, указывавшие на присутствие продуктов деградации.

Средняя масса содержимого флакона, г 0,088-0,098 0 0,096 0,093 0,095 0,095 0,096 0,094

0,5 года 0,098 0,094 0,096 0,095 0,096 0,094

1 год 0,100 0,094 0,098 0,095 0,096 0,095

Диаметр Докс-ТЛ, нм Не более 250 0 171 ±6 178 ±9 176 ± 10 172 ±5 172 ±5 160 ±9

0,5 года 170 ±5 178 ±9 176± 10 172 ±5 172 ±5 160 ±9

1 год 181 ±8 189 ±8 189 ± 7 169 ±6 178 ±9 165 ±9

рн 7,30-7,80 0 7,55 7,62 7,60 7,65 7,69 7,58

0,5 года 7,74 7,74 7,66 7,65 7,69 7,60

1 год 7,56 7,77 7,68 7,72 7,62 7,66

Потеря в массе при высушивании, % Не более 3,0 0 1,47 1,44 1,44 1,67 1,31 1,15

0,5 года 2,14 2,03 1,55 1,67 1,31 1,17

1 год 3,11 2,80 3,03 1,65 1,35 1,74

Содержание Доке, мг 0,60-0,80 0 0,76 0,76 0,77 0,78 0,78 0,77

0,5 года 0,77 0,76 0,77 0,78 0,78 0,77

1 год 0,76 0,76 0,76 0,77 0,78 0,78

Однородность дозирования, % 85-115 0 108 108 110 112 111 111

0,5 года 110 108 110 111 112 111

1 год 109 108 109 110 112 111

6. Изучение биологической активности Докс-TJI в сочетании с ГТ

6.1. Изучение биологической активности Докс-ТЛ на клетках in vitro

Результаты оценки действия свободного Доке, пустых ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ на клетки меланомы В-16 in vitro представлены на рис. 7. Видно, что при 42,5 °С Доке высвобождался из ТЛ в среду и вызывал значительное повреждение и гибель клеток.

1000,0

л «

Jfe —

1,0

0,1

1 10 Концентрация Доке, мкг/мл

100

Рис. 7. Выживаемость клеток меланомы В-16. Инкубация (4=14 при 37 "С и 42,5 °С) в присутствии свободного Доке и Докс-ТЛ трех стандартных серий. Данные оценены по отношению к контролю при 37 °С.

1 - ТЛ серии 071007 (37 °С) 2-Доке (37 °С)

3 - Докс-ТЛ серии 071007 (37 °С)

4 - Докс-ТЛ серии 081007 (37 °С)

5 - Докс-ТЛ серии 091007 (37 °С)

6 - ТЛ серии 071007 (42,5 °С) 7-Доке (42,5 °С)

8 - Докс-ТЛ серии 071007 (42,5 °С)

9 - Докс-ТЛ серии 081007 (42,5 °С)

10 - Докс-ТЛ серии 091007 (42,5 °С)

При воздействии свободного Доке, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ в дозе 10 мкг/мл на клетки V-79 китайского хомячка также наблюдали усиление степени повреждения клеток термолипосомальным Доке в сочетании с ГТ. После прогревания клеток с Докс-ТЛ их выживаемость снизилась в 3 раза.

Из результатов биологических экспериментов in vitro следует, что пустые ТЛ не обладают цитотоксическим действием. Инкапсулирование Доке в везикулы снижает его циготоксичность при физиологической температуре. Под влиянием ГТ Доке высвобождается из ТЛ и оказывает заметный угнетающий эффект на рост клеток.

6.2. Изучение биологической активности Докс-TJI in vivo

В исследовании на меланоме В-16 наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ на фоне введения Докс-TJI в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Доке и Докс-ТЛ на меланоме В-16 представлена в табл.6. Из табл.6 видно, что противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) в сочетании с ГТ оказалась выше, чем противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) и ГТ, используемых в монотерапии. Наибольшая выживаемость наблюдалась у животных, которым ввели Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг + ГТ.

Таблица 6

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Доке и Докс-ТЛ иа меланоме В-16

ТРО, %

Группы животных Дни после окончания лечения

1 3 7 12 14

1 Доке (9 мг/кг) 15 39 44 46 53

2 Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) 11 29 3 23 23

3 Докс-ТЛ (9 мг/кг) 15 39 13 25 27

4 ГТ 25 58 64* 67* 73*

5 Доке (9 мг/кг) + ГТ 30 66 78* 79* 75*

6 Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) + ГТ 30 65 90* 89* 88*

7 Докс-ТЛ (9 мг/кг)+ ГТ 35 72 91 *•** 96*'** 96 *'**

Примечания: * р < 0,05 по отношению к контролю;

**р< 0,05 по отношению к ГТ и Доке (9 мг/кг) + ГТ.

В исследовании на карциноме Эрлиха линии ELD наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе мышей, которым провели ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Доке и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD представлена в табл. 7. Как видно из табл. 7, торможение роста карциномы Эрлиха при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ было статистически достоверно выше, чем при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения свободного Доке, за счет большей избирательности действия Докс-ТЛ. Кроме того, выявлена более низкая терапевтическая эффективность при воздействии ГТ через 10-12 мин и 35-40 мин после введения Докс-ТЛ. Наибольшую выживаемость наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ через 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг.

Таким образом, оптимальный интервал между введением Докс-ТЛ и началом сеанса ГТ в проведенном исследовании составил 15-20 мин.

Таблица 7

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Доке и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD

ТРО, %

Группы животных Дни после окончания лечения

1 4 7 9 14 15

1 Докс-ТЛ +:2♦ +9 * +Г +15 * +9 * +32*

2 ГТ 14 46 54* 60* 66* 62

3 Доке + ГТ через 15-20 мин 17 54 64* 68* 63* 56

4 Докс-ТЛ + ГТ через 10-12 мин 19 58 69* 71 * 58* 49

5 Докс-ТЛ + ГТ через 15-20 мин 27 72 85*'** 86*** 84*.** 80

б Докс-ТЛ + ГТ через 35-40 мин 23 67 77* 80* 77* 74

Примечания: * знак «+» означает стимуляцию роста опухоли; * р < 0,05 по отношению к контролю; ** р< 0,05 по отношению к ГТ и Доке + ГТ через 15-20 мин.

По результатам биологических экспериментов in vivo можно заключить, что пустые ТЛ не обладают токсическим действием, а инкапсулирование Доке в ТЛ не повышает его токсичность. Лиофилизированный термолипосомальный Доке в дозе 9 мг/кг в комбинации с ГТ вызывает более высокий терапевтический эффект, чем свободный Доке в тех же условиях.

ВЫВОДЫ

1. Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны -дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC); дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин (Chol): дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) : а-токоферола ацетат (а-ТА) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат: суммарные липиды - 0,13-0,20 :1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы - 8794 %.

2. Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.

3. Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротекгором -4% раствором сахарозы.

4. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:

- спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием PCO доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;

- хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.

Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ - метанол -концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота-вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан-безводная уксусная кислота - метанол - вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт-ацетон - эфир - вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.

5. Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре -18 °С в течение одного года, исследования продолжаются.

6. В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Игнатьева Е.В., Орлова О Л., Ярцева И.В., Гатинская Л.Г., Кортава М.А., Тазина Е.В., Оборотова H.A. Оценка включения доксорубицина в термочувствительные стерически стабилизированные липосомы // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 1 (6). - С. 74.

2. Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова ОЛ., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова H.A. Получение термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина И Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 1 (6). - С. 78.

3. Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова H.A., Тарасова О.И. Разработка оптимального состава термочувствительных стерически стабилизированных липосом // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 1 (6). - С. 78.

4. Тазина Е.В., Оборотова H.A. Получение и стандартизация термочувствительной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (20 апреля 2007 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. - 2007. - № 2 (22). - С. 58.

5. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Оборотова H.A. Получение и стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Тезисы VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (2627 апреля 2007 г., Киев). Киев. - 2007. - С. 76.

6. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Бабкина М.М., Орлова OJL, Оборотова H.A., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Влияние растворителей на регидратацию лиофилизированных термолипосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - № 1 (7). - С. 32.

7. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова H.A., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Режим замораживания термочувствительных липосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (1719 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - № 1 (7). -С. 32.

8. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Орлова ОЛ., Мещерикова В.В., Вайнсон A.A., Оборотова H.A. Термозависимая липосомальная форма доксорубицина // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (25 апреля 2008 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. - 2008. - № 2 (25). - С. 37-38.

9. Мещерикова В.В., Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Оборотова H.A., Вайнсон A.A., Ярмоненко С.П., Барышников А.Ю. Противоопухолевый эффект включенного в термолипосомы доксорубицина в условиях гипертермии. - М.: Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 2008. - № 4 (53). - С. 7-12.

10. Тазина Е.В., Оборотова H.A. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии. - М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - № 3 (7). - С. 4-12.

11. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова ОЛ., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Получение и изучение противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина И Материалы XII Российского онкологического конгресса (18-20 ноября 2008 г., Москва). М.: Издательская труппа ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - 2008. - С. 142.

12. Тазина Е.В., Оборотова H.A. Новые подходы к использованию термочувствительных липосом и локальной гипертермии. - М.: Российский биотерапевтический журнал. -2008.-Х»4(7).-С. 71-79.

13. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Орлова О.Л., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Изучение биологической активности термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина in vitro и in vivo II Тезисы докладов 3-го съезда токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва). М.: М-во здравоохранения и соц. развития Российской Федерации [и др.]. - 2008. - С. 530-531.

14. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Мещерикова В.В., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Контролируемая доставка доксорубицина в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии И Rusnanotech Международный форум по нанотехнологиям: Сборник тезисов докладов научно-технологических секций (3-5 декабря 2008 г., Москва). - 2008. - Т. 2. -С. 420-422.

15. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова ОЛ., Оборотова H.A. Технология получения и анализ термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина. - М.: Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Том 42, № 12. - С. 3035.

16. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина с помощью термочувствительных липосом // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 1 (8). - С. 11-12.

17. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова OJI., Оборотова H.A. Выбор оптимального соотношения препарат/липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. -2009.-№1 (8).-С. 11.

18. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова ОЛ., Оборотова H.A. Изучение влияния криопротекторов на включение доксорубицина в термочувствительные липосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (1819 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. -№ 1 (8).-С. 11.

19. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова ОЛ., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Биофармацевтические исследования термочувствительной липосомапьной лекарственной формы доксорубицина. - М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 1 (8). - С. 40-47.

20. Игнатьева Е.В., Тазина Е.В., Гатинская Л.Г., Ярцева И.В., Оборотова H.A. Оценка качества термозависимой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 2 (8). - С. 48.

21. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В., Орлова О.Л., Оборотова H.A. Применение метода тонкослойной хроматографии для определения фосфолшшдов и доксорубицина в термозависимой липосомальной лекарственной форме // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (2122 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. -№2 (8).-С. 50.

22. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова H.A. Влияние размеров термолипосом на включение доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 2 (8). -С. 49.

23. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Использование термочувствительных липосом и локальной гипертермии для доставки доксорубицина в опухоль // Материалы IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. - 2009. -Приложение № 1.-С. 190-191.

24. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Мещерикова В.В., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Сравнительная оценка действия доксорубицина, инкапсулированного в термолипосомы, и свободного доксорубицина на солидные опухоли в условиях локального прогревания // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. - 2009. - Приложение № 2. - С. 189190.

25. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Вайнсон A.A., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Оценка противоопухолевой активности

термолипосомального доксорубицина и свободного доксорубицина in vivo II Материалы XIII Российского онкологического конгресса (17-19 ноября 2009 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - 2009. - С. 258-259.

26. Tazina E.V., Polozkova А.Р., Orlova O.L., Ignatieva E.V., Mescherikova V.V., Wainson A., Yarmonenko S.P., Oborotova N.A. Preparation and investigation of biological activity of thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin // Technical Proceedings of the 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA). -2008.-Vol. 2.-P. 53-56.

27. Tazina E.V., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu. Doxorabicin-encapsulated thermosensitive liposomes // The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia). SPb.: Publishing House of Politechnical University. - 2008. - P. 177-178.

28. Tazina E.V., Ignatieva E.V., Polozkova A.P., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu. Controlled delivery of doxorubicin to tumor by thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Rusnanotech 2008. Nanotechnology International Forum: Abstracts of Scientific and Technological Sections (December 3-5, 2008, Moscow, Russia). - 2008. - Vol. 2. - P. 311-313.

29. Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu.: Delivery of Doxorubicin to Solid Tumors using Thermosensitive Liposomes, in Advances in Material Design for Regenerative Medicine, Drug Delivery, and Targeting/Imaging, edited by V. Prasad Shastri, A. Lendlein, L-S. Liu, S. Mitragotri, A. Mikos (Mater. Res. Soc. Symp. Proc. Volume 1140E, Warrendale, PA, 2009). Paper number 1140-HH13-I4, P.l-6.

30. Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu. Nanostructural thermosensitive liposomal form of doxorubicin // Rusnanotech 2009. Nanotechnology International Forum: Abstracts of The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers (October 6-8,2009, Moscow, Russia). - 2009. - P. 816-818.

Подписано в печать г 9. о 4.1 о Формат 60 х 84/16 Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 470 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы

Применение большинства традиционных химиотерапевтических препаратов в онкологической практике часто ограничено из-за тяжелых токсических эффектов на здоровые ткани и , органы. Поэтому необходимо разрабатывать технологии новых наноносителей, которые можно использовать для селективной доставки лекарственных соединений в опухоль, и таким образом улучшать их терапевтический индекс [56]. Использование липосом в качестве носителей противоопухолевых веществ является одним из перспективных направлений в лечении злокачественных новообразований.

Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Поскольку проявление кардиотоксического действия зависит от дозы и резко повышается при высоких кумулятивных дозах, противоопухолевую активность доксорубицина нельзя реализовать полностью. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект [10]. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, Миоцет®, Липодокс. В состав Доксила и Келикса входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени [10]. Однако присутствие ПЭГ-причина возникновения некоторых новых побочных эффектов, в первую очередь, эритродизестезии ладоней и подошв (от обычного покраснения до появления язв на коже), а также гиперчувствительности, включая анафилактические реакции [49, 198, 199].

С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина проводятся исследования по созданию новых наноструктурированных лекарственных форм, в частности, термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией [89, 102, 139, 146]. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °С. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с СВЧ-нагревом -1-Й фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы [276].

В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН предложена модель термолипосомального доксорубицина [И, 12], однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы [3]. Но в процессе масштабирования производства и наработок лиофилизированного препарата для углубленных биологических и химико-фармацевтических исследований загрузка доксорубицина в термолипосомы снова снизилась. Поэтому данная работа посвящена разработке оптимального состава, технологии производства и методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Цель исследования

Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.

2. Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.

3. Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.

4. Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.

5. Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.

6. Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Методы исследования:

1. Технологические методы получения термолипосом, их гомогенизация, лиофилизация.

2. Физические методы анализа: спектрофотометрия, метод корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) для анализа размера везикул.

3. Физико-химические методы анализа: хроматография (гель-фильтрация, ТСХ).

4. Химические методы анализа: перекисное окисление липидов.

5. Методы экспериментальной химиотерапии: изучение биологической активности термолипосом in vitro и in vivo. ■

Научная новизна исследования

Впервые предложен состав и разработана технология производства отечественного противоопухолевого препарата - термолипосомального доксорубицина - в виде лиофилизата для приготовления инъекционного раствора. Разработана методика очистки везикул от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке. Показана возможность проведения стерилизующей фильтрации термолипосомальной дисперсии доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры -18 °С. Обосновано использование в качестве криопротектора 4% раствора сахарозы. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Предложены методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином: спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре —18°С. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и показана его стабильность при хранении в течение одного года при температуре -18 °С.

В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы доксорубицина не производятся, импорт дорогостоящих зарубежных препаратов резко сужает возможность применения лекарств с направленной доставкой в отечественной клинической практике. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым качество оказываемой населению медикаментозной помощи.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Положения, выносимые на защиту

1. Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.

2. Методики химико-фармацевтического анализа термолипосомального препарата: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.

3. Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре -18 °С.

4. Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (2627 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint

Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (25 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-легию НИИ онкологии- СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).

Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 - на иностранном языке.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны -дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC): дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин (Choi): дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000): а-токоферола ацетат (а-ТА) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат: суммарные липиды — 0,13-0,20: 1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы - 87-94 %.

2. Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.

3. Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротектором - 4 % раствором сахарозы.

4. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:

- спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием РСО доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;

- хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.'

Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ - метанол -концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота -вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан - безводная уксусная кислота - метанол - вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт - ацетон - эфир-вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.

5. Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре -18 °С в течение одного года, исследования продолжаются.

6. В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффективность большинства противоопухолевых препаратов ограничена их высокой общей токсичностью и метаболической неустойчивостью в организме. Использование липосом для целенаправленной доставки цитостатиков в опухоль - одно из перспективных направлений в химиотерапии злокачественных новообразований.

Целью данной работы явилось получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективной доставки препарата в опухоль. Основные задачи работы включали: оптимизацию технологии производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика, стандартизацию препарата по выбранным критериям качества, изучение его биологической активности на клетках in vitro и перевиваемых солидных опухолях животных in vivo в сочетании с локальной гипертермией.

Термолипосомы получали методом обращения фаз из 1,2-дипальмитоил-5«-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-5«-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), пегилированного 1,2-дистеароил-^п-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG-2000) и холестерина. Для предотвращения окисления липидов добавляли а-токоферола ацетат. Частицы измельчали через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм с помощью мини-экструдера. Доксорубицин загружали в везикулы против градиента сульфата аммония.

В результате проведенных исследований разработана спектрофотометрическая методика количественного анализа термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики хроматографического определения доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.

В ходе изучения перекисного окисления липидов установлено, что доксорубицин и сахароза мешают количественному анализу содержания МДА в термолипосомальной лекарственной форме по реакции с ТБК, поэтому данная методика не подходит для оценки стабильности препарата.

Показано, что оптимальным составом для получения термолипосом с доксорубицином является состав DPPC:DSPC:Chol:DSPE-PEG-2000:a-TA = 9:1:0,2:0,02:0,2. Оптимальное весовое соотношение препарат : суммарные липиды составляет 0,13:1 и 0,20:1.

Для оценки эффективности включения доксорубицина в везикулы разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося препарата на хроматографической колонке С 10/20, заполненной сефадексом G-50.

Выбран криопротектор для замораживания и лиофилизации термолипосомального доксорубицина -4% раствор сахарозы. Разработан режим лиофилизации препарата.

Показано, что наиболее подходящим является постепенное замораживание дисперсии до -40.-45 °С с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Выбран оптимальный режим сублимационной сушки термолипосом с доксорубицином: постепенный нагрев полок от -50.-55 °С до 0 °С со скоростью 4-5 °С/ч, затем нагрев от 0 °С до +20 °С со скоростью 5-6 °С/ч, и досушивание препарата при температуре +20 °С в течение 3 ч.

Согласно требованиям ГФХ1 и ОСТ 91500.05.001-00 к препаратам для инъекций выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина. На основе этих критериев разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата.

В биологических экспериментах показано, что лиофилизированный термолипосомальный доксорубицин в сочетании с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.