Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка липосомальных лекарственных форм для увеличения доставки химиопрепаратов и возможности преодоления множественной лекарственной резистентности

На правах рукописи

Шоуа Илона Беслановна

Разработка липосомальных лекарственных форм для увеличения доставки химиопрепаратов и возможности преодоления множественной лекарственной резистентности

14.00.14 - ОНКОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН М. И. Давыдов)

Научные руководители - доктор фармацевтических наук, профессор

Н.А. Оборотова

доктор медицинских наук, профессор, А. Ю. Барышников

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Т.А. Богуш

доктор медицинских наук, профессор, В.М. Бухман

Ведущее научное учреждение -

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита диссертации состоится «//'>> О1/ 2005г. в на заседании

диссертационного Совета (К.001.017.01) ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, Д. 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Однако большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится отсутствие избирательности действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. На сегодняшний день описано много механизмов, приводящих к множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является актуальной задачей.

Существует ряд подходов к увеличению эффективности лекарственных препаратов, среди которых использование новых фармацевтических технологий для создания систем транспорта известных противоопухолевых препаратов.

Одним из наиболее оптимальных вариантов для повышения доставки препаратов к опухолевым клеткам является использование носителей, таких как липосомы.

Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, внутри липосом находится водное пространство. В водное пространство липосом могут быть включены водорастворимые препараты, а в липидный бислой - гидрофобные. Липосомы способны транспортировать лекарственное средство, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами лекарств.

В настоящем исследовании при создании липосомальных лекарственных форм в качестве модельных препаратов использовали доксорубицин и циклоплатам.

з

Доксорубицин - антрациклиновый гликозид, широко применяемый противоопухолевый антибиотик представляющий собой S-фазовоспецифичный препарат. Точный механизм его противоопухолевого действия неизвестен, но оно может быть обусловлено связыванием с ДНК путем встраивания между парами оснований и ингибированием синтеза ДНК и РНК. Доксорубицин входит в круг препаратов МЛУ и является субстратом для Pgp 170, который является членом суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов, вследствие усиленного выброса лекарства из клетки.

Циклоплатам - оригинальное по структуре комплексное соединение платины второго поколения синтезировано П. А. Чельцовым с сотрудниками в 1982 году в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН. Механизм действия циклоплатама во многом совпадает с механизмом действия цисплатина и других производных платины. Циклоплатам ковалентно связывается с ДНК с образованием аддуктов в положении N-7 гуанина и аденина, которые в отсутствии процессов репарации способны реагировать с нуклеофильными центрами пуриновых оснований или белка с образованием сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок. Известно, что механизм развития резистентности опухолевых клеток к препаратам платины обусловлен повышенной репаративной способностью ДНК. Однако, тот факт, что клетки, резистентные к циклоплатаму, чувствительны к другим производным платины, свидетельствует о наличии, как сходных, так и различающихся механизмов, ответственных за резистентность к этому препарату.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать липосомальную лекарственную форму доксорубицина и циклоплатама, с целью преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать состав и технологию получения липосомальных форм доксорубицина и циклоплатама.

2. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного доксорубицина in vitro на клеточных линиях: Jurkat, K562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

3. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

4. Сравнить противоопухолевый эффект липосомального и свободного циклоплатама in vivo на экспериментальной мышиной модели солидной опухоли меланоме В-16.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Получены липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама.

Показано более высокое накопление липосомального доксорубицина в клетках, по сравнению со свободным препаратом. Продемонстрировано преимущество действия липосомальной лекарственной формы доксорубицина, как на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170, так и на клеточной линии Jurkat, по сравнению со свободным препаратом.

Впервые показана большая эффективность действия липосомального циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и in vivo на меланоме В-16 по сравнению с его свободной формой.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Созданы липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама, которые обладают большей цитотоксической активностью по сравнению со свободными препаратами. Показана возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости, опосредованной действием Pgp

170, с помощью липосомальной лекарственной формы доксорубицина. Продемонстрирована более выраженная цитотоксическая активность липосомального циклоплатама по сравнению со свободной формой препарата на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 in vitro, и большая эффективность липосомальной формы циклоплатама, чем свободного препарата при лечении меланомы В-16 in vivo.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 136 источников. Работа иллюстрирована в виде 8 рисунков, 2 графиков, 10 гистограмм и 4 таблиц.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация работы состоялась 10 декабря 2004. ца совместной научной конференции с участием лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории медицинской биотехнологии и лаборатории биохимической фармакологии, лаборатории медицинской химии НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН.

Результаты представлены на 6 Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), на Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» 2004, на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск. - 24-25 июня, 2004), 7-th European Congress of Pharmaceutical Sciences. (Sweden, 2002).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Реактивы

Для определения апоптоза использовали Annexin V коньюгированный с флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) (Caltag Laboratories, США).

Для получения липосом использовали лецитин (Е-80, Lipoid, Германия), холестерин (Sigma, США), который растворяли в 95% этаноле и 5% раствор кардиолипина в 95% этиловом спирте (Биолек, Украина).

Препараты

Доксорубицин (ICN Biomedicals, Icn., США). Лекарственная форма циклоплатама в виде лиофилизированного препарата была предоставлена -лабораторией разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ.

Моноклональные антитела

Для проведения иммунофенотипирования клеток использовали мышиные моноклональные антитела. Для прямой реакции иммунофлюорисценции использовали моноклональные антитела к антигенам CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD95, CD13, CD14, CD17, CD33, CD34, bcl-2 (Caltag Laboratories, США), HLA-DR (Becton Dickinson, США), Pgp 170 (Immunotech, Франция), коньюгированные с ФИТЦ или с фикоэритрином (ФЭ). В экспериментах также использовали соответствующие изотипические контроли, коньюгированные с ФИТЦ и ФЭ (Caltag, США).

Клеточные линии

Исследование in vitro проводили на клеточных линиях: родительская линия К562 (хронический миелоидный лейкоз человека) и К562 с гиперэкспрессией Pgp 170, Jurkat (Т-клеточный лимфобластный лейкоз человека). Все клеточные линии получены из банка клеточных культур ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Экспериментальная модель опухолевого роста

Работу in vivo проводили на перевиваемой солидной опухоли мышей -меланоме В-16. Опухоль перевивали самцам гибридам первого поколения

C57Bl/6xDBA/2-F1 массой 18-20 г в возрасте 1,5-2 мес. Количество животных в контрольных группах составляло 10 мышей, в опытных группах - 7-9 мышей. Инокуляцию опухолевых клеток проводили подкожно в правую подмышечную область каждой мыши по 50 мг опухолевой взвеси в среде-199 в разведении 1:10 (5x106 клеток).

Режимы введения и дозы циклоплатама in vivo

Лечение мышей начинали через 48 часов после подкожной перевивки опухолевых клеток. Лиофилизированную и липосомальную формы циклоплатама ex tempore разводили в 5% растворе глюкозы и вводили внутривенно в хвостовую вену мышей 3 раза каждый 4ЫЙ день.

Критериями эффективности исследуемых препаратов служили: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) леченных животных по сравнению с контрольными группами животных.

Активными в противоопухолевом отношении считались препараты, вызывающие торможение роста опухоли более чем на 50% или увеличение продолжительности жизни животных более чем на 25%.

Прямая реакция иммунофлюоресценции

Для определения иммунофенотипа клеток проводили прямую реакцию иммунофлюоресценции. Для этого к 50 мкл суспензии клеток добавляли моноклональные антитела к исследуемым антигенам и инкубировали 30 мин при 4°С. Далее клетки отмывали от не связавшихся антител в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), после чего фиксировали в 200 мкл 1% раствора формалина. В реакцию брали 3-5x105 клеток. Анализ иммунофенотипа клеток проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).

Определение гибели клеток с помощью Annexin У

К исследуемым образцам клеток после предварительной отмывки в ФСБ добавляли по 100 мкл связывающего буфера и 5 мкл Annexin V,

коньюгированного с ФИТЦ (Caltag Laboratories, США). Инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, затем добавляли по 400 мкл связывающего буфера и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur.

Исследование цитотоксической активности in vitro с помощью МТТ-

теста

Цитотоксический эффект исследуемых препаратов на опухолевых клеточных линиях человека оценивали по степени подавления роста клеток in vitro с помощью МТТ-теста. Клетки вносили в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, США) и инкубировали с препаратами в течение 72 ч при 37°С и 5% СО2- За 6 ч до окончания инкубации в каждую лунку вносили по 10 мкл раствора МТТ (маточный раствор 5 мг/мл, конечная концентрация 1 мг/мл.).

Затем из каждой лунки удаляли, по возможности, всю среду и добавляли 200 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Далее определяли оптическую плотность на спектрофотометре Titertek Multiscan MCC/340 (Flow Lab., США) при длине волны 540 нм.

На основании средних значений из 3 параллельных измерений для каждой концентрации препарата вычисляли 1С50 - концентрацию вещества, вызывающую гибель 50% клеток.

Электронно-микроскопическое исследование

Для электронно-микроскопического исследования клетки клеточной культуры К562 собирали из флаконов для культивирования, подсчитывали в камере Горяева, после чего центрифугировали в течение 7 мин при 1000 об/мин. Далее супернатант сливали, добавляли препарат липосом и инкубировали в следующих временных интервалах: от 1 сек до 60 сек; от 3 мин до 5 мин. Далее фиксировали в 2,5% забуференном растворе глутаральдегида. Дополнительно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, с последующей обработкой

2% раствором таниновой кислоты. После промывки буфером, образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпоксидных смол ЭПОН-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЛКБ-Ш (Австрия). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым или толуидиновым синим, ультратонкие срезы окрашивали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Полутонкие срезы просматривали в световом микроскопе, ультратонкие - в электронном микроскопе ДЖЭОЛ-1200-СХ-11 (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Создание липосомального доксорубицина и изучение его цитотоксической активности in vitro.

В результате исследований было подобрана оптимальная композиция липидов. Молярное соотношение яичного лецитина, холестерина и кардиолипина составило 12:6:1. При этом наиболее стабильная система получалась в случае приготовления липосомальной дисперсии, содержащей доксорубицин в концентрации 0,1 мг/мл.

При производстве липосом с доксорубицином использовали метод гидратации липидной пленки вакуум-упариванием раствора липидов в 95% этаноле при постоянном перемешивании с помощью роторного испарителя (ИР-1М). Липидную пленку смывали раствором доксорубицина. Поскольку доксорубицин является водорастворимым веществом, он включается в водное пространство липосом. Далее дисперсию липосом, нагруженных доксорубицином, озвучивали в ультразвуковой ванне в течение 30 мин с частотой 20 кГц. Полученную дисперсию подвергали экструзии через мембраны с размером пор 100 нм. Для освобождения от несвязавшегося доксорубицина проводили равновесный диализ полученных липосом в деионизованной воде.

Размер липосом определяли с помощью прибора NICOMP MODEL 380 (США). Стерилизующая фильтрация липосом с доксорубицином через

поликарбонатные фильтры с диаметром пор 200 нм позволила получить малые однослойные везикулы с диаметром 116±3 нм.

Элекронно-микроскопическое исследование

Для определения локализации и визуализации картины слияния липосом с поверхностью клеток использовали электронно-микроскопическое исследование.

При инкубации клеток с липосомами (37 °С), которые состояли из яичного лецитина, холестерина и кардиолипина, наблюдали включение липосом в клетки. Интенсивность включения липосом в мембрану клетки максимальна в первые десятки секунд инкубации. Однако постоянное присутствие адсорбированных липосом на плазматической мембране не исключает возможности их спонтанного включения и на более поздних сроках инкубации клеток. Также было установлено, что уже через несколько секунд после начала совместной инкубации липосом с клетками происходит заполнение поверхности клеток адсорбированными липосомами (рис. 1). При этом некоторые липосомы сливаются с мембраной клеток. При тех же условиях подготовки препаратов без липосом для электронно-микроскопического исследования никаких выростов, напоминающих липосомы на плазматической мембране не наблюдали. Этот факт свидетельствует о том, что везикулы на поверхности плазматической мембраны имели липосомальное происхождение.

Возможно, стабильная адсорбция липосом на клетках целиком определяется их электростатическим взаимодействием. Связавшись с клеткой, липосомы пребывают в контакте с клеточной мембраной и могут непосредственно обмениваться с ее липидной фазой фосфолипидными молекулами. Молекулы могут переходить при контакте мембран путем флип-флопа, т.е. перескока.

Рис. 1. Электронная микроскопия, увеличение х 1200

Исследование включения доксорубицина внутрь липосом

Доксорубицин обладает аутофлюоресценцией, в связи с этим по значению средней интенсивности флюоресценции (MFI — mean fluorescence intensity) можно судить о степени включения доксорубицина внутрь липосом. Поскольку размер липосом очень маленький 116±3 нм, на цитограмме устанавливали окно дискриминации (гейт) в районе дебриса, в котором вырезали основной пул липосом. Приготовленные липосомы хранили в при температуре +4°С.

Среднее значение интенсивности флюоресценции доксорубицина в свежеприготовленных липосомах было немного ниже (mean 241), чем в липосомах, которые анализировали спустя 24 ч (mean 580). В последующие 1 и 2 недели происходит небольшое смещение пика флюоресценции в сторону низких значений (mean 370 и 335 соответственно). Через месяц наблюдается снижение интенсивности флюоресценции (mean 195).

Таким образом, липосомы с доксорубицином были стабильны в течение 1 месяца. Наибольший пик интенсивности флюоресценции доксорубицина наблюдался через 24 ч, а самый низкий через 1 месяц после их приготовления. Небольшое динамичное смещение интенсивности флюоресценции, наблюдали через 1 и 2 недели.

Изучение цитотоксической активности липосом с доксорубицином in vitro

Сравнение цитотоксической активности липосомального и свободного доксорубицина проводили на клеточной линии Jurkat, клеточной линии К562 с гиперэкспрессией активного Pgpl70 и родительской линии К562.

Для выявления гибели клеток линии Jurkat путем апоптоза использовали аннексии V меченный ФИТЦ. Липосомальную и свободную формы доксорубицина исследовали в 5 концентрациях (0,1; 0,5; 5; 50; 500 мкг/мл). В качестве контроля использовали пробы, содержащие свободный доксорубицин и пустые липосомы. Процент гибели клеток определяли через 24 ч и 48 ч после инкубации. Результаты исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Индукция гибели клеток линии Juгkat под действием липосомальной и свободной форм доксорубицина (р<0,05)

Процент гибели клеток Концентрация мкг/мл Липосомальная лекарственная форма доксорубицина Свободная форма доксорубицина достоверность

через 24 ч после инкубации 5 мкг/мл 58%±3 23%±4 р<0,002

0,5 мкг/мл 25%±7 14%±5 р<0,05

через 48 ч после инкубации 5 мкг/мл 81%±7 62%±9 р<0,02

0,5 мкг/мл 45%±5 39%±4 р<0,05

Как видно из данных таблицы 1, липосомальный доксорубицин был более эффективен на клеточной линии Jurkat, чем свободный доксорубицин. Пустые липосомы не оказывали цитотоксического действия на клетки.

При изучении цитотоксической активности липосомального доксорубицина на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией активного Pgpl70 использовали МТТ-тест, в качестве контроля использовали родительскую линию К562. Определяли концентрацию свободного и липосомального доксорубицина, вызывающую гибель 50% клеток в обеих клеточных культурах (ГС^). Обе формы доксорубицина использовали в 10 концентрациях с шагом 2 (80; 40; 20; 10; 5; 2,5; 1,2; 0,6; 0,3; 0,1 мкг/мл). Препарат считали эффективным при концентрации, вызывающей не менее 50% гибели клеток. Результаты исследования приведены на рисунке 2 и 3.

Выживаемость клеток линии К562, экспрессирующеи функционально активный Рдр170, при действии липосомального и свободного доксорубицина

липосомальный доксорубицин —А—свободный доксорубицин

100

90

30

I 50

а

х

*

х

I 70 5 60

80

40

10

20

0

0,1 0,3 0,6 1,2 2,5 5 10 20 40 80

концентрация доксорубицина мкг/мл

Рис.2

Выживаемость клеток родительской линии К562 при действии липосомального и с вободного доксорубицина

И липосошльиый доксорубицин А свободный доксорубицин

100 90 80

0,1 0,3 0,6 1,2 2,5 5 10 20 40 80

концентрация доксорубицина мкг/мл

Рис.3

По данным, представленным на рисунке 1 и 2 видно, что Pgpl70 положительные клетки были более устойчивы к действию свободного доксорубицина по сравнению с чувствительными клетками. Свободный доксорубицин у Pgpl70 положительной клеточной линии вызывал 50% гибели клеток при концентрации 2,5 мкг/мл, тогда как липосомальная форма препарата при концентрации 0,5 мкг/мл (р < 0,02). Таким образом, липосомальный доксорубицин был почти в 5 раз более активный в резистентных клетках линии К562, чем свободный препарат. При сравнении действия липосомального доксорубицина и свободного доксорубицина на клетки чувствительной линии существенного отличия в проценте гибели клеток не наблюдали. Свободный доксорубицин был более эффективен на родительской клеточной линии (52% выживших при концентрации 0,3 мкг/мл) по сравнению с устойчивой клеточной линией (49% выживших клеток при концентрации 2,5 мкг/мл, р<0,05) (рис. 4).

Выживаемость клеток родительской клеточной линии К562 и К562 с гиперэкспрессией Рдр 170 при действии свободного доксорубицина

—♦—родительская линия К562 Я клеточная линия К562 с гиперэкспрессией Рдр 170

100

90

80

| 70 а

5 60

х

I 50

ш

1 40

2 а

# 30 20 10 0

0,1 0,3 0,6 1,2 2,5 5 10 20 40 80 концентрация Оох мкг/мл

Рис.4

Преодоление лекарственной устойчивости, обусловленной

функционированием белка Pgp 170, с помощью липосомального доксорубицина, по-видимому, происходит вследствие того, что липосомы, связываясь с липидами плазматической мембраны клеток, вызывают временную ее дестабилизацию, обуславливая «сбой» в работе Pgp 170.

Сравнение липосомального и свободного доксорубицина по накоплению

в клетках

Так как доксорубицин обладает аутофлюоресценцией, то по значению средней интенсивности флюоресценции можно судить о накоплении препарата в клетках. Клетки клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562 инкубировали с липосомальным или свободным доксорубицином в течение 2х ч, после чего их отмывали и продолжали культивировать в среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой.

При использовании липосомальной формы препарата на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Р£р-170 наблюдали более высокое включение доксорубицина в клетки, чем при использовании свободной формы препарата при той же концентрации. Так, при концентрации липосомального и свободного препарата 10 мкг/мл значения МИ составляли - 469 и 278 соответственно (рис. 5), при этой же концентрации для клеток родительской линии К562 значения МИ составляли 1723 для липосомального и 603 для свободного доксорубицина (рис. 6).

Рис. 5 Накопление доксорубицина в клетках линии К562 с гиперэкспрессией Pgpl70 Алипосомальный доксорубицин концентрация 10 мкг/мл (mean 469). В. свободный доксорубицин концентрация 10 мкг/мл (mean 278)

Рис. 6 Накопление доксорубицина в клетках родительской линии KS62

C.липосомальный доксорубицин концентрация 10 мкг/мл (mean 1723).

D. свободный доксорубицин концентрация 10 мкг/мл (mean 603).

При концентрации доксорубицина 1 мкг/мл интенсивность включения липосомальной формы препарата на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp-170 также выше, чем включение препарата в свободной его форме.

Таким образом, было выявлено более высокое накопление липосомального доксорубицина в клетках по сравнению со свободным препаратом. Поскольку известно, что существует корреляция между уровнем накопления препарата в клетках и его цитотоксическим действием, то можно предположить, что липосомальные носители увеличивают доставку лекарства внутрь клетки.

Создание липосомального циклоплатама и изучение его цитотоксической активности.

При получении липосомального циклоплатама использовали метод гидратации, при этом липидную пленку получали вакуум-упариванием раствора липидов в 95% этаноле при постоянном перемешивании с помощью роторного испарителя (ИР-1М). Липидную пленку смывали раствором циклоплатама в 5% растворе глюкозы, концентрация 0,1 мг/мл. Поскольку циклоплатам является водорастворимым веществом, он включается в водное пространство липосом.

Молярное соотношение яичного лецитина, холестерина и кардиолипина составляет 12:6:1, соответственно. Далее липосомальную дисперсию липосом нагруженных циклоплатамом, озвучивали в ультразвуковой ванне в течение 30 мин с частотой 20 кГц. Полученную дисперсию подвергали экструзии через мембраны с размером пор 100 нм. Для освобождения от несвязавшегося циклоплатама проводили равновесный диализ полученных липосом в деионизованной воде.

Размер липосом определяли с помощью прибора NICOMP MODEL 380 (США). После стерилизующей фильтрации липосом с циклоплатамом через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 200 нм получили малые однослойные везикулы с диаметром 142,3±4 нм.

Изучение цитотоксической активности липосомального циклоплатама

in vitro

Для изучения цитотоксической активности липосомального и свободного циклоплатама использовали клеточную линию К562 с гиперэкспрессией Pgpl70 и родительскую линию К562. Гибель клеток выявляли с помощью аннексина V меченного FITC. Процент гибели клеток на обеих клеточных линиях определяли через 24 ч и 48 ч после инкубации (таблица 2 и 3).

Таблица 2. Индукция гибели клеток линии К562 с гиперэкспрессией Рер170 под действием липосомальной и свободной форм циклоплатама

Процент гибели клеток Концентрация мкг/мл Липосомальная лекарственная форма циклоплатама Лиофилизированная лекарственная форма циклоплатама Достоверность

через 24 ч после инкубации 4 мкг/мл 61%±9 37%±12 р<0,01

2 мкг/мл 26%±6 19%±5 р<0,05

через 48 ч после инкубации 4 мкг/мл 74%±3 57%±10 р<0,01

2 мкг/мл 42%±5 30%±7 р<0,05

Таблица 3. Индукция гибели клеток родительской линии К562 под действием липосомальной и свободной форм циклоплатама

Процент гибели клеток Концентрация мкг/мл Липосомальная лекарственная форма циклоплатама Лиофилизированная лекарственная форма циклоплатама Достоверность

через 24 ч после инкубации 4 мкг/мл 56%±3 40%±5 р<0,05

2 мкг/мл 25%±3 20%±2 р=0,05

через 48 ч после инкубации 4 мкг/мл 70%±4 66%±3 р>0,05

2 мкг/мл 43%±3 37%±5 р<0,05

Как видно из таблицы 2 и 3 липосомальная лекарственная форма оказалась циклоплатама эффективней по сравнению со свободным препаратом.

Исходя из данных таблицы 2 и 3 можно сделать вывод, что циклоплатам не является субстратом для Pgpl70, поскольку различия в проценте гибели клеток при одних и тех же концентрациях на обеих клеточных линиях были незначительны, как для липосомальной, так и для свободной форм препарата. Тем не менее, липосомальная форма циклоплатама была более эффективна, как на родительской линии К562, так и резистентной клеточной линии К562. Поскольку циклоплатам не является флюорохромом, в наших исследованиях, мы не смогли продемонстрировать уровень накопления циклоплатама в клетке, возможно, преимущество липосомальной лекарственной формы циклоплатама связано с увеличением биодоступности, т.е. препарат в липосомальной форме больше накапливается в клетке.

Изучение противоопухолевой активности липосомального циклоплатама in vivo Исследования противоопухолевой активности липосомального и свободного циклоплатама проводили на перевиваемой солидной опухоли мышей -меланоме В-16. Лечение мышей начинали через 48 часов после подкожной перевивки опухолевых клеток. Препарат вводили внутривенно, режим введения 3-х кратный с интервалом 72 часа.

Для изучения противоопухолевой активности липосомальной и лиофилизированной форм циклоплатама исследования проводили в диапазоне доз 30-50 мг/кг. В эксперименте было 2 контрольных группы: мыши, которые не получали лечения и мыши, которым вводили пустые липосомы в том же объеме, что и липосомальный циклоплатам. Животным в опытных группах вводили липосомальную форму и лиофилизированную форму циклоплатама.

При сравнительном изучении противоопухолевой активности липосомальной и лиофилизированной формы циклоплатама показано, что при введении липосомального циклоплатама в дозе 30 мг/кг торможение роста опухоли (ТРО) в начале опыта составило 71%, к концу эксперимента 52%, тогда как при введении лиофилизированной формы препарата в той же дозе

ТРО было ниже и составило 43% в начале и 44% в конце опыта (таблица 4). При использовании липосомального циклоплатама в дозе 40 мг/кг, ТРО составило 68% в начале, а в конце эксперимента (20 сутки) снижалось до 52%, для лиофилизированной формы в той же дозе ТРО составило 56% в начале и 37% в конце исследования. Как видно из таблицы 4, максимальный противоопухолевый эффект наблюдается после полного курса лечения на 12-16 сутки. При введении липосомальной формы циклоплатама в дозе 50 мг/кг, ТРО в начале опыта при этом составило 76%, к 12-м суткам эффект нарастает до 82%, однако, к 16-м суткам начинается гибель животных от токсичности и концу опыта она достигает 67%. В случае применения лиофилизированной формы величина эффекта в этой же дозе определена в 52%, а в конце эксперимента снижается до 31% (таблица 4). Гибели мышей от токсичности при этом не наблюдается.

Таблица 4. Действие лиофилизированной и липосомальной форм циклоплатама на рост меланомы В-16

Группа Доза, мг/кг ТРО (%), по объему опухоли.

Дни опыта

7 9 12 16 20

Лиофили-зированная форма циклоплатама 30 43 20 4 оо * 48 44

40 56 10 57* 37* 37*

50 52 34 59* 46* 31

Липос омальная форма циклоплатама 30 71* 36 64* 57* 52

40 68* 44 75* 72* 52*

50 76* 57* 82* _** -**

* - р<0,05

**~к 16-20 суткам 67% животных погибли от токсичности

Средняя масса опухоли в контрольной группе, в которой мыши получали пустые липосомы, составила 10±2,3 г, что практически не отличалось от

показателей средней массы опухоли в контрольной группе без лечения 10±2,5 г (таблица 5). В группе животных, леченных липосомальным циклоплатамом в дозе 30 мг/кг, средняя масса опухоли составила - 8,0±2,2 г, тогда как при введении такой же дозы лиофилизированного препарата - 12,2±2,5 г. В группе получавшей 40 мг/кг - 4,5±2,8 г, при той же дозе лиофилизированного циклоплатама - 9,2±3,5 г. Гибель животных от токсичности в этих группах не наблюдалась. Средняя масса опухоли в группе получавшей 50 мг/кг липосомальной формы препарата, составила 3,6± 1,2 г, лиофилизированного циклоплатама - 8,2±4,3 г.

Следует отметить, что средняя масса селезенки у мышей, которые получали липосомальную форму циклоплатама в дозе 50 мг/кг, была меньше 44±6,7г, чем у мышей, леченных лиофилизированной формой препарата 209+51,6г, и контрольных групп животных: 180,5±64,Зг для животных без лечения и 261±39,4г для животных, получавших пустые липосомы. Гибель животных, в группе получавшей липосомальный циклоплатам в дозе 50 мг/кг, наблюдалась раньше, чем в контрольной. Следовательно, в настоящем эксперименте, показано, что доза 50 мг/кг для липосомального циклоплатама оказалась ниже ранее установленной максимальной переносимой дозы для лиофилизированной лекарственной формы препарата.

При введении пустых липосом, которые не содержали циклоплатама и состояли из такой же композиции липидов, как и липосомальный циклоплатам показатели величины опухоли, средней продолжительности жизни животных практически не отличались от показателей в контрольной группе животных, не получавших лечения. Таким образом, композиция липидов, из которых состояли липосомы, не оказывала влияния на противоопухолевый эффект основного препарата циклоплатама.

Таблица 5. Торможение роста опухоли и увеличение продолжительности жизни мышей с меланомой В-16 при действии лиофилизированной и

липосомальной форм циклоплатама

Группа Доза, мк/кг Ср.масса опухоли, г ТРО (%) по массе опухоли СПЖ, ДНИ Увеличение продолжительности жизни (%)

Контроль1 10,5+2,5 23,1+2,4

Контроль2 — 10,0±2,3 — 24,8+7,4 7

Лиофили-зированная форма циклоплатама 30 12,2+2,5 +16 24,0+3,9 4

40 9,2+3,5 12 29,3+1,0 27

50 8,2+4,3 22 25,3+1,3 10

Липосомальная форма циклоплатама 30 8,0+2,2 20 26,0+2,1 13

40 4,5+2,8 55 29,5+8,3 28

50 3,6+1,2 64 15,3+2,2 -34*

- УПЖ со знаком " - " означает гибель животных раньше контроля от токсического действия

Выводы:

1. Разработана липосомальная форма доксорубицина. Полученны липосомы со средним диаметром 116±3 нм.

2. Разработана липосомальная форма циклоплатама. Средний размер полученных липосом составляет 142,3±4 нм.

3. Липосомальный доксорубицин накапливается в клетках in vitro в большем количестве по сравнению со свободным препаратом.

4. Липосомальная лекарственная форма доксорубицина была более эффективной на линий К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 по сравнению со свободным препаратом.

5. Показана высокая цитотоксическая активность липосомального циклоплатама на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562 по сравнению с лиофилизированной формой циклоплатама.

6. При использовании липосомальной лекарственной формы циклоплатама меняется биодоступность препарата, в связи, с чем диапазон его оптимальных терапевтических доз снижается по сравнению с величинами доз препарата в лиофилизированной форме и составляет 30, 40 мг/кг и 40, 50 мг/кг, соответственно.

7. По торможению роста опухоли и длительности противоопухолевого эффекта липосомальный циклоплатам более эффективен при лечении меланомы В-16, по сравнению со свободной формой циклоплатама.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шоуа И.Б., Шпрах З.С., Полозкова А.П., Рыбалкина Е.Ю., Логачева Н.А., Полосухина Е.Р., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Исследование влияния липосомального доксорубицина на опухолевые клетки, экспрессирующие активный Pgpl70 / Медицинская иммунология. - Т. 4, № 2. - 2002. - Стр. 317

2. Шоуа И.Б., Полозкова А.П., Оборотова Н.А., Шпрах З.С., Орлова О.Л., Барышников А.Ю. Действие липосомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующие активный Pgpl70 / - Российский биотерапевтический журнал. - №1, том 3. - 2004. - Стр. 20-23

3. Шоуа И.Б., Полозкова А.П., Буркова А.А., Шпрах З.С., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Сравнение действия липосомальной и свободной формы доксорубицина на клеточную линию Jurkat / - Российский биотерапевтический журнал. - №2, том 3. - 2004. - Стр. 41

4. Шоуа И.Б., Полозкова А.П., Буркова А.А., Шпрах З.С., Оборотова НА, Барышников ,А.Ю. Исследование действия липосомашьной формы доксорубицина на клеточную линию Jurkat. / Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. Материалы Российской научно-практической конференции посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН Томск. - 24-25 июня 2004. - Стр.318319

5. Shprakh Z., Polozkova A., Orlova О., Shoua I., Oborotova N., Baryshnikov A., Pharmaceutical Assays of Liposomes encapsulated Doxorubicin / All-in one European Congress of Pharmaceutical Sciences with Exhibition. - Sweden. -2002. - Vol. - 17.-S129.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им НН ЕлохннаРАМН Подписано ■ печать 01.02.05 Заказ № 85 Тираж 100 за

1804

Актуальность темы

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Однако большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится отсутствие избирательности действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. На сегодняшний день описано много механизмов, приводящих к множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является актуальной задачей.

Существует ряд подходов к увеличению эффективности лекарственных препаратов, среди которых использование новых фармацевтических технологий для создания систем транспорта известных противоопухолевых препаратов. Одним из наиболее оптимальных вариантов для повышения доставки препаратов к опухолевым клеткам является использование носителей, таких как липосомы.

Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, внутри липосом находится водное пространство. В водное пространство липосом могут быть включены водорастворимые препараты, а в липидный бислой - гидрофобные. Липосомы способны транспортировать лекарственное средство, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами лекарств.

В настоящем исследовании при создании липосомальных лекарственных форм в качестве модельных препаратов использовали доксорубицин и циклоплатам.

Доксорубицин - антрациклиновый гликозид, широко применяемый противоопухолевый антибиотик, представляющий собой S-фазовоспецифичный * препарат. Точный механизм его противоопухолевого действия неизвестен, но оно может быть обусловлено связыванием с ДНК путем встраивания между парами оснований и ингибированием синтеза ДНК и РНК. Доксорубицин входит в круг препаратов МЛУ и является субстратом для Pgp 170, который является членом суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов, вследствие усиленного выброса лекарства из клетки.

Циклоплатам - оригинальное по структуре комплексное соединение платины второго поколения синтезировано П. А. Чельцовым с сотрудниками в 1982 году в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН. Механизм действия циклоплатама во многом совпадает с механизмом действия цисплатина и других производных платины. Циклоплатам ковалентно связывается с ДНК с образованием аддуктов в положении N-7 гуанина и аденина, которые в отсутствии процессов репарации способны реагировать с нуклеофильными центрами пуриновых оснований или белка с образованием сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок. Известно, что механизм развития резистентности опухолевых клеток к препаратам платины обусловлен повышенной репаративной способностью ДНК. Однако, тот факт, что клетки, резистентные к циклоплатаму, чувствительны к другим производным платины, свидетельствует о наличии, как сходных, так и различающихся механизмов, ответственных за резистентность к этому препарату.

I «

Цели исследования

Разработать липосомальную лекарственную форму доксорубицина и циклоплатама, с целью преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

Задачи исследования

1. Разработать состав и технологию получения липосомальных форм доксорубицина и циклоплатама.

2. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного доксорубицина in vitro на клеточных линиях: Jurkat, К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

3. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

4. Сравнить противоопухолевый эффект липосомального и свободного циклоплатама in vivo на экспериментальной мышиной модели солидной опухоли меланоме В-16.

Научная новизна

Получены липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама.

Показано более высокое накопление доксорубицина в клетках, по сравнению со свободным препаратом. Продемонстрировано преимущество действия липосомальной лекарственной формы доксорубицина, как на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170, так и на клеточной линии Jurkat, по сравнению со свободным препаратом.

Впервые показана большая эффективность действия липосомального циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и in vivo на меланоме В-16 по сравнению с его свободной формой.

Практическая значимость работы

Созданы липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама, которые обладают большей цитотоксической активностью по сравнению со свободными препаратами. Показана возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости, опосредованной действием Pgp 170, с помощью липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Продемонстрирована более выраженная цитотоксическая активность липосомального циклоплатама по сравнению со свободной формой препарата на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 in vitro и большая эффективность липосомальной формы циклоплатама, чем свободного препарата при лечении меланомы В-16 in vivo.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) это термин, * описывающий феномен резистентности опухолевых клеток одновременно к широкому ряду структурно и функционально отличающихся химиопрепаратов г

9]. При МЛУ опухолевые клетки приобретают устойчивость к различным классам токсических агентов. Было описано много механизмов, объясняющих явление множественной лекарственной резистентности. Они условно классифицированы на не клеточный и клеточный механизмы резистентности [110].

Не клеточные механизмы резистентности

Не клеточная лекарственная резистентность может появиться как результат опухолевого роста in vivo. Этот феномен связывают с солидными опухолями, которые проявляют уникальные свойства по сравнению с лейкозами. В частности, разветвленная структура сосудов в опухолевой ткани сильно v отличается от нормальной ткани сосудистыми шунтами и отростками [61, 62, > 118]. Внеклеточное окружение, связанное с солидными опухолями, характеризуется увеличенным давлением интерстициальной жидкости по сравнению с нормальными тканями. Это является следствием двух факторов, а именно, высокой проницаемости сосудов и отсутствием функциональной лимфатической системы. Следовательно, плохая опухолевая васкуляризация может приводить к уменьшению доступа лекарства в зоны солидных опухолей и, таким образом, защищать опухолевые клетки от цитотоксического действия препаратов [110]. Свойства солидных опухолей также приводят к тому, что некоторые области опухоли испытывают дефицит в питательных веществах и кислороде. Такие свойства могут индуцировать механизмы резистентности, которые возникают в результате внеклеточного влияния.

Клеточные механизмы резистентности

Клеточные механизмы классифицируют на основе изменений в биохимических процессах опухолевых клеток. Такие механизмы могут быть классифицированы на две группы: 1) не классический фенотип МЛУ и 2) классический фенотип МЛУ.

1. Не классический фенотип МЛУ с

Термин не классический фенотип МЛУ используют для описания не транспортного механизма, который затрагивает многочисленные классы лекарств. Этот тип резистентности может быть следствием изменения активности ферментных систем, таких как: глутатион S-трансфераза, глутатион и топоизомеразы, которые могут уменьшать цитотоксическую активность лекарств. Изменения соотношения белков, контролирующих апоптоз, также может приводить к резистентности ко многим противоопухолевым препаратам, которые проявляют цитотоксический эффект путем апоптоза.

Глутатион S-трансфераза (GST)

Глутатион S-трансфераза (GST) это ферментативная система, вовлеченная в клеточную детоксикацию. Глутатион (GSH) - небелковый тиол, взаимодействие сульфгидрильной группы которого с реактивной группой лекарственного препарата, определяет образование конъюгатов препарата с глутамином. Эти конъюгаты менее активны, растворимы и выбрасываются из клетки с помощью белков транспортеров GS-X, в том числе MRP [9]. Химические взаимодействия между глутатионом и алкилирующими соединениями катализируются группой ферментов GST, разные изоформы которых взаимодействуют с разными препаратами, повышая степень детоксикации лекарств [122].

GST вовлечен в метаболическую биотрансформацию многих противоопухолевых лекарств, он также защищает клетки от разрушения вследствие действия свободных радикалов. Существует несколько клеточных У линий с гиперэкспрессией GST. GST-тс изофермент, который гиперэкспрессирован в клетках рака молочной железы, устойчивых к адриамицину MCF7/ADR, эти клетки также экспрессируют P-gp. Увеличение уровня GST-ti также наблюдается в разных клеточных линиях с МЛУ. Другие GST изоформы в 8 раз увеличивают резистентность к лекарствам, таким как хлорамбуцил. Такие агенты, как этакриновая кислота и простагландин являются блокаторами GST активности. Они могут быть использованы для увеличения чувствительности к хлорамбуцилу или мелфалану [90].

GST является клеточным регулятором тиол трипептида. Глутатион также играет ключевую роль в детоксификации и клеточной репарации после разрушающего эффекта доксорубицина и алкилирующих агентов [110]. Увеличение уровня GSH наблюдается во многих клеточных линиях, резистентных к алкилирующим агентам. Уменьшение уровня GSH приводит к повышению чувствительности клеток с лекарственной резистентностью. Использование таких агентов, как бутатионин сульфоксамин (BSO) снижает GSH-опосредованную лекарственную резистентность, путем уменьшения GSH уровней [19].

Активность топоизомераз

Два типа топоизомераз присутствуют в эукариотических клетках (топоизомераза I и топоизомераза II) [96, 129]. Оба типа ферментов вовлечены в процесс ДНК репликации. Некоторые противоопухолевые препараты являются ингибиторами топоизомераз. Топоизомераза II является мишенью для доксорубицина и этопозида, тогда как топоизомераза I является мишенью для кампотецина. Эти препараты стабилизируют комплекс между ДНК и топоизомеразой, который в нормальных условиях быстро распадается. К препаратам, которые взаимодействуют с топоизомеразами, относятся доксорубицин, рубомицин, этопозид и др. Подобного рода резистентность может существовать параллельно с резистентностью, опосредованной действием P-gp, поскольку эти препараты являются субстратами для P-gp. Компенсаторное повышение уровня топоизомеразы I наблюдается в клетках, резистентных к ингибиторам топоизомеразы II, в которых наблюдается сниженный уровень этого фермента.

Изменение регуляции апоптоза.

Противоопухолевые препараты индуцируют программированную клеточную гибель (апоптоз). При апоптозе характерны агрегация хроматина, конденсация ядра, сморщивание клетки, уменьшение ее размеров и образование апоптотических телец. Решение будет ли клетка продолжать клеточный цикл или подвергнется апоптозу зависит от комплексного взаимодействия группы генов и белков. Опухолевый ген супрессор р53 играет роль не только в аресте клеточного цикла в Gi фазе, и апоптозе после повреждающего действия противоопухолевых лекарств на ДНК, но также регулирует экспрессию белка bcl-2 и Ьах [79]. Мутации гена р53 часто наблюдаются в опухолях, что обусловливает нарушение нормального функционирования белка и способности клеток индуцировать апоптоз или останавливать клеточный цикл после повреждения. Нарушение нормальных функций р53 может приводить к изменению чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам.

PTEN (также известен как ММАС-1 или ТЕР-1) - один из опухолевых г супрессоров. PTEN функционирует, как липидная фосфатаза и регулирует пути сигнальной трансдукции, ключевой мишенью которой является фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат [9]. Он проявляет слабую тирозин фосфатазную активность. С функционированием PTEN связывают многие нормальные процессы клетки, включающие рост, адгезию, миграцию, инвазию и апоптоз. Он также необходим для эмбрионального развития. PTEN препятствует действию фосфаинозитид 3-киназы (PI3-kinase) дефосфорилируя фосфотидилинозитол (3,4,5)-трифосфат. PTEN негативно влияет на выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, его активация может повысить чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам, а его инактивация вызывает лекарственную резистентность.

Вс1-2 - протоонкоген, повышенный уровень которого может наблюдаться в опухолях, подавляет апоптоз. Вс1-2 является членом семейства генов, продукты которых обладают, как антиапоптотическим (bcl-2, Bax-XL) так и проапоптотическим действием (Вах, Bad, Bic и др.) Способность клеток подвергаться апоптозу связана с образованием гетеро- и гомодимеров, f опосредованных через bcl-2 - Ьах взаимодействие [120]. Для примера, bax - bcl

2 гетеродимер, а также Ьах гомодимер способствуют апоптозу, тогда как апотоз к* ингибируется bcl-2 гомодимерами. Резистентнось может быть обусловлена мутациями генов, индуцирующих апоптоз (р53) или гиперэкспрессией генов, блокирующих клеточную гибель. Bcl-2 является геном, который играет ключевую роль в регуляции путей клеточной гибели.

Bcl-2 защищает клетки от стимулов, вызывающих гибель, таких как ультрафиолетовое или гамма облучение, фактор некроза опухолей или лекарства. Bcl-2 также может вызывать клеточную резистентность к цитостатическому действию ряда противоопухолевых препаратов, таких как доксорубицин, этопозид, таксол, камтотецин, митоксантрон и цисплатин. В отличие от МЛУ, опосредованной P-gp, гиперэкспрессия bcl-2 не предотвращает выброс лекарства из опухолевой клетки. Гиперэкспрессия bcl-2 t приводит к резистентным механизмам, при которых противоопухолевые лекарства способствуют аресту клеточного цикла, однако их эффект скорее цитостатический, чем цитотоксический [66].

CD95 является мембранным гликопротеином и членом семейства TNF рецепторов. При олигомеризации CD95 антителами или тримеризации CD95 лигандом, он передает апоптотические сигналы. CD95L - мембранный протеин, который принадлежит к семейству TNF цитокинов. Подобно другим членам этого семейства CD95L может находиться мембрано-связанным и в растворенной форме. Система лиганд-рецептор CD95L/CD95 играет важную роль в апоптозе некоторых типов клеток, есть данные, что эта система может иметь отношение к гибели опухолевых клеток при действии химиопрепаратов, л а нарушение в функционировании этой системы может приводить к ' лекарственной устойчивости [9].

2. Классический фенотип МЛУ Множественная лекарственная устойчивость, опосредованная транспортными белками

К транспортным белкам относится семейство АТФ-зависимых транспортеров. Эти белки также были обнаружены в бактериях и дрожжах [127]. Такие транспортеры обычно состоят из четырех структурных доменов, два из которых пронизывают мембрану (каждая состоит из нескольких трансмембранных сегментов) и два находятся в цитоплазме. Два последних звена являются нуклеотид-связанными доменами, они участвуют в расщеплении АТФ, извлекая энергию, необходимую для транспорта питательных веществ, аминокислот и низкомолекулярных пептидов через мембрану.

В число мембранных транспортеров, опосредующих МЛУ, входят MRP (белок, ассоциированный с МЛУ, или multidrug resistance associated protein),

LRP (lung-resistance-related-protein), P-gp, гиперэкспрессия которых может наблюдаться в опухолевых клетках и обуславливать выброс противоопухолевых лекарств из клетки, в результате чего происходит уменьшение уровня лекарства в клетке, необходимого для успешной терапии. Такие транспортеры объединяет общая доменная организация - наличие трансмембранных и АТФ-связывающих участков, которые также называются АВС-доменами.

MRP - белок, ассоциированный с МЛУ

MRP член семейства ABC транспортеров. MRP был обнаружен на клеточной линии мелкоклеточного рака легких резистентной к доксорубицину, которая не экспрессировала P-gp, и распознан, как трансмембранный гликопротеин. Он представляет собой несимметричную молекулу с восемью субъединицами и четырьмя мембранно-связанными доменами. Экспрессия MRP обнаруживается во многих опухолях, включая рак легких, острый лимфобластный лейкоз, хронический миелолейкоз [18, 30, 72].

В класс противоопухолевых препаратов, которые являются субстратами для MRP, входят антрациклины, такие как доксорубицин, винка-алкалоиды и этопозид. Проявлением МЛУ является выброс MRP препаратов из опухолевой клетки, вследствие чего уменьшается внутриклеточная аккумуляция лекарств. Хотя субстраты MRP и P-gp схожи, все же наблюдается только 15% гомологии по аминокислотам между ними. Известно несколько изоформ MRP, это MRP1, MRP2 или сМОАТ и MRP3-6. MRP1 и 2, идентифицированные как транспортеры органических анионов, также играют физиологическую роль в АТФ-зависимом однонаправленном транспорте конъюгатов глутатиона, таких как лейкотриен С4 и 8-(2,4-динитрофенил) глутатион. MRP2 может транспортировать винбластин.

Белок MRP определяет устойчивость клеток практически к тем же веществам, что и P-gp, однако с несколько другим спектром перекрестной резистентности. MRP также экспрессируется в нормальных тканях, таких как мышцы, легкие, селезенка, надпочечники, желчный пузырь. В клетках этих тканей MRP транспортирует конъюгаты глутатиона, которые играют важную роль в нормальной жизнедеятельности клеток.

Белок LRP (lung resistance protein)

LRP (major vault protein/lung resistance protein) был впервые обнаружен на клетках клеточной линии немелкоклеточного рака легких, в которых отсутствовал P-gp. Недавно было выявлено, что LRP присутствует во многих человеческих опухолевых клеточных линиях, которые ранее не были обработаны лекарствами. В этих клеточных линиях экспрессия LRP коррелирует с резистентностью к доксорубицину, винкристину и компонентам платины. Информация о клинической значимости LRP ограничена [80]. Он является специфическим белком клеточных органелл - рибонуклеопротеиновых частиц « vault», функция которых связана с ядерно-цитоплазматическим транспортом и везикулярным транспортом веществ, в том числе цитостатических лекарств, хотя прямые доказательства этого отсутствуют. Он экспрессируется при карциноме яичников, меланоме, немелкоклеточной карциноме легких, остром и хроническом миелолейкозе [17]. Экспрессию LRP связывают с плохим ответом на химиотерапию при карциноме яичников и остром миелолейкозе.

Транспортный белок Pgp 170

Pgp 170 - член суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков, является белком плазматической мембраны [9, 110]. Состоит из 1280 аминокислот, условно разделен на две половины, каждая из которых имеет 6 трансмембранных участков и цитоплазматический сайт связывания АТФ (рис.1). Было показано, что выброс субстратов P-gp из клетки это АТФ-зависимый процесс. Его субстратами являются антрациклины, винка-алкалоиды, подофиллотоксины и таксаны.

Pgp человека кодируется геном MDR1, который локализован на хромосоме 7. Семейство MDR включает два гена человека MDR1 и MDR2 и три гена грызунов (MDR1, 2, 3). Один ген человека (MDR1) и два грызунов имеют отношение к лекарственной резистентности.

В нормальных тканях Pgp 170 часто представлен на апикальных частях различных секреторных эпителиоцитов [11, 32]. Его физиологической ролью в организме является защита от экзогенных и эндогенных токсинов, транспорте АТФ, стероидов, полипептидов. Pgp также участвует в работе таких биологических барьеров как, плацента, гемато-тестикулярный, гемато-энцефалический барьеры. Он локализуется в таких тканях, как печень, почки, толстая кишка, ободочная кишка, кора надпочечников, поджелудочная железа, плацента, матка, клетки эндотелия сосудов и яичек [52, 116, 117]. клеточная 'А мембрана межклеточное пространство

О/? ОпС7 цитоплазма

CD0H

Рис.1 Вторичная структура P-gp

1-12 - гидрофобные трансмембранные участки А - сайты гликозилирования В - сайт связывания АТФ

Анализ уровня Р-гликопротеина на поверхности опухолевых клеток у онкологических больных показал, что экспрессия Pgp 170 наблюдается приблизительно в 50% случаев [27, 47, 76]. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов, вследствие усиленного выброса лекарства из клетки. В ряде случаев экспрессия P-gp на опухолевых клетках может служить плохим прогностическим признаком, даже если P-gp не всегда определяет резистентность больных к проводимой химиотерапии.

Выдвигаются несколько механизмов, объясняющих транспортные функции P-gp. Согласно модели Ниггесмана и Готтесмана (1992) P-gp, сталкиваясь с ксенобиотиками на внутренней стороне плазматической мембраны, переносит агенты к внешней стороне, где они диффундируют во внеклеточную среду (рис 2). Также предполагают, что P-gp повышает внеклеточный уровень рН, деполяризуя электрический потенциал плазматической мембраны клетки, действуя, как протонный насос или как хлоридный канал, таким образом, уменьшая аккумуляцию слабых оснований или уменьшая рН-зависимое связывание агентов к их внутриклеточным мишеням [115].

Рис.2 из клетки)

Сайт связывания лекарства лекарство 0

Мембрана ингибитор МЛУ О

Сай г связывания нн гнбитора внутрь клетки)

Рис.2 Схема функционирования P-gp Модель иллюстрирует белок, который использует энергию АТФ для выбрасывания лекарс твенных субстратов через плазматическую мембрану. Ингибитор МЛУ может взаимодействовать с местом связывания лекарства или с местом связывания ингибитора.

Согласно модели Готтесмана и Постана (1993), P-gp прямо взаимодействует с субстратами в плазматической мембране и выбрасывает их из клетки. Доказательства конкурентного связывания лекарства на P-gp молекуле было показано с радиоактивно меченными фотоаффинными зондами, такими как Nр-азидо-[3-1251]-салицил)- N -Р-амино виндезин и [3 Н] азидопин. Эта технология основана на передаче энергии от хромофорных субстратов P-gp к > фотоактивным радиомеченным зондам. Фотоактивный аналог винбластина, Nрг I р-азидо-[3- I]- салицил)- N -Р-амино виндезин использовали как зонд, который присутствовал на винбластин связывающих сайтах на молекуле P-gp, который находился на мембранах везикул, полученных из клеток легких китайского хомячка и клетках человеческой карциномы с МЛУ. Эта метка ингибировала связывание винкристина и даунорубицина, что свидетельствует о том, что связывание было конкурентным [33].

В связи с клинической значимостью P-gp ведутся поиски путей преодоления его активности. Было показано в эксперименте, что множество веществ ингибируют выброс лекарства из клетки, опосредованный P-gp и, следовательно, предотвращают резистентность [25, 28]. Для повышения чувствительности клеток к химиотерапии используют ингибиторы P-gp в комбинации с противоопухолевыми лекарствами. Такие комбинации позволяют > усилить внутриклеточную аккумуляцию лекарств, путем ослабления транспортной функции P-gp, и, вследствие этого, частичного преодоления клеточной резистентности.

К ингибиторам P-gp принадлежит ряд препаратов, таких как блокаторы кальциевых каналов, коронарные вазодиляторы, индол алколоиды, гормоны, циклоспорины и многие другие гидрофобные препараты [48]. Клинические испытания показали, что для большинства ингибиторов МЛУ, опосредованной P-gp, не удается получить в крови больных концентрации, необходимой для преодоления лекарственной устойчивости, поскольку высокие дозы этих препаратов дают тяжелые осложнения. В настоящее время разрабатываются менее токсичные и более эффективные модуляторы P-gp. Tsuruo и соавторы впервые продемонстрировали способность блокатора кальциевых каналов верапамила, преодолевать МЛУ [124, 125]. Верапамил усиливал внутриклеточную аккумуляцию многих противоопухолевых лекарств, включая доксорубицин во многих клеточных линиях [46, 55, 58]. Также было продемонстрировано, что антагонисты кальция преодолевали МЛУ in vitro, к > ним относятся: фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, бепридил и дилтиазем. Эти агенты ингибировали МЛУ при очень высоких концентрациях от 5 до 50 мкМ. Такие высокие концентрации приводили к цитотоксическому действию не только в резистентных, но и в нормальных клетках [73, 74]. Индол алколоиды, и антималярийный хинин также предотвращали МЛУ in vitro на клеточных линиях в комбинации с доксорубицином. Циклоспорин А, который применяется как иммуносуппрессант при трансплантации органов, является одним из эффективных модуляторов МЛУ. В комбинации с некоторыми противоопухолевыми лекарствами он эффективно преодолевал МЛУ во многих клеточных линиях, таких как Р388, СНО, К562, СЕМ и С26.

Большинство ингибиторов первого поколения преодолевали МЛУ при очень высоких концентрациях. Поиски не токсичных ингибиторов привели к г открытию новых соединений относящихся ко второму поколению, являющихся аналогами первых, но более сильных и менее токсичных.

Структурные аналоги верапамила: дексверапамил, емопамил, галлопамил и Ro 11-2933 преодолевали МЛУ in vitro аналогично верапамилу, но с незначительной токсичностью на многих экспериментальных моделях животных [92]. Некоторые из этих агентов показали сильное ингибирующее действие, такие как тиапамил аналог Rol 1-2933, который эффективен в концентрации 1-2 мкМ по сравнению с верапамилом 5-10 мкМ. Не иммуносуппрессивный аналог циклоспорина A, PSC 833, вызывал эффективное ингибирование МЛУ во многих экспериментах in vitro на клеточных линиях. PSC 833 преодолевал МЛУ в комбинации с даунорубицином, доксорубицином, винкристином, винбластином, таксолом и митоксантроном в клетках МЛУ клеточной линии Р388 in vitro в концентрации 0,5-2 мкМ [23, 67].

Недавно были созданы ингибиторы МЛУ путем использования структурно-активационных взаимоотношений и комбинаторных химических подходов против специфических механизмов МЛУ. Эти агенты эффективно преодолевали МЛУ в наномолярных концентрациях (20-100 нМ). К ним относятся специфические блокаторы P-gp, такие как циклопропилдибензосуберан LY 335979, акридонекарбоксамин GF 120918, дикетопиперазин XR9051, диарилимидазол ОС 144-093, также биспецифичные (и P-gp и MRP) блокаторы, такие как VX-710 и VX-853. Циклопропилдибензосуберан LY 335979 оказывает в 10-раз более сильное по сравнению с циклоспорином А ингибирующее действие, блокируя механизмы, специфичные для P-gp [39]. Акридонекарбоксамин GF 120918 сходен по характеристикам с LY 335979, которые заключаются в селективном блокировании механизма P-gp. Хотя все эти агенты показали эффективность в комбинации с противоопухолевыми препаратами, такими как доксорубицин, все еще исследуется в какой степени эти соединения могут преодолевать резистентность в более устойчивых моделях солидных опухолей и в клинике при лечении резистентных опухолей.

Первое поколение ингибиторов, таких как верапамил и циклоспорин А, обладали фармакологической активностью, что было показано и в предклинических и в клинических исследованиях, при этом требовались высокие дозы для получения терапевтических концентраций, достаточных для преодоления МЛУ in vivo [100]. Эти дозы оказывали тяжелое токсическое действие. Поэтому первое поколение ингибиторов нуждалось в развитии или создании новых соединений ингибиторов МЛУ с низкой токсичностью. Созданные ингибиторы второго поколения были менее токсичны и в целом преодолевали МЛУ более эффективно, чем первые. Не смотря на то, что эти агенты преодолевали МЛУ, опосредованной P-gp, при комбинированном введении с противоопухолевыми лекарствами они оказывали влияние на фармакокинетические свойства этих препаратов. Возможно, это было следствием блокирования P-gp в нормальных тканях, таких как печень и почки, которые обладают секреторной функцией. Например, такое фармакокинетическое взаимодействие в 8 раз увеличивало концентрацию в плазме даунорубицина, когда противоопухолевый препарат комбинировали с Р> gp ингибитором верапамилом у крыс, что приводило к усилению токсичности и, как следствие этого, требовалось уменьшение дозы противоопухолевого лекарства [94]. Многими исследованиями было подтверждено, что высокие дозы верапамила приводили к 8 кратному увеличению захвата винкристина в таких тканях, как печень, почки, кишечник, что потребовало 8-кратного уменьшения дозы препарата. Недавно было показано, что VX-853, сильный ингибитор МЛУ третьего поколения, в 3 раза уменьшал клиренс в плазме паклитоксела, при котором тоже требовалось уменьшение дозы лекарства.

По-видимому, как следствие этих осложнений, оказалась неудачной II фаза клинических испытаний у больных раком легкого, яичников, молочной железы, кишечника, почки, миеломой и лейкемии. Из-за отсутствия селективной экспрессии P-gp на опухолевой ткани не понятно в какой степени изменения в г фармакокинетике, вызванные ингибитором, могут отрицательно сказываться на терапии [107].

Механизмы МЛУ не ограничиваются основными положениями, которые были изложены выше. Однако ясно, что они многочисленны. Открытие новых механизмов, обусловливающих резистентность опухолевых клеток, продолжается.

Липосомы - новый подход для лекарственной доставки

Альтернативным подходом для преодоления лекарственной резистентности является новая система лекарственной доставки на основе липосомальных форм химиопрепаратов, которая способствует селективному накоплению препаратов в опухолевой ткани. Липосомальные носители в клинической онкологии стали распространенными при лечении солидных опухолей и по $ существу, являются моделью системы доставки, которые могут усиливать действие противоопухолевых лекарств [5, 56, 109]. Например, длительно циркулирующие липосомы и другие макромолекулярные носители могут увеличивать депонирование лекарств в солидных опухолях [38, 41, 98].

Липосомы представляют собой микросферы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что определяет их многие привлекательные качества. Гидрофильные полярные головки липидов находятся в контакте с водной фазой и защищают от воды гидрофобные углеводородные цепи. Они нетоксичны, биодеградируемы, при определенных условиях могут поглощаться клетками или сливаться с клеточной мембраной. Внутри липосомы находится водное пространство (рис. 3). Водорастворимые лекарства могут включаться в водное пространство липосом, а жирорастворимые в липидный бислой [1,7].

Рис.3 Модель липосомы

При включении лекарства в липосомы объем его распространения в организме значительно уменьшается, при этом увеличивается концентрация лекарства в опухоли, что приводит к снижению неспецифической токсичности препарата [49]. При оптимальных условиях, лекарство находится внутри водного пространства липосом, тогда как после попадании в клетку лекарство становится биодоступным. Липосомы защищают лекарство от метаболизма и инактивации в плазме. Транспорт липосом через нормальный эндотелий ограничен, вследствие чего уменьшается накопление лекарства в здоровых тканях. Эндотелий сосудов опухолевых тканей фенистрирован это приводит к тому, что небольшие носители могут проникать через образовавшиеся поры, в опухолевую ткань [57]. Все эти факторы вносят вклад в повышение терапевтического эффекта, которое наблюдается при применении липосомальных форм некоторых противоопухолевых препаратов. Большинство г липосомальных препаратов, которые используются в клинике при лечении опухолей, являются маленькими однослойными везикулами, состоящими из одной фосфолипидной бислойной мембраны с внутренним водным пространством для инкапсуляции лекарств. Многослойные и другие структуры, также используются для доставки гидрофобных лекарств, которые включаются в липосомальную мембрану. Фармакокинетика липосом зависит от свойств, таких как размер липосом, поверхностный заряд, композиции липидов, из которых состоит мембрана липосом. Липосомальные лекарства, которые в настоящее время используются в клинической онкологии, являются стандартизованными и предусмотрены для длительной циркуляции.

Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами лекарств, включая возможность преодоления лекарственной резистентности [5, 6, 134]. Липосомальные системы доставки препаратов могут преодолевать активность транспортных белков МЛУ даже в высоко резистентных опухолях.

В настоящее время в клинике используют липосомальные формы антрациклинов, а также другие липосомальные препараты, такие как липосомальная форма паклитаксела, различные камптотецины и винкристин. Также создаются новые конструкции липосом для лечения опухолей с лекарственной резистентностью. Например, анионные липосомы, поскольку анионные липиды могут ингибировать P-gp; термолипосомы, из которых вытекает лекарство в условиях гипертермии; липосомы, которые могут увеличивать и оптимизировать выход лекарства в ткани мишени в зависимости от рН окружающей среды. Также липосомальные химиопрепараты могут быть эффективнее, чем свободные лекарства в комбинации с ингибиторами МЛУ. Липосомы позволяют доставлять плохо растворимые лекарства, которые не являются субстратами для P-gp. Также липосомы используют для доставки антисмысловых олигонуклеотидов к опухолевым клеткам для преодоления лекарственной резистентности.

В настоящее время два липосомальных антрациклина используют для лечения опухолей: пегилированный липосомальный доксорубицин (PLD, Doxil, ALZA Pharmaceuticals, Palo Alto, CA; также известный как Caelyx) и липосомальный даунорубицин (DaunoXome, Gilead Sciences, Foster City, CA). PLD представляет собой маленькие униламеллярные везикулы (100 нм), состоящие из нейтральных липидов, окруженных полиэтиленгликолем (ПЭГ), который защищает от не специфических взаимодействий. Пегелированные липосомы называют стерически стабилизированными липосомами. При этом доксорубицин включается внутрь липосом очень эффективно, наблюдается хорошая упаковка или даже кристаллизация в водном пространстве липосом [20]. Липосомальный даунорубицин также представляет собой маленькие униламеллярные везикулы, которые состоят исключительно из нейтральных липидов дистеароилфосфатидилхолина и холестерина, и, таким образом, тоже характеризуется нейтральным зарядом и жесткими мембранами с очень маленьким размером липосом (< 40нм) [49].

Доксорубицин относится к антрациклиновым гликозидам, он является противоопухолевым антибиотиком. Доксорубицин представляет собой S-фазовоспецифичный препарат. Точный механизм его противоопухолевого действия неизвестен, но оно может быть обусловлено связыванием с ДНК путем встраивания между парами оснований и ингибированием синтеза ДНК и РНК в результате нарушения матрицы и изменения пространственной структуры. Другие возможные механизмы противоопухолевой активности включают связывание с липидами мембран клеток и, как следствие, изменение различных клеточных функций, взаимодействие с топоизомеразой II и образование расщепленных комплексов ДНК [6].

Через гематоэнцефалический барьер доксорубицин не проходит. Быстрая биотрансформация (в течение 1ч), происходит в печени, при этом образуется активный метаболит доксорубицинол. Ферментативное восстановление доксорубицина под действием оксидаз, редуктаз и дегидрогеназ приводит к образованию свободных радикалов, что может способствовать кардиотоксическому действию препарата. Фаза распределения примерно 5 мин. Фаза выведения 20-48 ч для доксорубицина и доксорубицинола. Препарат выводится с желчью 40% в неизмененном виде в течение 5 дней, почками 512% доксорубицина и его метаболитов, нахождение препарата в моче определяется в течение 5 дней [3].

Доксорубицин применяют главным образом в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами при лимфо- и ретикулосаркомах, лимфогранулематозе, острых лейкозах, раке молочной железы, раке легкого, злокачественных опухолях яичка, саркомах мягких тканей и некоторых костных саркомах, нейрабластоме и опухоли Вильмса у детей, а также у некоторых больных раком щитовидной железы и переходноклеточным раком мочевого пузыря.

Возможными отдаленными эффектами многих противоопухолевых препаратов являются вторичные злокачественные опухоли, хотя не ясно, связано ли их развитие с мутагенным или иммунодепрессивным действием этих средств. Влияние дозы и продолжительности лечения также не известно, но вероятно, риск повышается при длительном применении. Хотя информация ограничена, имеющиеся данные позволяют предположить, что риск канцерогенного действия наиболее высок при использовании алкилирующих препаратов. Доксорубицин оказывает канцерогенное действие у животных и является потенциальным канцерогенным препаратом для человека. Вызывает побочные эффекты, такие как гематологические осложнения, выпадения волос, осложнения со стороны сердца и вторичный рак [10].

Побочными эффектами при использовании доксорубицина могут быть: лейкопения, тромбоцитопения, инфекция, стоматит, кардиотоксическое действие, образование экстравазата, целлюлит, некроз ткани, изъязвление в желудочно-кишечном тракте, гиперурикемия, нефропатия, связанная с повышенным образованием мочевой кислоты, местная реакция, флебофиброз, рецедив лучевой эритемы, аллергическая реакция и анафилаксия [4, 6].

Оба липосомальных антрациклина (доксорубицин и даунорубицин) были впервые использованы для лечения саркомы Капоши, которая развивалась при СПИДе. Прямых доказательств того, что липосомальный доксорубицин способен преодолевать клеточную резистентность нет. В исследованиях, проведенных Northfelt, у 53 пациентов с саркомой Капоши, развившейся на фоне СПИДа, применяли PLD во второй линии после слабо эффективной предшествующей химиотерапии [95]. Из 28 пациентов, которые были с прогрессированием заболевания после лечения, включавшим стандартную лекарственную форму доксорубицина, на терапию PLD объективно ответ наблюдали у 32% пациентов. Эти результаты указывают на то, что PLD может вызывать клинический ответ у пациентов, рефрактерных к предшествующей терапии, которая включала в себя лиофилизированную форму доксорубицина.

PLD не вызвал эффекта у больных по поводу рака молочной железы, которые были антрациклин-резистентными [113]. Эта II фаза исследования включала 11 пациентов с метастазирующим раком молочной железы, которые или прогрессировали и получали стандартное лечение, включающее антрациклины или это были больные, у которых развивались метастазы через 6 месяцев после терапии, включавшей антрациклины. Никакого объективно ответа у этой резистентной по антрациклину группы получено не было. В этом исследовании PLD не показал перекрестной-резистентности к доксорубицину, как при саркоме Капоши. Это может быть следствием меньшей аккумуляции PLD в клетках опухоли при раке молочной железы, в отличие от высоко васкуляризированной саркомы Капоши, также это может быть за счет различий в механизмах резистентности между двумя типами опухолей или обусловлено другими причинами. Однако, PLD вызвал эффект при раке молочной железы, когда его использовали как в монотерапии, так и в комбинации с другими липосомальными антрациклинами, что сопровождалось уменьшением токсического эффекта [103].

В настоящее время липосомальные препараты можно комбинировать с другими терапевтическими подходами лечения. В частности, гипертермия может быть использована для ингибирования биораспространения липосомальных лекарств. В животных моделях применение гипертермии подкожных опухолей, после внутривенного введения длительно циркулирующих липосом, приводила к значительному увеличению захвата липосом в опухолевой ткани [85]. Это является следствием вызванных гипертермией изменений в динамике микроциркуляции и сосудистой проницаемости, которая облегчает проникновение липосом из опухолевых сосудов.

Липосомальные антрациклины были исследованы и при других нозологиях. Например, при III фазе рандомизированных клинических исследований терапии рака яичников PLD был эффективен во второй линии терапии, после первой, включавшей платину. Также хорошие результаты получены при лечении множественной миеломы и неХоджкинской лимфомы.

Таким образом, длительно циркулирующий липосомальный даунорубицин, как и пегилированный липосомальный доксорубицин, созданный и одобренный в Европе (MyocetTM, Elan Pharma, Munich, Germany) значительно изменяют биораспространение, уменьшают токсичность включенных в них лекарств [20].

Липосомы, способные ингибировать P-gp

Многими исследованиями было показано, что липосомы используют при лекарственной резистентности опухолей путем включения в состав липосом анионных фосфолипидов, таких как кардиолипин и фосфотидилсерин [99]. Эффектом такой доставки было увеличение клеточного накопления и цитотоксичности липосомальных агентов. Механизм действия для таких липосом включает прямое взаимодействие между анионными липидами и P-gp [99]. Было показано, что анионные липосомы интернализуются клетками определенного вида, в отличие от минимального взаимодействия, которое наблюдается при действии стабилизированных нейтральных липосом [75]. При интернализации анионных липосом наблюдался выход лекарства во внутриклеточную среду, обходя P-gp или другие мембранные транспортеры. Однако, несмотря на преодоление механизмов МЛУ в экспериментальных моделях, анионные липосомы не достаточно стабильны in vivo, время циркуляции для таких липосом невелико, все эти причины ограничивают их использование в клинике [43].

Нейтральные фосфолипиды, такие как фосфотидилхолин и фосфатидилэтаноламин, входящие в состав многих липосомальных мембран, являются субстратами P-gp, которые могут конкурировать с лекарством за связывание с P-gp [126]. Например липосомы, содержащие фосфотидилхолин или фосфатидилэтаноламин, вызывают увеличение захвата лекарства и усиление цитотоксичности в клеточных линиях с МЛУ. Это наблюдается не только с липосомальными формами лекарств, но также с пустыми липосомами, с которыми были предварительно проинкубированы клетки перед добавлением свободного препарата, что указывает на прямое взаимодействие между липосомами и клетками [101]. Michieli и соавторы 1999 наблюдали, что в клетках линии с МЛУ, которая гиперэкспрессировала P-gp, липосомальный даунорубицин, мембрана которого состояла из фосфотидилхолин/холестерина, вызывал значительную внутриклеточную аккумуляцию препарата по сравнению со свободным препаратом, что приводило к 4-5 кратному увеличению цитотоксического эффекта [88]. Однако, механизм этого эффекта неясен. Нейтральные липосомы не обнаруживают способности к хорошему слиянию с клетками и не интернализуются в большинстве опухолевых клеточных типах.

Липосомы, способные к триггерному выходу лекарства: Термо и рНчуствительные липосомы

Стабилизированные липосомы проникают из сосудов в опухолевые ткани, где в конечном итоге происходит выход лекарства и проникновение его в опухолевые клетки. Процессы, действующие как стимуляторы выхода препарата из липосом, могут включать захват липосом рэтикулоэндотелиальной системой, а также дестабилизацию тканевыми липазами, окисляющими агентами или другими тканевыми компонентами [44]. Новые подходы в создании липосомальных препаратов включают конструирование липосом, способных к триггерному выходу препарата: такие липосомы могут подвергаться структурным изменениям в ответ на физико-химические стимулы, таким образом можно контролировать выход препарата из липосом. Примером таких липосом являются: термочувствительные липосомы, из которых при гипертермии наблюдается выход лекарства, и рН-чуствительные липосомы, триггером которых является кислая среда.

Гипертермия может усиливать накопление в опухоли стабильных и длительно циркулирующих липосом, при этом гипертермия используется и как дестабилизатор термочувствительных липосом, таким образом, обеспечивая выход лекарства в гипертермированный регион. Термолипосомы должны состоять из липидов температурная фаза перехода которых выше 37°С. Таким образом, гипертермия индуцирует структурные изменения, приводящие к быстрому выходу инкапсулированного в липосомы препарата. Например, термочувствительные липосомы с доксорубицином были тестированы in vitro на клетках сублинии MCF-7 с МЛУ. При действии на них липосомального доксорубицина и гипертермии клеточный рост был ингибирован на таком же уровне, как и на клетках без МЛУ [87]. При этом наблюдался быстрый выход доксорубицина при 39-40°С.

Комбинация липосом и ингибиторов мембранных транспортеров Многие агенты способны ингибировать мембранные транспортеры, такие как P-gp, хотя до сих пор нет четких доказательств преимущества этих ингибиторов в клинике. Трудностями в развитии ингибиторов P-gp являются фармакологические ограничения, как самих ингибиторов, так и в комбинации с химиотерапией. Например, PSC 833 (валосподар) аналог циклоспорина и мощный ингибитор P-gp. Хотя этот агент сам вызывает токсичность при использовании его в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, такими как даунорубицин, доксорубицин и паклетаксел, наблюдается значительное изменение в клиренсе и фармакокинетике химиотерапевтических лекарств, приводящее к усилению токсичности [12]. В предклинических исследованиях комбинация PSC 833 с липосомальным доксорубицином была предпочтительнее, чем со свободным препаратом, поскольку он предотвращал нежелательное взаимодействие между лекарствами, пегилированный липосомальный доксорубицин был не затронут PSC 833. Липосомальная доставка может уменьшать определенные фармакологические сложности, связанные с сопутствующей антирезистентной терапией, путем включения антирезистентных агентов в липосомы. В ранних исследованиях в липосомы упаковывали ингибитор P-gp валиномуцин, который сам обуславливал значительную токсичность. Липосомальный валиномуцин давал меньшую токсичность без уменьшения ингбиторной активности для P-gp в экспериментальных моделях [40].

Доставка аналогов гидрофобных лекарств

Липосомы могут также использоваться для доставки аналогов гидрофобных лекарств, предназначенных для предотвращения резистентности, опосредованной мембранными транспортерами. Например, антрациклин -аннамицин и липофильное производные платины [105]. Эти соединения предназначены для того, чтобы сделать клеточный захват относительно независимым от P-gp и/или других выбрасывающих лекарства насосов. Хотя липосомальный аннамицин, проявил активность в предклинических исследованиях на моделях с лекарственной резистентностью, во II фазе клинических исследований липосомальный аннамицин никаких ясных доказательств эффективности у пациентов с • раком молочной железы, резистентных по доксорубицину не показал [24].

Иммунолипосомы

Для того чтобы оказать непосредственное действие лекарственных носителей на опухолевые клетки, были разработаны липосомы, связанные с антителами - иммунолипосомы [102]. Иммунолипосомы были созданы для специфического распознавания соответствующих антигенов. В принципе, терапевтический эффект может быть увеличен при применении иммунолипосом, поскольку их содержимое попадает прямо в опухолевые клетки вслед за рецептор опосредованным эндоцитозом. Исходя из сказанного, можно сделать вывод, что использование иммунолипосом может быть более эффективно при резистентных опухолях.

HER2 (ErbB2, Neu) является онкогеном рецептор-тирозин киназ (RTK), который может быть мишенью при терапии на основе моноклональных антител, таких как герцептин. Иммунолипосомы к HER2 были сконструированы для взаимодействия и интернализации с HER2гиперэкспрессирующими опухолевыми клетками, и приводили к селективной внутриклеточной лекарственной доставке [68, 100]. Иммунолипосомы, содержащие или Fab или scFv фрагменты против HER2, были использованы для доставки доксорубицина, в результате это привело к сильной и селективной противоопухолевой активности в ряде опухолевых моделей. При этом наблюдался больший эффект, чем при использовании свободного доксорубицина, обычного липосомального доксорубицина и липосомального доксорубицина плюс свободные анти- HER2 антитела [68, 100].

Иммунолипосомы против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR/HERl/ErbBl) представляют другой пример, основанный на иммунолипосомальной лекарственной доставке [81]. Иммунолипосомы к EGFR-мишеням, в клеточных культурах, как было показано, интенсивно интернализовались в цитоплазму EGFR-гиперэкспрессирующих клеток, тогда как в неэкспрессирующих клетках не наблюдалась интернализация. При этом отмечалась заметная цитотоксичность, когда включали в иммунолипосомы любые из нескольких химиотерапевтических агентов (доксорубицин, винорелбин и метотрексат).

Иммунолипосомы, захватываемые клеткой, обеспечивают точную внутриклеточную доставку лекарства, путем пенитрации плазматической мембраны, обеспечивают выход лекарства внутрь цитоплазмы, обходя мембран-связанные тарнспортные механизмы. В in vivo исследованиях на резистентных моделях мышиной карциномы легких была показана большая эффективность иммунолипосомального доксорубицина по сравнению со свободным препаратом и обычным липосомальным доксорубицином [53]. Рецептор трансферина также может являться мишенью для иммунолипосом. Антитрансфериновые иммунолипосомы использовали для доставки доксорубицина в резистентные по этому препарату клетки сублинии К562 (K562/ADR) [121]. При этом наблюдали минимальный выброс лекарства из клетки и уровень доксорубицина был приблизительно эквивалентен в резистентных K562/ADR клетках и родительской линии, тогда как свободный препарат был выброшен из клетки. В проведенных исследованиях антитрасфериновые иммунолипосомы, конъюгированные с антителами ОХ26, были использованы для доставки радиоактивномеченного дигоксина в иммортолизованных RBE4 крысиных капиллярных эндотелиальных клетках мозга. Клеточный захват дигоксина был в 25-раз выше при использовании иммунолипосом.

Другие иммунолипосомы, созданные для преодоления лекарственной резистентности, включают иммунолипосомы, конъюгированные с моноклональными антителами к P-gp, которые вызывали увеличение цитотоксичности инкапсулированного винорилбина в резистентных К562 клетках [84].

Использование липосомальных векторов в генной терапии

Существуют различные подходы генной терапии для ингибирования, преодоления или использования механизмов резистентности. Прогресс в этой области и в генной терапии опухолей в настоящее время ограничен недостаточным развитием генно-векторной технологии для доставки нуклеиновых кислот. Для вирусных векторов характерны: канцерогенность, токсичность, иммуногенность, не специфичность, низкая экспрессия вирусных рецепторов на опухолевых клетках, а также сложная процедура создания. Использование липосомальной системы доставки более дешево. Однако эти системы опираются в основном на катионные липиды/липосомы для упаковки нуклеиновых кислот, которые являются более стабильными, чем нейтральные липосомы, созданные для эффективной длительной циркуляции. Конструкции, содержащей ген, необходима стабильность для проведения успешной генной терапии, более того, добавление фрагментов антител или других лигандов к конструкции может позволить сделать генную доставку более специфичной и эффективной.

Генная терапия на основе липосом включает подходы, при которых возможно прямое воздействие на механизмы лекарственной резистентности [71, 104]. Например, использование катионных липосом для доставки антисмысловых олигонуклеотидов или рибозимов против сиквенсов MDR1 гена, а также использование технологии генной терапии для гиперэкспрессии генов лекарственной резистентности в нормальных тканях, для защиты тканей от токсического действия химиотерапии [123, 15, 83]. Например, ген MDR1 трансфецированный посредством липосомальных векторов в гематопоэтические предшественники в костном мозге [14].

Олигонуклеотиды сконструированы для того, чтобы смодулировать передачу генетической информации, но механизмы, с помощью которых олигонуклеотиды могут индуцировать биологический эффект, сложны. Для того чтобы антисмысловые олигонуклеотиды снижали экспрессию гена, он должен проникнуть в клетки мишени. Данные о точных механизмах, вовлеченных в этот процесс не ясны. Захват происходит через активный транспорт, который в свою очередь зависит от температуры, структуры и концентрации олигонуклеотидов и линии клеток [78, 128, 135]. Многочисленными работами было продемонстрировано, что олигонуклеотиды плохо интернализуются в клетках вне зависимости от того отрицательно они заряжены или нет, а также обязательным условием для действия антисмысловых олигонуклеотидов является, по-видимому, их ядерная локализация [54, 22]. Для того чтобы улучшить клеточный захват и активность антисмысловых олигонуклеотидов используют транспортеры, такие как липосомы. Использование этих транспортеров позволяет увеличить стабильность олигонуклеотидов от разрушения нуклеазами и позволяет использовать их меньшие концентрации .

Нуклеиновые кислоты могут легко инкапсулироваться в липосомы, которые содержат водное пространство, либо могут быть связанными с липосомальной поверхностью электростатическими взаимодействиями. Эти векторы, из-за их положительного заряда, имеют высокую аффинность к мембранам клеток, которые отрицательно заряжены при физиологических условиях [119].

Bcl-2 - важный антиапоптотический белок, который определяется в различных человеческих опухолевых клетках. Его ингибирование может теоретически вызывать чувствительность клеток к цитотоксической химиотерапии, что было показано в ряде последних исследований на тканевых культурах и экспериментальных моделях, которые привели к началу клинических испытаний [59].

Гиперэкспрессия Bcl-2 наблюдается при многих видах новообразований. Bcl-2 повышен приблизительно в 35% опухолей у больных раком предстательной железы [86, 21]. При гиперэкспрессии белка bcl-2 в опухолевых клетках простаты LNCaP увеличивался их in vivo туморогенный потенциал и появлялась резистентность к апоптозу [108]. Экспрессия Bcl-2 в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы является низкой или отсутствует.

Первоначально, антисмысловые фосфодиестер и фосфоротиоат олигонуклеотиды к мРНК bcl-2, использовались для ингибирования роста клеток в культуре 697 человеческой лейкемии [112]. Мишенью олигонуклеотидов является сайт инициации трансляции человеческого мРНК bcl-2. Оба класса олигомеров уменьшают клеточную пролиферацию: фосфоротиоаты более сильные ингибиторы, эксперименты с фосфодиестером в настоящее время потеряли свою значимость. Предполагалось, что фосфоротиоат bcl-2 антисмысловые олигонуклеотиды индуцируют клеточную гибель через взаимодействие со специфическими участками [26, 45].

Препарат G3139, представляющий собой фосфодиестер и фосфоротиоат антисмысловые олигонуклеотиды, направленные против первых шести кодонов Bcl-2 мРНК (G3139, Genta, Inc., Lexington, Mass.), был успешно использован на клетках Неходжскинской лимфомы. Молекулярная масса G3139 - 579,99. Он нестабилен в растворах со значением рН менее 3 или выше 7. Предполагаемое специфическое уменьшение уровня Bcl-2 мРНК через один день после обработки было продемонстрировано Kitada и соав. в клетках SU-DHL-4 [69]. Соизмеримое уменьшение в уровне белка Bcl-2, наблюдалось только после трех дней, по-видимому, из-за длительного периода жизни белка Bcl-2, что было связано с сильным снижением клеточной жизнеспособности. Обработка клеток лимфомы RS11846 препаратом G3139 приводила к уменьшению экспрессии Bcl-2 и увеличени. чувствительности этих клеток к АгаС и метотрексату [70]. При этом использовалась чрезвычайно высокая концентрация олигонуклеотидов.

Обработка опухолевых клеток LNCaP и опухоли Шионоги in vitro G3139 ингибировала экспрессию Bcl-2, что зависело от дозы и специфичности последовательностей [50, 89]. Авторы использовали катионный липид липофектина для доставки и измеряли уровни bcl-2 белка и мРНК. Однако они использовали только одиночный контроль олигонуклеотида, который уменьшает достоверность эксперимента. В других экспериментах, антисмысловые олигонуклеотиды существенно усиливали чувствительность к паклитакселу и доцетакселу, причем усиление действия препаратов зависело от их дозы. Характерные апоптотические изменения были обнаружены только после комбинированного лечения, а не после использования одного Bcl-2 олигомера [37, 51].

В настоящее время фосфоротиоат олигонуклеотиды (G3139) изучаются при введении внутривенно или интроперитонеально у пациентов, которые принимают участие в клинических испытаниях [13, 60]. Эти олигонуклеотиды стабильны в течение 48 часов, к этому времени их уровни все еще могут определяться в тканях. После внутривенного введения G3139 в дозе приблизительно 5 мкг/кг, элиминация в плазме составляет 22ч [34, 35, 111, 133].

Данные клинических исследований дают основания для дальнейшего клинического развития G3139, как монотерапии, так и в комбинации с другими цитотоксическими препаратами [29, 36, 64, 65, 91, 130, 131]. G3139 в настоящее время проходит I/II фазы испытаний у пациентов с андроген-независимым раком предстательной железы, которым назначают G3139 в комбинации с доцетакселом. Клинические испытания других нозологий опухолей планируются [29, 91]. Эффективность этого препарата в клинике в настоящее время обнадеживает, так как его токсичность относительно низкая, состоит, главным образом, в утомлении и тромбоцитопении.

Поиск подходов для доставки лекарств к мишени, включающий клеточный или субклеточные сайты и увеличения биодоступности активного лекарства, играет важную роль. Липосомальная система доставки активно развивается и становится более усовершенствованной. Одним из перспективных подходов является использование иммунолипосом или других лиганд-связанных липосом, которые характеризуются интеграцией с молекулярной мишенью и лекарственной доставкой. Эти агенты могут вызывать лиганд-опосредованную интернализацию и внутриклеточную доставку лекарства, таким образом, добиваясь значительной селекции и эффективности доставки к опухолевой клетке, включая резистентные опухоли. В настоящее время липосомальные антрациклины в ряде случаев могут значительно уменьшать механизмы резистентности, основанной, в основном, на изменении фармакокинетики, биодоступности и токсичности, по сравнению со свободным лекарством. Разрабатывается ряд других липосомальных лекарств. Стратегия, основанная на использовании липосом, включает попытку прямого воздействия на выброс лекарства, таким образом, преодолевая некоторые механизмы резистентности. Приведенные данные позволяют надеяться на реальную возможность использования липосомальных форм цитостатиков для лечения злокачественных опухолей. На сегодняшний день специалисты многих стран мира работают над созданием липосомальных форм химиопрепаратов. Применение цитостатиков, инкапсулированных в липосомы, значительно расширяет возможности химиотерапии опухолей и повышает ее эффективность даже в высоко резистентных опухолях.

Выводы:

1. Разработана липосомальная форма доксорубицина. Полученны липосомы со средним диаметром 116±3 нм.

2. Разработана липосомальная форма циклоплатама. Средний размер полученных липосом составляет 142,3±4 нм.

3. Липосомальный доксорубицин накапливается в клетках in vitro в большем количестве по сравнению со свободным препаратом.

4. Липосомальная лекарственная форма доксорубицина была более эффективной на линий К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 по сравнению со свободным препаратом.

5. Показана высокая цитотоксическая активность липосомального циклоплатама на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562 по сравнению с лиофилизированной формой циклоплатама.

6. При использовании липосомальной лекарственной формы циклоплатама меняется биодоступность препарата, в связи, с чем диапазон его оптимальных терапевтических доз снижается по сравнению с величинами доз препарата в лиофилизированной форме и составляет 30, 40 мг/кг и 40, 50 мг/кг, соответственно.

7. По торможению роста опухоли и длительности противоопухолевого эффекта липосомальный циклоплатам более эффективен при лечении меланомы В-16, по сравнению со свободной формой циклоплатама.