Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунолипосомальные конструкции доксорубицина и модели для их доклинического исследования

На правах рукописи

СОКОЛОВА ДАРИНА ВАДИМОВНА

ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ КОНСТРУКЦИИ ДОКСОРУБИЦИНА И МОДЕЛИ ДЛЯ ИХ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 г- > • п "Т'] / II ПО ¿Л I

Москва, 2010

4843464

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени H.H. Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Барышников Анатолий Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор Трещалина Елена Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Копнин Борис Павлович

доктор медицинских наук, профессор Петерсон Сергей Борисович

Ведущая организация:

ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий

Защита состоится «-¿У» 2010f г. в часов

на заседании диссертационного совета Д. 001.017.01 РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан

2010 г.

Ученый секретарь диссертационного сове

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Применение противоопухолевой химиотерапии ограничено дозолими-тирующими побочными эффектами, что связано с отсутствием специфичности доставки противоопухолевых препаратов в опухоль. В связи с этим актуальными в настоящее время являются два направления достижения избирательности противоопухолевого действия:

- поиск новых лекарственных препаратов, избирательно связывающихся с опухолевыми клетками (мишень-ориентированные, «таргетные» препараты);

- совершенствование лекарственной формы (ЛФ) клинических препаратов, обеспечивающее селективное накопление лекарства в опухоли.

Эти направления реализовались в разработке липосомальных ЛФ противоопухолевых препаратов. Инкапсулирование цитостатиков в липосомы способствует уменьшению побочных эффектов путем экранирования контакта с органами - мишенями токсичности, а также улучшению биодоступности лекарственного вещества (ЛВ) за счет особенностей неоангиогенеза, особенно в солидных опухолях [Баллюзек Ф.В. и соавт., 2008; Барсуков Л.И., 1998; Барышников А.Ю. и соавт., 2000; Давыдов М.И., 2003; Hobbs S.K. et al., 1998]. Этот подход назван пассивной доставкой и реализован в онкологии для некоторых липосомальных противоопухолевых препаратов, в частности, доксорубицина (Доке) (Doxil, Caelyx, Myocet, Липодокс), даунорубицина {DaunoXome), винкристина (VincaXome, Marqibo), цисплатина (Lipoplatin, Липоплат), оксалиплатина (Lipoxal), митоксантрона (LEM) и др., а также интенсивно изучается в эксперименте при доклиническом изучении новых ЛФ [Оборотова H.A., 2001; Шалимов С.А. и соавт., 2004; Шубина Д.А. и соавт., 2006; Martin F., Boulikas T., 2000]. Для осуществления стратегии направленного транспорта лекарственного агента в настоящее время интенсивно изучаются иммунолипосомальные конструкции (ИК), направленные к опухолеассоциированным поверхностным антигенам или рецепторам на опухолевых клетках. В качестве векторных лигандов лучшими признаны монокло-нальные антитела (МКА), пептиды или факторы роста, которые избирательно связываются с соответствующей мишенью [Lopes de Menezes D.E., 1998; Maruyama К. et al., 1995; Mastrobattista E. et al., 1999; Park J.W., 2002; Sugano M. et al., 2000]. В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН разрабатываются ИК противоопухолевых препаратов различных классов. В качестве основных мишеней выступают поверхностные антигены CD5, CD20, MUC-I и HLA-DR, экспрессированные на клетках Т-клеточного лейкоза, B-клеточной лимфомы и злокачественных опухолях эпителиального происхождения [Соколова Д.В. и соавт., 2010; Толчева Е.В., 2007]. На этапах экспериментального изучения противоопухолевой активности ИК необходимы адекватные модели опухо-

левого роста in vitro (прескрининг) и in vivo (скрининг, углубленное и доклиническое изучение). Адекватной моделью является клеточная линия опухоли человека со стабильной селективной гиперэкспрессией сигнальных антигенов, к которым специфичны МКА, конъюгированные с ИК. Для in vivo желательна идентичность модели исходной опухоли и способность к росту у иммунодефицитных животных в виде ксено-графтов. Такая модель должна иметь также адекватные кинетические параметры (достаточно длительную фазу экспоненциального роста, образование измеряемых опухолевых узлов и т.д.), а также способность к неоваскуляризации для эффективной доставки ЛВ к мишени [Kelland L.R., 2004; Siwak D.R. et al., 2002; Troiani Т. et al, 2008]. Данная работа посвящена разработке ИК Доке против MUC-1 и HLA-DR антигенов с улучшенными терапевтическими характеристиками и разработке условий для их экспериментального изучения in vitro и in vivo.

Цель исследования: разработка иммунолипосомальных конструкций доксорубицина и адекватных опухолевых моделей для их доклинического изучения.

Задачи исследования:

1. Получить иммунолипосомальные конструкции с доксорубицином, направленные против MUC-1, HLA-DR антигенов-мишеней;

2. Определить химико-фармацевтические характеристики полученных иммунолипосомальных конструкций;

3. В системе in vitro оценить цитотоксичность и специфичность связывания иммунолипосомальных конструкций с мишенью;

4. Адаптировать к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude клеточные линии рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 человека, экспрес-сирующих сигнальные антигены-мишени;

5. Охарактеризовать подкожные ксенографты T-47D, SKOV3 и лимфомы Беркитга по основным биологическим характеристикам: гистотип, кинетика роста, ангиогенная активность, экспрессия антигенов-мишеней в процессе пассирования на мышах. Научная новизна

Впервые:

• в РФ получены две ИК против антигенов MUC-1 и HLA-DR известного противоопухолевого антибиотика Доке с высокой степенью включения действующего вещества;

• in vitro на антиген-положительных клетках опухолей человека банка клеточных культур РОНЦ показана высокая цитотоксическая активность и иммунологическая специфичность полученных ИК;

• адаптирована к росту под кожей у иммунодефицитных мышей Balb/c nude разведения РОНЦ клеточная линия рака молочной железы человека T-47D из Коллекции РОЩ;

• установлены основные биологические характеристики подкожных (п/к) ксено-графтов: лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, аденокарциномы яичников SKOV3 и рака молочной железы человека T-47D, экспрессирующих MUC-I, HLA-DR, CDI9 антигены-мишени;

• выявлен высокий уровень ангиогенной активности полученных ксенографтов по экспрессии основных маркеров неоангиогенеза: VEGF, HlF-la, CDU;

• in vivo сформирована панель моделей опухолей человека с высокой экспрессией маркеров опухолей эпителиального происхождения, а также злокачественной лимфомы для экспериментального (доклинического) изучения ИК, направленных против соответствующих мишеней.

Научно-практическая значимость. Получены и охарактеризованы по основным химико-фармацевтическим параметрам две иммунолипосомальные конструкции противоопухолевого антибиотика доксорубицин, направленные против MUC-1 и HLA-DR антигенов-мишеней. Разработаны адекватные опухолевые модели для исследования ан-типролиферативной активности адресных препаратов против указанных мишеней. В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН создан мини-банк культур клеток лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 и соответствующих штаммов в количестве, достаточном для проведения исследований in vivo.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на следующих конференциях:

• Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 2008» 3-5 декабря 2008 г.; Rusnanotech 6-8 октября 2009 г., Rusnanotech 2010 1-3 ноября 2010 г., Москва;

• Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонко-логия» 18-19 февраля 2009 г., Москва;

• Пятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16-20 марта 2009 г., Москва;

• IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 18-19 мая 2010 г., Нижний Новгород.

• II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноон-кология», 26-28 сентября 2010 г., Тюмень;

• На межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 30 сентября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 2 глав с описанием результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (165 источников). Диссертация иллюстрирована 44 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Получение конструкции иммунолипосом с инкапсулированным доксорубици-ном

Для приготовления липосом использовали метод обращения фаз. Точные навески фосфатидилхолина (ЕРС) (Lipoid, Германия), холестерина (Sigma, USA), 1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламина-Я-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000] (DSPE-PEG-2000) аммониевую соль ([Avanti Polar Lipids, Lnc., США) и п-нитрофенилкарбонил-ПЭГ-липида (PNp-PEG300o-lipid) (УнифектГрупп, Россия) в мольных соотношениях 7,0:4,0:0,15:0,05 растворяли в хлороформе. Смесь упаривали в круглодонной колбе на роторном испарителе под вакуумом при температуре не выше 32±2°С до образования липидной пленки, которую гидратировали 125 мМ раствора сульфата аммония. Полученную дисперсию многослойных липосом экструдирова-ли через поликарбонатные мембраны Nuclepore (Whatman, Германия) с диаметром пор 400, 200 и 100 нм при помощи ручного мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США). Инкапсулирование Доке, ОАО ОНОПБ (Россия) в ИК осуществляли по принципу активной загрузки [Haran G., 1993] с одновременной конъюгацией моноклональных антител (МКА) ICO-1/ICO-25. МКА добавляли исходя из мольного соотношения белок/pNP-P EG 3lm-lipid 1:40. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при двадцатикратном разбавлении липосомальной дисперсии буфером, содержащим 10 мМ HEPES (Л'-2-гидроксютилпиперазин-Л"-2-этансульфоновая кислота), AppliChem GmbH (Германия) и 145 мМ NaCL (pH 8,4). Доводили pH в дисперсии 3 М раствором NaOH до значения 8,5-8,6 и инкубировали в течение 12 ч при 4°С и постоянном перемешивании. Весовое соотношение препа-рат:липиды составило 0,16:1,0. Очистку дисперсий от не включившегося в везикулы препарата и не присоединившихся МКА проводили методом гель-фильтрации. Образец наносили на хроматографическую колонку СЮ/20, заполненную сефадексом G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция) и предварительно уравновешенную 0,15 М

раствором хлорида натрия (скорость 0,3-0,4 мл/мин в течение 1 ч). В качестве элюен-та использовали 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции - 0,5 мл/мин. Процесс очистки контролировали детектором UVis-920 с длиной волны 215 нм и рекордером REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция). Анализ среднего диаметра везикул и оценка их распределения по размерам проведена методом корреляционной спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США). Концентрацию везикул подбирали так, чтобы частота импульсов, поступающих на фотоэлектронный умножитель, составляла от 200 до 600 кГц. Содержание Доке в ИК определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (PCO) Доке при длине волны 252±2 нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов проводили относительно 95% этилового спирта в кюветах (оптический слой 10 мм). Содержание Доке (X, мг) рассчитывали по D • а ■ С

формуле: Х=-, где D - оптическая плотность раствора (ОПР) образца; Do -

Do * c0

ОПР PCO Доке; С - величина разбавления образца; Со - величина разбавления PCO Доке; а - навеска PCO Доке, мг. Эффективность включения Доке в везикулы (%) рас-D - С - Vi

считывали по формуле: В=—!-!-1-х 100 %, где Di - ОПР фракции с очищенны-

D • С • V

ми липосомами/ИК с Доке; D - ОПР исходной дисперсии; С, - величина разбавления фракции с очищенными липосомами/ИК с Доке; С - величина разбавления исходной дисперсии; V¡ - объем фракции с очищенным липосомами/ИК с Доке (мл); V- объем исходной дисперсии, нанесенной на хроматографическую колонку (мл). Определение белка, связанного с поверхностью пустых пэгилированных ИК, очищенных от не связавшихся МКА, по общепринятому методу с использованием медного комплекса би-цинхониновой кислоты. По данным оптической плотности стандартного белка (БСА) строили калибровочную кривую, по которой определяли содержание белка в анализируемом образце.

2. Исследование специфической активности иммунолипосомальных конструкций доксорубицина in vitro

Клеточные линии. В работе использовали опухолевые клеточные линии человека: Т-47D (карцинома молочной железы) и SKOV3 (аденокарцинома яичников) (Коллекция опухолевых штаммов и культур клеток РОНЦ). Клеточные линии культивировали в полной питательной среде при 37°С в атмосфере 5% С02. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста.

Опухолевый штамм. Использован штамм лимфомы Беркитта ЛБР-2 [Трещалина Е.М., 2009], первично полученный на мышах Balb/c nude в виде п/к ксенографтов из куль-

туры клеток линии Namalwa и затем специально адаптированный нами к росту в культуре клеток.

Оценка специфического связывания ИК с клетками-мишенями. Использовали метод непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ). Анализ результатов реакции проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CELLQuest. В каждой пробе анализировали не менее 5000 событий.

Оценка цитотоксической активности ИК Доке в МТТ-тесте. Для оценки способности ИК, загруженных Доке, избирательно доставлять лекарственный препарат к клеткам-мишеням, исследуемые образцы инкубировали с клетками 1 ч при 4°С. После этого клетки отмывали и оставляли в С02-инкубаторе при 37°С и 5% С02 на 71 ч. Контролем служили интакгные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. 3. Технологические методы получения и исследования опухолевых моделей in vivo

Лабораторные животные. В работе использовали 140 конвенциональных мышей-самок Balb/c nude 8-10 нед массой тела 18-21 г. Мышей содержали в SPF-зоне специализированного однокоридорного кондиционированного отсека в стерильных условиях дыхания, питания и содержания. Для введения в эксперимент мышей ранжировали по массе тела с разбросом не более 10% у разных особей (п=3). Мониторинг кинетики роста ксенографтов. Опухоли трансплантировали мышам п/к по стандартной методике. Пальпируемые узлы многократно измеряли и рассчитывали объем в динамике течение не менее месяца после трансплантации. По этим параметрам строили кривые и определяли стандартные показатели роста опухоли. Морфолологическое исследование п/к ксенографтов. Проводили по стандартному методу.

Иммунофенотипическое исследование. Опухолевый материал, полученный от каждого пассажа, типировали с помощью прямой/ непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции. Использовали следующую панель МКА: HLA-ABC (Ser о tec), HLA-DR (Serotec), CD20 (Serotec), ICO-I80, ICO-1, ICO-25 (МНЦ «МедБиоСпектр»), CD\9 (Serotec), CDA5 {Serotec), CD227 (Beckman Coulter), изотопические контроли, конью-гированные с FITC и РЕ (Beckman Coulter). Для определения степени чистоты опухолевой суспензии (инокулят) ЛБР-2 проводили двойное окрашивание клеток МКА к молекулам МНС I класса HLA-ABC и общелейкоцитарному антигену CD45. Иммуногистохимическое исследование. Проводили с помощью ИГХ-анализа срезов парафиновых блоков опухолей. Ангиогенную активность опухоли определяли по экспрессии белков, запускающих процесс ангиогенеза HIF-la (клон антител Hlalpha 67,

разведение 1:1000, Abcam) и VEGF (клон С-1, разведение 1:300, Santa Cruz Biotech) и по количеству CD31* (поликлональные антитела, разведение 1:100, Abcam) микрососудов в опухоли. Для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество А7-67+(клон MIB-1, разведение 1:100, DAKO) клеток на 200-300 опухолевых клеток. Ki-67 определяли по формуле: ПА = число Ki-вТ клеток * 100/общее число клеток, где ПА - пролиферативная активность опухоли. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана) и интенсивность иммунного окрашивания.

Статистическая обработка данных. Выполняли с использованием компьютерной программы «BIOSTAT» (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v.5.0. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.

Нормативные документы при работе с лабораторными животными. Все манипуляции с лабораторными животными выполнены в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований, изложенными в «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», ЕЭС, Страсбург, 1985 г. [Ланималогия, 1993], руководствуясь требованиями Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000) [Большаков О.П. с соавт., 2002], а также рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977 и Приказом Минсель-хоза РФ №490 от 05.11.2008 «Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии» а также Приказом МЗиСР РФ №708 от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Завершение экспериментов с животными. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, трупы подвергали замораживанию и кремировали в специализированном подразделении РОНЦ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка технологии получения стерически стабилизированных иммуноли-посомальных конструкций доксорубицина

Технология получения стерически стабилизированных ИК Доке включает: получение больших многослойных липосом; получение малых однослойных липосом; инкапсулирование препарата в везикулы с одновременной конъюгацией молекул векторных лигандов; очистка иммунолипосом от не включившегося препарата и не связавшихся МКА; определение основных параметров полученных иммунолипосомаль-ных конструкций: размер везикул, включение препарата, количество MICA, связанных с липосомой.

Получение больших многослойных липосом. Нами было предложено следующее молярное соотношение компонентов - 7:4:0,15:0,05. В табл. 1 представлены значения концентрации липидов, использованных для получения модели многослойных липосом и их мольные соотношения.

Таблица 1.

Липидный состав больших многослойных липосом

Липид Молярная масса, г/моль Концентрация, мг/мл Мольный %

Фосфатидилхолин 760,09 47,4 62,5

Холестерин 386,7 13,34 35,7

DSPE-PEG20„o 2805 3,73 1,3

pNP-PEGmo-lipid 3850 I 1,67 0,44

£ =66,14

Дисперсию больших многослойных липосом получали гидратацией липидной пленки 125 мМ раствором сульфата аммония (NH^jSO4.

Получение малых однослойных липосом. Нами выбран метод экструзии, позволяющий получать липосомы с довольно узким распределение по размерам, которое определяется диаметром пор фильтра.

Инкапсулирование препарата в везикулы с одновременной конъюгацией монокло-нальных антител. Загрузку препарата в ИК проводили с использованием ионного градиента сульфата аммония, который стабилен во времени, не требует изменения рН внешней среды и универсален для липосом различного состава независимо от метода получения. Встраивание в состав везикул п-нитрофенилового эфира полиэтиленгли-коль-липидного коньюгата (pNР-Р EG ¡aM-l'P'd) позволило эффективно в 1 стадию конъюгировать молекулы МКА. Использование в составе коньюгата PEGSooo предотвратило экранирование молекул МКА цепями DSPE-PEG-2000, также входящего в состав везикул.

Получение чистой фракции ИК. Очистку ИК от не включенного Доке и не связавшихся МКА проводили путем гель-фильтрации. Метод основан на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой. Контроль разделения фракций осуществляли на проточном спектрофотометре UVis-920. На выходе регистрировали четкое разделение на 2 пика, соответствующие чистой фракции ИК с инкапсулированным Доке и буферу, состоящему из 10 мМ HEPES и 145 мМ NaCl (рис.1 А, Б). Сошедшие фракции собирали в стерильные флаконы и подвергали спекторофотомет-рическому анализу.

Рис. 1. Хроматограммы очистки ИК с инкапсулированным Доке: А - разделение 1СО-1 ИК (скорость движения бумаги в рекордере 2 мм/мин); Б - разделение 1СО-25 ИК (скорость движения бумаги в рекордере 1 мм/мин). Обозначения: I - фракция очищенных ИК с инкапсулированным Доке; II - буфер НЕРЕБ с ЫаС1.

Определение размера полученных ИК. Средний размер полученных 1С0-25- и 1СО-1-ИК существенно не различался и составил 140±5 и 152±10 нм соответственно. Спектрофотометрическое определение содержания Доке в ИК. Первоначально определяли максимумы поглощения спиртовых растворов субстанции Доке и препарата в исследуемых образцах в диапазоне длин волн 200-700 нм для выбора рабочей длины волны. В случае ИК исследовали также влияние МКА на спектрофотометрическое определение препарата в везикулах. Полученные спектры поглощения спиртовых растворов субстанции Доке, ИК и липосомального Доке, а также первых фракций ли-посомального и 1СО-1-ИК Доке представлены на рис. 2.

о

1.2

1.0

о.а

0.6

0.4

0.2

0.0

субстанция Доке: имиунолипосомальный Доке: лилосомлльный Доке:

I фракция иииунолмпосоидльиого Доке: I фракция лнлосомлльного Доке

300

400 500

>Л/ауе1епдШ (пт)

600

700

Рис. 2. Спектры поглощения образцов спиртовых растворов различных форм Доке.

На полученной спектрограмме наблюдается 2 четких максимума при 234 нм и 252 нм и 4 менее выраженных максимума при 289, 481, 496 и 532 нм. Спектр поглощения спиртового раствора липосомального//С0-7-ИК Доке по положению максимумов и форме кривой были идентичен спектру спиртового раствора субстанции Доке. На спектрограмме, полученной для спиртовых растворов субстанции Доке, ИК и липо-сомального Доке, а также I фракций липосомального и 1СО-25-ИК Доке выявлено 6 аналогичных максимумов поглощения в области 200-600 нм. Спектр поглощения спиртового раствора 1СО-25-ИК Доке по положению максимумов и форме кривой также были идентичны спектру спиртового раствора субстанции Доке. В качестве аналитической выбирали длину волны 252 нм.

Для исследования потенциального влияния МКА 1СО-25 и 1СО-1, используемых в качестве векторов, и компонентов липосом на спектральные характеристики Доке, прописывали максимумы поглощения спиртовых растворов МКА, а также пустых липосом. Полученные спектрограммы представлены на рисунке 3 А, Б и В.

«1

В

309 «0 510 НО

УУауекпдМ (пш)

Я) « М I

\ZVavelength (пш)

т и во (а ж и \Л/ауе1епдШ (пт)

Рис. 3. Спектрограммы спиртовых растворов пустых липосом (А), МКА 1СО-25 (Б) и МКА 1СО-1 (В).

Как видно из полученных спектрограмм, поглощение спиртовых растворов компонентов, входящих в состав липосом/ИК, а также МКА в области выбранной аналитической длины волны было минимальным.

Количественное определение содержания доксорубицина в дисперсиях. Оценку эффективности включения Доке в везикулы проводили путем определения содержания препарата в исходной дисперсии, внесенной в колонку, атак же в 1-х фракциях, полученных на выходе из колонки. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Содержание доксорубицина в различных фракциях

Образец D * D ** Масса PCO Доке, мг Содержание Доке в образце Эффективность включения препарата в везикулы, %

Исходная дисперсия липосом с Доке

1 0,624 х = 0,691

2 0,623 0,630 0,700 мг/мл 89,5-91,0

3 0,620 ДЗс = 0,002

Исходная дисперсия 1СО-1-ИК Доке

1 0,626 Зс = 0,694

2 0,626 0,630 0,700 мг/мл 91,8-94,5

3 0,624 Ах =0,001

Исходная дисперсия 1СО-25-ИКДоке

1 0,623 х = 0,695 мг/мл

2 0,627 0,630 0,700 92,0-94,9

3 0,628 Ах = 0,002

/ фракция липосом Доке

1 0,474 х = 0,622 мг ДЗс = 0,005

2 0,490 0,630 0,700 89,5-91,0

3 0,497

Iфракция ICO-1-И Доке

1 0,504 х = 0,645 мг Дх = 0,001

2 0,500 0,630 0,700 91,8-94,5

3 0,506

I фракция 1СО-25-ИК Доке

1 0,505

2 0,507 0,630 0,700 л = 0,649 мг А* = 0,005 92,0-94,9

3 0,486

Примечание: *Среднее значение оптической плотности образца; **Оптическая плотность PCO Доке.

Определение количества МКА. связанных с поверхностью липосом. Среднее количество белка во всей очищенной фракции пустых ICO-I-ИК составило 0,302 мг. Из литературных данных известно, что одну липосому диаметром 100 нм составляют 100.000 молекул липидов [Цибулькина Е.А., 2008; Enoch H.G., 1979], тогда на липосому диаметром 152 нм приходится 152.000 молекул липидов. Если учесть, что средняя молекулярная масса липидов 760, а молекулярная масса иммуноглобулинов IgG3 170.000 Da, то, зная соотношение фосфолипидов и белка в полученном препарате,

можно вычислить, сколько молекул антител приходилось на одну липосому:

mN4

N=

М

где N - число молекул, т - масса вещества, взятого согласно методике

приготовления ИК, М- молекулярная масса вещества.

Таким образом, в среднем на одну ICO-1-ИК приходилась ~ 21 молекула конъ-югированных антител. Среднее количество белка во всей очищенной фракции пустых ICO-25-ИК составило 0,292 мг. На одну липосому диаметром 140 нм приходится 140.000 молекул липидов. Если учесть, что количество липидов в препарате составило в среднем 9,48 мг, а молекулярная масса иммуноглобулинов IgGl составляет 146.000 Da, то количество молекул, приходящееся на одну липосому, составило ~ 23. 2. Исследование специфической активности ИК Доке in vitro

Оценка специфического связывания иммунолипосом с клетками-мишенями. Для снижения неспецифического связывания липосом с клетками инкубацию с везикулами проводили при +4°С. С помощью МКА ICO-1 в популяции клеток ЛБР-2 выявлено 97% позитивных по экспрессии антигена-мишени клеток (рис. 4 Б). При инкубации клеток с пэгшшрованными липосомами, не конъюгированными с МКА, связывание было незначительным (0,5% неспецифически связавшихся клеток - рис. 4 В). С пустыми ИК связывались 97% клеток-мишеней (Рис. 4 Г). После инкубации клеток с ИК без последующей инкубации с F(ab)2, меченными F1TC, в канале FL2 за счет аутоф-луоресценции Доке регистрировали 98% связывания с клетками ЛБР-2 (Рис. 4 Д), а после инкубации с меченными FITC F(ab)2 фрагментами отмечали двойное окрашивание 96±3% клеток (Рис. 4 Е).

S1 "о:

2-

Г

, 4, •.-О»

Щш

---'----1 Y '

1<Г 1<Г 151 1-Н

Е ■

. ••-• -Л

Рис. 4. Анализ специфического связывания ICO-1-UK с клетками ЛБР-2 методом проточной цитофлуориметрии: А - неокрашенные клетки; Б - клетки, инкубированные с МКА ICO-i, В - клетки, инкубированные с липосомальным Доке; Г - клетки, инкубированные с пустыми ИК; Д - клетки, инкубированные с ИК Доке без обработки F(ab)2 /FITC; Е - клетки, инкубированные с ИК Доке и F(ab)2, меченными FITC.

В популяции линии ЯКОУЗ выявлено 98% М11С-1 клеток-мишеней (Рис. 5 Б). При инкубации с липосомальной формой Доке специфическое связывание не отмечали (рис. 5 В), тогда как пустые липосомы связывались с 95% клеток (Рис. 5 Г). Специфическое связывание 1СО-25-ИК с инкапсулированным препаратом, выявляемое как за счет аутофлуоресценции препарата, так и за счет метки Р/7~С Р(аЬ)2 фрагментов, составило 97±2% (рис. 5 Е).

s! -

i В

д

Рис. 5. Анализ специфического связывания ICO-25-ИК с клетками линии SKOV3 методом проточной цитофлуориметрии: А - неокрашенные клетки; Б - клетки, инкубированные с МКА ICO-25; В - клетки, инкубированные с липосомальным Доке; Г -клетки, инкубированные с пустыми ИК; Д - клетки, инкубированные с ИК Доке без обработки F(ab)2!FITC; Е - клетки, инкубированные с ИК Доке и F(ab)2, меченными FITC.

Оценка цитотоксической активности ИК Доке. В исследовании использовали очищенные ИК с Доке, липосомальную форму, препарат в традиционной ЛФ, а также пустые ИК. В случае 1СО-25-ШС также исследовали МКА ICO-25, так как они сами по себе могут оказывать цитотоксическое действие. Разведения пустых ИК и МКА, готовили исходя из концентрации липидов и МКА в ИК Доке. Каждый препарат исследовали в 5 концентрациях (табл. 3 и 4).

Таблица 3.

Концентрации лекарственных форм, использованные в исследовании цитотоксиче-ского действия ICO- ¡-ИК Доке

Лекарственная форма Стоковые Стах в лунке, мкг/мл Шаг разведения

С*, мг/мл объем, мл

Липосом. Доке 0,2 2,0 0,015 2

Ж Доке 0,2 2,0 0,015 2

Доке 0,2 2,0 0,0! 5 2

Примечание: * Концентрация препарата.

Таблица 4.

Концентрации лекарственных форм, использованные в исследовании цитотоксиче-ского действия 1СО-25-ИКДоке

Лекарств нная форма Стоковые Сшах в лунке, мкг/мл Шаг разведения

С*, мг/мл объем, мл

Липосом. Доке 0,2 2,0 0,018 2

ИК Доке 0,2 2,0 0,018 2

Доке 0,2 2,0 0,018 2

Примечание: * Концентрация препарата.

По результатам теста строили кривые выживаемости клеток и определяли значения 50% ингибирующей концентрации 1С10 (рис. 6).

- иммунолипосомальныи доксорубицин

липосомальный доксорубицин

- доксорубицина гидрохлорид

- пустые иммунолипосомы

5 10

концентрация доксорубицина, мкг/мл

Рис. 6. Цитотоксический эффект Доке в различных формах в отношении клеток ЛБР-2.

Как видно из графика, лучший цитотоксический эффект проявил свободный Доке (традиционная ЛФ). При увеличении концентрации препарата уменьшается количество выживших клеток. /С;0 для традиционного доксорубицина гидрохлорида составило 2,5 мкг/мл. ИК Доке близок к липосомальной форме - значения 1С50 5,5 и 6,1 мкг/мл соответственно. Это может объясняться тем, что НЬЛ-ЭЯ антиген не способен к внутриклеточной интернализации, поэтому высвобождение препарата идет во внеклеточное пространство, как и в случае стерически стабилизированной липосомальной формы препарата «Пустые» ИК не проявляли цитотоксическое действие в отношении клеток лимфомы Беркитта человека ЛБР-2.

На рис. 7 представлены результаты МТТ-теста на клетках линии БКОУЗ.

110

100

ей 90

ас о 80

0} 70

i 60

и О SO

£ ш 40

га

со X 30

X л 20

m 10

0

IP«

-А— иммунолипосомальныи доксорубицин

-©— липосомальный доксорубицин

—Q— доксорубицина гидрохлорид

—пустые

иммунолипосомы

MKAICO-25

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18

концентрация доксорубицина гидрохлорида, мкг/мл

Рис. 7. Цитотоксический эффект Доке в различных формах в отношении клеток SKOV3.

Как видно из полученного графика, МКА ICO-25, используемые в качестве направляющего вектора в ИК в исследованном диапазоне концентраций не проявляют цитотоксического действия, а Доке в ИК был цитотоксичным соизмеримо с традиционной ЛФ: выживаемость клеток при концентрации Доке 18 мкг/мл составила 45,8±5,5% и 49,9±12%, для 7,5 мкг/мл - 60,6±3,05% и 6б,8±5,23% соответственно (различия недостоверны). Для липосомального Доке в изученных концентрациях 1С50 не достижима.

Таким образом, получены иммунолипосомальные конструкции Доке с высокой степенью включения действующего вещества и выраженной специфической активностью in vitro.

3. Разработка моделей для доклинического исследования иммунолипосомальных конструкций доксорубицина против HLA-DR и MVC-1 позитивных клеток

Для изучения адресных препаратов, направленных против HLA-DR антигена, нами выбран известный штамм лимфомы Беркитта человека ЛБР-2 хранения РОНЦ, а для ати-MUC-l адресных препаратов - клеточные линии SKOV3 и T-47D, которые были адаптированы к росту на иммунодефицитных мышах Balb/c nude.

3.1. Основные биологические характеристики штамма ЛБР-2 как модели для изучения smth-HLA-DR препаратов

В качестве основных характеристик данного штамма изучены кинетические параметры роста подкожных ксенографтов ЛБР-2, проведено морфологическое исследование

полученных опухолей, верифицирована экспрессия антигенов-мишеней и определена ангиогенная активность опухоли.

Мониторинг кинетики роста подкожных ксенографтов ЛБР-2 на мышах Balb/c nude. При работе со стандартным адаптированным к культуральному росту штаммом ЛБР-2 первый пассаж выполнен инокулятом в стандартной прививочной дозе 5*106 клеток на мышь. 100 % выход опухолей получен к 18 дню (латентный период) после инокуляции, Кср=336[198-474]мм3. К 22 дню опухолевый узел увеличился в 5,1 раза до Кср=1734[1312^2156]мм3 и сохранял постоянную скорость роста до 26 дня опыта. Экспоненциальная фаза роста, таким образом, составила 8 дней. Стационарную фазу роста с увеличением объема опухоли в 1,2 раза наблюдали в период от 26 до 30 дня опыта. В результате к концу наблюдения объем опухолей увеличился почти в 18 раз и достиг Vcp=5655[4311-6999]мм3. Проведено 10 пассажей.

Гистологическая характеристика подкожных ксенографтов ЛБР-2. Во всех гистологических препаратах, полученных из опухолевых узлов 1-10-го пассажей, выявлен диффузный рост относительно мономорфных мелких клеток полигональной формы с круглым или овальным ядром, по размерам превышающим ядро малого лимфоцита. Ядерная мембрана четкая. В ядре определяются множественные (2-5) базофильные нуклеолы. Характерны многочисленные фигуры митоза. Выявляется высокий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 приближен к 100%). Присутствует типичная для данного типа лимфомы картина «звездного неба» («starry sky»), обусловленная присутствием большого числа макрофагов. Выявленная при патоморфологи-ческом исследовании структура полученных нами п/к ксенографтов ЛБР-2 идентична гистологической картине лимфомы Беркитга человека [Барях Е.А., 2009]. Иммунофенотипическая характеристика подкожных ксенографтов ЛБР-2. Первоначально в популяции клеток штамма ЛБР-2, адаптированного к культуральному росту, выявлено 95±3% клеток, экспрессирующих МНС I класса; 81±5% CD19-позитивных клеток (средняя интенсивность флуоресценции (MFI - mean fluorescence intensity) составила 35,5 единиц флуоресценции); 87±2% С£Ш-позитивных клеток, MF1 составляла 20,4; 92±3% клеток, экспрессирующих МНС II класса HLA-DR, MFI составляла 27,1. При исследовании экспрессии CD45 и HLA-ABC как критериев степени чистоты опухолевого материала от загрязнения клетками мышиной стромы на 1-10 пассажах при двойном окрашивании с использованием МКА к исследуемым маркерам выявлено 94±2% позитивных клеток, что свидетельствует о чистоте опухолевого инокулята. Значение средней интенсивности флуоресценции клеток п/к ксенографтов ЛБР-2 1-го пассажа, экспрессирующих B-клеточный маркер CD 19, было относительно невысо-

ким по сравнению с исходным на клеточной линии и составило 12,8 единиц флуоресценции (рис. 8 А).

10" 10' 1Э2 10л 1С' F11+1

Рис. 8. Гистограммы экспрессии CD19 антигена на клетках ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude, 1-8 пассажи (А-3 соответственно); по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенные гистограммы -изотопический контроль; прозрачные гистограммы с черной линией исследуемый антиген.

Тенденция к снижению сохранялась вплоть до 4 пассажа - показатель MFI снизился до 9,6 (рис. 8 Г). Однако, начиная с 5 пассажа, интенсивность флуоресценции клеток, экспрессирующих маркер CD 19 начала восстанавливаться и к 8 пассажу достигла исходного уровня 32,8 (рис. 8 3). Это свидетельствует о завершении процесса адаптации культуры к условиям роста in vivo.

Экспрессия антигена CD20 полностью утрачивалась уже на 1 пассаже (значение MFI- 5,6 единиц флуоресценции) и не восстанавливалась на последующих (рис. 9 А-Г). Потеря экспрессии В-клеточного антигена может быть обусловлена относительно высоким иммунным ответом гибридных nude мышей.

!0° Ю1 102 103 И* 10° ю' 102 н>3 104

FL1-H F12-H

Рис. 9, Гистограммы экспрессии CD20 антигена на клетках ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude, 1-4 пассажи (А-Г соответственно); по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенные гистограммы -изотопический контроль; прозрачные гистограммы с черной линией исследуемый антиген.

Количество клеток, экспрессирующих молекулы МНС II класса (НЬА-йК) на первом пассаже снизилось до 58%, однако начиная со 2 пассажа количество антиген-позитивных клеток было относительно высоким на протяжении всего периода пассирования и составляло 87-98% (рис. 10 А-3). При этом средняя интенсивность флуоресценции МГ1 клеток колебалась от 21-103, что может быть связано с изменением степени активации лимфоцитов в п/к ксенографтах различных пассажей.

Iff1 Iff* 10" fllM

Рис. 10. Гистограммы экспрессии HLA-DR на клетках п/к ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude, 1-8 пассажи (А-3 соответственно); по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенные гистограммы -изотопический контроль; прозрачные гистограммы с черной линией исследуемый антиген.

Определение ангиогенной активности подкожных ксенографтов ЛБР-2. Показано, что в цитоплазме и ядре в 80-100% клеток ЛБР-2 наблюдается значительное накопление HIF-la без выраженных различий для разных пассажей (рис. 11 А). Это свидетельствует о высоком уровне гипоксии в опухолевом узле, который является ключевым фактором для запуска программы неоангиогенеза. Как правило, интенсивность окрашивания антителами к HIF-la в центральной части опухолевого узла была выше, чем в периферических участках. Экспрессия основного фактора ангиогенеза VEGF наблюдалась в цитоплазме 60-80% опухолевых клеток, интенсивность окрашивания и количество положительных клеток значимо не изменялись на протяжении всего периода пассирования (рис. 11 Б). Среднее количество микрососудов в опухоли, окрашенных антителами к CD31, составило 6±3 в поле зрения при увеличении Х40 (рис. 11 В) и значимо не изменялось от пассажа к пассажу. Это подтверждает высокую ан-гиогенную активность опухоли и дает возможность прогнозировать относительно хорошую биодоступность внутривенной терапии.

Рис. 1 1. Иммуногистохимическое окрашивание срезов ксенографта ЛБР-2 антителами к HlF-la Х20 (A), VEGFХ20 (Б), CD31 (В) Х40.

3.2. Получение моделей для доклинического изучения иммунолипосомальных форм, направленных против MUC-1 антигена

Мониторинг кинетики роста п/к ксенографтов SKOV3 in vivo. У 3 мышей, которым трансплантировали по 60 мг опухолевой ткани, подкожные узлы появились к 8 дню (латентный период) после имплантации, Кср=131[78^185]мм3. К 15 дню опухоль увеличилась в 3,6 раз, Кср=480[408-^-554]мм3 (экспоненциальная фаза). В период с 15 по 30 день установилась стационарная фаза роста (продолжительность 15 дней): на 21 день Кср=1439[1048-И830]мм3 (увеличение в 2,9 раза), на 30 день FCjo=2643[1806^3480]mm3 (увеличение в 1,8 раз).

Гистологическая характеристика п/к ксенографтов SKOV3. Опухоль состоит из сплошного пласта крупных, полиморфных клеток, разделенных узкими прослойками соединительной ткани. Ядра овально-округлой формы. Редко встречаются желези-стоподобные структуры. Имеются многочисленные сосуды. Фигуры митоза не мно-! гочисленны (2-3 в поле зрения). Антителами к Ki-67, с помощью иммуногистохими-ческого окрашивания, выявлен относительно высокий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 >50%).

Иммунофенотипическая характеристика п/к ксенографтов SKOV3. В культуре клеток, использованных в качестве инокулята для первого пассажа на мышах, исходно выявлен высокий уровень экспрессии MUC-1 антигена 97±6%, значение MFI составило 142. На протяжении 5 пассажей интенсивность флуоресценции клеток, экспресси-рующих MUC-1 антиген была стабильно высокой и составляла: на 1 пассаже - 101; на 2 - 130; на 3 - 102,7; на 4 пассаже - 140,3 и на 5 пассаже - 171,2 (рис. 12 А-Д).

Рис. 12. Гистограммы распределения клеток п/к ксенографтов (1-5 пассажи, А-Д, соответственно) по экспрессии М17С-1 антигена; по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенные гистограммы - изотопический контроль; прозрачные гистограммы - исследуемый антиген.

Определение ангиогенной активности п/к ксенографтов БКОУЗ. Исследование показало, что значимых различий в накоплении Н1Е-1а в цитоплазме и ядре опухолевых клеток от пассажа к пассажу не наблюдалось. Иммунное окрашивание наблюдалось в 80-100% опухолевых клеток (рис. 13 А). Экспрессия основного фактора ангиогенеза УЕОЕ наблюдалась в цитоплазме 60-70% опухолевых клеток, интенсивность окрашивания и количество положительных клеток значимо не изменялась на протяжении всего периода пассирования (рис. 13 Б).

Рис. 13. Иммуногистохимическое окрашивание срезов п/к ксенографтов антителами на HIF-la Х20 (A), VEGF Х20 (Б), CD31 (В).

Количество сосудов в опухоли, выявляемое антителами к CD31, составило 4±2 в поле зрения (рис. 13 В). Таким образом, стабильно высокая экспрессия факторов неоангио-генеза в п/к ксенографтах SKOV3 на протяжении 5 пассажей указывает на высокую ангиогенную активность этой опухолевой модели.

Мониторинг кинетики роста п/к ксенографтов T-47D in vivo. 1 -й пассаж получен имплантацией 1х107 клеток T-47D на мышь. К 9 дню (латентный период) получен 100% выход опухолей, Кср=266[257^275]мм3. К 15 дню объем увеличился в 3 раза, Кср=817[705^-929]мм3 (экспоненциальная фаза 6 дней). Затем рост опухолей замедлился, и с 15 по 22 день объем опухоли увеличился до Гср=1912[1448-2376]мм3 (в 2, 3 раза). В период 22-30 день Vcp=2307[1551-К3063]мм3 (увеличение в 1,2 раза). Таким образом, стационарная фаза составила 15 дней.

Гистологическая характеристика п/к ксенографтов Т-47Р. Опухоль состоит из солидных внутрипротоковых пролифератов. Протоки выполнены полиморфными клетками с круглыми ядрами. Имеются многочисленные фигуры митоза (2-10 в поле зрения). Строма опухоли рыхлая, хорошо развита. Имеются многочисленные сосуды. Выявляется высокий уровень пролиферативной активности, индекс Ю'-67~100%. Иммунофенотипическая характеристика п/к ксенографтов Т-47Р. В культуре клеток Т-47Р, использованных в качестве инокулята для первого пассажа на мышах, исходно выявлен высокий уровень экспрессии МиС-1 антигена 98±2%, значение МЕ1 составило 131. На протяжении всего 5 пассажей интенсивность флуоресценции клеток, экспрессирующих М11С-1 антиген оставалась стабильно высокой и составляла: на 1 пассаже - 131; на 2 - 129; на 3 - 165,2; на 4 пассаже - 131; на 5 - 155,3 соответственно (рис. 14А-Д).

Рис. 14. Гистограммы распределения клеток п/к ксенографтов Т-47В 1-5 пассажа (АД) по экспрессии МиС-1 антигена; по оси абсцисс - количество клеток: по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенная гистограмма — изотипический контроль; прозрачная гистограмма - исследуемый антиген.

Определение ангиогенной активности подкожных ксенографтов Т-47Р. Полученные результаты выявили иммунное окрашивание в 80-100% опухолевых клеток на протяжении всего периода пассирования. Интенсивность окрашивания антителами к НШ-1а была выше в центральной, чем в периферической части опухоли (рис. 15 А). Экспрессия УЕСЕ была высокой в стромальном компоненте, интенсивность окрашивания значимо не изменялась на протяжении всего периода пассирования (рис. 15 Б). С помощью антител к УЕвЕЯ-З на всех пассажах выявляется небольшое количество лим-фососудов (1-2 в поле зрения) (рис. 15 В). Количество СР31+ сосудов в опухоли составило 7±2 в поле зрения (рис. 15 Г). Стабильно высокая экспрессия факторов неоан-гиогенеза в п/к ксенографтах Т-47Р на протяжении 5-ти пассажей позволяет признать данную опухолевую модель высоко ангиогенной.

Рис. 15. Иммуногистохимическое окрашивание срезов п/к ксенографтов T-47D антителами на HIF-la Х20 (A), VEGFX20 (Б), VEGFR-3 Х40 (В), CD31 Х40 (Г).

Таким образом, полученные нами данные позволяют рекомендовать штаммы лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, а также рака молочной железы T-47D и яичников SKOV3 в качестве доклинических моделей для изучения специфической противоопухолевой активности иммунолипосомальных форм противоопухолевых препаратов, направленных против HLA-DR и MUC-1 антигенов-мишеней, соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения стерически стабилизированных ICO-1 и ICO-25 иммунолипосомальных конструкций с размером 152±10 и 140±5 нм, направленных против HLA-DR и MUC-1 антигенов, с включением действующего вещества до 94% и выраженной антигенспецифичностью in vitro 96±3 и 97±2% соответственно.

2. Полученные новые иммунолипосомальные конструкции проявляют выраженный цитотоксический эффект в отношении антиген-положительных клеток-мишеней: в культуре HLA-DR+ клеток лимфомы Беркитта ЛБР-2 цитотоксичность ICO-1-иммунолипосомальных конструкций доксорубицина достоверно не отличалась от ли-посомального препарата (р>0,05); в культуре MUC-1+ клеток SKOV3 ICO-25-иммунолипосомальные конструкции доксорубицина достоверно (р<0,05) более цито-токсичны, чем липосомальная форма.

3. Штамм перевиваемой лимфомы Беркитта человека ЛБР-2 HLA-DR+ из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ адаптирован к росту in vitro с сохранением устойчивой экспрессии маркера.

4. Клеточные линии аденокарциномы яичников человека SKOV3 и рака молочной железы человека T-47D с гиперэкспрессией антигена MUC-1+ адаптированы к росту под кожей иммунодефицитных мышей Balb/c nude разведения РОНЦ с сохранением устойчивой экспрессии маркера в течение 5 пассажей.

5. Подкожные ксенографты из клеточных линий ЛБР-2 (HLA-DR+) SKOV3 (MUC-1+) и T-47D (MUC-J+) при многократном пассировании на мышах Balb/c nude сохраняют экспрессию антигена-мишени, идентичны первичной опухоли по гистологической структуре, имеют адекватные параметры роста, высокую ангиогенную активность и представляют собой специфичные модели для доклинического изучения противоопухолевой активности препаратов, направленных против сигнальных мишеней.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соколова Д.В., Рубцова М.А., Саквина О.И., Костин К.В., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Иммунолипосомы - средство направленной доставки противоопухолевых препаратов. // Сборник тезисов докладов научно-технологических секций Международного форума по нанотехнологиям RusNanoTech Москва, 3-5 декабря 2008. -Т. 2.-С. 397-399.

2. Соколова Д.В., Рубцова М.А., Кортава М.А., Костин К.В., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Иммунолипосомы - средство направленной доставки противоопухолевых препаратов. // Материалы научной конференции с международным участием «Наноонкология» Москва, 18-19 февраля 2009. Российский Еиотерапевтический Журнал.-2009- Т.8,№1-С.Ю.

3. Sokolova D.V., Kostin K.V., Polozkova А.Р., Kortava M.A., Orlova O.L., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Y. Preparation of anticancer drug' immunoliposomal formulations for the directed delivery in a tumor. // Abstracts. The second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Reseachers. October 6-8, 2009. - Vol.1. -P. 804-806.

4. Baryshnikov A.Y., Kosorukov V.S., Sokolova D.V., Sokolova Z.A., Mikhailova T.V., Kosobokova A.N., Skrypnik E.A., Dorokhov Y.L. Monoclonal antibodies as a tool for direct drug delivery system. // Abstracts of the Second Nanotechnology international Forum participants. October 6-8, 2009. - P. 524-525.

5. Соколова Д.В., Тазина E.B., Кортава M.A., Хугаева О.В., Полозкова А.П., Иванов П.К., Гриневич А.С.,Чинарева И.В.,Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Ahth-CD20 и анти-HLA-DR иммунолипосомальные формы доксорубицина: технология получения и антигенспецифичность in vitro. // Материалы IX Всероссийской научно- практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2010 - Т.9, №2. - С. 90.

6. Соколова Д.В., Степанова Е.В., Трещалина Е.М., Барышников А.Ю. Оценка уровня экспресии основных факторов неоангиогенеза в подкожных ксенографтах лимфомы Беркитга человека. // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2010 - Т.9, №2. - С. 58.

7. Соколова Д.В., Степанова Е.В., Голубева В.А., Трещалина Е.М., Барышников А.Ю. Основные биологические характеристики ксенографтов лимфомы Беркитга че-

ловека ЛБР-2 как мишени для таргетной терапии. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, № 1. - С. 49-52.

8. Соколова Д.В., Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Степанова Е.В., Голубева В.А., Барышников А.Ю. Модели для доклинического изучения in vivo противоопухолевой активности таргетных препаратов против антигена MUC-1. // Российский биотерапевтический журнал. -2010. - Т.9, №3. - С. 55-60.

9. Соколова Д.В., Тазина Е.В., Кортава М.А., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Иванов П.К., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Анти-MUC-l иммунолипосомальная форма доксорубицина: технология получения и антигенспецифичность in vitro. // Материалы II Всероссийской научной конференции с международным участием «Нано-онкология». Тюмень, 26-28 сентября 2010. Российский Биотерапевтический Журнал. -2010,- Т.9, №3,-С. 21.

10. Соколова Д.В., Тазина Е.В., Кортава М.А., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Иванов П.К., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Оценка цитотоксической активности анти-МиС-1 иммунолипосомальной формы доксорубицина. // Материалы II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология». Тюмень, 26-28 сентября 2010. Российский Биотерапевтический Журнал. - 2010. - Т.9, №3. - С. 21.

11. Барышников А.Ю., Соколова Д.В., Кортава М.А., Хугаева О.В., Оборотова H.A. Иммунолипосомы - средство направленной доставки противоопухолевых препаратов. // Тезисы докладов XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2010». Иваново, 29 июня-2 июля 2010. - С. 182.

Подписало в печать: 22. И .20] О

Заказ № 4650 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы

Применение противоопухолевой химиотерапии ограничено дозо-лимитирующими побочными эффектами, что связано с отсутствием специфичности доставки противоопухолевых препаратов в опухоль. В связи с этим актуальными в настоящее время являются два направления достижения избирательности противоопухолевого действия:

- поиск новых лекарственных препаратов, избирательно связывающихся* с опухолевыми клетками (мишень-ориентированные, «таргетные» препараты);

- совершенствование лекарственной формы (ЛФ) клинических препаратов, обеспечивающее селективное накопление лекарства в опухоли.

Эти,направления, в частности; реализовались, в разработке липосомальных ЛФ противоопухолевых препаратов. Инкапсулирование цитостатиков в ли-посомы способствует уменьшению побочного действия путем экранирования* контакта с органами-мишенями1 токсичности, а также улучшению- биодоступности лекарственного вещества за счет особенностей неоангиогенеза, особенно в солидных опухолях'[1, 2, 4, 8, 10, 15, 65]. Этот подход, называемый пассивной, доставкой, реализован в онкологической» практике для некоторых липосомальных противоопухолевых препаратов, в частности, доксо-рубицина (£>охгг/, Сае1ух, МуосеЛиподокс), даунорубицина (.ВаипоХоте), винкристина (УтсаХоте, МагдгЬо), цисплатина (.ЫрорШт, Липоплат), окса-липлатина (ЫрохаГ), митоксантрона (ЬЕМ) и др., а также интенсивно изучается в эксперименте для подготовки новых ЛФ к клиническому изучению [10, 11,24, 25, 97].

Для осуществления стратегии направленного транспорта лекарственного агента в настоящее время интенсивно изучаются иммунолипосомальные конструкции (ИК), направленные к опухолеассоциированным поверхностным антигенам или рецепторам на опухолевых клетках. В качестве векторных лигандов лучшими признаны моноклональные антитела (МКА), пептиды или факторы роста, которые избирательно связываются с соответствующей мишенью [92, 99-101, 118, 143].

В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН разрабатываются ИК противоопухолевых препаратов различных классов и механизмов действия: противоопухолевые антибиотики антрациклинового ряда (доксорубицин, Доке), производные антрацендиона (митоксантрон), нитрозоалкилмочевины (лизомустин), фотосенсибилизаторы (тиосенс). В качестве основных мишеней выступают поверхностные антигены CD5, CD20, MUC-1 и HLA-DR; экспрессированные на клетках Т-клеточного лейкоза, B-клеточной лимфомы и злокачественных опухолях эпителиального происхождения [14, 16].

Для различных этапов экспериментального изучения противоопухолевой активности ИК необходимы адекватные модели опухолевого роста in vitro (прескрининг) win vivo (скрининг, углубленное и-доклиническое изучения). Единственно возможной опухолевой моделью является клеточная, линия опухоли человека со стабильной селективной гиперэкспрессией сигнальных антигенов, к которым специфичны МКА, конъюгированные с ИК. Для in vivo желательна гистологическая идентичность модели исходной опухоли и способность к росту иммунодефицитных животных в виде ксенографтов. Помимо этого такая модель должна иметь адекватные кинетические параметры (скорость роста, достаточно длительную фазу экспоненциального роста, образование измеряемых опухолевых узлов и т.д.), а также способность к неоваскуляризации для обеспечения эффективной доставки препарата к мишени [74, 140, 153].

Данная работа посвящена разработке ИК Доке с улучшенными терапевтическими характеристиками, направленных против 2-х из известных молекулярных мишеней MUC-1 и HLA-DR антигенов, и получению адекватных опухолевых моделей для их экспериментального изучения- in vitro и in vivo.

Цель исследования

Разработка иммунолипосомальных форм доксорубицина и адекватных опухолевых моделей для их доклинического изучения. Задачи исследования

1. Получить иммунолипосомальные конструкции с доксорубицином, направленные против MUC-1, HLA-DR антигенов-мишеней.

2. Определить химико-фармацевтические характеристики полученных иммунолипосомальных конструкций.

3. В системе in vitro оценить цитотоксичность и специфичность связывания иммунолипосомальных конструкций с мишенью.

4. Адаптировать к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude клеточные линии рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 человека, экспрессирующих сигнальные антигены-мишени.

5. Охарактеризовать подкожные ксенографты T-47D, SKOV3 и лимфомы Беркитта по основным биологическим характеристикам: гистотип, кинетика роста, ангиогенная активность, экспрессия антигенов-мишеней в процессе пассирования на мышах.

Научная новизна исследования Впервые:

• в РФ получены две ШС против антигенов MUC-1 и HLA-DR известного противоопухолевого антибиотика Доке с высокой степенью включения действующего вещества;

• in vitro на антиген-положительных клетках опухолей человека банка клеточных культур РОНЦ показана высокая цитотоксическая активность и иммунологическая специфичность полученных ИК;

• адаптирована к росту под кожей у иммунодефицитных мышей Balb/c nude разведения РОНЦ клеточная линия рака молочной железы человека T-47D хранения РОНЦ;

• установлены основные биологические характеристики подкожных (п/к) ксенографтов: лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, аденокарциномы яичников SKOV3 и рака молочной железы человека T-47D, экспрессирующих MUC-1, HLA-DR, CD19 антигены-мишени;

• выявлен высокий уровень ангиогенной активности полученных ксенографтов по экспрессии основных маркеров неоангиогенеза: VEGF, HIF-la, CD31;

• in vivo сформирована панель моделей опухолей человека с высокой экспрессией маркеров опухолей эпителиального происхождения, а также злокачественной лимфомы для экспериментального (доклинического) изучения ИК, направленных против соответствующих мишеней.

Практическая значимость результатов исследования

Получены и охарактеризованы по основным химико-фармацевтическим параметрам две иммунолипосомальные конструкции противоопухолевого антибиотика доксорубицина, направленные против MUC-1 и HLA-DR антигенов-мишеней.

Разработаны адекватные опухолевые модели для исследования анти-пролиферативной активности адресных препаратов против указанных мишеней.

В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН создан мини-банк культур клеток лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 и соответствующих штаммов в количестве, достаточном для проведения исследований in vivo. Положения, выносимые на защиту

1. Получены ИК Доке, направленные против MUC-1, HLA-DR антигенов-мишеней.

2. Определены химико-фармацевтические характеристики полученных дисперсий.

3. В системе in vitro проведена оценка цитотоксичности и специфичности связывания ИБС с мишенью.

4. Клеточные линии рака молочной железы T-47D и аденокарциномы яичников SKOV3 человека, экспрессирующих сигнальные антигены-мишени, адаптированы к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude.

5. Подкожные ксенографты T-47D, SKOV3 и лимфомы Беркитта ЛБР-2 охарактеризованы по основным биологическим характеристикам: гис-тотип, кинетика роста, ангиогенная активность, экспрессия антигенов-мишеней в процессе пассирования на мышах.

6. Подкожные ксенографты T-47D, SKOV3 и лимфомы Беркитта ЛБР-2 пригодны для проведения исследования антипролиферативной активности адресных препаратов.

Апробация работы 1

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях:

1. Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech» 3-5 декабря 2008 г., 6-8 октября 2009 г., 1-3 ноября 2010 г., Москва;

2. Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» 18-19 февраля 2009 г., Москва;

3. Пятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16-20 марта 2009 г., Москва;

4. IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 18-19 мая 2010 г., Нижний Новгород.

5. II Всероссийской научной конференции с международным участием Наноонкология, 26-28 сентября 2010 г., Тюмень;

6. На межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 30 сентября 2010 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 листах машинописного текста, содержит 44 рисунка и 5 таблиц. Библиографический указатель включает 165 наименований.

выводы

1. Разработана технология получения стерически стабилизированных ICO-1 и ICO-25 иммунолипосомальных конструкций, направленных против HLA-DR и MUC-1 антигенов с включением действующего вещества до 94% и выраженной антигенспецифичностью in vitro 96±3% и 97±2 соответственно.

2. Полученные новые иммунолипосомальные конструкции проявляют выраженный цитотоксический эффект в отношении антиген-положительных клеток-мишеней: в культуре HLA-DR+ клеток лимфомы Беркитта ЛБР-2 ци-тотоксичность ICO-1 иммунолипосомальных конструкций доксорубицина достоверно не отличалась от липосомального препарата (р > 0,05); в культуре MUC-1+ клеток SKOV3 ICO-25- иммунолипосомальные конструкции доксорубицина достоверно (р < 0,05) более цитотоксичны, чем липосомальная форма.

3. Штамм перевиваемой лимфомы Беркитта человека ЛБР-2 HLA-DR+ из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ адаптирован к росту in vitro с сохранением устойчивой экспрессии маркера.

4. Клеточные линии аденокарциномы яичников человека SKOV3 и рака молочной железы человека T-47D с гиперэкспрессией антигена MUC-1+ адаптированы к росту под кожей иммунодефицитных мышей Balb/c nude разведения РОНЦ с сохранением устойчивой экспрессии маркера в течение 5-ти пассажей.

5. Подкожные ксенографты из клеточных линий ЛБР-2 (HLA-DR+), SKOV3 (MUC-1+) и T-47D (MUC-1+) при многократном пассировании на мышах Balb/c nude сохраняют стабильно высокий уровень экспрессии антигена-мишени, идентичны первичной опухоли по гистологической структуре, имеют адекватные параметры роста, высокую ангиогенную активность и представляют собой специфичные модели для доклинического изучения противоопухолевой активности препаратов, направленных против сигнальных мишеней.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что штамм ЛБР-2, полученный из адаптировованной к культуральному росту и воспроизведенный in vivo в виде п/к ксенографтов, обладает адекватными характеристиками для ИК, направленных против HLA-DR положительных клеток: достаточно коротким латентным периодом - 18 дней, умеренно продолжительной экспоненциальной фазой роста — 8 дней. При этом штамм при 10-кратном пассировании на иммунодецифитных мышах-самках Balb/c nude сохраняет гистологическую структуру, идентичную лимфоме Беркитта человека [5, 20, 48] и стабильно высокий уровень экспрессии молекул HLA-DR на протяжении всего периода пассирования. При этом стабильная экспрессия В-клеточного маркера CD19 устанавливалась только после завершения периода адаптации к 6-му пассажу. Экспрессия В-клеточного маркера CD20 на использованных мышах не выявлялась ни на одном из пассажей. Высокий уровнень экспрессии ангиогенных маркеров VEGF и HIFl-a, а также стабильное количество микрососудов в опухоли на протяжении всех 10-ти пассажей и перечисленные выше свойства ЛБР-2 позволяют считать эту модель пригодной для доклинического изучения адресных препаратов против соответствующих мишеней с учетом значимой экспрессии каждого при многократном пассировании.

В результате проведенных исследований по разработке MUC-1+ моделей клетки аденокарциномы яичников SKOV3 и карциномы молочной железы линии T-47D адаптированы к росту на иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude разведения РОНЦ в виде подкожных ксенографтов. Имплантация клеток линии SKOV3 и T-47D под кожу бока иммунодефицитных животных в стандартных прививочных дозах приводила к 100%-ной прививаемости с образованием в течение 30 дней п/к ксенографтов среднего объема 2643[1806-К3480]мм3 и 2307[1551-К3063]мм3, характеризующихся относительно короткой латентной фазой - 8 и 9 дней, экспоненциальной фазой продолжительностью 6-7 дней и 15-ти дневной стационарной фазой. Морфологическое исследование выявило, что п/к ксенографты SKOV3 гистологически имеют строение светлоклеточной опухоли. П/к ксенографты T-47D гистологически опухоль состоит из солидных внутрипротоковых пролифератов, разделенных стромой. Иммунофенотипический анализ выявил, что на протяжении всего исследованного периода пассирования на клетках полученных ксе-нографтов поддерживается стабильно высокий уровень экспрессии М11С-1 антигена-мишени. Иммуногистохимическое окрашивание на основные маркеры неоангиогенеза выявило высокую ангиогенную активность штаммов. Плотность микрососудов в опухолевой модели рака молочной железы Т-47И была выше, чем в модели БКОУЗ - 4±2 и 7±2 в поле зрения при увеличении Х40 соответственно.

Таким образом, полученные нами данные позволяют рекомендовать штаммы лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, а также рака молочной железы Т-47Э и яичников БКОУЗ в качестве доклинических моделей для изучения специфической противоопухолевой активности ИК, направленных против НЬА-ПЯ и МиС-1 антигенов-мишеней, соответственно.