Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование эффективности химиотерапии экспериментальной холангиоцеллюлярной карциномы с помощью магнитоуправляемых липосом с доксорубицином

На правах рукописи

005553750

ЗЫРНЯЕВА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХОЛАНГИОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ С ПОМОЩЬЮ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ ЛИПОСОМ С ДОКСОРУБИЦИНОМ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 ОКТ 2014

Саранск 2014

005553750

Работа выполнена в лаборатории фармакокинетики и таргетной фармакотерапии Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва»

Научный руководитель:

Пятаев Николай Анатольевич - доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Ловцова Любовь Валерьевна- доктор медицинских наук, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» МЗ РФ, г. Нижний Новгород

Черепкова Елена Владимировна - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ФГБУ «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва

Защита состоится «28» ноября 2014 года в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д. 212.117.08 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68), с авторефератом - на официальном сайте Министерства образования и науки РФ.

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

А.Г. Голубев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкая избирательность действия и высокая системная токсичность противоопухолевых препаратов представляют собой главную проблему онкофармакологии. Частота побочных и токсических реакций при проведении химиотерапии злокачественных новообразований достигает 100% (Максимова Е. В., 2012), летальность от осложнений химиотерапии (XT) солидных опухолей достигает 20% (Переводчикова Н.И., 2001). В связи с этим ведутся активные поиски путей снижения токсичности XT и повышения ее избирательности. Одним таких путей является создание лекарственных форм химиопрепаратов, управляемых с помощью внешних воздействий (постоянное и переменное электромагнитное поле, ультразвук и др.). Примером данного подхода может служить магнитоуправляемые лекарственные препараты. Они были предложены в 70-е годы XX века и представляют собой комплекс ферромагнетика и лекарственного препарата (Widder К.,1976). Такое сочетание может позволить концентрировать лекарство в зоне патологического очага с помощью постоянного магнита или значимо повышать локальную температуру путем воздействия СВЧ-излучением (Hui S. Huang, 2013). В ранних работах по магнитоуправляемому транспорту лекарств сообщалось о создании конъюгатов наночастиц магнетита с лекарственными препаратами. Недостатками таких конструкций были невысокая «лекарственная емкость» и сложность получения обратимо диссоциирующих комплексов лекарства и ферромагнетика (Курегян А. Г., 2001; Babincova М., 2009). В связи с этим современные исследования направлены на создание магнитоуправляемых микро и наноконтей-неров (липосомальных либо полимерных), в которые инкорпорируется лекарственный препарат. Магнитоуправляемые липосомы были предложены в 90-е гг., и использовались в основном для местного применения (Черкасова О.Г., 1991; Харитонов Ю.Я., 1996). Сообщения о системном применении магнитных липосом с противоопухолевыми препаратами в российской литературе отсутствуют, в зарубежной - единичны и посвящены в основном локальной гипертермии (Duprat J.P., 2009; Pradhan P.C., 2010; Richmond A., 2013). Нет данных о токсичности химиопрепаратов, инкорпорированных в магнитные липосомы, и собственно магнитных липосом. Отсутствуют сведения об изменениях фарма-кокинетики и противоопухолевой активности доксорубицина при его направленном магнитоуправляемом транспорте. Данные обстоятельства и послужили основанием для проведения настоящего исследования. Объектом исследования стали магнитные липосомы с доксорубицином, полученные в лаборатории

фармакокинетики и таргетной фармакотерапии Медицинского института МГУ им. Н.П.Огарева.

Цель работы: Исследовать эффективность направленного транспорта доксорубицина, инкорпорированного в магнитные липосомы, в эксперименте на крысах с трансплантированной холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.

Задачи исследования:

1. Оценка системной фармакокинетики, тканевого распределения доксорубицина, инкорпорированного в магнитоуправляемые липосомы, у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1 в зависимости от воздействия магнитного поля.

2. Исследование острой токсичности магнитолипосомального доксорубицина в сравнении с его водорастворимой формой при внутривенном введении у интактных крыс.

3. Изучение эффективности и безопасности противоопухолевой химиотерапии с помощью магнитных липосом с доксорубицином у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.

Научная новизна

1. Изучена системная кинетика и тканевое распределение магнитолипосомального доксорубицина в сравнении с его водорастворимой формой. Установлено, что при введении в дозе 6 мг/кг магнитолипомальная форма создает меньшие концентрации препарата в таких тканях-мишенях токсичности, как сердце и почки.

2. Показано, что создание над областью опухоли магнитного поля с помощью постоянного магнита с силой отрыва 900 Н у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1 позволяет аккумулировать в опухоли липосомы, содержащие наночастицы оксида железа и доксорубицин, не оказывая при этом влияния на системную кинетику препарата. Установлено, что данная методика создает в опухолевой ткани концентрацию доксорубицина выше по сравнению с водорастворимым препаратом в 4, с липосомальным в 2,5 раза.

3. Проведена оценка острой токсичности магнитолипосомальнго доксорубицина в сравнении с его водорастворимой формой при внутривенном введении у крыс. Установлено, что магнитолипосомальная лекарственная формы доксорубицина имеют меньшую токсичность по сравнению с водорастворимой.

4. В условиях эксперимента на крысах с трансплантированной холангиоцеллюлярной карциномой РС-1 исследована эффективность и безопасность противоопухолевой химиотерапии с помощью магнитолипосомального доксо-

рубицина. Продемонстрирована возможность увеличения избирательности действия доксорубицина при введении в магнитных липосомах при условии создания магнитного поля над областью опухоли.

Практическая значимость

1. Экспериментально определены дозы магнитолипосомального доксорубицина, которые могут быть рекомендованы для проведения химиотерапии чувствительных опухолей. Максимально переносимая доза препарата для крыс составляет 15,1 мг/кг.

2. Разработан экспериментальный метод химиотерапии поверхностно расположенных опухолей, основанный на внутривенном введении магнитолипосомального доксорубицина на фоне создания над опухолью постоянного магнитного поля с помощью постоянного магнита. Разработанный метод может быть использован при проведении таргетного транспорта лекарственных препаратов различных групп, а также может стать основой для клинически применимой технологии лечения неоплазий.

Положения, выносимые на защиту

1. Инкорпорированный в магнитные липосомы доксорубицин имеет особенности фармакокинетики, типичные для липосомального доксорубицина, а именно - увеличение концентрации в плазме, органах с богатым представительством ретикулоэндотелиальной системы и в опухолевой ткани, снижение концентрации в сердечной мышце. Постоянное магнитное поле, локально создаваемое над опухолью у крыс с холангиоцеллюлярной карциномой РС-1, значимо (в 5 раз по сравнению с группой водного препарата) увеличивает концентрацию в зоне действия магнита, но практически не влияет на системную кинетику препарата.

2. Магнитолипосомальный доксорубицин является менее токсичным при однократном введении, чем водорастворимый препарат. Снижение токсичности проявляется как увеличением LD50, так и уменьшением количества побочных эффектов и осложнений, развивающихся в отсроченный период после введения.

3. Локальное воздействие магнитного поля повышает противоопухолевую эффективность магнитолипосомального доксорубицина за счет накопления препарата в опухолевой ткани, но практически не влияет на частоту и выраженность побочных эффектов химиотерапии.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология»

(Саратов, 2011); на IV международной Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012); на IV International scientific conference "Science4Health 2012", РУДН (Москва, 2012); на конференции «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Нижний Новгород, 2012); на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Саранск, 2012). VIII-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2011); на VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции молодых ученых (Москва, 2013); на II межд. студ. науч. конф. с участием молодых ученых: «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва: РУДН, 2010); на международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012); на Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Минск, 2013); на Международной научно-технической конференции «Нанотехнологии функциональных материалов (НФМ 2014)» (Санкт-Петербург, 2014).

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ в рамках госзадания, проект № 53/3-14 «Системы направленной доставки лекарственных препаратов на основе липосомальных и полимерных носителей» и Стипендии Президента РФ для молодых ученых и аспирантов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 4 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ, представляемых на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 224 источника (из них 68 отечественных и 156 зарубежных). Работа содержит 35 таблиц и иллюстрирована 24 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Выполнение работы включало несколько этапов, каждый из которых предполагал собственные объекты и методологию исследования. Общая характеристика материала и методологии исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Этапы, материал и методология исследования

Этап Материал Метод ология

1. Исследование фарма-кокинетикии тканевого распределения доксору-бицина при введении в различных лекарственных формах. Белые нелинейные крысы с трансплантированной холангио- целлюлярной карциномой РС-1, п=180 Определение концентрации доксору-бицина в крови и гомогенатах органов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Сравнительное исследование токсического действия различных лекарственных форм док-сорубнцина. Белые нелинейные крысы (ин-тактные), п=264 Общепринятые методы исследования токсичности: пробит-анализ, оценка пищевых реакций, патоморфологиче-ское (макроскопическое) исследование органов, гематологические и биохимические анализы

3.Исследование эффективности противоопухолевой химиотерапии с помощью магнитных липосом с доксорубицнном. Белые нелинейные крысы с трансплантированной холангио- целлюлярной карциномой РС-1, п=50 Динамический контроль показателей эффективности противоопухолевой терапии: - объем опухоли - индекс массы опухоли (НМО) - индекс торможения роста опухоли (1ГГРО) Исследование гематологических и биохимических показателей крови

Получение магнитоуправляемых липосом с доксорубицнном. В работе использовали самостоятельно полученные магнитные липосомы (МЛ). В качестве прототипа была использована методика получения магнитных липосом, описанная (Исмаилова Г. К., 2005) в модифицированном варианте. Получение магнитных липосом включало 2 этапа: 1. синтез коллоидного магнетита- методом соосаждения (реакция Элмора) (Байбуртский Ф.С., 2002); 2. получение собственно липосом- методом обращения фаз.

Оценка свойств и контроль качества магнитных липосом. Размер ли-посомальных частиц определяли методом динамического светорассеяния на лазерном корреляционном спектрометре (анализатор КАЫО-Яех, МюкПгас, США). Стабильность (степень агрегации) оценивалась по изменению среднего размера частиц в динамике. Концентрация магнетита в липосомальных суспензиях определялась методом электронного парамагнитного резонанса после

предварительной калибровки ЭПР-спектрометра стандартными образцами магнетита (Замышляев П.С., 2013). Концентрация доксорубицина определялась методом УФ- спектрофотометрии, рассчитывалась степень включения доксорубицина (Тазина Е.В., 2010).

Характеристика экспериментальных животных. Эксперименты проводили на нелинейных половозрелых лабораторных крысах обоего пола массой 210-250 г. На проведение экспериментов получено разрешение локального этического комитета при Медицинском институте ФГБОУ ВПО им.Н.П.Огарева. Лабораторные животные содержались в условиях вивария со свободным доступом к питьевой воде на стандартном рационе из гранулированного корма с соблюдением правил и Международных рекомендаций Европейской Конвенции по защите прав животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). В экспериментах использованы интактные животные и животные с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.

Техника перевивки карциномы РС-1. В исследовании использован штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1 из коллекции НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Для перевивки опухоли на 28-е сутки животное-опухоленосителя забивали путем мгновенной декапитации. Опухоль механически измельчали путем продавливания через сита с уменьшающимся размером ячеек. Интактным животным массой 80-100 г вводили ~ 7*10б опухолевых клеток в 0,5 мл среды 199 под кожу передней брюшной стенки.

Проведение магнитоуправляемого транспорта доксорубицина. Животных фиксировали в специальном станке, над опухолью создавали магнитное поле (МП) с помощью бор-неодимового постоянного магнита NdFeB N38 диаметром 4 см и высотой 2 см, создающего поле с силой отрыва 900 Н. Магнит размещался непосредственно под опухолью. Магнит плотно прижимался к коже плоской поверхностью. Время экспозиции магнитного поля составляло 3 часа.

Исследование фармакокинетики доксорубицина. Для проведения фармакокинетических исследований кровь забирали из сосудов шеи в пробирки КЗ объемом 2 мл с антикоагулянтом. Тестируемые органы (печень, почки, легкие, сердце, селезенку) и опухоль гомогенизировали на гомогенизаторе Silent Crusher (Heidolph, Германия) в течение 2 минут, добавляли ацетонитрил и встряхивали на шейкере Vortex-Shaker (Elmi, Латвия) в течение 10 мин, далее центрифугировали (Eppendorf Scan Speed mini, Германия) в течение 10 мин при 3500 об/мин, после чего анализировали. Количественное определение доксору-

бицина (ДРЦ) проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Konik HPLC 560 с флуориметрическим детектированием. Рассчитывались следующие фармакокинетические константы: пиковая концентрация(Стах), площадь под фармакокинетаческой кривой (AUC), суммарная площадь под кривой момента (AUMC), среднее время удержания (MRT), клиренс (Clearance), кажущийся объем распределения (Vss), константа элиминации a-фазы (к^а)), константа элиминации ß-фазы (kti(ß)), период полувыведения a-фазы (tm („)), период полувыведения ß-фазы (ti/2 (ß)).

Исследование острой токсичности магнитолипосомального доксору-бицина выполнялись в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005). Полученные результаты летальности животных были использованы для построения графика зависимости «доза - летальность», на основании которого были определены летальные и максимально-переносимые дозы для различных лекарственных форм доксорубицина с помощью программы Probit Analysis 2.0. У выживших животных оценивали общее состояние, интенсивность и характер двигательной активности, координации движений, состояние волосяного покрова, окраску слизистых оболочек, тонус скелетных мышц, потребление корма и воды. Также проводилось патоморфологическое (макроскопическое) исследование внутренних органов павших и выведенных из эксперимента выживших животных. Кроме того, исследовали гематологические и биохимические показатели крови.

Исследование гематологических и биохимических показателей крови. Из гематологических показателей определяли содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Из биохимических показателей определяли: концентрацию глюкозы, мочевины, билирубина, активность аланино-вой и аспарагиновой аминотрансфераз и альфа-амилазы сыворотки. Исследование проводилось на анализаторах Mindray ВС 3000 plus (гематологические показатели) и Human Star 600 (биохимические показатели) с помощью стандартного набора реактивов в соответствии с рекомендациями фирм - производителей.

Исследование эффективности и безопасности противоопухолевой химиотерапии проводилось согласно «Методическим указаниям по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ» (Трещалина Е.М., Хабриев Р.У., 2005). Проводили динамический контроль следующих показателей: динамика роста опухолей в каждой группе животных; индекс массы опухоли; индекс торможения роста опухоли, рассчитываемый по формуле:

ИТРО=(М. - Мо)/М,*100, где М, и Mo - средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах.

Статистическая обработка результатов исследования. Для оценки достоверности различий между количественными показателями использовали критерий t Стьюдента. Для сравнения качественных признаков применяли критерий х2. Различия считали достоверными при уровне значимости выше 95% (р<0,05). Статистический анализ был выполнен с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

Для оценки фармакокинетики и тканевого распределения доксорубицина при различных методах введения выполнены эксперименты на нелинейных половозрелых лабораторных крысах массой 230-250 г с трансплантированной хо-лангиоцеллюлярной карциномой РС-1. В зависимости вида проводимой терапии животные были разделены на 3 группы, по 60 особей в каждой.

Исследование фармакокинетики проводили на 14-е сутки после перевивки опухоли. Изучаемые препараты вводили внутривенно однократно в дозе 6 мг/кг. В 1-й группе вводили внутривенно доксорубицин (Teva Pharmaceutical Industries Ltd, Израиль); во 2-й и 3-й - доксорубицин, инкорпорированный в липосомы, содержащие наночастицы магнетита (МЛ-ДРЦ). В 3-й группе непосредственно после введения препарата над областью опухоли создавали магнитное поле с помощью постоянного магнита NdFeB N38 с силой отрыва 900 Н. Время экспозиции магнитного поля составляло 3 часа.

В ходе исследования концентрация препарата в крови и гомогенатах органах крыс определялась в следующих временных точках:0,5; 1; 2; 3; 5; 6; 8; 9; 12; 24 часа. В каждой временной точке исследование проводили у 6 животных.

Системная кинетика. Фармакокинетическая кривая доксорубицина при введении в виде водного раствора и в магнитоуправляемой липосомальной форме приведены на рисунке 1, а фармакокинетические константы в табл. 2.

Для водного раствора доксорубицина фармакокинетическая кривая хорошо апроксимировалась двухэкспоненциальной моделью.

С(/;=3,05e -0-8492' + 0,72e -0-'199 ,

где С-концентрация ДРЦ в плазме, t- время.

Время, ч

О Водный ДРЦ - Д МЛ-ДРЦ - О МЛ-ДРЦ+МЛ -

Рис. 1. Зависимость концентрации доксорубицина в плазме от времени

Таблица 2.

Фармакокинетические константы доксорубиццна для крови при использовании различных лекарственных форм н методов введения _

Константа Ед изм Водный ДРЦ МЛ-ДРЦ МЛ- ДРЦ + МП

Меап±80 МеапАвО Меап±50

Сил мкг/мл 2,84±0,13 18,98±1,11 16,74±0,89

Аис м кг* ч/мл 8,70±0,25 145,08±4,13 143,05±4,07

АиМС мкг*ч2/мл 49,0±1,5 1259,3±40,5 1287,7±67,8

МКТ ч 5,64±0,22 8,68=Ю,07 9,00±0,29

С1еагепсе мл/ч 151,8±4,3 9,1±0,3 9Д±03

л/кг 3,89±0,23 0,36±0,01 038±0,01

1/ч 0,8492±0,1828 0,6763±0,2171 0,4582±0,1419

МР) 1/ч 0,1199±0,0040 0,0563±0,0072 0,0522±0,0066

С1 мкг/мл 3,05±0,64 16,2б±4,76 9,96±2,21

С2 мкг/мл 0,72±0,07 9,53±0,99 9,09±0,66

•т («) ч 0,85±0,17 1,16±0,54 1,64±0,53

<1/2 (Р) ч 5,79±0 Л0 12,50±1,80 13,45±1,69

Примечание: все показатели во 2-й и 3-й группе достоверно отличаются от аналогичных в 1-й группе; достоверных различий между показателями 2-й и 3-й группы нет

Максимальная плазменная концентрация ДРЦ составила 2,84±0,13 мкг/мл. Период полувыведения а-фазы был равен 0,85±0,17 часов, /?-фазы -5,79±0,20 часов, соответственно Ае/(а)=0,8492±0Д828, =0,1199±0,0040.

Значение кажущегося объема распределения составило 3,89±0,23 л/кг, что свидетельствовало о высокой тканевой тропности препарата. А ис была равна 8,70±0,25 мкг*ч/мл, АиМС=49,0±1,5 мкг*ч2/мл. Среднее время удержания достигало 5,64±0,22 часа.

Для ДРЦ, инкорпорированного в магнитные липосомы, элиминация из крови также хорошо описывалась двухэкспоненциальной моделью. Однако значения фармакокинетических констант существенно отличалась от таковых в группе водного ДРЦ.

Уравнение фармакокинетической кривой имело вид: С(0=16,26е -0'6763' + 9,532е "°'0563',

где С-концентрация ДРЦ в плазме, и время.

Пиковая концентрация составила 18,98±1,11 мкг/мл, что на почти в 6 раз больше, чем в первой группе (р<0,01). Период полувыведения а-фазы был существенно выше, чем у водного ДРЦ, а р-фазы - практически не отличался от такового в 1-й группе. Значения этих показателей были равны соответственно 1,1б±0,54 и 12,50±1,80 часа. Общий клиренс липосомального ДРЦ был ниже, чем у водного, на 50% (р<0,05). Более высокое значение Спи2Х и снижение скорости элиминации в а-фазе приводили к тому, что А ис и АЦМС липосомального ДРЦ существенно превышали (в 16 и 25 раз, р<0,001) значения аналогичных показателей водного ДРЦ. Они были равны 145,08±4,13 мкг*ч/мл, 1259,3±40,5 мкг*ч/мл соответственно. Среднее время удержания липосомального ДРЦ было равно 8,68±0,07 часа, что в 1,5 раза больше, чем у водного ДРЦ (р<0,01).

Фармакокинетические константы магнитолипосомального ДРЦ для крови на фоне применения магнитного поля достоверно не отличались от таковых у магнитолипосомального ДРЦ без применения магнита.

Тканевое распределение. Результаты расчетов фармакокинетических констант для исследуемых тканей приведены в таблице 3.

Анализ тканевой кинетики свидетельствовали о преимущественном внутриклеточном накоплении препарата.

При введении ДРЦ в виде водного раствора ткани располагались в следующем порядке по убыванию показателей А11С: почка > печень> селезенка -опухоль - сердце — легкие — кровь. При этом тканевые концентрации ДРЦ были выше плазменных в 5-25 раз.

Таблица 3.

Фармакокинетические константы доксорубицина для исследуемых тканей_

Константа Ед изм Водный ДРЦ МЛ- ДРЦ МЛ-ДРЦ + МП

Меап±8П Меап±80 Меап±80

Печень

Сти мкг/мл 18,70±1Д0 54,49±2,65* 50,10±ЗД1*

лис мкг*ч/мл 152Д6±3,89 510,79±7,91* 479,28±14,45*

дтт ч 8,92±0,14 8,85±0,10 8,81±0,18

Оеагепсе мл/ч 8,7±0Д 2,6±0,0* 2,8±0,1*

ип м ч 1,37±0,37 2,87±1,39* 4,79±2,68*

Ьпт ч 15,36±1,76 1033±0,81* 10,60±1,15*

Селезенка

Стах мкг/мл 20Д1±1,94 52Д5±2,59* 49,40±2,15*

лис м кг* ч/мл 130,28±7,51 499,50±19,46* 450,68±14,08*

МЯТ ч 7,88±0,31 8,70±0Д0 8,56±0,19

С1еагепсе мл/ч 10,2±0,6 2,6±0Д* 2,9±0Д*

ип м ч 1,47±0,34 2,34±0,77 4,03±3,04*

<1/2 (В) ч 9,76±0,80 10,02±0,80 9,44±0;93

Почки

Стах мкг/мл 52,73±5,27 22,20±1,78* 24,91±1,03*

лис мкг*ч/мл 389,23±5,99 184,81±9,44* 201,00±5,62*

МЯТ ч 8,66±0,26 8,08±0Д5 8,51±0,21

С1еагепсе мл/ч 3,4±0Д 7,2±0,4* 6,6±0,2*

11Л(.| ч 2Д0±0,72 3,84±2,59* 1,75±0,43* **

ипа\ ч 19,87±4,26 9,66±1,02* 10Д4±0,57*

Сердце

Стах мкг/мл 10,28±1,00 7,86±0,90* 7Д1±0,49*

лис мкг*ч/мл 45,62±0,72 36,77±1Д0* 36,45±1,65*

МИТ ч 635±0ДЗ 5,71±0,20* 5,98±0Д4*

Оеагепсе мл/ч 28,9±0,5 35,9±1Д* 363±1,6*

11/2 (о) ч 1,08±0,27 1,64±0Д4 1,72±0,49

ип (В) ч 737±032 5,22±0Д8* 5,87±0,36*

Легкие

Стах мкг/мл 7,91±0,96 8,78±0,65 8,35±0,43

лис мкг*ч/мл 38,12±1,65 52Д6±1,68* 4837±1,46

МЯТ ч 6,80±031 б,99±0,29 6,58±0Дб

Оеагепсе мл/ч 34,7±1,5 25,3±0,8* 27,3±0,8

ип м ч 1Д5±0,13 1,85±0,46 1,62±0Д8

(В) ч 8,20±0,65 7,54±0,88 6,69±0,51

ОпуХОЛЬ

Стах мкг/мл 17,97±1,57 34,37±2,92* 88Д5±7,78* **

лис мкг*ч/мл 112ДО±3,30 297,31±12,06* 614,81*17,54* **

мет ч 8,27±0ДЗ 9,07±0,18 7,89±0ДЗ

Оеагепсе мл/ч 11,8±0,3 4.4±0Д* 2,1±0Д* **

ип М ч 1Д2±0Д8 1,77±1,02 1,94±0,86

ип (В) ч 14,15±1,58 15Д4±1Д5 12,63±1,73

Примечание: "-достоверное (р<0,05) отличие от показателей 1-й группы; ** - достоверное (р<0,05) различие между показателями 2-й и 3-й групп.

■ Водный ДРЦ V" МЛ-ДРЦ (Без МП) а МЛ-ДРЦ+МП

Рис. 2. Абсолютные значения AUC ДРЦ для исследованных тканей

Кинетика магнитолипосомального ДРЦ имела особенности, типичные для липосомального препарата. МЛ ДРЦ в эквивалентных дозах создавал значительно более высокие плазменные концентрации препарата, чем водный раствор. При этом распределение препарата имело совершенно другую структуру. В ткани сердца и почек концентрация препарата (как С^, так и AUC) были ниже, а в ткани опухоли, печени и селезенке - выше, чем при введении водного

ДРЦ.

В группе с применением магнитного поля для тканевого распределения в основном отмечались те же закономерности, что и при использовании МЛ-ДРЦ без поля. Исключение составила ткань опухоли, где концентрация ДРЦ была выше по сравнению с двумя рассмотренными ранее группами. Так по уровню разница с группой водного ДРЦ составила 400% (р<0,01), с группой липосомального ДРЦ - 250 % (р<0,01). По уровню AUC различия достигали соответственно 500% (р<0,01) и 190% (р<0,05). Примечательно, что депонирование МЛ-ДРЦ в опухоли под воздействием МП не оказывало влияние на системную кинетику и распределение препарата в других органах и тканях. По видимому, это связано с небольшим (по отношению ко всему организму) объемом ткани, в

которой происходит аккумуляция частиц. На рисунке 3 приведены фармакоки-нетические кривые ДРЦ для опухолевой ткани.

О Водный ДРЦ - Д МЛ-ДРЦ - о МЛ-ДРЦ+МП -

Время, ч

Рис. 3. Зависимость концентрации доксорубицина в опухоли от времени Задачей второго этапа нашей работы было в условиях острого эксперимента оценить токсичность различных лекарственных форм доксорубицина при внутривенном введении у крыс. Выполнены эксперименты на нелинейных половозрелых лабораторных крысах массой 230-250 г. В зависимости от вида исследуемого препарата животные были разделены на 4 группы (контрольную и 3 опытных). В контрольной группе животным внутривенно вводили 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В 1-й опытной вводили внутривенно доксорубицин ; 2-й опытной — доксорубицин, инкорпорированный в липосомы; 3-й опытной- доксорубицин, инкорпорированный в липосомы, содержащие наночастицы магнетита. Для оценки острой токсичности в каждой из опытных групп было выделено по 7 подгрупп, в которых вводили препараты в возрастающих дозах (3, 6, 9, 12, 15, 18 и 21 мг/кг в пересчете на чистый доксорубицин). Исследование включало определение количественных показателей токсичности методом пробит-анализа, оценку показателей обмена и пищевых реакций и макроскопических изменений внутренних органов.

Результаты исследования летальности при введении различных лекарственных форм доксорубицина представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Летальность животных при введении доксорубицина

Группа Препарат Летальность (абс/%) в зависимости от дозы ДРЦ, мг/кг

3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 18,0 21,0

1 Водорастворимый ДРЦ (п=12) 0 1/8,3 3/25,0 7/583 10/833 12/100,0 -

2 Липосомальный ДРЦ(п=12) 0 0 1/83 1/83 5/41,6 6/49,8 9/74,7

3 Магнитолнпосо-мальный ДРЦ (п=12) 0 0 0 1/83 4/33,2 7/583 10/833

На основании полученных данных о летальности с помощью пробит-анализа были определена зависимость доза-летальность для исследованных форм доксорубицина. Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Показатели острой токсичности различных лекарственных форм доксорубицина

Показатель Меап±80 от„*

Водорастворимый ДРЦ (п=12)

ЬО-5 6.86±1,18 3,41 1031

1ЛЫ6 7,49±1,12 5,03 9,95

1.0-50 10,9±1,08 9Д 12,6

1Л)-84 15,9±1,11 13,6 18,2

1ЛМ00 2631±1Д2 19,9 32,72

Липосомальный ДРЦ (п=12)

1Л)-5 9Д±1,16 53 13,1

Ш-16 11,77±1,10 8,45 15,09

Ш-50 17,11±1,08 14,93 19,29

Ы>-84 24,89±1,15 20,48 293

иыоо 41,1±1,29 29,14 53,06

Магнитолипосомальный ДРЦ (п=12)

Ы>-5 11Д4±1,15 7,8 14,68

1Л-16 13,18±1,07 10,42 15,94

1Л)-50 16,8±1,05 15,1 18,5

Ы>-84 21,41±1,08 18,9 23,92

ЬО-ЮО 29,62±1Д6 24,1 35,14

Примечание: * - минимальные и максимальные значения расчетных показателей определены соответственно как нижняя и верхняя границы их 95%-ного доверительного интервала

Анализ показателей обмена и морфофункционального состояния внутренних органов у экспериментальных животных свидетельствовал о том, что липосомальный и магнитолипомальный ДРЦ практически не различаются по токсичности между собой и имеют меньшую токсичность по сравнению водорастворимой формой препарата.

Заключительным этапом нашего исследования было установление эффективности и безопасности противоопухолевой химиотерапии с помощью магнитных липосом с доксорубицином. Исследование проводилась на крысах с трансплантированной холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. В зависимости от характера проводимой терапии животные были разделены на 5 групп (1 контрольную и 4 опытных), по 10 особей в каждой. В опытных группах на 14-й день после перевивки начинали лечение. Препараты вводили внутривенно трехкратно с интервалом в 2 суток. В 3-й и 4-й группах непосредственно после введения препарата над областью опухоли создавали МП с помощью постоянного магнита К<1РеВ Ы38с силой отрыва 900 Н. Время экспозиции магнитного поля составляло 3 часа. На 35-е сутки после начала лечения животных забивали.

Результаты исследования эффективности противоопухолевой химиотерапии приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Эффективность противоопухолевой терапии при различных формах введения

Группа Характер терапии ИМО ИТРО

Контроль - 34±0,9 1АЗ -

1 ДРЦ 6 мг/кг 20,1±1,8 0А4 65,4±1,7

2 МЛ-ДРЦ 6 мг/кг (без МП) 17,2±2,2 <МА* 70,6±1,1 1А4

3 МЛ - ДРЦ 6 мг/кг (+ МП) 8,5±0,9°ДЛ4 82,5±0,8 1Д'4

4 МЛ + МП 31±0,8 ХД±0,4

Примечание: " - достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; 1 - достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в 1-й опытной группе; - достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе;3 - достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 3-й опытной группе; - достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 4-й опытной группе

Как видно из таблицы 6, исследуемый штамм карциномы РС-1 проявил достаточную чувствительность к доксорубицину: в 1-й опытной группе (водный раствор доксорубицина в дозе 6 мг/кг) индекс торможения роста опухоли составил 65,4 % .

Противоопухолевый эффект при использовании магнитолипосомального доксорубицина без применения МП (2-я опытная группа) был эквивалентным таковому у водного раствора доксорубицина. ИТРО в данной группе был равен 70,6%. ИМО составил 17,2% и достоверно отличался от такового в контрольной группе.

Эффективность магнитолипосомального доксорубицина в дозе 6 мг/кг с применением магнитного поля (3-я опытная группа) была несколько большей. ИТРО был равен 82,5%, что в 1,2 раза больше показателя 1-й опытной группы.

МЛ без доксорубицина (4-я опытная группа) практически не обладали противоопухолевой эффектгивностью: ИТРО в данной группе составил 1,2%.

Анализ побочных и токсических эффектов химиотерапии показал, что встречаемость и выраженность осложнений при ее проведении различалась в сравниваемых группах.

Выраженность токсических эффектов химиотерапии была наибольшей при введении водного раствора доксорубицина в дозе 6 мг/кг. У всех крыс регистрировалась анемия и выраженная миелосупрессия, тромбоцитопения. Выявлено повышение билирубина относительно исходных значений в 1,7 раза (р<0,05), печеночных трансаминаз (АсТ, АлТ) - в 2 раза (р<0,05), кардиоспеци-фических ферментов (ЛДГ, МВ-КФК) - в 5 раз (р<0,01). Всего в процессе лечения пало четыре крысы (40%). Причиной их гибели стал язвенно-некротический энтероколит.

При введении магнитолипосомального доксорубицина в дозе 6 мг/кг без МП (2-я опытная группа) выявлены менее выраженные токсические эффекты со стороны показателей красной крови и белой крови и тромбоцитарного ростка кроветворения. На 7-е сутки эксперимента отмечалось повышение уровня АлТ и АсТ (на 33 и 32 %, (р>0,05)), ЛДГ (в 3,3 раза, р<0,01), МВ-КФК (в 2,8 раза, (р<0,05). Но при этом выраженность гиперферментемии была меньшей, чем при использовании водного раствора доксорубицина.

В 3-й опытной группе (МЛ с доксорубицином в дозе 6 мг/кг + МП) у животных отмечалось изменение показателей, аналогичное таковому во 2-ой опытной группе, а именно: снижение гемоглобина на 34 % (р>0,05), эритроцитов - на 25 % (р>0,05), лейкоцитов - на 54% (р<0,05), тромбоцитов - на 49 % (р<0,05) по сравнению с исходным этапом. Показатели АлТ и АсТ на заключительном этапе увеличивались соответственно на 40 и 27% (р>0,05). Уровень ЛДГ и МВ-КФК повышен в 2,5 и 2,8 раз соответственно (р<0,05).

Во 2-й и 3-й опытных группах (МЛ+ДРЦ с применением и без МП) летальность составила по 10%. При этом на секции у павших животных регистрировались атрофия слизистой кишечника, участки кровоизлияния в ткань поджелудочной железы.

При введении МЛ в условиях создания МП (4-я опытная группа) частота и выраженность побочных эффектов химиотерапии была минимальной. Отмечалось недостоверное увеличение печеночных трансаминаз относительно исходных значений, аналогичное таковому в контрольной группе. Летальность в данной группе не регистрировалась.

19

ВЫВОДЫ

1. Специфическими особенностями фармакокинетики доксорубицина, вводимого в магнитных липосомах без применения внешнего магнитного поля по сравнению с водорастворимой формой препарата являются: увеличение пиковой концентрации препарата в плазме и АиС (в 6,7 ив 16,6 раз соответственно); увеличение времени выведения альфа-фазы; увеличение А1ЛС в печени и селезенке (в 3,3 и в 3,8 раз соответственно); уменьшение концентрации в сердечной мышце в 1,2 раза.

2. У крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1 введение магнитолипосомального доксорубицина с параллельным созданием над опухолью магнитного поля с помощью постоянного магнита с силой отрыва 900 Н обеспечивает увеличение АЦС доксорубицина в ткани опухоли в 2 раза по сравнению с магнитолипосомапьной формой, вводимой без магнитного поля. Системная кинетика магнитолипосомального доксорубицина на фоне воздействия постоянного магнитного поля существенно не изменяется.

3. Инкорпорирование в магнитные липосомы снижает острую токсичность доксорубицина по сравнению с водорастворимой формой препарата (в 2,5 раза по ЬЭ50). Отсроченные побочные эффекты после введения препарата при применении магнитолипосомального доксорубицина развиваются реже и отличаются меньшей выраженностью, чем после введения водорастворимого препарата в аналогичной дозе.

4. Применение магнитолипосомального доксорубицина с параллельным созданием над опухолью магнитного поля с помощью постоянного магнита с силой отрыва 900 Н повышает эффективность химиотерапии, обеспечивая увеличение индекса торможения роста опухоли на 126 % по сравнению с водорастворимой и на 116 % по сравнению с магнитолипосомапьной формой препарата без применения МП.

5. Магнитолипосомапьный доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1 вызывает менее выраженные побочные эффекты, чем водорастворимый препарат в эквивалентной дозе. Отличия по частоте и выраженности побочных эффектов магнитолипосомального доксорубицина при его введении на фоне магнитного поля и без него отсутствуют.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для экспериментального исследования магнитолипосомального доксорубицина необходимо учитывать, что пороговая летальная доза 1Л35 препарата составляет 11,24±1,15 мг/кг, а терапевтическая активность (при условии ис-

пользовании внешнего магнитного поля) превышает таковую у водорастворимой формы препарата в 2,5 раза.

2. При разработке схем лечения экспериментальных опухолей целесообразно исследовать эффективность направленного транспорта магнитолипосо-мального доксорубицина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зырняева H.H. Направленный транспорт доксорубицина с помощью магнитоуправляемых эритроцитарных теней при экспериментальном канцерогенезе/ Н.Н.Зырняева, М.С. Лебедько // Мат. II межд. студ. науч. конф. с участием молодых ученых: «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», г. Москва: РУДН. 22-23 апреля 2010.-С. 84.

2. Зырняева H.H. Распределение магнитоуправляемых носителей в организме крыс под влиянием внешнего магнитного поля/ Н.Н.Зырняева, H.A. Пятаев, Г.С.Столяров, А.А.Фирсов, О.ЕЛунина//Астраханский медицинский журнал.- 2011. т.6. №.3. - С.260-262.

3. Минаева О.В. Исследование острой токсичности магнитной жидкости на основе магнетита Fe304, стабилизированного олеиновой кислотой/О.В.Минаева, H.H. Зырняева, Г.С.Столяров, А.А.Фирсов, О.ЕЛунина, H.A. Плотникова// Российский биотерапевтический журнал. -2011.- Т.10, №4.-С.Ю4.

4. Пятаев H.A. Влияние пути введения магнитных наночастиц на их тканевое распределение/Н.А.Пятаев, О.В.Минаева, Г.С.Столяров, Н.Н.Зырняева // Российский биотерапевтический журнал.- 2011.-Т.10. №1. -С. 52-53.

5. Пятаев H.A. Фармакокинетика и фармакодинамика доксорубицина при направленном транспорте с помощью магнитоуправляемых эритроцитарных теней / Н.А.Пятаев, Г.С.Столяров, Н.Н.Зырняева, A.M. Зюзин, О.В. Минаева //Российский биотерапевтический журнал.-Москва:РОНЦ.-2011.-4.-С.109.

6. Пятаев H.A. Влияние пути введения магнитных наночастиц на их тканевое распределение/ Н.А.Пятаев, Г.С.Столяров, Н.Н.Зырняева, A.M. Зюзин, О.В.Минаева // Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» Саратов, 6-7 сентября 2011 г.

7. Пятаев H.A. Особенности тканевого распределения и противоопухолевой активности доксорубицина при введении в форме конъюгата с ДНК у крыс с трансплантированной карциномой РС-1/ H.A. Пятаев, П.И. Скопин, О.В. Минаева, С.А. Щукин, Е.Ю. Коровина, H.H. Зырняева // Российский биотерапевтический журнал.-2011,- Том 10_№2.- С. 55-61.

8. Zyrnyaeva N.N. Biokinetics of magnetite nanoparticles at various routes of introduction in rats/ N.N.Zyrnyaeva, G.S. Stolyarov, S.A. Firstov, A.V. Kokorev, A.A. Firsov, N.A.Pyataev// Вестник РГМУ- 2012. №1.-С. 199-200.

9. Minaeva O.V. Evaluation of the toxicity of injected intravenously magnetic fluid based on magnetite Fe304, stabilized with oleic acid/ O.V. Minaeva, N.N.Zyrnyaeva, R.M. Evseev, G.S. Stolyarov, A.A. Firsov, N.A.Pyataev// Вестник РГМУ-2012. №1.-C.205.

10. Minaeva O.V. Biokinetics of magnetite nanoparticles at various routes of introduction in rats/O.V. Minaeva, N.N.Zyrnyaeva, A.A. Firsov, N.A.Pyataev// Материалы IV конференции "Science4Health 2012".РУДН. Москва.-2012.-С.48.

11. Пятаев Н.А.Взаимодействие магнитной жидкости на основе коллоидного магнетита Fe304 с некоторыми цитостатическими препаратами/ Н.А.Пятаев, П.С.Петров, Н.Н.Зырняева, О.В. Минаева, А.А.Фирсов, Н.А. Плотникова // Российский биотерапевтический журнал.- 2012.- T.l 1, №2,- С.44.

12. Зырняева Н.Н. Исследование распределения магнитной жидкости FLW 001.40 под влиянием внешнего магнитного поля in vivo/ Н.Н. Зырняева, О.В.Минаева, С.А.Фирстов, Р.М.Евсеев, А.В.Кокорев, В.В. Кузин, А.В.Вавилин // Мат. I Всерос. науч.-практ. конференции «Актуальные проблемы медико-биологических дисциплин».Саранск, 26 мая 2012 г. -С.89-91.

13. Зырняева Н.Н. Острая токсичность магнитной жидкости на основе ферромагнитных наночастиц, стабилизированных олеинатом/ Н.Н.Зырняева, А.В.Кокорев, Г.С.Столяров, О.В.Минаева, А.А.Фирсов, И.В.Саушев // Материалы международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии». Саранск, 3-5 октября 2012 г.- С. 105-106.

14. Пятаев Н.А. Особенности тканевого распределения магнитных наночастиц в зависимости от пути введения/ Н.А. Пятаев, Н.Н.Зырняева, А.В. Кокорев, Г.С.Столяров, О.В.Минаева, А.А. Фирсов // Материалы международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии». Саранск, 3-5 октября 2012 г.- С. 107-108.

15. Замышляев П.С. Определение концентрации магнитной жидкости в биообразцах с помощью ЭПР-спектроскопии / П.С.Замышляев, В.В.Радайкин, Н.Н.Зырняева //Актуальные проблемы медико-биологических дисциплин. Сборник научных трудов II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов,- Саранск: Издательство Мордовского университета.-2013.-С. 59-62.

16. Зырняева Н.Н. Взаимодействие магнитной жидкости на основе коллоидного магнетита Fe304 с цитостатическими препаратами in vivo/

Н.Н.Зырняева, П.С.Петров, O.B. Минаева, Г.С.Столяров, С.А.Фирсов, И.В.Саушев // Вестник РГМУ- 2013. №1.-С.232.

17. Зырняева H.H. Особенности взаимодействия магнитной жидкости на основе ферромагнитных наночастиц с доксорубицином и циклофосфаном/ Н.Н.Зырняева, H.A. Пятаев, П.С.Петров, О.В. Минаева //Мат. XVII науч.-практ. конференции молодых ученых, аспирантов и студентов. Саранск: Издательство Мордовского университета.-2013 г. -С.55-56.

18. Пятаев H.A. Исследование эффективности полимер- иммобилизованной формы противоопухолевого препарата проспидин у крыс с трансплантированной гепатомой Зайдела/Н.А.Пятаев, А.А.Кладиев, А.В.Кокорев, О.В.Минаева, Н.Н.Зырняева // Современные проблемы науки и образования. -2013,-№5.-URL: http://www.science-education.ni/l 11-10532

19. Зырняева H.H. Сравнение токсичности коллоидного магнетита Fe304 и магнитоуправляемых липосом, изготовленных на его основе/ Н.Н.Зырняева, Н.А.Пятаев, О.В.Минаева, Замышляев П.С., Г.С.Столяров, С.А.Фирсов, А.В.Кокорев/ЛГруды международной научно-технической конференции «Нанотехнологии функциональных материалов (НФМ 2014)». Санкт-Петербург, 24-28 июня 2014 г.- С. 390-392.

20. Минаева О.В. Оптимизация метода получения магнитных липосом для направленной доставки лекарственных препаратов/ О.В.Минаева, Н.А.Пятаев, М.Н.Жарков, И.А. Юрлов, НЛ.Зырняева, Замышляев П.С., Р.М.Евсеев//Труды международной научно-технической конференции «Нанотехнологии функциональных материалов (НФМ 2014)». Санкт-Петербург, 2428 июня 2014 г.-С. 394-396.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,16. Уч.- изд. л. 1,66. Тираж 100 экз. Заказ № 320 от 30.09.2014г.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт». 430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21. Тел. (8342) 48-25-33.