Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Создание коллекции криоконсервированных бета-лимфоцитов селезенки и ее применение в серологических тестах трансплантационного мониторинга

п о* 9$

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

НАУЧЮ-ИССЛаОЗАТЕЕЬСКИИ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАШВ

7ДС 612.017.1:616-089.843 На оравах рукописи

КЛДЛШНй. Зат алия Нщолаврна

Создание ксшгевшш криоконсервированных В-лимфопитов селезенки а ее ариыеыенде в серологических тестах трансшщвтзцроадзго мониторинга

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат диссертации на соискание ученой стелена зангошста биодозтгчесхих наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР.

Научный руководитель: кандидат медицинских лаук

А.Г.Лолбин

Официальные ошюненгы:доктор медицинских наук,

профессор Л.П.Алексеев доктор медицинских наук, профессор А.Е.Цышш

Ведущее учреждение: Всесоюзный научный центр хирургии АМН СССР

Защита диссертации состоится "24 " июня_ Х991 г.

в час. на заседании специализированного Ученого Совета

Д.074.34.01 при Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР (123436 Москва, ул.Щукинская, д.1).

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР.

Автореферат разослан " 24 "_мая_1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.А.Пясаревски

7г""Актуальное ть теми исследования. ," Успешный исход трансплантации аллогенной почки во многом зависит ;. от совместимости донора и реципиента по антигенам HLA . Наи-"большее влияние оказывает совместимость по антигенам HLA -J)R , которая обеспечивает 20$-ный прирост выживаемости аллотрансплан-тата за год. Тканевая совместимость продолжает играть определяющую роль в судьбе пересаженного органа и в "эру циклоспорина" (Ю.М.Зарецкая с соавт., 1989; G.Oel? , 1987; "D.O.S.Sengar étal. 1989).

Отторжение пересаженной почки могут вызвать не только антител; к антигенам HLA I класса, но и антитела к антигенам HLA ; класса, экспрессированянм на В-лимфоцитах и некоторых других клетках (WE.Braun, 1989; A,Ting , 1989). Поскольку HLA антитела рассматриваются как неблагоприятный для трансплантации фактор, поиск рациональных подходов к трансплантации органов сенсибилизированным больным становится одной из важнейших задач ( F.Claas 1988). Традиционный подход к оценке степени сенсибилизации через определение процента положительных реакций с панелью аллогенных лимфоцитов малоинформативен, гак как не позволяет установить характер и специфичность предсуществующих антител. Современные схемы иммунологического мониторинга реципиентов аллотрансплантата предусматривают проведение скрининга антител различных классов и разной специфичности, а именно, антител против антигенов различных популяций лимфоцитов, против антигенов H LA I и 2 класса ( HLA -А, В,С, Î>RS1>G( ), разнотемпературных лимфоцитотоксинов (холодовых, тепловых) ( P.J. Morris é al., 1983; W. £. Braun , 1989). В претрансплантационном мониторинге серологические тесты применяют для наблюдения за динамикой предсуществугацих антител, в посттранс плантационном мониторинге - для наблюдения за профилем специфичес кой антидонорской реактивности сыворотки реципиента.

В ведущих зарубежных трансплантационных центрах для скрини типирувдих сывороток, мониторинга предсуществувдих антител и о деления их специфичности широко применяются криоконсериврованн лимфоциты ( Н. Ruder etai , 1984; С. Barocci ёЫ„ 1984). Благ даря применению замороженных клеток появляется возможность сос вления панели тест-лимфоцитов с определенным HLA фенотипом

Для определения специфичности антител к антигенам HLA 2 са необходима суспензия клеток, обогащенная В-лимфоцитами. Тра, ционным источником лимфоцитов является периферическая кровь. Н кое содержание В-лимфоцитов в периферической крови затрудняет : сепарацию. Более предпочтительным источником HLA класс 2-й. тивных клеток является донорская селезенка, поскольку относите, ноё содержание В-клеток в популяции лимфоцитов селезенки в ней лько раз выше, чем в периферической венозной крови (до 50$). К; ме того, В-лимфоциты селезенки более чувствительны й воздейств: лимфоцитотоксических HLA антител в комплементзависимом цито' сическом тесте (Ю.М.Зарецкая с соавт., 1986).

Актуальной задачей является изучение возможности криоконсе] рования В-лимфоцитов селезенки и применение их в качестве клек мишеней в серологических тестах трансплантационного мониторин:

Цель исследования

Выполненное исследование имело своей целью создание коллекции ] оконсервированных В-лимфоцитов селезенки, типированных по анти; нам HLA I и 2 класса, и обоснование возможности применения i в серологических тестах трансплантационного иммунологического i ниторинга.

Задачи исследования

Задачи исследования состояли в следующем:

- изучить жизнеспособность В-лимфоцитов селезенки после Kpi

консервирования в жидком азоте по методу И.31гоп0с соавт. в течение 5 лет;

- изучить экспрессию общих антигенных детерминант молекул Н1_А 2 класса на поверхности замороженных-размороженных В-лимфо-цитов селезенки в разные сроки криоконсервирования;

- произвести сравнительный анализ результатов тканевого титрования поверхностных антигенов НЬА I и 2 класса замороженных лимфоцитов в различные сроки криоконсервирования;

- изучить возможность тшшрования антигенов Н1_А без отмывания криоконсервированных лимфоцитов от криопротектора;

- разработать и внедрить микрометод идентификации изолированных ИЬА класс 2-лозитивных клеток селезенки с помощью иммуномаг-нитных микрочастиц 1)упаЬе<эо15 ТМ Н1А с^йяИ .;

- изучить возможность применения криоконсервированных В-лим-фоцитов для скрининга специфических Н1А-1Ж антител;

- изучить возможность применения криоконсервированных В-лим-фоцитов для выявления разнотемпературных лимфоцитотоксинов;

- создать коллекцию типированных по антигенам НЬА криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки;

- осуществить на базе коллекции криоконсервированных В-лимфоцитов всесоюзную межлабораторную программу клеточного обмена.

Научная новизна и практическая значимость результатов исследован; Впервые в СССР создана коллекция криоконсервированных В-лимфоцит селезенки, типированных по антигенам НЬА I и 2 класса, включаю щая 68 образцов клеток. В коллекции представлены лимфоциты, несу шие антигены ША-Ш, №2, ЗЖЗ, И?4,1Ж5,1)^6,^7,ТЖ\л/8,Ж9, 3>^10,1>^52,1>1?и'53,'1Х}и/1. На основе коллекции впервые осущестЕ лена всесоюзная программа клеточного обмена, в ходе которой обос нована и продемонстрирована возможность эффективного применения

крибконсервированных В-лимфоцитов селезенки в качестве стандарт для совершенствования тканевого типирования.

Установлено, что применявшийся метод программного заморакив ная й-лимфоцитов селезенки обеспечивает в течение 5 лет высокун жизнеспособность клеток после размораживания и инкубации в услс ах микролимфоцитотоксического теста. Доказано, что криоконсерв! ванные В-лимфоциты селезенки можно использовать в микролимфоцм токсическом тесте для типирования тканевых антигенов без отмывг от криопротектора. Разработан и внедрен микрометод для ускорен! визуальной идентификации Н1.А класс 2-позитивных изолированнь лимфоцитов селезенки. Установлено, что общие и частные детермш ты молекул I и 2 класса сохраняются на поверхности криоконсерв* ванных В-лимфоцитов в течение не менее чем 5 лет. Доказано, чтс криоконсервированные В-лимфоциты селезенки можно использовать 1 качестве клеток-мишеней для скрининга разнотемпературных лимфо! тотоксинов и специфических ША-ЗЖ антител. Исходя из получению результатов обоснована целесообразность применения криоконсерв! рованных В-лимфоцитов селезенки в серологических тестах трансш тационяого иммунологического мониторинга.

Диссертационная работа выполнена в рамках Государственной ] граммы ГКНТ СССР 0.69.03 (тема "Создать государственную службу пирования органов и тканей, централизованную систему подбора д< ров и реципиентов для трансплантации органов и тканей", номер з сударственной регистрации 80068850, и тема "Разработать метода кие приемы изучения докусов НЬА-1) и НЬА-ХЖ номер государс венной регистрации 80068852) и Государственной программы ГКНТ < 0.69.07 (тема "Внедрить в экспериментальную и клиническую прак1 метода типирования ЗЖ и 1а антигенов", этап 01.01.Н6, и тема ширить коллекцию типирукщих Н1А сывороток для типирования люд и оценки связей антигенов Н1А с болезнями", этап 01.01.НИ).

ттплгожения. выносимые на защиту На защиту выносятся следующие положения:

1. Примененный метод программного криоконсервирования В-лимфоцитов селезенки в жидком азоте обеспечивает в течение 5 лет уровеI жизнеспособности клеток, приемлемый для выполнения микролимфоцито-токсического теста. На поверхности криоконсервированных клеток после размораживания сохраняются общие и частные детерминанты молекул НЬА I и 2 класса.

2. Сохранение высокой жизнеспособности и специфических детерминант молекул НЬА I и 2 класса на поверхности криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки при длительном хранении позволяет создать коллекцию стандартных клеток-мишеней с разнообразным набором антигенов I и 2 класса.

3. Коллекция криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки может применяться в серологических тестах пре- и посттранспладтаци-онного иммунологического мониторинга для скрининга антител к антигенам НЬА I и 2 класса, выявления разнотемпературных лимфоцито-токсинов, а также поиска типиругацих сывороток.

4. Свойства криоконсервированных клеток не страдают после транспортировки в жидком азоте. Коллекция типированных В-лимфоци-тов селезенки может служить эффективным инструментом совершенствования серологических методов типирования в трансплантационных центрах страны.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на II Всесоюзной конференции по пересадке органов и тканей (Тбилиси, 1982), на заседании комиссии экспертов СЭВ по проблеме 8.1 (София, 1983), на Всесоюзном семинаре по тканевому типированию (Москва, 1984), на объединенной межлабораторной конференции НИИ ТиИО МЗ СССР (1990).

-о-

Публикашгя результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ в сборниках £ центральных журналах. Объем и структура работы

Диссертация изложена на 187 страницах и состоит из введения, че рех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, ре зультаты исследования, обсуждение результатов исследования), вь дов, списка основной литературы, включащего 59 отечественных и 204 иностранных источников, и приложения. Текст диссертации илл стрирован 19 рисунками и включает 30 таблиц. В приложении приве ны копии актов внедрения результатов работы.

Объект и методы исследования

Объектом исследования служили свежие и криоконсервированные в а ком азоте I) лимфоциты периферической венозной крови человека, лимфоциты, выделенные из трупной селезенки, и 3) В-лимфоциты се зенки.

Основными применявшимися методами были:

- метод флотации в градиенте плотности для получения лимфоц тов периферической крови и селезенки (А.Бейум, 1980);

- метод адгезии к нейлоновому волокну для обогащения суспен лимфоцитов В-клеткада ( D. Ayoub ët"al. , 1980);

- метод программного криоконс ервирования и хранения лимфоци в жидком азоте ( M.D. Strong ebl, 1975);

- метод еуправитального окрашивания 0,3^-ным раствором трип нового синего для определения жизнеспособности лимфоцитов;

- комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (Р.Тег ki -ёЫ., 1978) для тканевого типирования и скрининга цитотоксиче ких антител (использовавшиеся типирующие сыворотки идентифициро ли 18 антигенов H LA-А , 29 антигенов HLA-B , 6 антигенов HLA-Cw

антигены HLA -DR I-DRlO,])Rw52,DRw53,DQwI-DGiw3);

- модифицированный комплемеятзависимый микролимфоцитогоксичес-кий тест для определения разнотемпературных (4,22 и 37°С) лимфоци-тотоксических антител (Р.Я.Войлокова с соавт., 1982);

- метод непрямой иммунофлюоресценции с моноклональннми антителами OK DR. (Ortlio , США) в модификации фирмы-производителя;

- метод розеткообразования с микрочастицами Düna beads

( Dynal , Норвегия) для идентификации HLA антигенов 2 класса на поверхности лимфоцитов (Н.Н.Калужина с соавт., 1991).

При анализе результатов применялись соответствующие биометрические методы (Н.Н.Плохинский, 1970).

Результаты исследования и их обсуждение

Основными условиями адекватности тиоирования антигенов HLA являются высокая жизнеспособность клеток-мишеней и сохранность поверхностных антигенных детерминант. Криоконсервирование лимфоцитов кр< ви и селезенки для целей тканевого типирования выполняли по метод; описанному Strong с соавт. (1975), в нашей модификации (Н.Н.Калужина с соавт., 1984). Криозащитная смесь состояла из 70% среды 19'. 20$ инактивированной сыворотки АВЦУ) и 10% криопротектора димети. сульфоксида (ЩСО). Клетки замораживали в аппарате программного з. мораживания Pia пег (Великобритания) со скоростью 2°С/мин от 0°С д< -50°С и затем 15°С/мин до -196°С, после чего переносили в жидкий азот. Жизнеспособность криоконсервированных лимфоцитов изучали не посредственно после размораживания. До замораживания жизнеспособность лимфоцитов периферической крови (к. =10) и лимфоцитов селезе ки ( а=Ю) составляла, соответственно, 98,и 91,4^. После крио-консервирования в течение I года она не изменялась и составляла, соответственно, 97,8$ и 91,95? (р>0,05). Жизнеспособность В-лимфо цитов селезенки изучалась в течение 5 лет хранения в жидком азоте

Таблица I

Жизнеспособность В-лимфцитов селезенки после различных сроков криоконсервирования (/г =15)

Срок хранения в жидком азоте Жизнеспособность, в % (Ы^т)

До замораживания 93,47^0,59

1-2 мес хранения 93,00^0,58

5-6 мес хранения 93,13+0,51

11-12 мес хранения 92.27i0.44

2 года хранения 90,87^0,50

5 лет хранения 83,73^1,82

(табл.1). До замораживания она составляла 93,5$. В течение 12 ме хранения жизнеспособность В-клеток оставалась неизменной (92,3$,

р>0,05), снижалась за 2 года на 2,6$ (р<0,01), а в течение последующих 3 лет - на 7,1$ (р<0,01).

Было изучено влияние специфических условий микролимфоцит от о* сического теста на жизнеспособность размороженных клеток. С отш тыми от криопротектора и одновременно с неотмытыми от него клет* ми одного и того же образца лимфоцитов крови (м=5), криоконсерх рованвого в течение 12 ыес, ставили цито'гоксическую реакцию, пр! меняя сыворотку АВ(1У) (отрицательный контроль) и ксеногенный ах лимфоцитарный гамма-глобулин (положительный контроль). В тех же ловиях ставили удлиненный цитотоксический тест с криоконсервиро! ными образцами В-лимфоцитов селезенки (я =5). Клетки обоих виды сохраняли исходную жизнеспособность (выше 90$) после проведения микролимфоцитотоксического теста с отрицательной контрольной сш роткой и кроличьим комплементом. 90-100$ тех же клеток лизировал антилимфоцитарным глобулином в присутствии комплемента. Таким ос зом, в условиях лимфоцитотоксической реакции криоконсервированнь клетки, с одной стороны, не претерпевали неспецифического лизисе и, с другой стороны, не утрачивали способности лизироваться под

дейстшем специфических антител и комплемента. Кроме того, было установлено, что при точном выполнении условий размораживаний ( M.TiSîrongëtal., 1975) замороженные лимфоциты можно немедленно использовать в микролимфоцитотоксическом тесте без отмывания от кри-опротектора. Лимфоциты периферической крови и B-лимфоциты селезенки, неотмытые от JPC0, сохраняли ту же жизнеспособность (выше 90%) в условиях цитотоксической реакции, что и клетки, отмытые от крио-протектора. Одинаковой была и реакция с лимфоцитотоксическими ант! телами в положительном контроле: лизис более 90$ клеток.

Серия экспериментов с криоконсервированными лимфоцитами крови, селезенки и B-лимфоцитами селезенки позволила доказать, что примененный нами метод программного криоконсервирования позволяет получить клетки, сохраняющие высокую жизнеспособность как после размораживания, так и после инкубации в условиях лимфоцитотоксического теста. Жизнеспособность B-лимфоцитов селезенки даже после 5-летнего хранения сохраняется на уровне, достаточном для выполнения тканевого типирования и скрининга лимфоцитотоксинов.

Сохранность антигенов MLA I и 2 класса на поверхности крио-консервированных лимфоцитов изучалась с помощью моноклональных антител к антигенам HLA 2 класса и аллогенных типирующих сывороток к антигенам H LA I и 2 класса.

Нами был разработан экспресс-метод идентификации HLA класс 2-позитивных клеток в суспензии лимфоцитов селезенки. За основу был взят метод выделения HLA класс 2-позитивных клеток из цельной крс ви с помощью полимерных монодисперсных микрочастиц Dünabeads , покрытых моноклональными антителами к мономорфному эпитопу бета-цепи молекулы HLA антигена 2 класса. При контакте с клеткой, несущей молекулы 2 класса, частицы специфически связываются с клеточной мембраной и образуют розетки, легко различимые в световом микроскопе ( Т Lea d'aï. , 1985). В пластмассовой пробирке для микро-

-хи-

Таблица 2

Розеткообразоваиие лимфоцитов с иммуномагнитными микрочастицами в различных режимах и условиях инкубации

Источник лимфо- Относительное содержание розеткообразующих клеток, в % (М±т)

Розеткообразоваиие

цитов В пробирке На стекле

инкубация 20 мин инкубация 5 мин инкубация 5 ми

Селезенка (п =5) 46,3±3,0 46,?±2,9 46,3±3,0

В-лимфоциты селезенки (л-=5) 86,6±2,2 86,012,0 86,3±2,7

Примечание: при сравнении по горизонтали р>0,05 во всех случаях

проб смешивали 10 мкл взвеси клеток (концентрация 52хЮ^/мл) и 5 м взвеси микрочастиц. Смесь инкубировали в ледяной бане, периодичес встряхивая. Затем добавляли раствор трипанового синего, переносил взвесь на предметное стекло и подсчитывали число розегкообразующи. клеток под световым микроскопом. Для получения розеток в капле на стекле (микрометод) смешивали 2 мкл взвеси клеток и I мкл взвеси микрочастиц. Было установлено, что при постоянном соотношении мик рочастиц и клеток (50-60:1) розеткообразоваиие не зависело от вре мени инкубации реагентов в смеси и от финального объема, в которо] протекала реакция (табл. 2).

Полученные результаты сравнили с результатами традиционного м тода непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител ОКЗЖ (СМЬо) к константной части молекулы антигена 2 клас< Методом розеткообразования с микрочастицами Т>УпаЬеаси и иммуно-флюоресцентным методом во взвеси неразделенных лимфоцитов селезен-

Рис. I. Определение содержания HLA класс 2-позитивных клеток в различных суспензиях лимфоцитов селезенки, методами розеткообразо-вания с микрочастицами 1>Упа beads и. непрямой иммунофлюоресцен-ции с моноклональными антителами OKJDR .А - относительное содержание HLA класс 2-позитивных клеток (в %); Б - корреляция результатов, полученных двумя методами. ДС - лимфоциты селезенки, ВЛС -В-лимфоциты селезенки, К - коэффициент корреляции.

ки (п=10) было идентифицировано, соответственно, 50,3 и 51,4$ ULA класс 2-позитивных клеток (р>0,05). Доля клеток, выявлявшихся обоими методами после обогащения взвеси лимфоцитов селезенки В-клетками (п =5), также была одинакова (соответственно, 85,2 и 86,3$, р>0,05) (рис. IA). Корреляционный анализ показал сильную положительную связь результатов, полученных при исследовании обоими методами лимфоцитов селезенки (R =0,9) и В-лимфоцитов селезенки (R =0,9) (рис. 1Б).

Методы розеткообразования с микрочастицами Dy па beads и непрямой иммуноф^-люоресценции были использованы для обнаружения антигенов HLA 2 класса на поверхности криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки. В обогащенной В-клетками суспензии лимфоцитов се-

Таблица 3

Относительное содержание ИLA класс 2-позитивных клеток в суспе зии В-лимфоцитов селезенки до и после криоконсервирования в жида

азоте (п. =5)

Содержание HLA класс 2-нозитивных клеток, в % Срок —----——•

хранения Розеткообразование с Иммунофлюоресценция с

Dünabeads OKER

До замораживания 85,2±I,8X р>0,05 86,3^1,9

6 мес 84,6±2,2 р>0,05 84,7±1,6

12 мес 85Д±1,2 р>0,05 84,8+2,0

18 мес 85,4±0,9 р>0,05 85,2±1,8

Примечание: * - М±т. р>0,05 при сравнении по горизонтали и по вертикали во всех случаях.

лезенки методом розеткообразования с микрочастицами выявлено 85, клеток, асспрессировавших на своей поверхности антигены 2 класса методом непрямой иммунофлюоресценции - 86,3$ (табл. 3). В течени полутора лет хранения замороженных В-лимфоцитов в жидком азоте о носительные размеры популяции ША класс 2-позитивных клеток не изменялись и составляли, соответственно, 85,4 и 85,2$, что свиде тельствовало о сохранности общих специфичностей молекул 2 класса экспрессированных на клеточной мембране. Таким образом, разработанный микрометод идентификации Н1.А класс 2-позитивных клеток с помощью микрочастиц 3)упзЬеас15 эффективен при количественном определении лимфоцитов селезенки, несущих антигены Н1А 2 класса и может заменить для этой цели традиционный иымунофлюоресцентный метод.

Установив, что экспрессия молекул Н1А 2 класса и специфичность мономорфных детерминант не страдает в результате криоконсервирования, мы перешли к типированию полиморфных частных детер минант ША . При титровании детерминант Н1_А-А,В,Су/ в качес

Таблица 4

Выявление НЬА антигенов I класса на криоконсервированных

лимфоцитах

Фенотип

№ Срок хранения

№ _—____

До заморажив. 3 мес 6 мес 12 мес

Лимфоциты периферической крови

1 А2.З.В21,35 А2,3,В21,35 А2,3,В21,35 А2,3,В21,35

2 А2Д0.В35 А2,Ю,В35 А2Д0,В35 А2Д0.В35

3 A3.BI5.Cw3 АЗ,В15,СиЗ A3.BI5.Cw3 A3.BI5.Cw3

4 А25Д1.В7 А25ДГ.В7 А25.В? : А25Д1.В7

5 А1,2,В12,17 А1,2,В12,17 А1,2,В12Д7 А1,2,В12Д7

6 А2,3,В7,40 А2,3,В7,40 А2,3,В7,40 А2,3,В7,40

В-лимфоциты селезенки

7 А2,9,В16,40 А2.9.В16.40 А2,9,В16,40 А2,9,В16,40

8 А2,9,В7,С*2 А2,9,В7,С»2 А2,9.В7.С*2 А2,9,В7,С*2

9 А2,В14,40,С*4 А2,В14,40,С*4 А2,В14,40,Ск4 А2,В14,40,Си4

10 А29,31,В7,21 А29,31,В7,21 А29,31,В7,21 А29,31,В7,21

11 A2.26.BI6 А2,26,В16 А2,26,В16 А2,26,В16

12 A25.32.BI8 А25,32,В18 А25,32,В18 A25.32.BI8

13 А1,28,В8,60 А1.28.В8.60 А1,28,В8,60 А1,28,В8,60

14 А2,32,В14,27 A2.32.BI4,27 A2.32.BI4.27 A2.32.BI4.27

ве клеток-мишеней использовали криоконсервированные лимфоциты периферической крови и В-лимфоциты селезенки (табл. 4). Наблюдалось полное совпадение Н1-А фенотипа клеток, установленного до замораживания, с фенотипом, который выявлялся после 3-, 6- и 12-месячного хранения образцов. Недовнявление антигена Н1А -АН (образец 4) через 6 мес хранения было, по-видимому, артефактом, так как впоследствии (после 12 мес хранения) антиген был выявлен на лимфоцитах того же образца. Антигены Н1.А-!>{?. типировали в удлиненном двуступенчатом микролимфоцитотоксическом тесте. Результаты типиро-

Таблица 5

Типирование Н1.Аантигенов на криоконсервированных В-лимфоцит

селезенки

Срок __Фенотип НЬА-ЗЖ

Хранения I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 52 . 53

I До заморажив. + + +

3 мес ± + + н.д.

12 мес + + +

5,5 лет + + ± +

2 До заморажив. + + +

12 мес + + +

2 года + + +

5 лет + + +>

3 До заморажив. + + +

4 мес + • +

5 лег + + +

4 До заморажив. + + н.д. ±

3 мес + + + +

4,5 лет + + + +

5 До заморажив. + + + +

3 мес + + + +

5 лет..... + + + +

6 До заморажив. + +

12 мес + + н.д.

4,5 лет + + +

7 До замаранив. + + + +

12 мес + + + +

4,5 лет + + + +

8 До заморажив. + + + +

12 мес + + + +

5 лет + + + +

9 До заморажив. + +

12 мес + +

4,5 лет + +

10 До заморажив. +

12 мес +

4 года + + +

Примечание: + - положительная реакция; + - сомнительная реакция; н.д. - типирование не проводилось.

-1Ь-

вания 10 образцов В-лимфоцитов селезенки до замораживания и в различные сроки криоконсервирования приведены в табл. 5. ША-ЗЖ фенотип клеток, установленный в различные сроки хранения вплоть до 5,5 лет (промежуточные результаты полностью в таблице не приведены) , соответствовал фенотипу, выявленному до замораживания. Единичные отклонения в результатах гипирования антигенов Н1-А -Ш. (образцы 1,3 и 10) не коррелировали со сроками хранения клеток в жидком азоте. Таким образом, результаты типирования частных специфич-ностей антигенов НЬА I и 2 класса, экспрессированных на замороженных В-лимфоцитах, показали, что даже после 4-5 лет хранения они адекватно выявляются типирующими сыворотками • в цитотоксическом тесте.

Основываясь на полученных результатах, мы приступили к созданию коллекции криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки, в которую вошло 68 образцов клеток, типированных по антигенам ША I и 2 класса. В коллекции представлены 13 антигенов и сплитов ША - А , 24 антигена и сплита ША-В , антигены Н1А -1Ж Н1.А-

Р^52,Н1Л-3>Е»53,Н1А-1>й«г1- Гс^ 3. Антиген Н1А-Г>£ I был представлен в коллекции 16 раз, Н1-А-ТЖ 2-21 раз, Н1.Д -ФЯ. 3-14 раз, Н1-А -1Ж 4-17 раз, Н1А-1Ж 5-19 раз, 6-19 раз,

Н1_А-5Я 7-17 раз, Н1_А-Э£м8, 9 и м 10 по одному разу. Общее количество замороженных клеток каждого образца было не менее 2530 млн В-лимфоцитов. Этого количества достаточно для выполнения примерно 8-12 тыс типирований в микролимфоцитотоксическом тесте. Некоторые образцы, несшие редкие антигены, были заморожены в объемах до 100 млн клеток. Оптимальный объем замораживаемой суспензии в каждой пробирке составлял около 200 мкл.

Коллекционные образцы криоконсервированных В-лимфоцитов применяли в серологических тестах иммунологическогб мониторинга. Замороженные В-лимфоциты были использованы в качестве клеток-мишеней для

определения специфичности лимфоцитотоксических антител к антига МLA 2 класса в аллогенных сыворотках. Целью исследования, коте проводилось в рамках международной программы Интертрансплаят, 6i отбор высокоспецифических сывороток для включения в международна панель типируодих сывороток. Предположительно HLA-DR. антител; содержались во всех сыворотках, отобранных для скрининга. HLA-A.I антитела были удалены из них предварительной абсорбцией тромбоц] тами. Все сыворотки были скринированы против 30-50 образцов заг.к женных клеток, подобранных таким образом, чтобы имелось пример» равное представительство в панели клеток с каждым отдельным ант) геном 2 класса. Во время первой программы скрининга сывороток И; тертранспланта (п. =40) 60% проверявшихся сывороток подтвердили свою специфичность. Были обнаружены высокоспецифические сыворот: HLA - PR2, HLA -DR 3, HLA -DR 4, HU-DQwI ( R от 0,81 0,91) и несколько биспецифических сывороток с высоким коаффицие том корреляции. Неподтверздение предварительно заявленной специ ности ряда сывороток не было вызвано дефектом скрининга, поскол наши результаты хорошо согласовывались с результатами других уч ников программы Интертрансплант. Еце более успешным был второй скрининг в рамках Интертранспланта (П. =51), когда 76$ проверенн сывороток подтвердили свою специфичность. В этом скрининге были обнаружены сыворотки с высоким коэффициентом корреляции HLA-D HLA-DR 3, И LA-DR. 4, HLA-DR. 7 и сыворотки к антигенам НЬ DQw I и HLA-DRw 52 ( "R. от 0,81 до 0,98).

Выполнение обеих программ скрининга показало, что коллекция криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки служит эффективным струментом идентификации В-клеточных антител, направленных к де терминантам NLA-DR. . Для определения специфичности HL4-DR е тител достаточно 25-30 образцов замороженных В-лиыфоцитов, nocí льку серологический полиморфизм HLA -DR. антигенов относите;

узок. Преимущество же применения коллекции состоит в том, что она обеспечивает целенаправленный отбор образцов для скрининга и при необходимости позволяет дублировать реакции с теми же клетками или добавлять в скрининг клетки с требующимся фенотипом.

Коллекционные образцы В-лимфоцитов, криоконсервированных в течение I года, были использованы в качестве клеток-мишейей в серологических тестах для выявления разнотемпературных (4,22 и 37°С) лим-фоцитотоксических антител. Исследовались сыворотки 10 пациентов, ожидавших трансплантации аллогенной почки. В 8 из 10 сывороток содержались лимфоцитотоксические антитела, обнаруженные с помощью стандартного теста с криоконсервированными и свежими лимфоцитами периферической крови. Абсорбцию сывороток тромбоцитами не проводили, что позволяло изучить весь набор лимфоцитотоксинов к В-лимфо-цитам (в том числе антитела к антигенам I класса), .а не только активность сшороток в отношении антигенов 2 класса. Сыворотки исследовали в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16. Содержание В-лимфодатарных разнотемпературных цитотоксических антител в сыворотках изучали на панели, включавшей 13 образцов В-лимфоцитов селезенки. Сравнение содержания лимфоцитотоксических антител в каждой сыворотке проводили по средним значениям реакции сыворотки со всеми образцами В-лимфоцитов, отобранными в панель. Было установлено, что ни одна из отрицательных сывороток не содержала антител к нативным В-лимфоцитам. В сыворотках, реагировавших с В-лимфоци-тами, содержались как тепловые (37°С), так и холодовые (4°С) лим-фоцитотоксины. Все сыворотки были охарактеризованы в тесте с на-тивными В-лимфоцитами в цельном виде и указанных разведениях. При изучении разнотемпературных реакций сывороток (при 4,22 и 37°С) с теми же образцами В-клеток после замораживания и хранения в жидком азоте в течение 3,6,9 и 12 мес было установлено, что сила цитоток-сической реакции оставалась постоянной в каждом разведении сыворот-

ки вне зависимости от сроков хранения клеток (р>0,05 во всех изз ченных случаях). Исключение составляла одна сыворотка (Ж), которая продемонстрировала усиление реакции с Холодовыми лимфоцитото! синами в цельном виде и в некоторых разведениях. Эти изменения, с нако, не коррелировали со сроками хранения замороженных лимфоците Таким образом, характер реакции раз нот емпературных лимфоцитотокси нов, содержавшихся в сыворотках, и ее сила в тесте с криоконсерви рованными В-лимфоцитами не отличались от характера и силы реакции в тесте с нативными В-лимфоцитами до замораживания, из чего следу ет, что коллекцию криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки мол но использовать для скрининга разнотемпературных лимфоцитотоксино в претрансплантационном мониторинге.

Была также изучена сравнительная реактивность каждого образца В-лимфоцитов до и после заморатавания со всеми сыворотками, взяты ми для опытов. Для этого сравнивали реакцию одного и того же обра ца В-клеток до замораживания и после криоконсервирования в течени 3,6,9 и 12 ыес. Реактивность криоконсервированных В-лимфоцитов каз с цельными сыворотками, так и с их разведениями оставалась неизме! ной вне зависимости от сроков хранения (р>0,05 во всех изученных случаях). Таким образом, В-лимфоциты селезенки, замороженные по применявшейся нами программе и хранившиеся в течение года при -196°С, не теряли способности специфически реагировать с лимфоците токсинами в разных температурных режимах, из чего следует, что кр! оконсервированные донорские В-лимфоциты можно использовать в после операционном скрининге вновь появляющихся антидонорских антител.

Для того, чтобы оценить воспроизводимость результатов типиро-вания коллекционных образцов В-лимфоцитов ВИИ ТиИО МЗ СССР была проведена Всесоюзная межлабораторная программа клеточного обмена. Программа предусматривала распределение коллекционных образцов замороженных В-клеток между участниками, типирование клеток на месте

^

ч» 9о § 8о

§ 7о

а &

С: _ и 5о

§6

к) 4о

^Зо

■ 4- ——6 — 7— 8 — 3 — -10—11—12—15-74-/^-76 —

Рис. 2. Жизнеспособность В-лимфоцитов, установленная участниками Всесоюзной программы клеточного обмена после транспортировки и размораживания образцов. Точками на рисунке обозначены отдельные результаты.

после транспортировки, сбор и обработку результатов типирования в НИИ ТиИО. В программе приняло участие 18 лабораторий тканевого типирования из 14 городов страны. Каждая лаборатория получила от 2 до 8 образцов криоконсервированных клеток. В фенотипе лимфоцитов, отобранных для клеточного обмена (п. =16), присутствовали антигены Ни - А I, 2, 3, 9, 10, 11,1/19, Ни-В 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 21,зд22, 35, 40, Ни-ЗЖ I, 2, 3, 4, 5,^6, 7. 2изне-способность всех отобранных клеток, определенная накануне рассылки, превышала 90$. После транспортировки, хранения в жидком азоте и размораживания клеток участниками жизнеспособность В-лимфоцитов в большинстве случаев по-прежнему была выше 90 % (рис. 2). Единичные отклонения в сторону снижения жизнеспособности были, скорее всего,обусловлены нарушением условий размораживания. Все антигены, за исключением Н1_А-3)1?\л/6, выявлялись с точностью, близкой к 60$

Таблица 6

Результаты типирования антигенов криоконсервированннх

В-лимроцитов селезенки участниками межлабораторной программы

клеточного обмена

№№

Участник

Н А Б В Г д Е 1 3 И

I 2,5 2,5

2 4,7 3,7 4,7

3 2,4 2,4 2

4 5,6 4,6 5,6 5,6

5 2,5 2,5 3,5 5,7

6 3,4 3 2,5

7 4,5 4,5 4,10

8 2,7 2,7 2,10

9 1.6 I 2,4

10 1,2 1.2

II 2 2 1.5 1,5 2,5 2 2,7 6

12 3 3 3,7 3,4 3,7 1,2

13 1,7 1.2 1,7 1,7 1.4 1.7 1.2 3,6 7 8,10

14 3,6 3,5 2,3 2,4 2,5 3,6 3,7 2,7 7 2,3

15 2,5 5 1.3

16 4,6 4,6 3,4

К

2.7 4.5

Примечание.: в таблице против каждого участника, обозначенного буквой, приведены установленные им фенотипы замороженных В лимфоцитов; Н - НИИ ТиИО.

(табл. 6). Наиболее хорошо идентифицировался антиген Н1А -ДЖ 2. Типирование антигена Н1_Абыло наименее точным (правильное определение в 35$ случаев). Антигены ША I класса,правильно выявлялись примерно в 90$ случаев, причем антигены И1А-А в цел! типировались точнее, чем антигены Н1_А - Б . Наибольшие трудност] возникали при типировании антигенов ША-Аю 19 и И1А-В\л/ 22.

Итоги всесоюзной программы клеточного обмена показали, что замороженные В-лимфиитн селезенки пригодны для использования в каче-

стве стандартных тест-клеток в микролимфоцитотоксическом тесте. Криоконсервированные клетки могут служить инструментом для стандартизации и совершенствования иммунологического типирования в различных лабораториях страны независимо от их удаленности. При правильном размораживании жизнеспособность криоконсервированных B-клеток не страдает после транспортировки в жидком азоте и сохраняется на высоком исходном уровне. Антигены НLA обоих классов хорошо выявляются на размороженных клетках и при наличии совершенной: панели типирущих сывороток их идентификация не вызывает затруднений. Распределяя коллекционные криоконсервированные клетки в лаборатории типирования и трансплантационные центры, можно постоянно иметь в них одинаковый набор стандартных клеток-мишеней и получать, применяя замороженные клетки в тестах трансплантационного иммунологического мониторинга, сравнимые результаты, что очень важно при организации иммунологический службы в рамках крупных- трансплантационных объединений.

Выводы

1. Впервые в СССР создана коллекция криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки, типированных по антигенам HLA I и 2 класса. В коллекции представлены клетки, несущие антигены HLA-DR I, DR 2, DR 3, DR 4, DR 5, 3)Ew 6, ER 7, 3>Rw 8, DR 9,DRw 10, а также HLA -ERw 52, HLA-DRv53 я HLA-DQwI.

2. Показано, что при криоконсервировании В-лимфоцитов селезенки в жидком азоте по методу МР.Strohe соавг. жизнеспособность замороженных клеток в течение 5 лет сохраняется на уровне, необходимом для выполнения мжромшфоцитотоксического теста.

3. Методами непрямой иммунофлюоресценции и розеткообразования с иммуномагнитными микрочастицами Dynabeads TM HLA dassl установлено, что замораживание и хранение В-лимфоцитов селезенки по пред-

ложенной программе в течение полутора лет не изменяет способности общих детерминант молекул 2 класса, экспрессированных на поверхности В-клеток, специфически связываться с моноклональяыми антителами.

4. Показана высокая воспроизводимость результатов типирования антигенов HLA I и 2 класса на поверхности криоконсервированных В-лимфоцитов селезенки в течение 5 лет. Установлено, что после размораживания клетки можно использовать в микролимфоцитотоксичес ком тесте без отмывания от криопротектора. Доказана возможность применения криоконсервированных В-лимфоцитов для скрининга специфических HLA -DR антител.

5. Разработан и внедрен экспресс-метод идентификации изолиро ванных лимфоцитов селезенки, экспрессирующих молекулы 4LA 2 кла са, с помощью иммуномагяитных микрочастиц Dynabeads ТМ HLA class И Продемонстрирована высокая корреляция результатов, полученных эти методом, с результатами иммунофлюоресцентного теста.

6. Установлено, что В-лимфоциты селезенки, криоконсервирован-ные в течение I года, сохраняют способность специфически реагировать с антителами в различных температурных режимах и могут использоваться для выявления разнотемпературных лимфоцитотоксинов к В-лимфоцитам в пре- и посттрансплантационном мониторинге.

7. На основе коллекции криоконсервированных В-лимфоцитов селе зенки проведена всесоюзная программа клеточного обмена. Показано, что при правильной транспортировке и размораживании клетки не теряют жизнеспособности и могут служить инструментом для стандартизации и совершенствования тканевого типирования в различных лабораториях страны.

Список работ, опубликованных до теме диссертации

1. Ефименко H.H., Долбин А.Г. Программная криоконсервация лимфоцитов и B-клеток доноров и их хранение в жидком азоте. В кн.: Трансплантация органов и тканей. Тезисы докладов IX Всесоюзной конференции по пересадке органов и тканей/ Под ред. Шумакова В.И. -Тбилиси, 1982. - С.232-233.

2. E£f imanko W.NV Polbin A.G., Zaretskava У. M., Vurneva TS. Programme crüoconservation oí lymphocytes in the Practica o£ immunological department of transplantation center. In: Scripta scientifita medica / Ed. (S.Kaprelyan. - Sofia, 1982,-P. Í05-107.

3. Войлокова P.Я., Битязева В.A., Ефименко H.H. Использование отечественной синтетической ваты для выделения B-лимфоцитов из селезенки. В кн.: Вопросы трансплантологии и искусственных органов.-M., 1982.-- С.65-66.

4.Калугина H.H., Войлокова Р.Я., Витязева В.А. Криоконсервиро-вание и длительное хранение в жидком азоте B-лимфоцитов, выделенных из селезенки. В кн.: Трансплантация и искусственные органы. -M.,1984. - С.98-99.

«

5. Абрамов В.Ю., Ефименко H.H., Войлокова Р.Я., Витязева В.А., Зарецкая Ю.М. H LA-PR типирование замороженных В-лимфоцитов. -Гематология и трансфузиология, 1985, №5, С.50-53.

6. Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю., Калужина H.H., Оточева Л.В., Бакулина А.Г. Итоги Всесоюзной программы клеточного обмена. -Гематология и трансфузиология, 1986, Ж5, С.58-60.

7. Калужина H.H., Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю., Оточева Л.В. Криоконсервированные B-лимфоциты как инструмент совершенствования и стандартизации H LA-DR тшшрования. В кн.: Клиническая иммунология и иымуногенетика. Научные труды АМН СССР. - Новосибирск,

1988. - С.52-57.

8. Калугина H.H., Абрамов В.Ю. Изучение экспрессии HLA анти генов 2 класса на криоконсервированных изолированных клетках селе зенки. - Гематология и трансфузиология, 1991, №3, С.5-7.