Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Роль HLA-антигенов 1 и 2 классов в индукции и реализации реакции бластной трансформации лимфоцитов

, Г 6 1л-

1 з 110 Г.РоЬсиЙСНАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Громова Нряна Игоревна

РОЛЬ Н1А-АНТВГЕН0В 1 И 2 КЛАССОВ В ИНДУКЦИИ И РЕАЛИЗАЦИЙ РЕАКЦИИ ВЛАСТНОЙ ТР/ЛОТОРИАЦИН ЛИМФОЦИТОВ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36 - иммунология и аллергология

ь

АЕТОРЕСЕРАТ

дассергации на сояснакне ученой степени кандидата медицинских паук

Москса - 1993

Работа вшишена в Гематологическом Научном Центре РАИН Научный руководитель:

член-корресяондеят ЛЕН РФ доктор биологических наук, профессор О.М.ЗАРЕЦКАЯ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г.Й.КОЗИНЕД, доктор биологических наук й. И. ДЗЕРЖИНСКАЯ

Ведущее учреждение - Ленинградский НИН гематологии и переливания крови

Защита диссертации состоится "_*_:_ 139 г.

в час. на заседании Специализированного Совета

Д 074.08.01 в Гематологическом Научном Центре РАМН

( ■

(125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией мскао ознакомиться в библиотеке . Гематологического Научного Центра.

Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук,

старазш научныа сотрудник В.Д.РЕУК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Главный комплекс гпсгосовместимости. носящий название НЬА у человека, является сферой пересечения интересов научных исследователей и практиков медицины. Трансфузиологая и. особенно, трансплантология неразрывно связаны с понимаем роли и Функции этого главного координатора иммунологических явлений в поддержании гомеостаза организма.

Аллотрансплангация костного мозга (АлТКМ) является методом терапии некоторых заболеваний системы крови. Иниунологи-•чесгае проблемы, возникающие при трзнсплантации костного мозга, изучаются в России с нача."а_60-х^гб55в (эксперикентальные исследования а1сад. Р. В. Петрова и проф. Ю.М. Зарецкой). С конца 80-х годов в кашей стране проводятся плановые родственные ал-, лотрансплантации костного мозга (школа акад. А.И.Воробьева). Сейчас настало ■ время клинического воплощения самого трудного варианта АлТКМг- пересадки от неродственного .совместимого донора. Принципиальное отличие аллотрансплантащй костного мозга от аллотрансплантаций сомщных органов состоит в наличии двунаправленного конфликта. С одной стороны наблюдается реакция реципиента на генетически чужеродную ткань, проявлявшаяся реакцией "хозяин против трансплантата" (РХНТ), с другса стороны, иммунокомпетеаткые клеткч донора в свою очередь распознают и атакуют инородные клотки хозяина с развитием реакции "трансплантат претив хозяина" (РГПХ). Известно, что главными инициаторами в развитии названных реакций являются антигены системы НЬА. В связи с важностый проведения тщательной селекции неродственных доноров для трансплантаций костного мозга существует необходимость экспериментально охарактеризовать на-

иболее активные в иммунологическом смысле НЬА-детерминанты, способные вызвать достаточно сильные и выраженные иммунореэк-тивные процессы в ответ на "чужое". Впервые такие данные стало возможны!-! получить на моделях пересаженной почки и образования аллоантител. Была показана неравнозначность- вклада отдельных НЬА-антигеяоз .в осуществлении иммунологических процессов, выявлены антигены с различными иммунологическими потенция}®. Однако, данные эти неиногочисленны и довольно противоречивы, не содержат сведений обобщающего характера. Поэтому определение иммунологических потенций отдельных КЬА-детершшант 1 и 2 классов представляет несомненный научный и практический интерес. Актуальной является проблема изучения иммуногенности и иммунореактавности отдельных НЬА-детерминант как прогностических критериев способности отзета клеток донора и реципиента на чужеродаув ткань с развитием соответственно РТПХ и РХПТ.

Изучение антигенов гистосовместимости возможно при использовании нескольких подходов. Серологическое НЬА-типиро-вание является неотъемлемой процедурой в трансплантационной практике а основано на применении аллогенкых типирующих сывороток.

К преимуществам метода смешанной культуры лимфоцитов (ЫЬС) относится возможность оценки функциошрования клетки как единой системы, аиспрессируЕщей комплекс антигенов гистосовместимости, по-разному влияющих на процессы клеточного распоз-кавагая и реагирования. В отличие от метода типирования Н1Л на молекулярно-гекетическоы уровне (ДНК-ташрование). определявшего минимальные различия в биохимической структуре НЬА-Ой-ан-тигенов, Ш; позволяет оценить вклад НЬА-А. В - антигенов. минорных антигенов 1йА и других генетических систем в пролифера-

тивный аллогенный ответ. В ведущих трансплантационных центрах Европы. Канаде, США. Австралии учет пролиферативного ответа в смешанной культуре лимфоцитов является доминирующим критерием оценки генетической совместимости донора и реципиента при подготовке к аллогенной трансплантации .костного мозга. Поэтому реакция бластной трансформации лимфоцитов в смешанной культу, ре. остающаяся в настоящее время информативным методом, используемым .в практике и исследовательской работа, выбрана наш в качестве экспериментальной модели. Под иммунореактив-ностью ¡.ш поникаем способность отвечап'дих клеток пр'олифериро-вать в М1.С и реакции бластной трансформации лимфоцитов с мито-генами (РБТЛ). под иммуногенностьп - способность стимулирующих клеток внзывать аллогенный прсшфератиьный ответ в ИЬС.

Целью работы явилось изучение иммуногенности и иммуноре-актив^ости отдельных НЬА -детерминант и НЬА-фенотипоз, выявление сильных и слабых в иммунологическом смысле НЬА-антигенов: выявление зозмояной зависимости между НЬА-фекотипом. юдизидуу-ма ¡! его иимунной реактивностью методом ИЬС.

В Залачк ягследования входило:

1. Одрзд?лггь влияние ША-ЗЯ-Фенотипа лимфоцитов на про-лифэратавпьй ответ в реакции бластной трансформации с митоге-нами и в мьс.

2. оценить влияние степек! 111А-ПК-несовмеотиыостй между реопочдеракч и стимуляторами на интенсивность пролиферации в МЬС.

3 Определить вклад НЬА-ачтигенов 1 класса (НЬЛ-А. В - фенотипов) в иролифгративнкй ответ лимфоцитов з реакцзи бласткэй трансформг.цкч и в МЬС.

4. Опекать степень кснкордактности пролпферативпых отзе-

- А -

тов лимфоцитов в реакции властной трансформации с митогенами и в MLC.

5. Оценить пролиферативною активность криоконсервирован-ных лимфоцитов в реакции бластаой трансформации лимфоцитов с митогенадн и в MLC с последующей отработкой постановки MLC с криоконсервированнкыи лимфоцитами.

Научная новизна.

Осуществлена оценка иммунореактивности и иммуногенности отдельных HLA-DR-антигенов 2 класса - DR-антигзков методом MLC; выделены сильные и слабые HLA-DR-детермкнанты. Показан вклад HLA-антигенов 1 класса (HLA-A. В - Фенотипов) в пролифе-ративный клеточный ответ; выделены HLA-A. В - фенотипы с сильными и слабыми ишуногенныии и игмунореактивными потенциалами. Предложены прогностические критерии оценки интенсивности раз-внтия РТПХ и РХПТ у индивидуумов о конкретным ШдА-фенотипом.

В сметанной культуре лимфоцитов отмечена корреляция интенсивности пролкферативного ответа и степени HLA-DR-несов-местимоста стимулирующих и отвечающих клеток.

Выявлена конкордантность интенсивности пролиферативкого ответа лиифоцитов в смешанной культуре и реакции бластной •трансформации с метогенами растительного происхождения: наивысшая конкордаытаость наблюдается при использовании митоген» фитогемагглютиЕша.

Показана сохранность пролиферативной активности крио-консервированных в DMS0 лимфоцитов, что позволяет использовать постановку смешанной культура с криоинсервировашшми клетками для мониторинга "вторичной болезни" в клинике трансплантации костного мозга.

Научно-практическое значение.

донный микропланшет в обьеме 200 икл/лунку. Использовали постановку MLC в трех повторах. Клетки культивировали при 37 С .в.атмосфере 100% влажности с 5% содержанием СО,в течение 144 часов.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов с митогенами растительного происхождения

Свеневыделеннке и кркоконсервированные лимфоциты ресуспенднровали в полной питательной среде, описанной вше. В качестве митогенов использовали лектины растительного происхождения: фитогемагглютивин - РИА в концентрации 40 мкг/мл. конканавалин А - Con А концентрации 10 мкг/мл, покпад-штоген - PWH в концентрации 30 мкг/мл ( концентрация митогенов подбиралась опытным путем). В 96-лунсчякй круглодонный кикропланшет последовательно вносили лектин в указанной концентрации и отвечающие клетки в концентрации 2x10* в общем объеме 200 мкл/лукку. Дальнейший ход см. 1ILC. Клетки культивировали в течение 72 часов.

Определение поолиФерзткзной активности За 18 часов до окончания инкубации в культуры вносили по 1 мкКи ЗН-тиыидина (актизкссть 5400 мкКи/мл) в 20 мкл среды RPMI -1640 с последующим снятием клеток на стекловолокнистые фильтры полуавтоматическим сборником клеток Harvester. Радиоактивность фильтров измерялась во флаконах со сцинтиллятором (РР0-4.0 г. РОРОР-0,2 г . толуол - 1.0 л) на счетчике ^частиц. Статистическая обработка результатов ■ Результаты выражали в числе импульсов в минуту (срт). представлявшей среднее арифметическое измерений в трех параллельных культурах с вычетом фоновой импульсации (50-200 икп/мин).:

(срш1-фон)+(срш2-Фок)+(сриЗ-фон)-

срт--------------------------------------,

3

и индексах стимуляции,, рассчитавши по формуле: срт трех опытных образцов

КС------------------------------

сртп трех контрольных образцов

Контрольны»® образцами служили аутологичные культуры отвечавших клеток.

Статистическую обработку данных производила с использова-

нием пакетов программ "Statgraphics", "Chàrt", "SAS". Достоверность различий оценивалась до критериям 1 Стьвдента с $! вероятностью. •

Определение средней степени HLA-несозместшости В каадой дара респондер-стикулятор вычислялось число HLA-антигенов, по которым эта пара клеток различалась. Расчет проводился в отдельности для антагенов локусов HLA-A, HLA-B. HLA-DP. и в целом по HLA. Полученные значения суммировались, и для конкретной груша клеток (DR1+, DR2+ и пр. ) вычислялась средняя величина различий по HLA-антигенам, определяемая нами как средаяя степень HLA-несовиесткмости.

Прстюп метода среднестатистической вероятности Для изучения яымунореактявности тиаированных по HLA-антигенам шюнуклеаров в работу в качестве респондероз отбиралась - клетки, зкссрессирующие изучаемый HLA-антиген. Стимуляторами служили клетки разных HLA-фенотипов. С каждым респокдером осуществлялось от 1 до 4 постановок смешанной культуры. Показатели пролиферативной активности респондероз в каждой изучаемой группе (напр., DR1+, D22+ и пр. ) суммировались и вычислялись среднестатистические значения. Подобная ке схема опытов использовалась при изучении юшукогенности. Стимуляторами в этом случае слугали клетки, несущие изучаемый HLA-антиген, респондераыи - клетки лвбого HLA-феноткпа. Схема опытов представлена в разделе "результаты исследования".

Анализировались средние величины ерш и ИС в культурах, зк-спрессирувщях изучаемы;! HLA-антиген ( в дальнейшем HLA-DR1+. DR2+- и т.д. я HLA-A1BS+, HLA-A2B12+ и т.д.). При учете включения метки в культуры, не несущие изучаемого антигена, они обозначались как HLA-DRi-, D.R2- и т. д. и HLA-A1B8-. HLA-A2B12-и т.д.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЭДЕНИЕ

Опыты ставили по схеме: 1. При изучении кшукореакгивности: RI R2

Sis im .. Slm S2m .. Sn-lm

2. При изучении иммуногенности:

Sim S2m .. Siun

R1 кг .. Rn, Ri R3 .. Rn. .. R1 R2 .. En-i где:

R - клетки - респондеры. S - клетки - -стимуляторы, m - обработка митомицином С.

Показатели пролиферации аутологичных культур (R—Rn) варьировали в пределах 1000-2000 имп/мик.

I. Оценка иммунореактизности крпоконсервированных лвмфоттитов Для проведения оценки пролиферативной активности крио-консервкрсванных лимфоцитов осуществлялась постановка РБТЛ и MLC параллельно со свежевыделеннши и криоконсервярованными клетками каждого докера, суммированные показатели пролиферации в которых представлены на рис. 2.

ерт г

ШЗ

ULC РНА СОК A rwu

UtC РИА СШ А ГУН

СЗ^ЕЗЦдРШШЬИ ЛККСЦ^ТОЗ Я Щ; 1" ?Б1Л

Из рисунка следует, что пролиферативная активность СЕеке-Еыделенных и криокснесрвированвдх мононуклеаров периферической крови при аллогенной и поликленальной стимуляции фактически одинакова. Некоторое снижение пролиферативной активности крио-консервировакых клеток по сравнению со свевевьщелгиными статистически незначимо (Р>0,05) во всех случаях. Использованная методика криокояезрващш достаточно проста и эффеагавна для применения в повседневной практике иммунологических гсследоза-НйЯ. ..... ,, --

В результате отработки программы криоконсервирования "мононуклеаров периферической крози создан банк крйоконсервкрс-ванных лимфоцитов, прздетавляющй собой коллекции образцов клеток от 47 типировакньк пс НЬА-систеые допоров.

II, Изучение икыукореактиввости мононуклеаров периферической крови в тестах НЬП и РЕ^Л с мтгтогенами растительного происхождения

Показатели пролиферативной активности клеток в КЬС и РБТЛ

' были нами условно разделены на группы в зависимости от интенсивности пролиферации. Для определения степени конкордант-носта иммунных ответов в изученных системах была просчитана частота совпадения степени интенсивности пролиферации отвечающих клеток при аллогенной и поликлональной стимуляциях. Данные приведены в таблице »1.

кэдкоедлнттюсгь типов прол итеративных" "

ОТВЕТОВ В М1С И РБТЛ

со«иаа<м(стл»м»смс(ммостма ma

Как следует из таблицы, в большинстве случаев (в 78,21%, 69.882, 63.77% при воздействии РИА.. Con A. PYJM соответственно) интенсивность иммунного ответа в РБТЛ соответствует интенсивности ответа в MLC. Другими словами, клетки, высокопроляфери-руащие при стимуляции митогенами. как правиле, демонстрирует высокий ответ в KLC, и наоборот, низкие уровни пролиферации в РБТЛ характерны для слабоотвечаюпщх в KLC клеток. Вероятно, иммунная реактивность в описанных тестовых системах является проявлением обще2 потенциальной способности клеток к реактивности в условиях In vitro, что в свою очередь может быть отражением . тала иммунореактивнести индивидуума как такового. Максимальное совпадение степени интенсивности ответа в MLC и РБТЛ наблюдается при использовании в качестве поликлонального стикулятора в РБТЛ лектина РИА. Конкордактность в этом случае составляет 78.21Я.

III. Изучение иммуяореактиБВОсти и иммуногенкости HLA-антагенов 1 и 2 классов Для уверенности в тон, что шмунореактивноегь или иммуно-генность клеток действительно обусловлена наличием изучаемого НЬЛ-антигева, прякеяеншй метод среднестатистической вероятности предусматривал 3 вида контроля:

1. Определение доли второго DR-антагена в DR-позктивных респондерах (стимуляторах): определение доли DR-антигена в АВ-гозитивных клетках респондерах (стимуляторах);

м

«и

2. Изучение пролиферативной активности клеток, не несущих изучаемый НЬА-антиген ( клетки БЕ-, АВ-).

3. Определение средней степени НЬА-несовместимости по срав- -ниваемыы грушам.

1) Сценка иммунореактивности лимйшитов. экспрессирутаих отдельные НЬА-РК-детерминанты

Определена иммунореактивность клеток, несущих НЬЛ-БН!, 2. 3, 4. 5, 6, 7 -детерминанты.

Суммарные данные, представлявшие результирующую МЬС-реак-ций. представлены на рис. 3.

Наибольшей реактивностью в КЬС по отношению к пулу (набору)' стимуляторов обладали клетки Бй5+. ОЙ7+ и БЕ4+ (срт=33.361*5.330, ИС=28, Зэ±5,14; срт=29.408±4.070,

ИС=24.70±3,90; срт=27.919±3.300, ИС=21.87±2.95 соответственно) , показатели пролиферации мезду хоторьш достоверно не различались (р> 0,05). Наименьшую иммунореактивность обнаружили клетки 0К1+, С3?2+ И-ЛШ6+ (срт=11.809*1.760. ИС=8,69±1.47; срт=15.178±1.940, ИС=11.05±1.39; срт=17.925±2.610,

ИС=14".27±2.49 соответственно). Различия средних значений реакций меаду клетками 051+, 0Р.6+ с одной стороны и 0Е4+. 0Й5+, СН7+ - с другой, статистически достоверны (р<0,05).

Как следует из рис. 4 при 100% содержании изучаемого Щ-антигена в 0Е+ клетках доля второго ОР.-антигена существенно ниже, что свидетельствует об обусловленности иммунореактивности в кавдой группе изучаемым Вй-антигенон.

Для ответа на вопрос, не вызваны ли эти различия в пролиферации степенью несовместимости респондеров и стимуляторов по НЬА-антигенам 1 и 2 классов, была просчитана средняя несовместимость по НЬА-А, В и ГО-гнтигенаы (табл. N 2).

-paa. -pes

J ij

JJUJIUjb X

,!■ д —is, DOMveocCii

neioenxj^^ „ A«*m V HLA>m"

1*1* ас* но* ÇR4* PR5* CR7* 15 » 25 ?» 36 >.«7«) 17 157aAtt 1.57 »Û13 1.71*010 l.ttaOU (.<>•&(? 14MUO 1.73л). 1 г ■7«0 M tJMCT VMMCÎ 1 «*Û07 l-SM-ÛÎ t.c?>e i6 t-40>.0 te 1.54*009 1.41x0.12 1 6M.I! 1Л«й>о 4.§7*Q3i « t(37>0 ît 4M«0 24 »г-лго 4 03*0.7« 4j;«ai«

СМ-ORZ-С*У DR»-0"S-ОН-СЯ7- » « Т7 St 79 02 6? 1.12*0 D7 VS&»007 1.51*009 iAî»aor i баю об 1.63*409 1.7*iOO$ 1.77.0« 17WI05 1 tÎTÛ.» 1-5<«007 {.«tjar 1 49*0 07 t.«?«o os 1.47*0 09 14ЫО.М 1.42x0 OS lAinO.M 4НЛ.12 4 «1*0 tî 4_KXtO 14 4 (7*0 16 4i1s0 ta iKM ta â 91*0.15

Отличия в несовместимости изученных груш клеток статистически незначкмы (р>0,05).

Данные изучения иммунореактизности клеток, не экспресси-рующих соответствущую детерминанту (DRi-, DR2- и т.д.),.' отражены в части "В" рис. 3. При сравнении обеих частей рисунка обнаруживается следующее явлеше. Низкая шмунореактивяость Е-клеток, экспрессирувдих данный антиген, соответствует высо- . кой реактивности Е-клеток. не энспрессирующкх этот антиген. Это положение особенно наглядно при сравнении групп R-клеток DR1+ и DE1-; DR2+ и DR2-; DR6+ и Ш6-. В то не время высокий ответ респокдеров, несущих определенней аллель, ссотвзтствует низкой пролйфераткзной активности клеток, не экспрессирующих его . что наглядно при сравнении показателей пролиферации респсндеров DR4+ и Ш4-; DR5+ и DR5-; DR7+ к DR7-. Различил в показателях проли^еративного ответа DR1+ - DR1-, DR2+ - DR2-. DE4+ - ÏJP.4-. DR5t - DR5-. DR7+ - DR7- статистически— значимы (р<0,05). Различия з степени HLA-несозместамости в группах D2-клеток статистически недостоверны (р>0,05).

-Таким образом, иммунсреахтивность моаонуклз&ров периферической крош человека при описанных -тестовых условиях аллоген-ной, стимуляции находится в зависимости от HLA-DS-фенотипа клетки;,экспрессия соответствующего m-sxMtèa& или, отсутствие такового обуславливает низкую или высокую кммунорэактивность в KLC. По,-степени ивд-эторзактиЕНоети в тесте клеточных взаимодействуй .мозао выдашь следусдае группы DS-дзтершшаят: вчсркорсактЕЕНые: DR5. БЙУ. DR4:' низксреактквкые: DR1.DP.2. DP.6.

2) Оценка иммуногакности клеток, эксггоессирувшкх отдельные НЬА-Рй-знтигекы

.. Определена иммукогзнность мононуклеаров. экспрессируюких. антигены Н1А-Щ 1, 2, 3, 4. 5. 6, 7.

Суммарные данные пролпферативной активности при стимуляции отдельными ОК-антигенами. представлены на рис. 5.

Возможно выделение детерминант слабой иммуногенности (К1А- ЮЛ!. 2, 6; показатели пролиферации респондеров при стимуляции несушда эта детерминанты клетками соответственно равны: срш=14.133±1.570, йС=10.74*1.25; срп=16.330±2.620. ИС=12,34± 1,85; срк-16.300±3.220, КС-12.61^2,20) и детерминанты, сказавшиеся сильными стимуляторами (НЬА-Б8-3, 5, 7; показатели пролиферации респондеров пря стимуляции несущими эти детерминанты клетками соответственно были равными: срш=26.404±2.210, ИС-21.88±2,33: Срш-24.320±3.430, ШМ8, 78±3,14; срт=24.942*2.260,И>20,55*1.15 ). Различия между стимуляцией, вызываемой пи-положительными клетками с одной стороны и ЮйЗ, Ш4, ЕИ5 и Ш7 положительными клетками - с другой - статистически достоверны (р<0.05). Существенны также ргзлгая з показателях пролиферации груш клеток, стимулированных с одной стороны СК2+, 0К6+ клетками, с другой стороны - ВЙЗ+, БЙ7+ клетками (р<0,05). Статистически достоверных различий в ША-несовместшостй менду группами не имеется (р>0,05). Доля второго ШЬантигена з Ой+ стимуляторах несущественна.

При сравнении стимулирующего эффекта клеток БЕ1+ - БН1-, ЮК2+ - Б1?2- и т.д. обнаружилось, что клетки, не несущие низко иммуногенных детерминант, во всех случаях обладали больиим стимулирующим эффектом, нежели клетки, несущие соответствующие НЬА-детерминаяты { сравнить Ш- - 0Р.2- - 0Р.2+, 0И6- -

Ш6+, рис. 5 "В") и наоборот, клетки, не экспрессирующие силь-

Гче.5. гло-нсггеша СЛПЭЧ. ЗКСГГОСЦИГВ^та ни-ок-ЛКПГ£НЫ. В 5йС

ноимкуногеншк антигенов, демонстрируют низкий пролиферативный ответ (см. СИЗ- - БГ!3+. 0Е5- - 0Р.5+ и ПН7- - №.7+). Различия в пролиферации клеток БК1+ - Ш1-, Ш2+ - ВЕ2-. 0113+ - БНЗ-. БЕ6 + - Ийб-. СК7+ - ВЕ7- - статистически значимы (р<0.05). Разница в степени НЬА-нзсовместимости недостоверна (р>0.05).

Таким образом. клетки. "эксцрессирувдие различные НЬА-ОК-детерминанта. демонстрируют различную иммуногенность в йЬС-теоте. По степени иммуногенкоста в тесте клеточных взаимодействий можно выделить следующие группы Ой-детерминант: сильноиммуногенные - НЬАЧЖ-З, 5, 7: слабоиммуногенные - ША-ОК-!. 2, 6. 3) Зависимость кеяяу НЬА-РН-несовместикостью и пролиФера-тивной активностьв в смешанной культуре лимфоцитов

Определена пролиферативная активность респондеров. несущих идентичные со стимуляторами НУ.-ОР-детеркинанты или различающиеся по 1 или 2 Ш-детершшантам ( в дальнейшем О-БР-шт. 1-Вйш1,. 2-БКш).

Суммарные данные показателей пролиферативной активности в группах клеток с 0. 1 или 2 - БЯ-несовместимостями, отражены на рис. 6.

Реопоядеры, несдае идентичные со стимуляторами Юй-детер-юшанты. демонстрируют кшмяльные показатели пролифератизного ответа (cpm-7.S3Ctl.050, КС=5,95*0,85), показатели пролиферации клеток, различавшихся по 1 ГО-антигену, равны: срт=20.350±3.120, ИС«15.93*2.9; клетки. различающихся по 2 В8-актигенгк, продемонстрировали максимальнее показатели пролиферации: (срш»29.710±3.650, ЙС=23.2Е£3,32). Показатели пролиферации в изученных 3 группах клаток различаются между собой со стастистически значимой достоверностью (р<0,05). Нетрудно яа—

метить, что возрастание условной прямой, соединяющей средние величины пролиферации при 0. 1 и 2 DRran находятся в прямой зависимости от увеличения числа HLA-DR-несовместимостей. Различия в степени несовместимости по HLA-A- и HLA-B-антигенам в изученных группах несущественны (р>0.05).

Б изученных грушах не обнаружено преобладающей встречаемости сильных (DR5, 7) и слабых (DRi,2.6) HLA-DR-антигенов.

Следовательно, различия в пролиферативной активности объясняются степенью HLA-DR-несовместикости респондеров и стимуляторов.

Обращают на себя внимание достаточно высокие показатели пролиферации при "нулевой" Ш-несовместимости пар R - S (отмечены на рисунке фигурной скобкой). Указанные "остаточные" значения пролиферативной активности при ODSran позволяет предположить существование других (не-DR) факторов, также оказываицих влияние ка отзет в MLC. Монно предположить. что такими факторами могут быть другие антигены 2 класса (DP, Dil), минорные антигены HLA и других генетических систем, а также HLA-антиге-ны 1 класса.

4) Иммунореактивность и иммуногекность клеток, несуиих часто встречавдиеся HLA-A.В-Фенотипы

При изучении репрезентативных .групп популяций различных рас определены частоты некоторых распространенных аллелей каждого из локусов HLA. Наиболее часто встречающимися антигенами у представителей европеоидной расы в локусе А являются антигены HLA-A2 (45,7%), HLA-A1 (15.8%). KLA-A3 (12,6%); з локусе В - HLA-B12 (16,6%), HLA-S7 (10,43). HLA-Bw35 (9.9%) . По данным Международного Рабочего Совещания по гистосовместамости 1S87 года в европеоидной расе наиболее распространенными являются гаплотипы (на 10.000 обследованных) : А1-В8 - 672, А2-В12 (А2В44+А2В45) - 513. АЗ-В7 - 477. A3-Bw35 - 257, А9-В12 - 158.

' При изучении иммунореактивности и иммуногенности HLA-анти-генов 1 класса ны исследовал! клетки с наиболее часто встречающимися HLA-A. В - фенотипами.

Изучены следущие HLA-A. В-фенотшзы: А1БЗ, А2В12, А9В12, АЗВ7. A3B35.

Результаты изучения пролаферативной активности клеток, несущих указанные HLA-A, В-фенотшш. отражены на ряс. 7.

Ш Ш!2 43В7 икнлява

Л1М 02312 «И ЛЗВМ Ш12

р«. 1. ииуцогеАетиввосл пиитоцигов. гап-щих "исто

ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ ПЛ-вЕВОТШК В ШС

В качестве контрольной отсечена линия, демонстрирующая среднестатистический уровень пролиферации НЬА-Ш-идентичных пар Е-Б (008ит). Наивысшей пролиферативной активностью в смешанной культуре обладают НЬА-А1Б8 и АЗВЭ5 положительные клетки. Показатели пролиферации в этих группах соответственно равны: срт=25.939*2.801. ИЕ>17,30±1.44; срш=20.678±1.940. ИС=15,85*1.29. Меньшей способностью к пролиферации обладают НЬА-А2В12, АЗВ7. А9В12 положительные клетки (срш=14.229*1.530, ЖМ0.60±1,42; срш=12.104=Ы. 449. ЙС=8,9±1,03;

срш=12.816И.006, ИС=8.27±1,06 соответственно). Различия в показателях пролиферация клеток, эксрессирующих А1В8 и АЗВ35 с одной стороны и АЗВ7. А9В12, А1В12 - с другой - статистически значимы <р<0.05). Различия б числе несовместимых Н1А-А. В, ОН-антигенов в изученных группах статистически недостоверны (р>0,05).

Показатели пролиферации клеток, не несущих соответствующих ЖЛ-АВ-антигеяов, приведены в части "В" рис. 7. Высокой иммунореактивноста клеток, несущих конкретный НЬА-АВ-Фенотип, соответствует низккй ответ клеток, не несущих такового ( см. кэдетреактивкость клеток А1В8+ - А138-, АЗВ35+ - АЗВ35-). С другой стороны, при слабой реактивности клеточных популяций, несущи определенный АВ-фенотип, характерен высокий ответ клеток, не несущих его ( см. камукореактивность клеток А2В12+ - А2В12-. АЗВ7+ - АЗВ7-. А9В12+ - А9В12). Различия в проли-феративком ответе изученных АВ+ - к АБ- клеток статистически достоверны (р<0,05). Различия в степени Н1Л.-несовместимости изученных групп клеток незкачикп (рХ),05).

Показатели пролиферации лимфоцитов, стимулированных метками с часто встречающимися КЬА-А.В-акт.чгенамя в фенотипе.

представлены на рис. 8.

В качестве контрольной, как и на предыдущем рисунке, отмечена линия, демонстрирующая среднестатистический уровень пролиферации HLA-DR-идентачных пар респондер-стимулятор {ODRura). Большим стимулирующим эффектом обладают клетки, несущие А1В8 и А2312. Показатели пролиферации в культурах, активированных клетками с этими HLA- фенотипами равны соответственно: срш=24.171±2.073, HC=18,87i2,93; ■ срш-21.843*2.065, ИС-18.49± 2,13. Минимальные уровни пролиферации демонстрируют клетки, стимулированные лимфоцитами с A3B35, АЗВ7, А9В12 в HLA-феноглпах (сри=19.330±2.569, ИС=13,72±1,71;

срт=17.623±6.350. ЙС=13.23±3. 87; срп=12.086±2.310,

ИС=7,43±1,15 соответственно). Различия в показателях пролиферации А1В8, А2В12 и A3B35 несущих клеток с одной стороны и АЗВ7-несувдх клеток - с другой - статистически достоверны (р<0,05). Результата просчета средней HLA-несовместимости между респондерами и стимуляторами показали их статистическую незначимость (р>0,05).

Показатели стимулирующего эффекта АВ- клеток .отражены в нижней ("В") часта рис. 8. При анализе представленных данных обращает на себя внимание ранее прослеженная тенденция, а именно: сильная атинулкрущая способность клеток, несушх определенный HLA-AB-фенотил, сменяется слабой стимулирующей способностью, если клетка не несут данный АВ-фенотип ( см. А1В8+ - А1В8-, А2В12+ - А2В12-), и наоборот, слабая стимулирующая способность клеток при наличии определенного HLA-AB - фенотипа соответствует высокой степени стимуляции в случае^ его отсутствия (см. АЗВ7+ - АЗВ7-. А9В12+ - А9312-.. A3B35+ -A3B35-). 1 Различия в показателях пролиферации при стимуляции

клетками А1В8+ - А1В8- и А2В12+ - А2В12- статистически значимы (р<0,.05). Различия в степени HLA-несовместимости в изученных группах статистически недостоверны (р>0.05).

При рассмотрении иммунореактивности и ичмуногенности клеток, несущих часто встречающиеся HLA-AB-фенотипы, нельзя не учитывать влияния KLA-DS-антигехЮВ в пх фенотипах на пролкфе-ратавный ответ. Анализ DR-фенотипов изученных АВ-кесущих клеток только в случае А1В8+ клеток выявил преобладание антигенов DR3. DR4 по отношению к другим DR-антагенам. Частоты встречаемости отдельных DR-антигенов в удельном весе остальных изученных клеток (А2В12+, АЗВ7+. A3B35+, АЭВ12+) существенно не различались.

Таким образом, на модели смешанной культуры лимфоцитов показано., что HLA-антигены 1 класса вовлечены в процессы иммунного распознавания и реагирования, что проявляется, в частности, во влиянии HLA-A, В-фенотипа клетки на интенсивность пролиферативного ответа.

Наибольшей иммунологической реактивностью характеризуются HLA-A1B8 и HLA-A3B35 позитивные клетки. Максимально высокими иммуногенными потенциями обладают клетки, несущие HLA-A1B3 и HLA-A2B12. Слаборзактивнши пвлявтся KLA-A2B12, HLA-A3B7. HLA-А9В12 положительные клетки, слабоюшукогенньад - HLA-A3B35, HLA-A3B7, HLA-A9B12 положительные клетки.

В заключении откетим, что в результате исследования среди первых семи HLA-DP.-актигенов и некоторых часто встречающихся HLA-A, В-фенотапов можно выделить два груши по их ш.даологи-ческому потенциалу: DR1, DR2. DR6, АЗВ7, А9В12 являются маркерами клеток со слабой пролифсраткзной и одновременно со слабой стимулирующей активностями, в то время как ГО5, DR7. А1ВЗ яз-ляются маркераш! клеток с высокой пролмферативной к одновременно с высокой сткмулкрукщей активностями.

Определенные методом KLC ¡гаыунореактавные и иммуногенные потенции отдельных HLA-антигенов позволяют предполагать силу иммунологических реакций при аллотранеплзнтаттии костного коз-га, протекащих в двух направлениях с развитием отторжения трансплантата и "вторичной болезни". Мы.предлагаем схему ориентировочного прогноза интенсивности развития РХПТ и РТПХ при АлТКК (см. табл. К 3).

ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ «НПО«« В ОПРЕДЕЛЕНИИ склоквослг к кнтснсиввост РАЗВИЛ» ХЛГГ01ВЫХ РЕАКЦИЙ ПОСЛЕ АлТХМ

млличчг в П1Л11 лрсдтлм-мдоы« по*ми:»*и»я •мпнсимостъ пампия

МСШЧПНЖНГА домом

1|| &Л4» ОЙ5* УМвА* АЗ«М5* РХГТТ Р/ПХ

Из пм» Ой»* ол?-» ми»* АМи* РТох РХПТ

Так. если реципиент и неродственный донор являются носителями сильных антигенов Ш5, Ш1. А1В8. предполагается повышенная интенсивность равзктиия реакций ХПТ и ТПХ и наоборот, наличие в фенотипе пары слабых Ш1. ТШ2. ШШ. А387, А9Б12 ан-тигеноз предполает пониженную интенсивность развития названных реакций.

ВЫВОДЫ:

1. Пролиферагивная активность лимфоцитов в МЬС. определяемая экспрессией Н1А~антнш;ов 2-го класса (Бк-антигексв}, зависит от различной иммунореак'тиьностк и иммуногенности кон- кретных ОН-детерминант.

2. У европеоидов при ответе на аллогенкую стимуляцию в МЬС клетки с фенотипам! БЬА-СМ, Н1А~БР.5. НЬА-БК7 развивают высокую реактивность (высокоиимунореактивны). клетки с фенотипами НЬА-ВИ, НЬА-082, ЙЬА-БКВ развивают низкую \ реактивность низкоиммунореактивны).

3.' У еропеоидов в МЬС-реакции клетки с фенотипами НЬА-ШЗ. НЬАЧЖб, Н1А-Ш7 являются стимуляторами высокого пролифератив-ного ответа (вьгсокоиммуногешш)... клетки с фенотипами Н1А-0Р1, НЬА-Би2, Н1А-0й6 являются стимуляторами низкого пролифератив-кого ответа (низкоикмуногеннк).

4.. В МЬС интенсивность пролифератавного ответа находится в прямой зависимости от степени НЬА-ГК-несовместтмсти стимулирующих и отвечающих клеток. При конкретных концентраций и удельной активности радиоактивной кэтки вклад о,иной Вй-дехердананты оценивается по штзнсивиости включения радиоактивной метки.

5. Ш-антигэкы 1-го класса вносят определенный вклад в реализацию пролиферативяого ответа в МЬС. проявляющийся в позитивной КЮ в случаях идентичности отвечающих и сткмулируютак клеток по НЬА-антигенам 2-гс класса (Ой-антигенам).

6. В МЬС клетки, несуще различные Н1А-АВ~фгяотпж, разделяются по иммунореактизнос ги: высокодамунореактивны клетки с

_ ..фенотипами Н1Л-41В8, НЬА-АЗВЗб; низкодамунореактивны клетки с фенотипами НЬА-АЗВ7. 1ИЛ-А2В12. 1!ЬА-АЭВ12.

7. В КЬС клзтки, несущие различные Н' А-АВ-фгнотины. разделяются по икауногекности: высокоиммуногенны клетки с фенотипам-* Н1А-А1Е8. Н1А-А2В12; низксшнуногекны клетки с фенотипами Н1А-АЗР7, Н1А-а5312.

8. Имеется конкордантаость интеноизкости прелифератишого ответа лккфоцитсз з смеванной культуре и реакции властной трансформации с ннтогеиоя растательного происхождения; наивысвая конкордантность двух типов реакции навидается при использования ¡.агтогена фитогемггглзшшка.

5. криокснсервчроваиные в ВМЗО лимфоциты сохраняют проли-

феративную активность в MLC. что в практическом отношении мокет быть использовано в постановке Ш,С с криоконсервирозанными клетками для мониторинга "вторичной болезни" после АлТКМ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При неродственной АлТКМ постановка MLC-реакции в сравнении с серологическим определением различий по DR-локусу приобретает решающее значение.

2. Постановка MLC с гипирозанными по KLA-антигенам локусов А. В. DR лимфоцитами внедрена в практику работы Российского Регистра неродственных доноров для трансплантации костного мозга.

3. MLC-анализ остается на данном этапе и в течение ближайших лет решающей формой пробы на совкестаность; учитывая, что HLA-антигены 1 масса активны в клеточных реакциях, а оли-г'отипирование для них не разработано.

4. При прогностической оценке результатов АлТКМ представляется полезным учитывать полученные данные о различных иммунных потенциях HLA-антигенов 1-го и 2-го классов.

5. MLC моает быть осуществлена с криокснсервироЕанными по описанной выше методике лимфоцитами, не теряющими иммунных потенций при данного вида консервации.

6. Постановка MLC с-криоконсервированшми лимфоцитами донора может быть использована для мониторинга "вторичной болезни" после АлТКМ.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАМШХ ПО Th'iJE ДИССЕРТАЦИИ

1. Калинина Л. А.. Громова И.И., Танасий А. Г. Распространенность HLA-антигенов у больных хронической почечной недостаточностью. Труды 1 Всесоюзного Иммунологического сьезда. М.. 1989. С. 57.

2. Громова 11.11. Оценка типа иммунореактивнссти мононук-леаров периферической крови In vitro. В кн.: Экологические факторы и кроветворение. М., 1992. С. 27.

3. Громова И.И. Изучение иммуногенности наиболее частотных HLA-A.В-гаплотипов методом смешанной культуры лимфоцитов. В кн.: Экологические факторы и кроветворение, М., 1992,

С. 28-29.

4. Громова И.И., Заршкея Ю.ы. Опенка иммуногенности отдельны.; НЬА-детериинант 2 класса методом смешанно" культуры лимфоцитов.// Иммунология. - 1993. - Г 4. С.24- 26.

5. Громова ".И., Зарепкая 2.¡Л. Оценка иммунореактив-ности Н1А-де?ермкнант 2 класса методом смешанно'" культуру лимфоцитов. В печати: Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. -Г . - С. -