Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Создание бактериального продуцента рекомбинантного человеческого Г-КСФ на базе технологии слитных белков

На правах рукописи

СКРЫПНИК Ксения Александровна

СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Г-КСФ НА БАЗЕ ТЕХНОЛОГИИ СЛИТНЫХ БЕЛКОВ

14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ОКТ 2011

Москва-2011

4858032

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор -академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук B.C. Косоруков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бухман доктор биологических наук, профессор C.J1. Киселев Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена

Защита состоится « » 2011 г. еУ^ часов на заседании

диссертационного совета Д.001.017.01 Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан ((^О » 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является одним из основных цитокинов, применяемых в химиотерапевтической онкологической практике. Он активно стимулирует рост числа нейтрофилов, что положительно сказывается на лечении различных нейтропенических состояний, оказывая влияние на их пролиферацию, созревание и дифференцировку.

Препараты чГ-КСФ используются для лечения нейтропении - состояния, характеризуемого снижением числа нейтрофилов. Подобное нарушение может быть как врожденным, так и приобретенным в результате инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также, являться следствием проведения химио- или радиотерапии.

Организм пациента, страдающего нейтропенией, неспособен эффективно сопротивляться инфекциям, иммунитет такого больного снижен. Введение препаратов, созданных на основе рекомбинантных форм чГ-КСФ, позволяет увеличить количество нейтрофилов, повысить иммунитет и избежать возникновения сопряженных инфекций. Введение чГ-КСФ при проведении химиотерапии значительно улучшает переносимость процедуры и позволяет избежать увеличенных интервалов между химиотерапевтическими циклами и сокращения доз препаратов, что, в свою очередь, положительно отражается на эффективности лечения и выживаемости пациентов.

Исследования последних лет дают основания предполагать, что область клинического применения этого цитокина может быть значительно расширена. Обнаруженные у чГ-КСФ иммунорегуляторные и нейропротекторные свойства позволят применять этот препарат не только для лечения гематопоэтических заболеваний, но и для борьбы с инсультом, аутоиммунными болезнями и сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Создание рекомбинантных аналогов природного человеческого Г-КСФ является одной из важных биотехнологических задач. При разработке рекомбинантных аналогов важно подобрать подходящую экспрессионную систему, позволяющую получать достаточные количества препарата и использовать систему очистки, обеспечивающую сохранение биологической активности целевого белка.

Существующие в настоящий момент рекомбинантные аналоги чГ-КСФ, полученные с использованием бактериальных продуцентов, экспрессируются в нерастворимой форме. Экспрессия чГ-КСФ в растворимой форме позволила бы избежать дополнительных этапов очистки и упростить процесс получения рекомбинантного аналога этого белка.

В настоящий момент практически нет экспрессионных систем, которые позволяли бы получать чГ-КСФ в растворимой форме. Исследователи сталкиваются с тератогенным эффектом при продуцировании этого белка в организме различных трансгенных животных. Попытки экспрессировать чГ-КСФ в растворимой форме в бактериальных клетках приводили к гибели клеток при достижении высокого уровня продукции цитокина. Решением проблемы может являться использование растворимого белка-партнера. Конструирование экспрессионного вектора, в состав которого будут входить последовательности как целевого гена, так и высокорастворимого партнера, и последующая экспрессия гибридного белка, сделает возможным «маскировку» чГ-КСФ в организме продуцента. Таким образом, можно добиться высокого уровня продукции чГ-КСФ в растворимой форме с использованием лишь одного этапа очистки белка.

Цель работы - разработка и создание векторных конструкций, позволяющих, с помощью бактериальных продуцентов, получать чГ-КСФ в растворимой форме.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Модифицировать последовательность гена чГ-КСФ для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

2. Подобрать экспрессионную систему, позволяющую обеспечивать «маскировку» Г-КСФ в составе продуцируемой в растворимой форме гибридной конструкции.

3. Разработать и создать векторные конструкции для бактериальной экспрессии чГ-КСФ.

4. Оптимизировать экспрессию гибридной конструкции, несущей в составе домен чГ-КСФ.

5. Очистить продуцируемый цитокин с помощью аффинной хроматографии.

6. Оценить биологическую активность полученного чГ-КСФ и сравнить с биологической активностью коммерческого аналога -Нейпогена.

Научная новизна исследования.

1. Впервые при экспрессии чГ-КСФ использована экспрессионная система, включающая в себя хитин-связывающий домен и интеин.

2. Впервые достигнута экспрессия чГ-КСФ в растворимой форме при использовании бактериальных продуцентов.

3. Разработана методика, позволяющая получать в растворимой форме белки, склонные к формированию телец включения.

Практическая значимость исследования.

Известно, что рекомбинантный чГ-КСФ токсичен при экспрессии в эукариотических и прокариотических клетках, а также в организмах трансгенных животных - в тех случаях, когда белок находится в растворимой форме. Проявления подобного эффекта при продуцировании рекомбинантного аналога чГ-КСФ можно было бы избежать, если обеспечить супрессию активности целевого белка в процессе синтеза и накопления его в клетках. В противном случае большие количества экспрессируемого белка приводили к проявлению токсического эффекта. Подавление активности чГ-КСФ возможно достичь следующими путями; экспрессия в виде телец включения и использование белка-партнера. В случае формирования телец включения белок не является активным, так как накапливается в клетке в качестве нерастворимых клеточных агрегатов. Для получения биологически активного белка требуется проведение рефолдинга, что усложняет проведение очистки целевого белка, но все же остается эффективным с экономической точки зрения.

Использованная в данной работе технология позволяет получать биологически активный цитокин в растворимой форме, исключая этапы растворения и последующего рефолдинга. Описанная выше экспрессионная система может быть с успехом применена и для других белков, которые склонны формировать тельца включения при использовании бактериальных продуцентов. Также данный подход, возможно, окажется эффективным при создании трансгенных животных и растений. Возможно, что применение гибридных конструкций, в которых биологическая активность целевого белка ингибирована, позволит реализовать получение рекомбинантного чГ-КСФ и других терапевтически важных белков не только в бактериальных, но и в растительных и животных продуцентах.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы прошла 27

июня 2011 года на совместной научной конференции лаборатории

б

экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории медицинской биотехнологии и лаборатории лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦим. Н.Н.Блохина РАМН.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях: ESMO scientific and educational conference (Budapest, 2005), Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005), «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России» (Москва, 2007), международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино, 2008), 2nd international student conference of biotechnology (Tehran, 2008), Experimental science in Pablo de Olavide University (Seville, 2008), International conference for students of nature science "The Coins 2009" (Vilnius, 2009), XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010), «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 134 библиографических источника, в том числе 123 на иностранном языке. Материалы диссертации изложены на 101 странице машинописного текста. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и культуры клеток

Основные манипуляции для клонирования векторов проводили в штамме E.coli dH5a. Для изучения экспрессии полученных конструкций в E.coli использовали штамм BL21 (DE3).

Для изучения биологической активности полученного рекомбинантного

7

чГ-КСФ использовали культуру клеток НЬ-60 (любезно предоставлена Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Получение бактериального продуцента чГ-КСФ.

В последовательность чГ-КСФ с помощью ПЦР - мутагенеза были введены сайты рестрикции, необходимые для последующего клонирования. Также было заменено несколько кодонов на оптимально используемые бактериальной системой экспрессии. Полученная в результате клонирования векторная конструкция рТУВП-ОСБР несла в своем составе последовательности, соответствующие чГ-КСФ, хитин-связывающему домену и интеину.

Соответствие полученных последовательностей ожидаемым подтвердили секвенированием (Евроген, Москва).

Полученной плазмидой трансформировали клетки штамм ВЬ 21 (БЕЗ) Е.соИ,

культуры наращивали в течение ночи. Индукцию белка осуществляли добавлением 1РТС. Для изучения эффективности экспрессии отбирали пробы для проведения электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блоттинга. Для количественной оценки экспрессии целевого белка проводили сравнение интенсивности полос на электрофореграмме при помощи программы ОепеТоок (Зуг^епе, США).

Выделение и очищение белка проводили в несколько этапов. С целью лизирования бактериальные клетки инкубировали в присутствии лизоцима, далее подвергали действию ультразвукового дезинтегратора ВапсЫт БопорЫз. Полученный лизат центрифугировали. Для дальнейшего исследования использовали супернатант, содержащий гибридный белок с доменом чГ-КСФ.

Жидкую фракцию лизата наносили на колонку с хитиновыми гранулами,

необходимыми для проведения аффинной хроматографии. Благодаря наличию в

составе гибридного белка хитин - связывающего домена, конструкция

эффективно связывалась с аффинным сорбентом. После удаления несвязавшихся

бактериальных белков добавляли буфер для разрезания, содержащий ДТТ

(дитиотрейтол). ДТТ влияет на аутопротеолитическую активность интеина, тем

8

самым позволяя вырезать целевой белок из состава связанной гибридной конструкции. Таким образом, стало возможным получать чГ-КСФ в растворимой форме в результате одноэтапной очистки. Определение биологической активности рекомбинантного чГ-КСФ.

Данный эксперимент проводился на основании исследований Yamaguchi с соавторами (Yamaguchi Т. et al., 1997). Клетки HL-60 выращивались в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, при 37°С в С02-инкубаторе.

Подсчет клеток проводился с использованием камеры Горяева и микроскопа Leica. Клеточная суспензия смешивалась с красителем трипановый синий в соотношении 1:1. Для определения числа клеток в мл подсчитывали число неокрашенных клеток в 15 больших квадратах, для расчета использовали формулу: С=5 х 105х N, где N- число клеток в большом квадрате.

Клетки в количестве 2*105 помещали в полную среду, содержащую 1,25% ДМСО. Инкубировали в течение 72 часов.

На третий день по 180 мкл клеток в количестве 15*103 на лунку вносили в 96-луночный планшет. К клеткам добавляли 20 мкл среды, содержащей Г-КСФ в концентрациях от 0,1 нг/мл до 10 нг/мл. Инкубировали 72 часа. В качестве контроля использовали препарат Нейпоген.

В каждую ячейку добавляли 20 мкл раствора МТТ. Инкубировали 4 часа, после чего планшет центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин на центрифуге Rotanta 460R. Удаляли жидкость из лунок и добавляли 100 мкл димексида для растворения образовавшихся кристаллов. Далее измеряли оптическую плотность в каждой ячейке при 530 нм.

Полученные результаты были обработаны с использованием двувыборочного U-критерия Манна — Уитни для определения статистически значимых различий между тестируемыми препаратами и контролем.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сконструированный экспрессионный вектор на основе плазмиды pTYB 11 (NEB) содержал в своем составе последовательности, соответствующие хитин-связывающему домену, интеину и чГ-КСФ. Клонирование было осуществлено таким образом, что интеин, входящий в состав вектора экспрессии, был слит с N-концом чГ-КСФ. Гибридная конструкция в полученном векторе находится под контролем Т7 вирусного промотора. Непосредственно перед промотором расположен ген lacl, кодирующий /аорепрессор. Промотор Т7 является индуцируемым, его индукция осуществляется с помощью IPTG. Для осуществления индукции плазмидой трансформировали штамм, содержащий ген Т7 РНК -полимеразы (BL21(DE3)). В неидуктивных условиях этот ген, находящийся под контролем /ас-промотора, не транскрибируется, так как этому мешает молекула /асАрепрессора. Молекула IPTG, являющаяся индуктором, связывается с репрессором, что позволяет гену Т7 РНК-полимеразы транскрибироваться. Только при ее наличии осуществляется транскрипция гибридного гена, находящегося в составе плазмиды pTYBl 1-GCSF.

После трансформации полученной конструкцией бактериального штамма BL21(DE3) и оптимизации условий экспрессии был выбран клон, обеспечивающий достаточный уровень экспрессии белка (Рис.1).

Гибридный белок, несущий в своем составе домен чГ-КСФ, экспрессируется в растворимой форме. При иммунологических методах детекции целевой белок идентифицировался лишь в жидкой фракции бактериальных лизатов, а в осадке обнаружен не был.

ю

20 кДа ЩЩШ граноцит

1 2 | ♦ 4 1 2 3 4

Рисунок 1. А. Электрофореграмма анализа лизатов, несущих гибридный белок в ПААГ. Б. Идентификация домена чГ-КСФ в составе гибридного белка с использованием Вестерн-блоттинга. 1. Лизат клеток BL21, не несущих векторную конструкцию. 2,3 Лизат клеток BL21, несущих вектор PTYB11-G-CSF, 4. Маркеры молекулярного веса (альбумин, граноцит).

Бактериальный лизат очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием хитинового сорбента. После удаления несвязавшихся белков добавляли буфер, содержащий ДТТ. Результаты очистки представлены на рисунке 2.

Г~-Т 3 4 5

Рисунок 2. Электрофореграмма анализа элюатов, полученных после нанесения лизата на колонку. 1- штамм, не несущий рТ¥В11-СС15, 2- проскок (содержат белки лизата, не связавшиеся с колонкой), 3- граноцит+альбумин, 4 -элюат, после 40ч действия БТТ, 5- элюат, полученный в результате промывки

0,3 м тон.

После анализа полученных электрофореграмм, был сделан вывод о том, что гибридная конструкция почти полностью связывается с хитиновым сорбентом, что свидетельствует о функциональной активности хитин-

11

связывающего домена. При этом аутопротеолитическая активность интеина действием тиольных реагентов не индуцировалась.

Изучение аминокислотного состава вблизи места слияния интеина и последовательности чГ-КСФ показало, что в месте расщепления находится остаток пролина. Было высказано предположение, что присутствие пролина вблизи места гидролиза может вызывать конформационные изменения, затрудняющие проведение реакции гидролиза с участием тиольных реагентов. Замена аминокислотного остатка пролина на аргинин на Ы-конце последовательности чГ-КСФ могла бы предотвратить возникновение конформационных изменений и существенно повысить эффективность гидролиза связи между чГ-КСФ и интеином, не оказав при этом влияния на биологическую активность целевого белка.

Были разработаны новые праймеры, с помощью которых в последовательность чГ-КСФ внесли необходимые изменения. После ряда клонирований была получена новая экспрессирующая конструкция рТУВП-С08Р (рис. 3). Последовательность была отсеквенирована и полностью соответствовала ожидаемой.

Вектором рТУВП-СвБР был трансформирован бактериальный штамм ВЬ21(БЕЗ). Среди клонов, полученных в результате трансформации, были отобраны те, в которых был зафиксирован наибольший уровень экспрессии при действии ИПТГ.

Далее проводили аффинную хроматографию, согласно методике описанной выше. Предварительная очистка проводилась на этапе центрифугирования, когда, после проведения лизиса, бактериальный лизат разделяли на жидкую фракцию и осадок. Это дало возможность уже на этапе центрифугирования избавиться от ряда балластных белков, способных оказать влияние на качество очистки.

Ряд проведенных нами экспериментов по хроматографической очистке целевого белка и индукции автопротеолитической активности интеина, позволил значительно оптимизировать процесс очистки. Изменение концентраций ЫаС1 в

12

составе колоночного буфера и буфера для отмывки сделало возможным смывать с сорбента неспецифически связавшиеся белки, которые первоначально элюировались вместе с целевым белком.

1ас1

Рт II (4370)

Рун 11 (4277)

Есо 47111 (4064)

рМВ1

Рт II (3530)

Рз1 I (7843)

1

Рт 11(7691) Ри I Рз1 I (7639) Ка-СЭР Рт П (7580) 7>и I (7579) Рт II (7558) Есо 47111 (7459) ВатН I (7347) 5со I (6460) Мг1Ргздте1 Ж Т7|гот

Есо 47111 (5565)

хитин -лотор связывающий

ХИо 1(1) Ря I (20)

Ват И I (27)

Рт II (412)

Sca I (1314)

АцЯ

Рисунок 3. Экспрессионный вектор рТУВП-ССБР, несущий в своем составе последовательности, соответствующие хитин-связывающему домену, интеину и чГ-КСФ.

Полученные элюаты анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а идентификацию чГ-КСФ в элюатах и в составе гибридного белка проводили с помощью вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа (Рис.4). Идентификация чГ-КСФ в полученных лизатах с использованием метода ИФА позволило предположить, что домен чГ-КСФ находящийся в составе гибридного белка, обладает третичной структурой,

соответствующей таковой в нативном белке.

13

1 2 34 1234

Рисунок 4. А. Электрофореграмма анализа элюатов, полученных в результате нанесения лизата, несущего плазмиду pTYBl 1-GCSF на хитиновый сорбент. 1. Экспрессионный штамм, несущий плазмиду pTYBl 1-GCSF. 2. Элюат, несущий чГ-КСФ. 3. Филграстим — рекомбинантный аналог чГ-КСФ. 4. Маркер молекулярных весов. Б. Идентификация чГ-КСФ с помощью вестерн-блоттинга.

Исследование биологической активности проводилось согласно методике, предложенной Yamaguchi с соавторами. Этот метод позволяет определить биологическую активность рекомбинантного белка с использованием человеческой промиелоцитной клеточной линии HL-60.

В исследовании использовали клетки HL-60, предварительно обработанные ДМСО. В результате воздействия ДМСО рост клеток существенно замедлялся, также наблюдалась дифференцировка по нейтрофильному пути.

Клетки HL-60 выращивались в С02-инкубаторе в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки. Далее клетки помещались в среду с 1,25% ДМСО, где выращивались в течение 72 часов.

Добавление ДМСО привело к подавлению пролиферации клеток HL-60. Также способствовало дифференцировке клеток по пути нейтрофилов (Martin SJ. et al., 1990).

Скорость роста клеток представлена на рисунке 5.

Зависимость роста клеток HL-60 при добавлении ДМСО

-без дмсо - с дмсо

дни

Рисунок 5. Рост клеток после обработки ДМСО.

Далее в лунки вносили по среду, содержащую различные концентрации контрольного образца чГ-КСФ (Нейпоген, Roche) и очищенного рекомбинантного чГ-КСФ.

После добавления к HL-60 препаратов, содержащих Г-КСФ, было отмечено более быстрое увеличение числа клеток, по сравнению с клетками HL-60, к которым препараты Г-КСФ не добавлялись. При добавлении Г-КСФ к клеткам, которые предварительно не обрабатывались ДМСО, усиления роста клеток не происходило. График, отражающий прирост клеток после добавления Г-КСФ, представлен на рисунке 6.

Инкубировали 72 часа, в течение которых определяли количество клеток в лунках содержащих и не содержащих тестируемый препарат. Спустя 72 часа к клеткам добавлялся МТТ для определения числа живых клеток в зависимости от количества добавленного чГ-КСФ. Увеличение числа клеток находится в прямой зависимости от количества добавляемого препарата. График, отражающий дозозависимость, представлен на рисунке 7.

4,5 4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Рост клеток Н1.-60 после добавления Г-КСФ

2 дни

-среда - среда+к среда+оп

Рисунок 6. Рост клеток с течением времени после добавления Г-КСФ. Синяя линия - клетки, обработанные ДМСО, без добавления цитокина. Красная линия - клетки, обработанные ДМСО, добавлен нейпоген в концентрации 0,5нг/мл. Зеленая линия - клетки, обработанные ДМСО, добавлен рекомбинантный Г-КСФ в концентрации 0,5 нг/мл

Рисунок 7. Дозозависимый рост клеток НЬ-60, предварительно обработанных ДМСО. За 100% принято количество клеток, обработанных ДМСО, к которым Г-КСФ не добавлялся. Отражено количество клеток на Зй день после инкубации с Г-КСФ.

Полученные результаты были обработаны с использованием двувыборочного и-критерия Манна — Уитни для определения статистически значимых различий между тестируемыми препаратами и контролем. Число клеток в лунках, куда не добавляли чГ-КСФ, значимо отличается от количества клеток, выросших под воздействием препаратов чГ-КСФ (р<0,05; иэмп= 0). Сравнение выборок между собой показало, что они сходны (р<0,05; иэмп= 10,5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление чГ-КСФ к клеткам НЬ-60 существенно стимулирует рост клеток, предварительно обработанных ДМСО. Нейпоген и исследуемый рекомбинантный аналог чГ-КСФ действуют сходно, увеличивая число клеток почти на 50% по сравнению с клетками, к которым чГ-КСФ не добавлялся.

Биологическая активность полученного цитокина соответствует ожидаемой и сопоставима с биологической активностью коммерческого аналога -Нейпогена. Получаемый белок функционально соответствует Г-КСФ.

ВЫВОДЫ

1. Последовательность гена чГ-КСФ была модифицирована для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

2. Для «маскировки» чГ-КСФ при бактериальной экспрессии в растворимой форме в составе гибридного белка был выбран интеиновый домен.

3. Введение аминокислотных замен на Ы-конце последовательности чГ-КСФ с ТЬг-Рго на А1а-А^ позволило существенно увеличить эффективность гидролиза связи между интеином и целевым белком. Совершенные замены не оказали влияния на биологическую активность цитокина.

4. На основе клеток В121(ОЕЗ) создан штамм-продуцент, экспрессирующий гибридный белок. Белок экспрессируется в растворимой форме и несет в своем составе хитин-связывающий домен, интеин и чГ-КСФ. Уровень экспрессии составляет 7 мг/л.

5. Аффинная хроматография с использованием хитинового сорбента позволяет добиться одноэтапной очистки чГ-КСФ из состава гибридного белка.

6. Биологическая активность полученного цитокина соответствует ожидаемой и сопоставима с биологической активностью коммерческого аналога -Нейпогена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Developing of E.coli recombinant strain producing soluble human G-CSF // Сборник материалов Annals of oncology, ESMO scientific and educational conference, Budapest, 2005. P. 321-322. (Skrypnik K.A., Kosorukov V.S.).

2. Создание рекомбинантного штамма E.coli, продуцирующего чГ-КСФ в растворимой форме // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 2005 (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

3. Разработка гибридной белковой конструкции чГ-КСФ-интеин для эффективной экспрессии в молочной железе трансгенных животных // Материалы международной конференции Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России, Москва, 2007. (Скрыпник К.А., Половинкина B.C., Косоруков B.C.).

4. Получение чГ-КСФ в растворимой форме с использованием бактериального продуцента E.coli // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва - Пущино, 2008. (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

5. Producing of soluble hG-CSF with intein tag using Escherichia coli // Материалы 2nd student conference of biotechnology, Tehran, 2008. (Skrypnik K.A.).

6. Producing of hG-CSF in Escherichia coli // Материалы Experimental science in Pablo de Olavide university, Sevilla, 2008. (Skrypnik K.A.).

7. High-level expression of human granulocyte colony-stimulating factor in Escherichia coli // International conference for students of Nature Science "The Coins 2009". Vilnius, 2009. (Skrypnik K.A., Kosorukov V.S.).

8. Разработка бактериальной системы, продуцирующей гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека // Сборник тезисов докладов XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2010. (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

9. Получение растворимого рекомбинантного аналога чГ-КСФ с использование бактериальной системы экспрессии // Сборник научных трудов по материалам конференции «Первые Беккеровские чтения», Волгоград, 2010. (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

10. Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в клинической практике // Российский биотерапевтический журнал. - 2011 - № 2. - С. 19 - 24. (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

и.Рекомбинантные продуценты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Российский биотерапевтический журнал. - 2011 - № 4. - С. 3 - 8. (Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

Заказ № 12-Р/10/2011 Подписано в печать 04.10.2011 Тираж 100 зкз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 }; с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) — один из гемопоэтических факторов, играющих важную роль в организме. Этот цитокин способствует выживанию клеток-предшественников нейтрофильных гранулоцитов, стимулирует их деление, последующую дифференцировку и созревание, необходим он и для активации зрелых нейтрофилов (Morstyn and Burgess, 1988).

Обладая широким спектром активностей, чГ-КСФ применяется в онкологической практике для» лечения нейтропении, возникающей после проведения химио- и радиотерапии. Нейтропения характеризуется значительным снижением количества нейтрофилов, что ведет к резкому снижению иммунитета неспособности сопротивляться«внешним инфекциям. Введение препаратов, содержащих чГ-КСФ, позволяет восстановить уровень нейтрофилов, повысить иммунитет и избежать возникновения сопряженных инфекций.

В' последние годы было проведено множество исследований, показывающих, что чГ-КСФ-может быть использован не только при лечении онкологических заболеваний. Этот цитокин является- одним? из возможных препаратов для лечения ряда аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний, последствий инфаркта миокарда и инсульта.

Создание рекомбинантных аналогов природного человеческого Г-КСФ является одной из важных биотехнологических задач. При разработке рекомбинантных аналогов важно подобрать подходящую экспрессионную систему, позволяющую получать достаточные количества препарата и использовать систему очистки, обеспечивающую сохранение биологической активности целевого белка.

Существует несколько коммерческих рекомбинантных аналогов^ чГ-КСФ. Получение рекомбинантного белка осуществляется как в клетках эукариот, так и в прокариотических организмах. Наиболее доступной является экспрессия целевого белка в бактериальных клетках, в частности, в

Escherichia coli. Использование этого организма позволяет получать высокий уровень экспрессии при минимальных затратах.

При цитоплазматической экспрессии в бактериях целевой белок может формировать тельца включения или присутствовать в растворимой форме. Получение растворимой формы предпочтительнее, так как позволяет избежать при очистке дополнительных этапов растворения и рефолдинга.

Существующие в настоящий момент рекомбинантные аналоги чГ-КСФ, полученные с использованием бактериальных продуцентов, экспрессируются в нерастворимой форме. Получение чГ-КСФ в растворимой форме позволило бы избежать дополнительных этапов, очистки и упростить процесс получения рекомбинантного аналога этого белка. .

В настоящий момент практически нет экспрессионных систем, которые позволяли бы получать чГ-КСФ в растворимой форме. Исследователи сталкиваются с терратогенным эффектом при продуцировании этого белка в организме различных трансгенных животных. Попытки экспрессировать чГ-КСФ в растворимой' форме в бактериальных клетках приводили к гибели клеток при достижении высокого- уровня процукции цитокина. Решением проблемы может являться- использование растворимого белка-партнера. Конструирование экспрессионного вектора, в состав которого будут входить последовательности как целевого гена, так и высокорастворимого партнера, и последующая экспрессия гибридного белка, сделает возможным «маскировку» чГ-КСФ в организме продуцента. Таким образом можно добиться высокого уровня продукции чГ-КСФ в растворимой форме с использованием лишь одного этапа очистки белка.

В данной работе отражены основные современные стратегии, применяющиеся при экспрессии рекомбинантных белков, в частности, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Представлены данные, касающиеся клинического применения этого цитокина, особое внимание уделено новым перспективным путям использования чГ-КСФ. В работе изложен новый подход, позволяющий обеспечивать экспрессию целевого белка в растворимой форме, исключая формирование телец включения.

Целью исследования была разработка и создание векторных конструкций, позволяющих, с помощью бактериальных продуцентов, получать чГ-КСФ в растворимой форме.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать экспрессионную систему, позволяющую обеспечивать «маскировку» Г-КСФ в составе продуцируемой в растворимой форме гибридной конструкции.

2. Модицифировать последовательность гена чГ-КСФ для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

3. Разработать и создать векторные конструкции для бактериальной экспрессии чГ-КСФ.

4. Оптимизировать экспрессию гибридной конструкции, несущей в составе домен чГ-КСФ.

5. Очистить продуцируемый цитокин с помощью аффинной хроматографии.

6. Оценить биологическую активность полученного чГ-КСФ и сравнить с биологической активностью коммерческого аналога - Нейпогена.

2. Обзор литературы.

Выводы.

1. Последовательность гена чГ-КСФ была модифицирована для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

2. Для «маскировки» чГ-КСФ при бактериальной экспрессии в растворимой форме в составе гибридного белка был выбран интеиновый домен.

3. Введение аминокислотных замен на Ы-конце последовательности чГ-КСФ с Ткг-Рго на А1а-А^ позволило существенно увеличить эффективность гидролиза связи между интеином и целевым белком. Совершенные замены не оказали влияния на биологическую активность цитокина.

• 4. На основе клеток В121(БЕЗ) создан штамм-продуцент, экспрессирующий гибридный белок. Белок экспрессируется в растворимой форме и несет в своем составе хитин-связывающий домен, интеин и чГ-КСФ. Уровень экспрессии составляет 7 мг/л.

5. Аффинная хроматография с использованием хитинового сорбента позволяет добиться одноэтапной очистки чГ-КСФ из состава гибридного белка.

6. Биологическая активность полученного цитокина соответствует ожидаемой и сопоставима с биологической активностью коммерческого аналога - Нейпогена. Она составляет 98% от биологической активности Нейпогена.