Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани rhBMP-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние на иммунную систему

на правах рукописи

ОСИДАК Егор Олегович

Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани гЫЗМР-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние

на иммунную систему.

14.03.09 - Клиническая иммунология и аллергология 03.01.02-Биофизика

13 СЕВ 2014

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2014 г.

005545002

005545002

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Анна Станиславовна Карягина-Жулина

кандидат биологических наук, Сергей Петрович Домогатский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Александр Наумович Наровлянский -руководитель лаборатории цитокинов, ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

доктор физико-математических наук, профессор Михаил Александрович Пантелеев -заведующий лабораторией молекулярных механизмов гемостаза, Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт Биологии Развития РАН

Защита состоится "28" февраля 2014 г. в 11:00 на заседании Диссертационного совета Д 208.130.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу г. Москва, ул. Гамалеи д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

Автореферат разослан "27" января 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Введение

Актуальность проблемы: Костная ткань является одной из немногих тканей организма взрослого человека, которая может спонтанно восстанавливаться при полученном повреждении, если размер дефекта не превысит критического (от 1 см2). В противном случае, в результате полученной травмы (например, переломы позвонков) или болезни (например, остеохондроз позвоночника или дегенеративное заболевание межпозвонкового диска) самостоятельная регенерация костной ткани без оперативного вмешательства становится невозможной. Для ускоренного восстановления поврежденной костной ткани в зоне регенерации необходимо продолжительное время поддерживать достаточную концентрацию биологически активных соединений - факторов роста. Группа костных морфогенетических белков (Bone Morphogenic Proteins, BMP) регулирует регенерацию костной ткани [Зайцев и др., 2009]. ВМР-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных клеток в хондрогенные и остеогенные клетки, а также способствует пролиферации остеобластов [Chen et. al., 2004]. Рекомбинантный ВМР-2 человека (rhBMP-2) используется в клинике при лечении костных повреждений с 2000 года [Boden et. al., 2000]. С момента создания рекомбинантных факторов роста, их использование в клинической практике вызывало обеспокоенность у врачей в связи с возможной индукцией иммунного ответа при их введении в организм [Poynton et. al., 2002]. При оценке иммуногенности rhBMP-2 необходимо учитывать свойства этого фактора роста, отличающие его от других терапевтических рекомбинантных белков. Например, большинство терапевтических рекомбинантных белков используются при полном отсутствии или низкой экспрессии нативной формы данного белка в организме, a rhBMP-2 были разработаны специально для индукции остеогенеза при спондилодезе [White et. al., 2007]. Таким образом, rhBMP-2 должны действовать локально, в месте имплантации композита, чтобы индуцировать формирование новой костной ткани в месте повреждения костной ткани, в то время как другие терапевтические рекомбинантные белки действуют системно. Рекомбинантный ВМР-2, как и любой другой рекомбинантный человеческий белок, является антигеном [Hwang et al,, 2009]. Поэтому в клинике, при оценке иммуногенности rhBMP-2 важно следить за наличием гуморального ответа на данный рекомбинантный белок [Schellekens Н, 2002], так как наличие циркулирующих антител может привести к подавлению терапевтической активности вводимого rhBMP-2. Особенно следует опасаться возникновения гиперчувствительности организма к конкретному белковому препарату. Этот относительно редкий тип ответа ассоциирован преимущественно с применением биофармацевтических препаратов, содержащих рекомбинантные белки бактериального происхождения, к которым относится rhBMP-2. Из данных литературы известно, что при клиническом использовании рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 (rhBMP-2) в 6% случаях с помощью ИФА были обнаружены антитела к ВМР-2 [Govender et al., 2002]. На сегодняшний день клиническое значение наличия гуморального иммунного ответа на экзогенные

формы гЬВМР-2 остается неясным, однако, при обнаружении циркулирующих антител специфичных к гЬВМР-2, лечение с использованием данного белка настоятельно рекомендуется прекратить [РоуШоп е1. а!., 2002].

Желательно, чтобы действие факторов роста в зоне регенерации было локальным, ограниченным местом аппликации композита. Концентрация ростовых факторов, поддерживаемая продолжительное время в зоне регенерации, должна быть достаточной для активирующего воздействия на клетки. Однако, при этом общее количество белка, выделяемого из композита, должно быть минимальным, чтобы избежать запуска иммунной реакции на уровне целого организма.

Для улучшения фармакодинамических свойств препаратов гЬВМР-2 существует потребность в разработке контролируемых систем доставки и замедленного высвобождения этого белка. Для локализации и продолжительности воздействия рекомбинантного гЬВМР-2 в клиниках США используют коллагеновую губку, при этом доза местно вводимого в организм пациента гЬВМР-2 в среднем составляет около 12 мг [Ней е1. а1., 2008]. При этом следует отметить, что в 1 кг кости находится около 1 мкг ВМРв [Ьиу1еп е1. а1., 1989], а у взрослого человека массой 100 кг на долю костной ткани приходится около 15 кг, таким образом, общее количество ВМРб во всей костной ткани у взрослого человека не превышает 15 мкг, что в тысячу раз меньше количества гЬВМР-2, применяемого при лечении. А так как г!1ВМР-2 применяют в локальной области, то это соотношение увеличивается еще в несколько раз. Емкость коллагеновой губки по отношению к гЬВМР-2 невелика, поэтому использование избыточного количества гЬВМР-2, не связанного с коллагеном, приводит к быстрому высвобождению 30-50% рекомбинантного белка в первые дни после имплантации [На!с1аг е1. а1., 2009]. Это, вероятно, и является одной из основных причин, приводящих к возникновению серьезных побочных эффектов, наблюдаемых в ряде случаев при использовании остеопластических материалов, содержащих гЬВМР-2. К таким эффектам относятся, в частности, отмеченные в различных исследованиях эктопическое образование костной ткани в спинномозговом канале при заднем поясничном межтеловом спондилодезе; остеолиз, и, как следствие, потеря фиксации имплантата [Сагга§ее е1. а1., 2011]; отек тканей шеи и горла и дисфагия при шейном спондилодезе; возникновение сильной воспалительной реакции в месте перелома, а также наличие циркулирующих антител к ВМР-2 [Аго е! а1., 2011]. Появление антител к ВМР-2 в организме пациента опасно с точки зрения возможности возникновения аутоиммунных реакций и системного иммунного ответа при повторном применении материалов, содержащих данный белок [РоуШоп е1. а1., 2002].

Цель исследования - оценка иммунологических и физиологических реакций организма, возникающих при имплантации коллагенового носителя с гЬВМР-2, а также обеспечение контролируемого высвобождения гЬВМР-2 из имплантируемого коллаген-содержащего материала.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) Разработать тест-систему для определения концентрации rhBMP-2 в плазме крови с целью оценки скорости высвобождения фактора роста из коллагенового носителя.

2) Исследовать влияние плазмы крови на диссоциацию комплекса ко ллаген-rhB МР-2.

3) Описать процесс контролируемого высвобождения rhBMP-2 из коллагенового носителя с помощью математической модели.

4) Разработать экспериментальную модель для изучения выхода rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля in vitro и in vivo.

5) Определить наличие/отсутствие антител к rhBMP-2 у крыс при имплантации коллагенового носителя с rhBMP-2.

6) Описать физиологические реакции организма на коллагеновый носитель с rhBMP-2 при подкожной имплантации.

Научная новизна:

Впервые обнаружено и экспериментально доказано, что фибронектин плазмы крови человека вытесняет связанный rhBMP-2 из комплекса с коллагеном в составе гидрогеля, тем самым регулируя скорость высвобождения rhBMP-2 из имплантата.

Разработана математическая модель, описывающая механизм контролируемого высвобождения rhBMP-2 из коллагенового геля фибронектином плазмы крови, продемонстрировано, что скорость высвобождения rhBMP-2 зависит от скорости проникновения фибронектина внутрь геля.

С учетом полученных данных создан новый вариант носителя для факторов роста костной ткани, представляющий собой коллаген-фибронектиновый гель. С помощью разработанной ИФА тест-системы исследована кинетика высвобождения rhBMP-2 из данного носителя. С помощью гистологических методов установлено, что rhBMP-2 в составе коллаген-фибронектинового носителя не вызывает иммунных реакций и индуцирует эктопический остеогенез на 42 день при подкожной имплантации.

Разработана методика, позволяющая оценивать гуморальный иммунный ответ, возникающий у пациентов при использовании rhBMP-2 с любыми типами носителей.

Практическая значимость работы:

Предложенная модель конкурентного вытеснения факторов роста из коллагенового носителя позволяет оптимизировать системы, обеспечивающие контролируемое высвобождение rhBMP-2, уменьшить количество используемого фактора роста и избежать стадии быстрого начального высвобождения rhBMP-2 из коллагенового носителя. Результаты модели позволяют предложить новые варианты носителей, обеспечивающих контролируемое высвобождение не только rhBMP-2, но и других факторов роста. Данные носители можно будет применять в различных областях

тканевой инженерии как в научно-исследовательских целях, так и в прикладных.

Разработанная «сэндвич» ИФА тест-система определения концентраций гЬВМР-2 в плазме/сыворотке крови человека и животных найдет широкое применение в лабораториях, разрабатывающих новые формы полимерных носителей для контролируемой доставки гЬВМР-2.

С помощью разработанной методики количественной оценки циркулирующих антител к гЬВМР-2 в крови у пациентов возможно проведение быстрого скрининга пациентов для дальнейшего принятия решения о возможности продолжать лечение с использованием гЬВМР-2.

Внедрение результатов работы:

Разработаны методические рекомендации «Оценка эффективности удержания гЬВМР-2 в полимерных носителях методом иммуноферментного анализа», предназначенные для научно-исследовательских институтов биотехнологического профиля, утвержденные на заседании Совета по внедрению научных достижений в практику ФБГУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России от 10 октября 2013 г., протокол № 27.

Положения выносимые на защиту:

1. Разработаны основы технологии, обеспечивающие подавление иммунной реакции организма на рекомбинантный фактор роста костной ткани ВМР-2, включаемый в имплантат в составе коллагенового гидрогеля, за счет контролируемого продолжительного высвобождения фактора.

2. В качестве основного компонента плазмы крови, ответственного за высвобождение гЬВМР-2 из комплекса с коллагеном идентифицирован фибронектин, мультидоменный димерный гликопротеин.

3. Разработан метод иммуноферментного анализа для количественной оценки эффективности удержания гЬВМР-2 в составе имплантируемого гидрогеля.

4. Показана эффективность подавления иммунной реакции организма при замедленном высвобождении гЬВМР-2 из имплантируемого коллагенового гидрогеля при включении в него фибронектина.

5. Испытан на животных новый коллагеновый матрикс для имплантации, содержащий фибронектин и фактора роста гЬВМР-2, обеспечивающий такое контролируемое высвобождение этого фактора, при котором стимулируется рост костной ткани, но не происходит выработки антител на гЬВМР-2.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Международная интернет-конференция «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012), XII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2012), II Международная

научная интернет-конференция «Математическое и компьютерное моделирования в биологии и химии. Перспективы развития» (Казань, 2013), VI Ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2013), XIII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2013), I Национальный конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2013).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 публикации в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК и б - тезисы в трудах конференций.

Структура диссертации:

Диссертация состоит из 8 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Теоретическая модель», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 195 цитируемых источников, в том числе 2 на русском языке.

Содержание работы: 1 Материалы и методы

Поликлоиальные кроличьи антитела

Специфические поликлоиальные антитела к rhBMP-2 получали путем внутрикожной иммунизации кроликов препаратом rhBMP-2. Поликлоиальные антитела выделяли из сывороток методом иммуноаффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным rhBMP-2. Моноклональные антитела

Девять типов асцитных жидкостей, полученных при инокуляции мышей девятью различными гибридными клонами, содержащие моноклональные антитела к ВМР-2, были получены от ООО фирмы «Имтек». Иммуноглобулины осаждали в 40% сульфате аммония. Ресуспендированный осадок иммуноглобулинов подвергали дальнейшей очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Чистоту фракции не связавшегося с колонкой материала контролировали методом электрофореза в полиакриламидных гелях (12 %) в присутствии додецилсульфата натрия по Laemmli (SDS PAGE).

Приготовление иммуноконъюгатов с пероксидазой хрена Конъюгат поликлональных антител и моноклональных антител к rhBMP-2 с пероксидазой хрена получали методом перийодатного окисления пероксидазы (77332, Sigma, США) по Nakane.

Плазма крови без коллаген-связывающих белков

Свежая плазма крови человека, антикоагулированная ЭДТА, при температуре

37°С была пропущена в течение 4 часов через сорбент с иммобилизованным коллагеном (S-Col, «Имтек», Россия) в соотношении объемов 1:1. Белки, связавшиеся с коллагеном, были элюированы раствором, содержащим 6 М мочевины и 10 мМ ЭДТА, рН 6,5. Белковый состав элюата анализировали методом электрофореза в полиакриламидных гелях (6 % и 10 %) в присутствии додецилсульфата натрия по Laemmli (SDS PAGE)

Плазма крови без фибронектина

Свежая плазма крови человека, антикоагулированная ЭДТА, при температуре 37°С была пропущена в течение 4 часов через сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к фибронектину человека (S-IM FneH, «Имтек», Россия) в соотношении объемов 3:1.

Приготовление коллагенового матрикса с включением rhBMP-2 Коллоидный раствор крысиного коллагена смешали с раствором rhBMP-2 в концентрации. Полученную смесь, титруя при постоянном перемешивании, доводили раствором 1 М NaOH до нейтральных значений рН. Инкубировали смесь при + 4°С в течение 2 часов, затем разливали в лунки 24-х луночного планшета. Для формирования геля полученную смесь инкубировали при +37°С в течение 30 минут. Образованные коллагеновые гидрогели, извлеченные из планшета, отмывали в фосфатном буферном растворе Рингера-Кребса при комнатной температуре в течение 24 часов с заменой раствора каждые 8 часов.

Приготовление коллагенового матрикса с включением фибронектина и rhBMP-2

Все процедуры выполняли аналогично вышеприведенной методике приготовления коллагенового матрикса, но в исходную смесь дополнительно было введено 0,3 мг высокоочищенного фибронектина.

Вымывание rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля in vitro

Вымывание rhBMP-2 из сформированных гелевых дисков объемом 0,1 мл оценивали, инкубируя их в фиксированном объеме цельной плазмы крови человека и фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса при постоянном перемешивании. В каждую экспериментальную группу входило по 5 образцов. Перед сменой омывающего раствора часть его отбирали для определения количества вышедшего из геля rhBMP-2.

Высвобождение rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля in vivo

Исследование проводилось на крысах-самцах стока Wistar весом от 300 до 350 г. Возраст животных составлял 7-8 месяцев. Хирургическое поле в паховой области освобождали от шерсти, обрабатывали однопроцентным спиртовым раствором йода. В асептических условиях скальпелем делали линейный кожный разрез длиной 1,5 см. В полученные «карманы» каждой крысе имплантировали по два образца коллаген-фибронектинового матрикса. Рану послойно ушивали атравматической нитью ПГА и обрабатывали препаратом «Террамицин» для предупреждения развития бактериальной инфекции.

На 4, 7, 14, 28 и 42 день после операции имплантированные гидрогели с прилегающими тканями извлекали для морфологического анализа.

Для полной экстракции rhBMP-2 коллаген-фибронектиновый матрикс помещали в 0,5 мл водного раствора 6 M мочевины, 10 мМ ЭДТА, рН 6,5 и при комнатной температуре (25°С) и постоянном перемешивании выдерживали до полного растворения матрикса.

Гистологическая обработка и описание исследуемых образцов Гистологическая обработка выполнена в НИЦ ТБП ФМБА России. Описание гистологических образов проведено к.б.н. Рыбалкиным С.П. - зав. отделом патологии и репродуктивной токсикологии НИЦ ТБП ФМБА России, и к.б.н. Надеждиным C.B. - доцент кафедры анатомии и физиологии живых организмов БГУ. Математическая модель

Математическая модель контролируемого высвобождения rhBMP-2 из коллагенового носителя была выполнена совместно с кандидатом физико-математических наук, научным сотрудником ООО фирмы «Имтек» Ахмановой М.А.

2 Характеристика основных свойств сделанной тест-системы для определения rhBMP-2 в биологических жидкостях

Тест-систему для количественного определения rhBMP-2 разрабатывали в формате сэндвич-ИФА. На предварительном этапе были подобраны оптимальные условия для иммобилизации моноклональных антител к ВМР-2 на поверхности планшетов из полистирола. При концентрации антител более 10 мкг/мл в карбонатном буфере (30 мМ Na2C03, рН 9,6) график зависимости оптической плотности при титровании rhBMP-2 не изменялся.

Разработанную тест-систему проверяли по способности выявлять в физиологическом растворе как препарат rhBMP-2, полученный микробиологическим синтезом, так и препарат коммерческого rhBMP-2 (RD systems, DY355). Была подготовлена серия разведений данных препаратов в PBS от 30 нг/мл до 1 нг/мл с шагом 1:2, а также раствора без rhBMP-2. Образцы инкубировали в лунках планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к rhBMP-2. После отмывки вносили во все лунки планшета препарат кроличьих антител к rhBMP-2, конъюгированных с пероксидазой. После инкубации и тщательной отмывки ферментативную активность пероксидазы проявляли раствором хромогенного субстрата. Результаты эксперимента представлены на рисунке 1. Анализ графика, приведенного на рисунке 1, позволяет сделать вывод, что созданная тест-система позволяет определять концентрацию rhBMP-2 в интервале от 5 до 30 нг/мл.

Поскольку основной задачей тест-системы является оценка эффективности удержания rhBMP-2 в полимерных носителях в условиях, приближенных к in vivo, то проверку тест-системы проводили по способности детектировать rhBMP-2 в плазме и сыворотке крови человека, плазме и сыворотке крови крысы, плазме и сыворотке крови кролика. Для сравнения с предыдущим

9

экспериментом готовили серийное разведение гЬВМР-2 в плазме и сыворотке крови выше указанных видов. Фоновая реакция тест-системы была оценена в образцах без добавления гЫЗМР-2. Исследуемые образцы инкубировали в лунках планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к ВМР-2. После отмывки во все лунки планшета вносили препарат кроличьих антител к ВМР-2, конъюгированных с пероксидазой. После инкубации и тщательной отмывки ферментативную активность пероксидазы проявляли раствором хромогенного субстрата. Результаты измерения пяти независимых проб гЬВМР-2 для каждого исследуемого раствора приведены в таблице 1 и на рисунке 2.

Рис. 1 Зависимость оптической плотности субстрата от концентрации коммерческого ВМР-2 (пунктирная линия) и гЬВМР-2 (сплошная линия), полученная при тестировании разработанной тест-системы на пробах, приготовленных разведением белков в физрастворе

Сопоставляя графики на рисунке 2 и данные в таблице 1, видно, что рабочий диапазон для оптимального определения концентрации гЬВМР-2 во всех типах исследованных биологических жидкостей находится в интервале от 5 до 30 нг/мл. Это позволяет исследовать выход гЬВМР-2, входящего в состав различных типов носителей, в плазму и сыворотку крови человека, лабораторных животных в достаточно широком диапазоне концентраций.

Рис. 2 Зависимость оптической плотности от концентрации гЬВМР-2 в фосфатном буфере (штрих-пунктирная линия), в сыворотке крови человека (пунктирная линия) и в плазме крови человека (сплошная линия), полученная при тестировании разработанной тест-системы

Таблица 1.

Средние значения оптической плотности при длине волны 450 нм для различных концентраций гЬВМР-2, полученные при использовании разработанной тест-системы для количественного определения белка,

Раствор Среднее значение оптической плотности субстрата при длине волны 450 нм для различных концентраций гЬВМР-2"

30 нт/мл 15 нт/мл 7,5 нт/мл 3,7 нт/мл

Буфер для антигена 0,5±0,04 0,29±0,02 0,15±0,01 0,09±0,01

Плазма крови человека 0,42±0,02 0,26±0,02 0,15±0,03 0,07±0,01

Сыворотка крови человека 0,48±0,02 0,3±0,01 0,13±0,02 0,06±0,01

Плазма крови кролика 0,43±0,02 0,27±0,02 0,13±0,03 0,06±0,01

Сыворотка крови кролика 0,47±0,02 0,29±0,01 0,12±0,02 0,06±0,01

Плазма крови крысы 0,45±0,02 0,26±0,02 0,14±0,03 0,07±0,01

Сыворотка крови крысы 0,47±0,02 0,28±0,01 0,11±0,02 0,07±0,01

Примечание. ''Стандартное отклонение рассчитывалось по результатам 5 измерений оптической плотности гЬВМР-2.

3 Взаимодействие ВМР-2 с коллагеном

Коллаген, иммобилизованный на агарозном носителе, промывали раствором, содержащим избыточное количество гЬВМР-2. После тщательной отмывки коллаген-сефарозы десятью объемами фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса при температуре +37°С гЬВМР-2 в омывающем растворе не обнаруживался. Адсорбированный на коллагене гЬВМР-2 элюировапи раствором 6 М мочевины, 10 мМ ЭДТА, рН 6,5 (рис. 3). При проведении 808-электрофореза в обработанных образцах коллаген-сефарозы остаточный гИ ВМР-2 не выявлялся. Титрованием элюата определено количество гЬВМР-2, смытого мочевиной с коллаген-сефарозы при соотнесении с образцом сравнения - исходным препаратом гЬВМР-2. Из оценки с погрешностью измерения 20 % можно заключить, что нативный коллаген I типа человека, иммобилизованный на носитель, способен связывать гИВМР-2 в весовом соотношении 10:1 при вышеуказанных условиях.

Рис. 3 График элюции гЬВМР-2 адсорбированного на коллагене человека I типа.

4 Влияние белков плазмы крови на связывание ВМР-2 с коллагеном

Как указано выше, коллаген, иммобилизованный на агарозном носителе, был инкубирован с гЬВМР-2 до насыщения связывания. После тщательной отмывки коллаген-сефарозы фосфатным буферным раствором Рингера-Кребса через сорбент с адсорбированным гЬВМР-2 было пропущено 6 миллилитров человеческой плазмы крови (тридцать объемов сорбента). Измеряя концентрацию гЬВМР-2 в каждой из фракций пропущенной плазмы, выявлено, что, начиная с третьей фракции по двадцать пятую, концентрация гЬВМР-2 была практически одинакова и равна 10 мкг/мл с погрешностью в 20%. Это свидетельствует о равномерном высвобождении фактора роста в омывающий раствор. Следовательно, в плазме крови есть компоненты, способные элюировать гЬВМР-2 с колонки. Для проверки предположения о том, что элюирующие компоненты плазмы крови представляют собой коллаген-связывающие белки, была приготовлена плазма крови человека, пропущенная через сорбент с иммобилизованным коллагеном - абсорбированная плазма крови. Заменив в схеме предыдущего эксперимента цельную плазму крови на препарат абсорбированной плазмы крови без коллаген-связывающих белков, обнаружили, что концентрация высвобождаемого гЬВМР-2 снизилась в пропущенных фракциях плазмы почти в десять раз. Анализируя с помощью ЭОЗ-электрофореза состав белков плазмы крови, адсорбированных на иммобилизованном коллагене, обнаружили в геле преобладающую полосу белка с массой 200-220 кДа. По данным литературы, мажорная полоса в элюате соответствует мономерам фибронектина, димерного белка-гликопротеина с молекулярной массой 440 кДа. Анализ методом твердофазного ИФА показал, что после абсорбции плазмы крови на иммобилизованном денатурированном коллагене концентрация фибронектина в ней составила всего 30 мкг/мл, т.е. в десять раз меньше, чем в исходной плазме крови. Вероятно, именно фибронектин среди других белков плазмы крови конкурировал с гЬВМР-2 за связывание с коллагеном.

С помощью высокоспецифичного иммуносорбента была получена человеческая плазма крови, не содержащая фибронектина. В препарате плазмы крови, пропущенной через сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к фибронектину человека, по данным проведенного ИФА,

12 5 4 5 6

ОбЬСМ (фон МЖ'Н Н1Н о 1,'1)<>»Т», ОП1ССОШШЙ к* обьоп колонки

концентрация фибронектина была менее 1 нг/мл. Плазму крови без фибронектина также, как ранее, пропускали через сорбент с коллагеном, насыщенным гЬВМР-2. При этом высвобождение гЬВМР-2 снизилось приблизительно в 30 раз по сравнению с цельной плазмой крови. Следует отметить, что если в человеческой плазме крови без фибронектина восстановить концентрацию фибронектина до физиологических значений (0,3 мг/мл), добавив очищенный фибронектин, то способность такой плазмы крови вымывать гЬВМР-2 восстанавливается. Раствор чистого фибронектина (0,3 мг/мл) также эффективно вытесняет гЬВМР-2 с коллаген-сефарозы. В таблице 2 приведены средние значения концентрации гЬВМР-2 по двадцати собранным фракциям для каждого омывающего раствора. Стандартное отклонение для приведенных в таблице 2 значений рассчитывалось как среднее значение стандартного отклонения по результатам 5 измерений концентрации гЬВМР-2 в каждой фракции.

Таблица 2.

Усредненная концентрация гЬВМР-2 во фракциях при пропускании различных растворов через сорбент с иммобилизованным коллагеном и

адсорбированным гЬВМР-2.

Подвижная фтй Содержание фнбронектннй Концентрация гЬВМР-2 во фракциях, мкг/мл

Плазма крови без <10 нг/мл фибронектина 0,35 ± 0,25

Плазма крови без коллаген-связывающих 30 мкг/мл белков 0,9 ± 0,25

Раствор фибронектина 300 мкг/мл 7,0 ± 2,0

Плазма крови с восстановленным уровнем 300 мкг/мл фибронектина 9,0 ±2,0

Плазма крови 300 мкг/мл 10,0 ± 2,0

5 Взаимодействие ВМР-2 с фибронектином

Фибронектин, иммобилизованный на агарозном носителе, промывали раствором, содержащим избыточное количество гЬВМР-2 для полного насыщения участков связывания гЬВМР-2 с фибронектином. После тщательной отмывки фибронектин-сефарозы десятью объемами фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса при температуре 37°С гЬВМР-2 в отмывающем растворе не обнаруживался. Адсорбированный на фибронектине гЬВМР-2 элюировали раствором 6 М мочевины, 10 мМ ЭДТА, рН 6,5 (рис. 4). Титрованием элюата было определено количество гЬВМР-2 смытого мочевиной с фибронектин-сефарозы при соотнесении с образцом сравнения - исходным препаратом гЬВМР-2. С погрешностью 20% можно заключить, что нативный фибронектин человека, иммобилизованный на носителе, способен связывать гЬВМР-2 в весовом соотношении 10:1 при вышеуказанных условиях.

Следует отметить, что в аналогичных условиях никакой значимой адсорбции гЫЗМР-2 на аналогичный агарозный носитель с иммобилизованным альбумином человека, а также с иммуноглобулином С человека не наблюдалось. По совокупности формальных признаков взаимодействие гЬВМР-2 с фибронектином и коллагеном следует считать специфичным.

Рис. 4 График элюции rhBMP-2 адсорбированного на

фибронектине человека.

6 Высвобождение rhBMP-2 из коллагеновых носителей in vitro

Измерение кинетики высвобождения rhBMP-2 из коллагеновых носителей было проведено для коллагенового и коллаген-фибронектинового гидрогеля при инкубации в фосфатном растворе Рингера-Кребса и в плазме крови человека при температуре +37°С. Для этого гидрогели с включенным в них фактором роста инкубировали в растворе Рингера-Кребса и в плазме крови человека. Каждый раз отбирали пробы омывающих растворов для определения количества rhBMP-2, вышедшего из геля за текущие сутки. На рисунке 5 приведено количество rhBMP-2, вышедшего из коллагенового геля в плазму крови (Рис. 5, столбцы). Выход rhBMP-2 из коллагенового геля в раствор Рингера-Кребса полученной тест-системой детектировать не удалось, в связи с чем можно сделать вывод о том, что концентрация rhBMP-2 в пробах раствора Рингера-Кребса составляет менее 5 нг/мл (т.е менее 0,025 мкг rhBMP-2 в пробе) (Рис. 5, сплошная линия). При последовательном суммировании измеренных значений получена интегральная зависимость количества вышедшего белка от времени инкубации (Рис. 5, пунктирная линия). Полученные данные показывают, что компоненты плазмы крови активно способствуют высвобождению rhBMP-2 в омывающий раствор.

п П Q п

Рис. 5 Высвобождение гЬВМР-2 из коллагеновых гидрогелей в человеческую плазму крови и раствор Ригера-Кребса. Столбцы - количество гЬВМР-2, вышедшего из коллагенового гидрогеля при инкубации в плазме крови. Пунктирная кривая - суммарное количество гЬВМР-2, вышедшее из коллагенового гидрогеля при инкубации в плазме крови. Сплошная линия -количество гЬВМР-2, вышедшего из коллагенового гидрогеля при инкубации в растворе Ригера-Кребса.

На рисунке 6 приведено количество вышедшего гНВМР-2 в плазму крови из коллагенового геля без фибронектина (рис. 6, столбцы в линейку) и коллагенового геля с фибронектином (рис. 6, полные столбцы). При последовательном суммировании измеренных значений получены интегральные зависимости количества вышедшего белка от времени инкубации (рис. 6, пунктирные линии). Приведенные зависимости показывают, что включение фибронектина в состав коллагенового гидрогеля значительно замедляет высвобождение гЬВМР-2 из матрикса, особенно в течение первых четырех дней. После 4 дней скорости высвобождения гЬВМР-2 из коллагеновых гидрогелей становятся сопоставимыми, но без фибронектина из геля успевает высвободиться более половины исходно включенного гЬВМР-2.

Время инкубации, дни

Рис. 6 Высвобождение гЬВМР-2 из коллагеновых гидрогелей в человеческую плазму крови. Столбцы в линейку - количество гЬВМР-2 вышедшего из коллагенового гидрогеля без фибронектина; полные столбцы -количество гЬВМР-2 вышедшего из коллагенового гидрогеля с фибронектином; пунктирные кривые - суммарное количество гЬВМР-2 вышедшее из коллагенового гидрогеля (штрих-пунктирная) и из коллагенового гидрогеля с фибронектином (пунктирная).

7 Высвобождение rhBMP-2 из коллагеновых носителей in vivo

Было проведено измерение кинетики высвобождения rhBMP-2 из коллаген-фибронектинового гидрогеля при имплантации гелей крысам подкожно в паховую области. На 3, 7, 14, 28 и 42 день после операции гели извлекали и оценивали оставшийся в них rhBMP-2, путем экстракции в водный раствор 6 М мочевины, 10 мМ ЭДТА, рН 6,5.

На рисунке 7 представлено изменение количества rhBMP-2, оставшегося в геле, с момента его имплантации до 42 дня после операции.

Рис. 7 Количество оставшегося гЬВМР-2 в коллагеновых гидрогелях с фибронектином при подкожной имплантации крысам в область холки.

8 Определение титра антител к rhBMP-2 при его контролируемом высвобождении из коллагенового гидрогеля с фибронектином in vivo

Иммунный ответ на rhBMP-2 определяли путем обнаружения сывороточных антител специфичных к данному белку. Концентрацию антител к rhBMP-2 в исследуемых образцах сывороток крови крыс определяли с помощью метода твердофазного ИФА.

Рекомбинантный человеческий ВМР-2 был адсорбирован на поверхности 96-ти луночного планшета (82.1581, «Sarstedt», Германия). В ячейках инкубировали исследуемые образцы и стандарты, разведенные серийно с шагом 1:2. После отмывки в ячейках инкубировали раствор конъюгата пероксидазы с кроличьими антителами к иммуноглобулинам крысы. Ферментативную активность пероксидазы проявляли раствором хромогенного субстрата. Оптическую плотность при длине волны 450 нм в ячейках планшета детектировали на фотометре УНИПЛАН («Пикон», Россия).

В результате проведенного анализа титр антител к rhBMP-2 в сыворотке крови экспериментальных животных на протяжении всего эксперимента не превышал фоновое значение нормальной крысиной сыворотки. Следует отметить, что при иммунизации крыс препаратом rhBMP-2 был получен титр 1 : 90 ООО. По совокупности формальных признаков следует считать, что коллагеновый гидрогель с фибронектином обеспечивает такую презентацию rhBMP-2, при которой не происходит выработки антител к данному рекомбинантному белку.

9 Оценка тканевых реакций организма на введение коллагенового гидрогеля с rhBMP-2 и фибронектином in vivo

Для проверки физиологической совместимости тканей живого организма и коллаген-фибронектинового матрикса, содержащего рекомбинантный ростовой фактор rhBMP-2, гидрогель подкожно имплантировали крысам. Выбор модели подкожного введения обусловлен удобством наблюдения за тканевыми реакциями.

В ранние сроки (3 суток) имплантат уже плотно прилегает к окружающим тканям (рис 8а), без проникновения элементов инфильтрата внутрь имплантата, и окружен тонкой капсулой из рыхлой волокнистой соединительной ткани, с визуально схожей плотностью клеточного состава в сравнении с контролем (коллагеновый гель без rhBMP-2).

Рис. 8 Фотографии имплантатов в месте введения. А, Б, В, Г, Д -имплантация коллаген-фибронектинового матрикса с г11ВМР-2 (сам имплантат обведен черной линией) на 3, 7, 14, 28 и 42 сутки соответственно. Е - демонстрация врастания окружающих тканей в гель на 7 сутки.

В клеточном составе окружающей материал ткани отмечено преобладание незрелых фибробластов, гистиоцитов и лейкоцитов. Капсула имела рыхлое строение и не содержала характерной для грануляционной ткани капиллярных структур. Гигантские клетки инородных тел отсутствовали (рис. 9).

Через семь суток при подкожной имплантации коллагенового носителя с гЬВМР-2 вокруг имплантата сформировался тонкий непрерывный слой грануляционной ткани, обеспечивающий интеграцию импланта с окружающими тканями (рис. 8 б, е). Определялись единичные кровеносные сосуды внутри самого материала имплантата. В клеточном составе в большей степени преобладали фибробласты, отмечено наличие единичных моноцитов и лейкоцитов. Гигантские клетки инородных тел отсутствовали. Отмечено

Рис. 9 Состояние зоны имплантации на 3 сутки после операции. А, В - имплантация коллаген-фибронектинового матрикса с гЬВМР-2; Б, Г -имплантация коллаген-

фибронектинового матрикса. Звездочкой показан введенный материал, черными стрелками

моноциты, белыми фибробласты. Окр.

гематоксилином и эозином.

наличие единичных кровеносных сосудов. Фибробласты внутри имплантата располагаются перикапиллярно (рис. 10).

Рис. 10 Состояние зоны имплантации на 7 сутки после операции. А, В -имплантация коллаген-фибронектинового матрикса с гЬВМР-2; Б, Г -имплантация коллаген-фибронектинового матрикса. Звездочкой показан введенный

материал, черными

стрелками - кровеносные сосуды, белыми фибробласты, зеленая стрелка - прослойка соединительной ткани. Окр. гематоксилином и эозином.

На 14-й день после подкожной имплантации коллагенового-носителя с гЬВМР-2 признаков воспаления не обнаружено (рис. 8в). Анализ гистологических препаратов показал, что фибробласт-подобные клетки из окружающих тканей активно мигрируют внутрь имплантата, при этом большая часть которых расположена перикапиллярно. Однако в образце коллаген-фибронектинового матрикса без гЬВМР-2 миграция клеток внутрь матрикса происходит гораздо медленнее. В обоих случаях количество сосудов внутри имплантата значительно увеличилось, по сравнению с предыдущими образцами. В клеточном составе преимущественно выявлялись фибробласты и единичные лимфоциты; нейтрофилы, лейкоциты и моноциты обнаружены не были (рис. 11).

Рис. 11 Состояние зоны имплантации на 14 сутки после операции. А, В - имплантация коллаген-фибронектинового матрикса с гЬВМР-2; Б, Г -имплантация коллаген-

фибронектинового матрикса. Звездочкой показан введенный материал, черными стрелками -кровеносные сосуды, белыми -фибробласты. Окр.

гематоксилином и эозином.

На 28-й день капсула вокруг импланта начала замещаться пластом соединительной ткани, которая местами врастала внутрь самого коллагенового геля (рис. 8, г) Сам имплантат пронизывала густая сетка кровеносных сосудов, обеспечивающих активное проникновение фибробластов внутрь коллагенового геля (рис. 12).

Рис. 12 Состояние зоны имплантации на 28 сутки после операции.

Имплантация коллаген-фибронектинового матрикса с гЫЗМР-2. Звездочкой показан

введенный материал,

черными стрелками кровеносные сосуды. Окр. гематоксилином и эозином.

На 42-й день произошла полная интеграция коллагенового имплантата с окружающими тканями (рис. 13). Соединительная капсула отсутствовала. Из-за врастания соединительной ткани в материал имплантата, зона интерфазы была мало заметна. Так же в прилегающих к месту апликации коллаген-фибронектинового матрикса была обнаружена формирующаяся костная ткань (рис. 13).

Рис. 13 Состояние зоны имплантации на 42 сутки после операции. Имплантация коллаген-

фибронектинового матрикса с гЬВМР-2. Звездочкой показан введенный материал, черной стрелкой кровеносные сосуды, белой стрелкой -формирующаяся костная ткань. Окр. гематоксилином и эозином.

Постулаты модели

В работе рассматривается процесс контролируемой диффузии ВМР-2 из коллагенового носителя с равномерно распределенными участками связывания. Имплантированный коллагеновый матрикс представляет собой пористый материал, каркас которого составляют коллагеновые фибриллы, а поры заполняет окружающая его жидкость. Материал, в котором каркасом являются полимерные молекулы, называется гелем, который обладает механическими свойствами (проницаемость, упругость и т.д), в большей степени зависящими от концентрации коллагена. В пределах зоны носителя отсутствует циркуляция крови и тканевой жидкости, однако снаружи имплант хорошо омывается данными жидкостями.

Ранее нами было показано, что среди белков плазмы крови, только фибронектин способен вытеснять и обратимо связывать ВМР-2 связанный с

коллагеном. Так как концентрация фибронектина в плазме крови поддерживается на постоянном уровне (около 300 мкг/мл), то скорость диффузии ВМР-2 из коллагенового носителя зависит от скорости проникновения фибронектина вглубь носителя. Чем больше свободного фибронектина в носителе и чем глубже он проникает, тем быстрей происходит высвобождение ВМР-2.

Исследуемый коллагеновый гель имеет форму цилиндра с радиусом 5 мм и высотой 1 мм, поэтому потоком веществ через боковую поверхность можно пренебречь, в результате чего будем рассматривать одномерную модель контролируемого высвобождения ВМР-2 из коллагенового носителя, в которой выделим две зоны:

- Зону, являющуюся источником фибронектина с концентрацией Р0= 0,7-10"3 мМ.

- Зону носителя, являющуюся источником ВМР-2 со стартовой концентрацией В0=3 ■ 10'2 мМ, в которой происходит диффузионное перемещение и взаимодействие фибронектина с ВМР-2, фибронектина с коллагеном, ВМР-2 с коллагеном.

Концентрация фибронектина Ро считается постоянной вследствие бесконечной емкости соответствующей зоны-источника и наличия непрерывного перемешивания в данной зоне. Зона носителя имеет фиксированные размеры Н=1 мм и в данной модели является гомогенной, что означает равномерное распределение участков связывания для фибронектина и ВМР-2, а также постоянство коэффициентов диффузии ВМР-2 и фибронектина внутри матрикса.

Взаимодействие фибронектина (Рп) и ВМР-2 (В), фибронектина и коллагена (С) и, наконец, коллагена и ВМР-2, рассматриваются как обратимые бимолекулярные реакции.

Полная концентрация ВМР-2 внутри матрикса равна сумме концентраций свободных молекул ВМР-2, растворенных в жидкой фазе, и массы молекул ВМР-2, связанных с фибронектином (РВ), коллагеном (РС) и комплексом фибронектин-коллаген (РВС). Следовательно, полная концентрация ВМР-2, находящегося внутри матрикса, равна , аналогично

полная концентрация фибронектина внутри матрикса -

си „

Уравнение диффузии для вещества и принимает вид ^ , где и

- концентрация вещества, I - время, О - коэффициент диффузии данного вещества.

Модель представляет собой систему дифференциальных уравнений, описывающих данные реакции и диффузию компонентов внутри коллагенового геля. Для нахождения значений 7-ми неизвестных концентраций решаются следующие уравнения:

+ Ьсфс] - ЧИН + faAFB] + [FBC]) - A+Wi] + [FC][B]\ (1)

лр

DFAF + fik.[FB] - ft>k+[F\B\ + fck,[FC] - fikjFld (2)

C/l

^=DFBAFB + Jbk,[F][B] - Jh.[FB] + J<:k.[FBC] - fck.{[FB]{Cl (3)

8FC dt

SBC

^A+MC] - fiklFC] + flklFBC] - fbk+[FC]{Bl (4)

8t hck+[BlC]-l>4lBCl (5)

^J%[FCM - H_[FBC\ + /^-+[F«][C] - fik_[FBC\, (6)

С=Со-[ГС]-[0С]-[/.-ДС]. (7)

Граничные условия, учитывающие приближения модели, следующие: концентрация фибронектина на внешней границе равна концентрации в плазме крови (около 0,3 мг/мл), концентрация BMP, а также комплекса BMP-Fn на этих границах равна нулю (в силу перемешивания и частой замены омывающей жидкости). Для всех остальных компонентов (коллагена и комплексов с коллагеном) границы являются непроницаемыми, скорость их диффузии равна нулю. Точка х=0 является осью симметрии, поэтому поток веществ через нее равен нулю. Начальное значение концентрации ВМР-2 равна равновесной концентрации, полученной для данного количества BMP помещенного в коллагеновый гель.

Система уравнений решалась численно методом конечных элементов в программном пакете COMSOL Multiphysics 3.2. Отрезок прямой длиной 0,5 мм (равной полувысоте цилиндра геля), разделен на 256 треугольных элементов, в вершинах которых вычисляется значение концентраций компонентов.

Результаты модели

Результат модели представлен на рисунках 14 а, б, в. Из представленных на рисунках 14 зависимостей, видно что по мере проникновения фибронектина внутрь носителя 14а, общее количество ВМР-2 в носителе уменьшается 166. Увеличение скорости выхода ВМР-2 зависит от скорости проникновения фибронектина внутрь геля.

Рис. 14 Распределение общего количества фибронектина (а) и гЬВМР-2 (б) внутри носителя в моменты времени 1 = 3 часа, 1 день, 2 дня, 5 дней, 7 дней.

Ы од

Раегггежше, *м

Результаты, полученные в математической модели, были сопоставлены с экспериментальными результатами (рис. 14в). Сопоставление результатов математической модели с экспериментально полученными данными, позволяет утверждать, что предложенная математическая модель позволяет предсказывать количество высвобожденного ВМР-2 из коллагенового геля в плазму крови с точностью 20%.

Рис. 14в Высвобождение гЬВМР-2 из коллагенового матрикса. Пунктирная линия

экспериментальные данные. Сплошная линия - результат численного решения

математической модели.

о

0 12 5 4

Время инкубации, д

Выводы

1. Разработана тест-система для определения концентрации rhBMP-2 в плазме крови методом иммуноферментного анализа.

2. С помощью метода иммуносорбции фибронектина из плазмы крови было доказано, что именно фибронектин вытесняет связанный rhBMP-2 из комплекса с коллагеном.

3. Экспериментально определено, что rhBMP-2 способен связываться с иммобилизованным фибронектином человека при физиологических условиях в массовом соотношении 1:10, что соответствует стехиометрическому связыванию молекул.

4. Построена математическая модель, описывающая контролируемое высвобождение rhBMP-2 из коллагенового носителя. С ее помощью обоснован способ продолжительного удержания rhBMP-2 в коллагеновом носителе.

5. Создан коллаген-фибронектиновый матрикс для контролируемой доставки rhBMP-2. Продемонстрировано высвобождение rhBMP-2 из коллагенового носителя в течение 28 дней в опытах in vivo.

6. Экспериментально доказано, что контролируемое высвобождение rhBMP-2 из коллаген-фибронектинового матрикса способствует формированию новой костной ткани и не индуцирует выработки антител к rhBMP-2.

7. Экспериментально показано с помощью гистологического анализа образцов ткани, содержащих имплантат, что введение rhBMP-2 в составе коллаген-фибронектинового матрикса сопровождается быстрым прохождением воспалительной реакции и отсутствием выраженного иммунного ответа.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1) Осидак Е.О.. Осидак М.С., Ахманова М.А., Домогатский С.П. Коллаген — биоматериал для доставки факторов роста и регенерации ткани. // Рос. хим. ж., 2012, т. LVI, №5-6, С. 102-113.

2) Осидак Е.О. . Осидак М.С. , Сивогривое Д.Е., Портная Т.С., Грунина Т.М., Соболева Л.А., Лунин В.Г., Карягина A.C., Домогатский С.П. Регуляция связывания фактора роста ВМР-2 с коллагеном фибронектином плазмы крови. // Ж. Прикл. биохим. и микробиол., 2014, т. 50, № 2, С.

3) Осидак Е.О. . Осидак М.С. , Сивогривое Д.Е., Портная Т.С., Грунина Т.М., Галушкина Т.М., Лунин В.Г., Карягина A.C., Домогатский С.П. Определение кинетики высвобождения ВМР-2 из коллагенового носителя методом иммуноферментного анализа в присутствии белков плазмы крови. //Бюлл. эксп. биол. и мед., 2013, в печати

4) Осидак Е.О.. Карягина A.C., Лунин В.Г., Домогатский С.П. Исследование высвобождения рекомбинантного человеческого ВМР-2 из коллагенового гидрогеля и регенерации костной ткани. // Международная интернет-конференция «Биотехнология. Взгляд в будущее», Казань, 2012, Сборник тезисов, С. 179-181.

5) Осидак Е.О.. Бартов М.С., Мишина Д.М., Карягина A.C., Лунин В.Г., Домогатский С.П. Вытеснение rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля компонентами плазмы крови in vivo и in vitro. // XII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», Москва, 2012, Сборник трудов конференции, С. 32.

6) Осидак E.Ó.. Ахманова М.А., Осидак М.С., Домогатский С.П. Модель контролируемого высвобождения факторов роста из коллагенового носителя в присутствии плазмы крови. // II Международная научная интернет-конференция «Математическое и компьютерное моделирования в биологии и химии. Перспективы развития», Казань, 2013, Сборник тезисов, т. II, С. 710.

7) Осидак Е.О.. Осидак М.С., Бартов М.С., Карягина A.C., Лунин В.Г., Домогатский С.П. Эктопический остеогенез индуцированный rhBMP-2 в составе коллаген-фибронектинового матрикса. // VI Ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий», Москва, 2013, Тезисы докладов, С. 44-45.

8) Осидак Е.О.. Ахманова М.А., Осидак М.С., Домогатский С.П. Контролируемое высвобождение rhBMP-2 из коллагенового носителя индуцирует эктопический остеогенез у крыс. // XIII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», Москва, 2013, Сборник трудов конференции, С. 15.

9) Осидак Е.О.. Карягина A.C., Лунин В.Г., Домогатский С.П. Разработка коллаген-фибронектинового матрикса для контролируемой доставки rhBMP-2. // I Национальный конгресс по регенеративной медицине, Москва, 2013, Тезисы докладов, С. 53.

Подписано в печать: 21.01.13 Тираж: 80 экз. Заказ № 1032 Объем: 1,5 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru