Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Альтернативные системы экспрессии рекомбинантного ИФН-alpha-2b

Препараты интерферона-а:-2Ь человека (чИФН-се-2Ь) нашли широкое применение в медицине В1 качестве противовирусных и иммуномодулирующих лекарственных средств. Существующие на фармацевтическом рынке препараты используются при лечении ряда онкозаболеваний как доброкачественной, так и злокачественной природы. Несмотря на это они редко назначаются пациентам с соответствующим диагнозом. Это связано с тем, что зарубежные препараты недоступны для многих больных в силу ряда причин (высокая стоимость, недостаточное количество или полное, отсутствие на отечественном рынке), а российские аналоги показали себя как менее эффективные. В рамках государственной программы импортозамещения разработка технологии получения высокоэффективного препарата чИФН-а-2Ь, позволяющей снизить себестоимость субстанции, является актуальной на сегодняшний день.

В продаже присутствует ряд препаратов на основе интерферонов человека. Источники их получения различны. Однако препараты первого поколения на основе природных интерферонов практически полностью вытеснены рекомбинантными аналогами. Это связано с дефицитом и неоднородностью сырья (донорской- крови) и высокой стоимостью конечного продукта. Основные коммерческие препараты представляют собой рекомбинантную форму человеческого ИФН-а-2. Их фармакологическое действие сходно с нативным белком и включает в себя противовирусный, противоопухолевый и иммуномодулирующий эффекты, характерные для всех ИФН-<х Наиболее часто в клинике используется ИФН-а-2Ь. Одной из важнейших областей использования-этого белка является онкология. Препараты ИФН включены в состав комбинированной терапии в схемы лечения хронического миелолейкоза, Т-клеточной лимфомы» кожи, множественной миеломы, злокачественной меланомы и рака почки.

Последние достижения в геномике, протеомике и биоинженерии привели к значительному росту числа лекарственных белков, получаемых с использованием 5 биотехнологий. В технологическом процессе применяются различные методы очистки и используется целый ряд продуцентов: бактериальные и дрожжевые клетки, культуры клеток насекомых и млекопитающих, а также растения. При разработке технологии получения высокоочищенного рекомбинантного белка целью исследования становится снижение конечной стоимости субстанции. При этом основной акцент ставится на получение максимально возможного количества целевого белка в единице объема, эффективности его очищения и восстановлении биологической активности.

В настоящее время существует два наиболее перспективных направления. Первое из них - использование в качестве продуцента бактериальных культур. Эта система экспрессии пользуется популярностью благодаря большому объему доступной информации об этом организме и высоким показателям продуктивности. Оптимизация отдельных процессов в технологии получения рекомбинантных белков из бактериальных культур клеток позволит снизить себестоимость конечного продукта, но эти цифры будут незначительными (порядка 10-20%).

Второе направление — эток использование в качестве продуцентов растений. Такой принципиально новый подход предоставляет новые возможности для создания рекомбинантных аналогов. В настоящее время основными продуцентами для получения терапевтически значимых белков являются бактериальные или дрожжевые культуры, которые не обеспечивают проведения посттрансляционных модификаций, характерных для человека. Предполагают, что именно это является причиной образования антител против ИФН и сопутствующего снижения эффективности интерферонотерапии при длительном использовании препаратов этого цитокина в процессе лечения таких серьезных заболеваний как гепатит и рак почки. Создание растительного продуцента Шсойапа ЬепЖаппапа, экспрессирующего рекомбинантный чИФН-се-2Ь и обеспечивающего проведение посттрансляционных модификаций, характерных для человека, возможно, позволит решить эти проблемы.

Целью данной работы стало создание бактериального (Escherichia coli) и растительного (Nicotiana benthamiana) продуцента ИФН-а-2Ь человека (чИФН-а

2Ь), сравнение их эффективности и выбор оптимального варианта с точки зрения соотношения1 материальных и временных затрат.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка генетических конструкций, оптимизированных для экспрессии чИФН-0!-2Ь в E.coli и N. benthamiana

2. Получение продуцентов на основе E.colinN. benthamiana

3. Изучение эффективности экспрессии в каждом из продуцентов

4. Разработка технологий очистки целевого продукта

5. Изучение противовирусной активности рекомбинантных белков, полученных из разных продуцентов

6. Изучение противоопухолевой активности- рекомбинантных белков, полученных из разных продуцентов /

7. Сравнение двух систем экспрессии по нескольким параметрам: эффективность экспрессии, качество; очистки, активность полученного продукта, материальные и временные затраты на получения субстанции.

Научная новизна исследования:

1. Впервые разработана технология получения ИФН-се-2Ь из растительного продуцента, дающего возможность дешевого промышленного производства терапевтического белка

2. Впервые разработана технология восстановления активности чИФН-о:-2Ь на аффинной колонке, позволяющей значительно повысить выход биологически активного белка, полученного из бактериального продуцента

3. Впервые проведены сравнительные исследования влияния полигистидинового домена на эффективность экспрессии рекомбинантного белка в бактериальной системе экспрессии

4. Впервые в рамках одной работы проведено сравнение процессов продукции чИФН-а-2Ь в бактериальных продуцентах и в растительной биомассе, которое дает основание утверждать, что разработанная технология получения чИФН-а-2Ь из растительного продуцента на основе КЬепЖатгапа более перспективна для дальнейшего масштабирования.