Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Альтернативные системы экспрессии рекомбинантного ИФН-α-2b человека

На правах рукописи

КОСОБОКОВА Екатерина Николаевна

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИФН-а-2Ь ЧЕЛОВЕКА

14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 СЕН 2011

Москва-2011

4853258

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников кандидат биологических наук, B.C. Косоруков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе доктор биологических наук, Т.М. Соколова

Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена

Защита состоится » 2011 г. в\ \ часов на заседании диссертационного

совета Д.001.017.01 Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан ¿О -К* 011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Препараты интерферона-а-2Ь человека (чИФН-а-2Ь) нашли широкое применение в медицине в качестве противовирусных и иммуномодулирующих лекарственных средств. ВОЗ рекомендует препараты ИФН для профилактики и лечения гриппа. Клинические исследования показали лечебный эффект в виде уменьшения клинических проявлений заболевания, сокращения сроков заболевания и снижения количества осложнений в 2-4 раза. Другое направление, в котором препараты ИФН занимают ведущие позиции - это терапия хронических вирусных гепатитов. При успешном лечении происходит резкое ограничение репликации вируса, что позволяет предотвратить прогрессирование патологического процесса и развитие гепатоклеточной карциномы.

Активно изучается использование чИФН-а-2Ь при лечении некоторых онкологических заболеваний, в первую очередь хронический миелолейкоза, Т-клеточной лимфомы кожи, множественной миеломы, злокачественной меланомы и рака почки. Существующие на фармацевтическом рынке препараты имеют показания к применению не только этих, но и ряда других онкозаболеваний как доброкачественной, так и злокачественной природы. Несмотря на это они редко назначаются пациентам с соответствующим диагнозом. Это связано с тем, что зарубежные препараты недоступны для многих больных в силу ряда причин (высокая стоимость, недостаточное количество или полное отсутствие на отечественном рынке), а российские аналоги показали себя как менее эффективные. В рамках государственной программы импортозамещения разработка технологии получения высокоэффективного препарата чИФН-а-2Ь, позволяющей снизить себестоимость субстанции, является на сегодняшний день актуальной.

Одним из направлений современной биотехнологии является оптимизация уже существующих процессов получения рекомбинантных белков. С этой целью в данном исследовании проведена работа по оптимизации разработанной ранее технологии получения рекомбинантных белков из бактериальных клеток.

Другим актуальным направлением является создание принципиально новых продуцентов, позволяющих получить субстанцию с характеристиками и свойствами, отсутствующими у белков, полученных традиционными способами. В настоящее время основными продуцентами для получения терапевтически значимых белков являются бактериальные или дрожжевые культуры, которые не обеспечивают проведения посттрансляционных модификаций, характерных для человека. Предполагают, что именно это является причиной образования антител против ИФН и сопутствующего снижения эффективности интерферонотерапии при длительном использовании препаратов этого цитокина в процессе лечения таких серьезных

заболеваний как гепатит и рак почки. Поэтому одним из направлений данной работы стало создание растительного продуцента Nicotiana benthamiana, экспрессирующего рекомбинантный чИФН-а-2Ь и обеспечивающего проведение постгрансляционных модификаций, характерных для человека.

Цель работы - создание бактериального (Escherichia coli) и растительного (Nicotiana benthamiana) продуцентов интерферона-а-2Ь человека (чИФН-а-2Ь), сравнение их эффективности и выбор оптимального варианта с точки зрения соотношения материальных и временных затрат.

Задачи исследования.

1. Разработка генетических конструкций, оптимизированных для экспрессии чИФН-а-2Ь в E.coli и N.benthamiana,

2. Получение продуцентов на основе Е. coli и N. benthamiana,

3. Изучение эффективности экспрессии в каждом из продуцентов,

4. Разработка технологий очистки целевого продукта,

5. Изучение противовирусной активности рекомбинантных белков, полученных из разных продуцентов,

6. Изучение противоопухолевой активности рекомбинантных белков, полученных из разных продуцентов,

7. Сравнение двух систем экспрессии по следующим параметрам: эффективность экспрессии, качество очистки, активность полученного продукта, материальные и временные затраты на получения субстанции.

Научная новизна исследования.

1. Впервые разработана технология получения чИФН-а-2Ь из растительного продуцента, дающая возможность дешевого промышленного производства терапевтического белка;

2. Впервые разработана технология восстановления активности чИФН-а-2Ь на аффинной колонке, позволяющая значительно повысить выход биологически активного белка, полученного из бактериального продуцента;

3. Впервые проведены сравнительные исследования влияния полигистидинового домена на эффективность экспрессии рекомбинантного белка в бактериальной системе экспрессии;

4. Впервые в рамках одной работы проведено сравнение процессов продукции чИФН-а-2Ь в бактериальных продуцентах и в растительной биомассе, которое дает основание утверждать, что разработанная технология получения чИФН-а-2Ь из растительного продуцента на основе N. benthamiana более перспективна для дальнейшего масштабирования.

Практическая значимость исследования. Оптимизация отдельных процессов в технологии получения рекомбинантных белков из бактериальных культур клеток позволит снизить себестоимость конечного продукта. Разработанная технология восстановления нативной посттрансляционной конформации чИФН-а-2Ь (а, соответственно, и его активности) непосредственно на аффинной колонке обеспечит снижение себестоимости субстанции на 1020%, благодаря значительному уменьшению объемов используемых растворов и сокращению количества стадий. Такой подход может быть интересен руководителям производства с отработанной технологией получения белков с использованием бактериальных продуцентов, т.к. изменения в технологическом процессе будут минимальными и не потребуют дополнительного оборудования.

С другой стороны, наиболее интересны принципиально новые подходы, которые при серьезных первоначальных вложениях обеспечат значительное преимущество в дальнейшем. Именно такую возможность предоставляет разработанная технология получения биологически активного рекомбинантного чИФН-а-2Ь с использованием растительного продуцента.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы прошла 9 декабря 2010 года на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории лучевых методов лечения, лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов, лаборатории химии природных соединений, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармакологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Материалы работы были представлены на VI съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006 г.), на конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России» (Москва, 2007 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008 г.), на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва -Пущино, 2008 г.), на Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, 2008 г.), на Пятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы» (Москва, 2009 г.), на международной конференции для студентов "The Coins 2009" (Вильнюс, Литва, 2009 г.), на XXII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010 г.), на конференции «Первые международные беккеровские чтения» (Волгоград, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, описания

перспектив применения разработанных технологий, выводов и списка использованной литературы, включающего 176 библиографических источника, в том числе 161 на иностранном языке. Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Данная глава посвящена вопросам актуальности тематики диссертационной работы. Сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данной главе автор описывает современное состояние научных исследований. Даны общие сведения об ИФН (история открытия, классификация, структура интерферонов), изложен механизм действия, описаны биологические эффекты и клиническое применение существующих препаратов, а также способы получения интерферонов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и культуры клеток

Основные манипуляции для клонирования векторов проводили в штамме Е.соИ (Ш5а. Для изучения экспрессии полученных конструкций в Е.соП использовали штамм ВЬ21 (БЕЗ), в N.ЬемЬат'шпа- А%гоЬасХепит Ште/аЫет вУ-3101.

Для изучения противовирусного действия полученных белков использовали культуру перевиваемых диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (линия ЛЭЧ- 977 11 пассаж, Медико-генетический центр РАМН, Москва).

Противоопухолевую активность изучали на адгезионных культурах клеток меланомы человека линии те1Ког.

Получение бактериального продуцента чИФН-а-2Ь

Ген чИФН-а-2Ь был искусственно синтезирован на основе синтетической последовательности, разработанной автором с учетом частоты встречаемости кодонов в геноме Е.соИ. С целью изучения влияния полигистидинового домена на эффективность экспрессии и проведение очистки при помощи аффинной хроматографии в генетическую конструкцию была введена последовательность, кодирующая полигистидиновый домен (бШз), с использованием метода ПЦР-мутагенеза со специфическими праймерами. Для обеспечения возможности удаления белкового остатка аффинного домена бИв в процессе очистки целевого белка в генетической конструкции между последовательностями вШэ-домена и чИФН-а-2Ь был запланирован сайт гидролиза энтеропептидазой.

Структуры полученных плазмид подтверждали секвенированием (Евроген, Москва).

6

Полученными плазмидами трансформировали клетки E.coli штамм BL 21 (DE3), культуры наращивали в течение ночи. Индукцию белка осуществляли добавлением IPTG. Для изучения эффективности экспрессии отбирали пробы для проведения электрофореза в полиакриламидном геле и Вестерн-блот анализа. Для количественной оценки экспрессии целевого белка проводили сравнение интенсивности полос на электрофореграмме при помощи программы GeneTools (Syngene, США).

Выделение и очистку белка проводили в несколько этапов. Лизирование бактериальной биомассы проводили в присутствии лизоцима. Полученный лизат центрифугировали. Осадок отмывали в 4 этапа, постепенно увеличивая концентрацию мочевины до 4М. Полученный в конечном итоге отмытый осадок на 80-85% состоял из агрегатов целевого продукта в виде телец включения (ТВ). Отмытые и растворенные в присутствии гуанидин гидрохлорида ТВ наносили на аффинную колонку с никелевым сорбентом. Согласно разработанной методике рефолдинг чИФН-а-2Ь проводили непосредственно на аффинной колонке, постепенно снижая концентрации гуанидин гидрохлорида с 6М до 0,5М в присутствии окислительно-восстановительных агентов (глутатиона окисленного и восстановленного). Целевой продукт элюировали буферным раствором, содержащим 150 мМ имидазола. Удаление гистидинового участка проводили при помощи легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP), произведенную в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН [Gasparian et al., 2003]. После этого проводили повторную хроматографию на Ni2+-NTA-arapo3e.

Получение растительного продуцента ч11ФН-а-2Ь

Ген чИФН-а-2Ь был искусственно синтезирован на основе последовательности, построенной с учетом частоты встречаемости кодонов ДНК в геноме N.bentamiana. Между аффинным доменом 6His и сайтом гидролиза энтеропептидазой в конструкцию был введен нейтральный полилинкер, состоящий из простых линейных аминокислот, не образующих жестких структур, способствующий более эффективному гидролизу целевого сайта энтеропептидазой. С целью сравнения эффективности экспрессии использовали вирусные векторы, в которых экспрессия рекомбинантного белка регулируется разными промоторами (35S и Act2).

Полученными плазмидами трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens, штамм GV3101, культуры наращивали в течение ночи. Для введения агробактерий в листовую пластинку использовали метод агроинъекции, то есть инфильтрации листовой пластинки растения N.benthamiana суспензией агробактерий при помощи шприца без иглы. После инфильтрации растения выращивали под биолампами с долготой дня 16 часов при 22°С и влажности 60%.

На пятые сутки после заражения листья собирали, удаляли центральные крупные жилки, биомассу взвешивали, растирали в фарфоровой ступке в присутствии жидкого азота. Белок экстрагировали в течение часа при комнатной температуре. Далее экстракт фильтровали последовательно через двойной слой предфильтра Miracloth (Merck, Германия), через фильтр с размером пор 1,2 мкм и 0,45 мкм (Whatman, Англия). Отфильтрованный экстракт наносили на аффинную колонку с никелевым сорбентом. Целевой продукт элюировали буферным раствором, содержащим 150 мМ имидазола. Удаление гистидинового участка проводили также как в случае белка, полученного в E.coli.

Определение биологической активности рекомбинантных белков, полученных разными способами

Изучение противовирусной активности. Использована стандартная международная методика изучения биологической активности чИФН-а.

Противовирусную активность образцов препаратов ИФН-а-2Ь определяли общепринятым микрометодом в 96-луночной планшете с культурой перевиваемых диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (линия ЛЭЧ- 977 11 пассаж, Медико-генетический центр РАМН, Москва) по подавлению цитопатогенного действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита (ЭМК) [Meager, 2002]. В лунки с монослоем клеток, выращенном в течение 48 ч в питательной среде ДМЕМ с L-глютамином, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко) и гентамицином, вносили 2-х кратные разведения исследуемых препаратов в объёме 100 мкл. Каждый образец исследовали повторно в 2-х лунках в 2-х независимых определениях. Клетки инкубировали с разведениями ИФН 24 часа при 37°С в атмосфере СО2. В лунки вносили 100 мкл вируса в дозе 100 ЦПД50, которая вызывала 100% гибель клеток в контроле через 20 часов инкубации при 37°С. Оценку ЦПД вируса в лунках с разведениями ИФН проводили в световом инвертированном микроскопе (Meiji Techno, Япония). Титр ИФН рассчитали как обратную величину разведения ИФН, подавляющего ЦПД вируса в 50% клеточного монослоя.

Изучение противоопухолевой активности. Использована оценка цитотоксического действия МТТ-тестом.

Метод основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5- дифенилтетразолий бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, нерастворимые в воде. Количество образовавшегося формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках и может являться критерием степени их чувствительности к противоопухолевому воздействию химиопрепаратов.

В исследовании использовали адгезионные культуры клеток меланомы человека линии melKor (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва). Клетки культивировали в среде RPMI-1640,

содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, водорастворимые витамины, аминокислоты, пируват натрия, L-глутамин, ЮмМ HEPES и антибиотики, pH 7,3, при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пассированием культуры через каждые 2-3 дня.

Для регистрации результатов исследования использовали плоскодонные 96-луночные планшеты. В каждую лунку помещали по 4 тыс. клеток (200 мкл среды). Через 24-48 часов к ним добавляли ИФН в различных концентрациях. Отрицательным контролем служили интактные клетки, которые находились в тех же условиях, но в отсутствии ИФН. В качестве положительного контроля использовали препарат Реаферон-ЕС (Россия). Помимо этого проводили контроль буфера, в котором была растворена субстанция. Результаты регистрировали через 24 и 48 часов. Для этого в лунки добавляли по 20 мкл МТТ-красителя. После образования формазана планшеты центрифугировали при 2000 оборотах/минуту 7-10 минут, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметисульфоксида (DMSO). Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при температуре 37°С. Затем планшеты встряхивали на шейкере, после этого интенсивность окрашивания среды измеряли на ридере Biotrak II (Amersham, США) при длине волны 530 нм.

Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Процент живых клеток вычисляли по формуле:

Nj х Ю0% N°= —N5-■

где No - процент живых клеток; Nj - средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат; N2 - средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки.

Статистическая обработка результатов Статистический анализ проводили с использованием программы Microsoft Excel, использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение чИФН-а-2Ь из бактериального продуцента

В результате генно-инженерных манипуляций получили три рекомбинантные плазмиды, содержащие гены чИФН-а-2Ь (рис. 1):

1. рЕ126-60 (содержит ген чИФН-а-2Ь, клонированный в плазмиду рЕТ26),

2. рЕМ26 (содержит ген чИФН-а-2Ь-6№б, клонированный в плазмиду рЕТ2б),

3. рЕМ28 (содержит ген чИФН-а-2Ь-12№8 клонированный в плазмиду рЕТ28).

Ndel Xhol

сайт гадропиэа

Ndel Xhol

Рисунок 1. Ппазмидные векторы, использованные для экспрессии чИФН-а-2Ь в E.coli.

Для определения времени максимального накопления целевого белка в бактериальных клетках и оптимальных условий культивирования был проведен сравнительный анализ содержания белка через 4, 5, 6, 7, 8, 12 и 24 часа в экспериментах с использованием разных концентраций IPTG. Было установлено, что содержание ИФН достигает своего максимума через 7 часов индукции, при концентрации индуктора 0,5 мМ.

Полученные гибридные конструкции находятся под контролем сильного вирусного Т7 промотора и lac оператора, что позволяет достигать высокого уровня экспрессии в E.coli и обеспечивает надежную регуляцию транскрипции. После индукции клетки штамма E.coli BL21(DE3), содержащие плазмиды рЕ126-60, рЕМ26, и рЕМ28, продуцировали рекомбинантные белки размером приблизительно 18,5 кДа, 19,5 кДа и 20,5 кДа соответственно (рис.2). Такой результат соответствовал ожиданиям и явился дополнительным подтверждением корректности полученных конструкций.

Результаты работы показали, что наличие полигистидинового домена на N-конце последовательности значительно увеличивает уровень экспрессии рекомбинантного ИФН-а-2Ь человека. При этом увеличение длины аффинной последовательности до 12His на N-конце несколько снижает ее (рис. 2: 3, 4, 5), В целом рекомбинантные белки, содержащие

10

полигистидиновую систему, при оптимальных условиях составляют более 30% всех белков клетки.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 2. А - Анализ продуктов экспрессии в ПААГ (Электрофореграмма), Б - Идентификация чИФН-а-2Ь при помощи Вестерн-блот анализа. Маркер молекулярного веса (дорожка I). Положительный контроль чИФН-а-2Ь (дорожка 2). Лизат клеток ВЬ21(ОЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-12Шз (дорожка 3). Лизат клеток ВЬ21(ЭЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-6Н1$ (дорожка 4). Лизат клеток ВЬ21(йЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ъ (дорожка 5). Отрицательный контроль - лизат клеток ВЬ21(ОЕЗ) без рекомбинантной плазмиды (дорожка 6).

В процессе экспрессии целевой белок практически полностью агрегировался в виде телец включения (ТВ) и частичная очистка от бактериальных белков проходила уже на этапе центрифугирования культуральных лизатов: целевой белок полностью оставался в осадке (рис. 3:4,7, 10).

123456789 10

Рисунок 3. Электрофореграмма проб, полученных в результате центрифугирования лизатов бактериальных клеток. Лизат клеток ВЬ21(Т)ЕЗ) без рекомбинантной плазмиды (дорожка 1). Лизат (дорожка 2), супернатант (дорожка 3) и осадок (дорожка 4) после центрифугирования лизата клеток ВЬ21(йЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь. Лизат (дорожка 5), супернатант (дорожка 6) и осадок (дорожка 7) после центрифугирования лизата клеток ВЬ21(ОЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-6№э. Лизат (дорожка 8), супернатант (дорожка 9) и осадок (дорожка 10) после центрифугирования лизата клеток ВЬ21(ОЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-12Ш$. Стрелки на электрофореграмме указывают на положение целевого белка.

ЙФН в виде ТВ плохо растворим, что сделало возможным проведение предварительной стадии очистки, путем отмывки телец включения. В ходе работы мы выяснили, что для чИФН-а-2Ь и чИФН-а-2Ь-12Н1з необходимо пересмотреть состав буферов в сторону уменьшения концентрации мочевины до 2М, т.к. часть целевого белка терялась. С другой стороны, эта стадия необходима для чИФН-а-2Ь-6Н15, т.к. в последующем это увеличивает эффективность связывания белка с сорбентом и качество отмывки от белков бактериальной клетки. Чистота рекомбинантного белка после отмывки ТВ составляет около 80% (рис. 4: 7).

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 4. Электрофореграмма проб, полученных в результате отмывки чИФН-а-2Ь-бтв. Лизат клеток ВЬ21 (БЕЗ), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-6Ш$ (дорожка I). Супернатант после центрифугирования лизата (дорожка 2). Последовательные отмывки телец включения (дорожка 3 -6). Отмытые тельца включения (дорожка 7). ИФН-а-2Ь~6Н1з после очистки на .\7" колонке (дорожка 8). Стрелка на электрофореграмме указывает на положение целевого белка.

Благодаря наличию в составе гибридного целевого белка аффинного домена, обладающего выраженным сродством к №2+-сефарозе, стало возможным использование на последующем этапе очистки аффинной хроматографии. После нанесения растворенных ТВ на колонку была собрана фракция несвязавшихся с сорбентом белков, с целью оценки эффективности сорбции целевого белка на колонку. Было показано, что чИФН-а-2Ь-6№8 полностью связывается с №2+-сефарозой, а основная часть бактериальных белков не задерживается на колонке (рис. 5: 2).

12 3 4

Рисунок 5. Электрофореграмма элюатов, полученных после нанесения отмытых телец включения на колонку. Отмытые тельца включения ИФН-а-2Ь-6Шз, наносимые на колонку (дорожка I). Белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом (дорожка 2). Элюция целевого белка, первая фракция (дорожка 3). Элюция целевого белка, вторая фракция (дорожка 4).

После проведения серии отмывок был нанесен элюирующий буфер, посредством которого происходит разрушение связи между аффинным доменом и никелевым сорбентом. Элюаты собирали и оценивали при помощи ПААГ-электрофореза. Результаты свидетельствуют о том, что конечный продукт очищен более, чем на 90% (рис. 4: 8, рис. 5: 3,4).

Для восстановления нативной пространственной конформации белка, а, следовательно, и его активности, проводили рефолдинг. С целью подбора условий и состава буферных растворов процесс осуществляли до нанесения белка на аффинную колонку. Максимальные результаты (порядка 70% рефолдированного белка) были получены при разведении растворенных и очищенных ТВ буферным раствором с 0,5М Ь-аргинином и инкубировании в течение ночи при +4°С.

При перенесении процесса рефолдинга на аффинную колонку без изменения состава буферных растворов наблюдали отсутствие связывания целевого белка с аффинным сорбентом. В ходе работы было установлено, что даже низкие концентрации Ь-аргинина вызывают разрыв связи между полигистидиновым доменом и №2+-сефарозой (рис. 6)

1 2 3 4 5

Рисунок 6. Анализ влияния L-аргинина на связь полигистадинового домена с Ni2*сефарозой (Электрофореграмма). После нанесения на аффинную колонку чНФН-а-2Ь-6Н1^ продукт элюировали растворами содержащими разную концентрацию L-аргинина: 50мМ (дорожка 1), 1 ООмМ (дорожка 2), 200мМ (дорожкаЗ), 300 мМ (дорожка4), 500мМ (дорожка 5),

При снижении концентрации L-аргинина до 100 мМ получили порядка 10-20% рефолдированного белка, при полном удалении этого компонента из раствора процент рефолдированного белка был ниже 10.

С целью увеличения количества восстановленного белка проводили градиентный рефолдинг на аффинной колонке. Такой подход обеспечивал эффективность рефолдинга до 7080% (рис. 7: 4-7). Следует отметить, что для 4HOH-o-2b-12His процент восстановления конформации белка был несколько ниже (60-70%). Объяснить это можно размерами аффинного домена (12 His), образующего конформационно более жесткую структуру, мешающую правильному сворачиванию белка. Такой результат является достаточно высоким по сравнению с литературными данными (40-50%) и более чем интересным с точки зрения его использования для разработки производственных технологий очистки рекомбинантных белков и интерферона человека, в частности.

123456789

116 66,2 45,0 35,0

25,0

18,4 14,4

Рисунок 7. Анализ проб, полученных в результате проведения градиентного рефолдинга чИФН-а-2Ъ-бНк на аффинной колонке в присутствии окислительно-восстановительных агентов. Стандарт молекулярной массы белков (дорожка 1). Нанесение на аффинную колонку отмытых ТВ (дорожка 2). Белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом (дорожка 3). Последовательные элюаты рефолдированного чИФН-а-2Ь-6Шя (дорожки 4-7). Последовательные элюаты нерефолдированного чИФН-а-2Ь-6Н1я (дорожки 8-9).

На заключительном этапе проводили расщепление гибридного белка легкой цепью энтерокиназы (L-HEP) с целью удаления полигистидинового домена (6 His и 12 His). Эффективность гидролиза гибридного белка в случае 4H<I>H-a-2b-6His составила порядка 50%, в случае 4HOH-a-2b-12His - 40% (рис. 8: 3, 5).

12 3 4 5

25,0 |

18,4 14,4

Рисунок 8. Электрофореграмма, иллюстрирующая результат гидролиза Ь-НЕР. Стандарт молекулярной массы белков (дорожка 1), чИФН-а-2Ь-6№з до гидролиза Ь-НЕР (дорожка 2), чИФН-а-2Ь-6Н1э после гидролиза Ь-НЕР (дорожка 3), контроль: чИФН-а-2Ь без полигистидинового домена (дорожка 4), чИФН-а-2Ь-12Н1$ после гидролиза Ь-НЕР (дорожка 5).

В соответствии с литературными данными возможно было получить более высокие результаты (80-90%). Невысокую эффективность гидролиза мы объясняем отсутствием в генетической конструкции нейтрального полилинкера между полигистидиновой последовательностью и сайтом отрезания энтерокиназой. Такой участок, состоящий из простых линейных аминокислот, не образующих жестких структур, является конформационно гибким и позволяет крупной молекуле энтерокиназы без помех подойти к сайту гидролиза.

При переносе процесса гидролиза гибридного белка энтерокиназой на аффинную колонку наблюдали неспецифическое разрезание рекомбинантного белка параллельно со снижением специфической активности (рис. 9).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 9. Электрофореграмма, иллюстрирующая результат гидролиза Ь-НЕР на аффинной колонке. А - Удаление полигистидинового домена (6Н1з) от рекомбинантного чИФН-а-2Ь-6Н1в: через I, 2, 3, 4, 5, 6 и 24 часа работы Ь-НЕР (дорожки 2-8 соответственно), отрицательный контроль - без внесения Ь-НЕР (дорожка ]), положительный контроль - чИФН-а-2Ь без домена (дорожка 9). Б - Удаление

полигистидинового домена (¡2His) от рекомбинантного 4M<PH-a-2b-12His: через 3, 5, 6 и 24 часа работы L-HEP, отрицательный контроль - без внесения L-HEP (дорожка 1).

Получение чИФН-а-2Ь путем экспрессии в растениях

В ходе работы с конструкциями для экспрессии в бактериальном продуценте были выявлены недочеты в генетической конструкции. Так, по предположению автора, отсутствие полилинкера между полигистидиновым доменом и сайтом гидролиза энтеропептидазой сказывалось отрицательным образом на эффективности работы L-HEP и способствовало неспецифическому расщепления гибридного белка на аффинной колонке. С учетом накопленных данных автором были разработаны конструкции чИФН-а-2Ь для получения белка из растительного продуцента. Ген чИФН-а-2Ь был искусственно синтезирован на основе последовательности, построенной с учетом частоты встречаемости кодирующих кодонов ДНК в геноме N.bentamiana (рис. 10). На краевых участках гена чИФН-а-2Ь были введены сайты гидролиза эндонуклеазами NdeJ и Xhol, необходимые для последующего переклонирования кодирующего фрагмента в экспрессионные векторы. Для удаления полигистидиновой последовательности после очистки целевого белка в генетическую конструкцию между 6His-доменом и чИФН-а-2Ь был введен сайт расщепления энтеропептидазой. Согласно литературным данным и предшествующим работам автора данного исследования эффективность работы энтеропептидазы зависит от способности крупной молекулы фермента подойти к сайту гидролиза. Между сайтом расщепления энтеропептидазой и полигистидиновым доменом был введен нейтральный полилинкер. Такой участок, состоящий из простых линейных аминокислот, не образующих жестких структур, является конформационно гибким "хвостом", позволяющим крупной молекуле энтерокиназы без помех подойти к сайту гидролиза. Для удобства манипулирования конструкциями гены были клонированы в Т-вектор. Структура полученных плазмид подтверждена секвенированием (Евроген, Москва).

Синтезированный фрагмент 4Í-K№-a-2b-6His

coate gat cat cat cac cat cat cac ggt gga ggt gga fecg gat gat gac gat aga tgt gat ctt cet caa act cat tct ctt ggt tct aga agg act ctt atg ctt ttg get caa atg aga agg att tct ctt ttt tct tgt ctt aag gat aga cat gat ttt ggt ttt cct caa gaa ggt aat caa ttt caa aag get gaa act att cct gtt ctt cat gaa atg att caa cag att ttt aat ctt ttt tct act aag gat tct tct get gca tgg gat gaa act ctt ttg gat aag ttt tat act gaa ctt tat caa cag ctt aat gat ctt gaa get tgt gtt att caa ggt gtt ggt gtt act gaa act cct ctt atg aag gaa gat tct att ctt get gtt aga aag tat ttt caa aga att act ctt tat ctt aag gaa aaa aag tat tct cet tgt get tgg gaa gtt gtt aga get gaa att atg aga tct ttt tct ctt tct act aat ctt caa gaa tct ctt aga tct aag gaa tga ctcgagctgcag

Рисунок 10. Генетические последовательности, кодирующие чИФН-а-2Ь. cat cat cac cat cat cac -HisTag, ggt gga ggt gga - нейтральный полилинкер, gat gat gac gat ug§ - сайт расщипления энтеропептидазой, ccatgg - сайт рестрикции Ncol, ctcgag - сайт рестрикции Xhol, ctgcag - сайт рестрикции PstI, - сайт рестрикции EcoR I

Для получения экспреесионных плазмид Т-вектор, содержащий последовательность гена 4HOH-a-2b-6His, был подвергнут рестрикции по сайтам Ncol и Xhol. Короткий фрагмент размером 551 был выделен из геля после проведения электрофоретического разделения и лигирован в 2 экспреесионных вектора. В первом случае использовался один из наиболее популярных векторов на основе вируса мозаики цветной капусты (CaHV), в котором ген целевого белка находится под контролем сильного 35S промотора (рис. II).

рА9387

I—| 35S Proms-—j^sGFP (inü

Рестрикция по сайтам Ncol-Xhol

Лигирование фрагмента: pT-IFNplJNco//Xho/ (515,563) в вектор рА9387INcol/Xhol (5000 bp) LB

L-[35s Prom>■-jiw>H-a-2bj—SsTem|—^

pA-IFN-S

Рисунок 11. Схема конструирования плазмиды pA-IFN-S для экспрессии 400H-a-2b-6His. LB (left border) и RB (right border) - левая и правая границы Т-ДНК соответственно. sGFP (intron) -некодирующая область зеленого флюоресцентного белка (green fluorescent protein), mRFP - красный флюоресцентный белок, 35S Prom - промотор 3SS, 35S term - терминатор 35S.

В соответствии с литературными данными и ранее проведенными автором исследованиями для достижения высокого уровня экспрессии рекомбинантного гена, находящегося под контролем 35S промотора, необходимо, чтобы целевой белок отличался высокой стабильностью, что было продемонстрировано на GFP (зеленый флюоресцирующий белок).

С целью сравнения эффективности экспрессии был использован ранее полученный и зарекомендовавший себя как высоко продуктивный вектор, содержащий гены полимеразы TVCV, транспортного белка, ген тяжелой цепи антитела Her2/neu. Т.к. для переклонирования фрагмента, кодирующего целевой белок, были введены сайты Ncol и Xhol, а в базовом векторе содержалось 2 сайта Ncol, вырезающие функционально значимый участок, для создания экспрессионной конструкции проводили комбинированное клонирование, представленное на рис. 12.

Лигирование фрагментов: pA11455/EcoR//Nco/(175bp), pT-IFNpl/Nco//X/ra/ (515,563) в вектор pA11520IEcoRI/Xhol (15000 bp)

Рисунок 12. Схема конструирования плазмиды pA-lFN-A для экспрессии 4pl0H-a-2b-6His. LB (lefi border) и RB (right border) - левая и правая границы Т-ДНК соответственно. Arab.Act2 - актиновый промотор, TVCV Polymerase - ген полимеразы вируса TVC, сгМР — ген транспортного белка крВТМ, Нег-АЬ-Н - ген тяжелой цепи моноклональных антител Her2neu, Tnos (terminator of nopaline synthase) -терминатор гена нопалинсинтазы.

Вся кассета транскрибировалась под контролем актинового промотора из A.thaliana и терминатора гена наполинсинтазы из A.tumefaciens.

Для доставки вирусных векторов в листья растений был использован метод агроинъекции с помощью культур клеток A.tumefaciens, предварительно трансформированный конструкциями pA-IFN-S и pA-IFN-A.

Для стимуляции продуктивности и повышения уровня экспрессии вирус-вектора pA-IFN-S опыты проводились в условиях совместной агроинъекции смесью агробактерий, несущих геном вирус-вектора и агробактерий, содержащих ген белка р19 из вируса карликовой кустистости томатов. Белок р19 является суппрессором противовирусной реакции клеток растения-хозяина - «умолкание генов» вирусной РНК. Эффект ингибирования достигается за счет способности белка р19 образовывать комплекс с короткими интерферирующими РНК, что блокирует систему передачи сигнала «умолкания генов». Поэтому агроинъекция гена pl9 позволяет повысить стабильность РНК вирус-вектора.

В случае с вектором, в котором ген целевого белка находится под контролем сильного актинового промотора Act2, нет необходимости в совместной агроинъекции.

Для определения времени максимального накопления рекомбинантного белка проводили сравнительный анализ содержания ИФН в зараженных листьях каждые 24 часа после агроинъекции. Установили, что содержание чИФН-а-2Ь достигает своего максимума на 5-ые

сутки, более длительное культивирование растений приводит к гибели зараженного листа. В процессе сравнения уровня экспрессии целевого продукта при использовании двух разных конструкций выяснили, что 358-промотор обеспечивает значительно более низкую продукцию чИФН-а-2Ь, чем АЛ2 (1 мг растворимого чИФН-а-2Ь на 1 кг сырой зеленой массы - в первом случае и до 200 мг растворимого белка на 1 кг сырой зеленой массы - во втором).

Благодаря наличию аффинного домена, обладающего сродством к никелевому сорбенту, возможно было использование аффинной хроматографии для очищения целевого продукта. Однако наши исследования показали, что эффективность сорбции рекомбинантного белка на аффинную колонку увеличивается после проведения предварительной очистки, заключающейся в центрифугировании и фильтровании через предфильтр и фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Для оценки экспрессии и эффективности очистки использовали метод вертикального электрофореза ПААГ с додецилсульфатом натрия. Идентификацию целевого продукта проводили при помощи Вестерн-блот анализа (рис. 13).

1 2 3 4 5

Рисунок 13. Анализ экспрессии и эффективности очистки чИФН-а-2Ь, полученного из растительного продуцента. А - Электрофореграмма, Б - Вестерн-блот анализ. Стрелкой отмечены белковые полосы, соответствующие чИФН-а-2Ь-бН1в; звездочкой - предполагаемые димеры чИФН-а-2Ь-6Н1з. Экстракт листьев, содержащих чИФН-а-2Ь-6Н1я (дорожка 1), Растительные белки, не связавшиеся с М*'+-сефарозой (дорожка 2), Сорбент после элюции целевого белка (дорожка 3), Элюат целевого белка (дорожка 4), Контроль: чИФН-а-2Ь без полигистидинового домена (дорожка 5).

На заключительном этапе проводили удаление полигистидинового домена при помощи гидролиза энтеропептидазой. В работе использовали легкую цепь Ь-НЕР, произведенную в

19

лаборатории инженерии белка ИБХ РАН. Эффективность гидролиза составила порядка 50% (рис. 14).

Рисунок 14. Электрофореграмма проб, полученных в результате подбора условий работы Ь-НЕР. 1-6 -результаты работы Ь-НЕР разной концентрации (5,0; 2,5; 1,2; 0,6; 0,3; 0 ед. Ь-НЕР/мг белка). 7 -Контроль: чИФН-а-2Ь (без полигистидинового домена).

Определение биологической активности рекомбинантных белков, полученных разными способами

Противовирусная активность

С целью сравнения полученных препаратов было проведено несколько экспериментов по изучению противовирусной активности полученных белков. Использовался стандартный метод для ИФН-а, основанный на изучении подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита (ЭМК). Результаты представлены в таблице 1.

Препарат Активность, МЕ/мг белка Активность после хранения при 10°С в течение 7 дней в буфере I

чИФН-а-2Ь-6Ш5 (бактериальный) 2 х 107 1,6 х Ю5

чИФН-а-2Ь-12Н18 (бактериальный) 107 3,2 х 105

чИФН-а-2Ь-6Н15 (растительный) 2 х Ю5 3,2 х Ю4

Стандарт 2,4 х Ю8 —

Таблица \ . Противовирусная активность чИФН-а-2Ь, полученных в данной работе.

Данные этих исследований свидетельствуют о высокой активности чИФН-а-2Ь во всех вариантах и дают основание утверждать, что использованные методы очистки не приводят к потере противовирусной активности чИФН-а-2Ь. С целью изучения стабильности полученных рекомбинантных белков было проведено сравнение противовирусной активности через 7 суток

при хранении белка при 10°С в буфере, не содержащем стабилизирующих агентов (0,5М NaCl; 0,05М Tris; рН 7,00). На основании полученных результатов можно говорить о более высокой стабильности белка, полученного из растительного продуцента. Для длительного хранения белка был использован буфер следующего состава: 0,5М NaCl, 0,05М Tris, 0,1 М L-аргинин; рН 3,5-4,5. Повторные исследования после хранения препарата в этом буфере при -20°С в течение месяца показало сохранение его противовирусной активности.

Прямое противоопухолевое действие

В соответствии с литературными данными, интерфероны обладают прямым противоопухолевым действием. В связи с этим был проведен МТТ-тест на культурах опухолевых клеток человека линии melKor. Результаты исследований представлены на рисунке

15.

Все результаты нормированы по отношению к контролю для каждого эксперимента. Для отражения общей тенденции параметра была построена линия Тренда. Линия Тренда свидетельствует об общей тенденции увеличения эффекта (снижения количества живых клеток по сравнению с контролем) с увеличением концентрации. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии статистически значимого эффекта через 24 часа после инкубации опухолевых клеток с рекомбинантными белками, хотя и наблюдается незначительное снижение количества опухолевых клеток по сравнению с контролем (до 9095%). Увеличение времени инкубации приводит к возникновению циготоксического эффекта порядка 20% (рис. 16).

Через 24 часа после добавления интерферона

Через 48 часов после добавления интерферона

100% ■ 95% 90% 85% 80% 75% 70% 65% 60% 55% 50%

......♦:

. ♦

.......

20000

.Активность, МЕ

200 2000 Активность, ЫЕ

гч л

Л я ? а.

£ Р

© §

К ю

100% 95% 90% 85% 80% 75% 70% 65% 60% 55% 50%

500 5000 50000 .Активность. МЕ

100' 95 90% 85°Л 80' 75' 70% 65% 60% 55% 50%

1 * *' * и : ^

200 2000 .Активность. МЕ

20000

С Щ

й А

$ 4........

¡$4

50

Л Ж«

95%

411%

Х5%

80%

Л%

к 70%

* 65%

л

Л 55%

50%

500 5000

.Активность. МЕ

200

.Активность. МЕ

20000

20

200

2000

100% 95% 90% 85% 80% 75% 70% 65% 60% 55% 50%

20

.Активность, МЕ

200 2000 20000 Активность. МЕ

Рисунок 15. Изучение прямого противоопухолевого действия различных концентраций чИФН-а-2Ъ на клетки линии те1Ког. В качестве контроля использовали Реаферои-ЕС.

Рисунок 16. Результат действия интерферона, полученного разными способами, на клетки melKor в МТТ-тесте через 24 и 48 часов. 1 - 4M0H-a2b-6His (бактериальный), 2 - 4H0H-a2b-12His (бактериальный), 3 - 4H0H-a2b-6His (растительный), 4 - чИФН-а2Ь (стандарт).

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ РАЗРАБОТАННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Разработанная технология восстановления нативной посттрансляционной конформации чИФН-а-2Ь (а соответственно и его активности) непосредственно на аффинной колонке снижает себестоимость субстанции на 10-20%. Такой подход может быть интересен руководителям производства с отработанной технологией получения белков с использованием бактериальных продуцентов, т.к. изменения в техническом процессе будут минимальными и не потребуют дополнительного оборудования.

С другой стороны, для инвесторов наиболее интересны существенно новые подходы, которые при серьезных первоначальных вложениях обеспечат значительное преимущество в дальнейшем. Именно такую возможность предоставляет разработанная технология получения биологически активного рекомбинантного чИФН-а-2Ь с использованием растительного продуцента.

ВЫВОДЫ

• Получены высокоэффективные продуценты интерферона-а-2Ь человека на основе E.coli. Показано, что наличие полигистидинового домена на N-конце последовательности в 3-5 раз увеличивает уровень экспрессии рекомбинантного интерферона-а-2Ь человека.

• Проведено сравнение генетических конструкций, оптимизированных для экспрессии в E.coli, которое позволило установить, что в отношении уровня экспрессии и

эффективности очистки оптимальна конструкция с шестью гистидиновыми остатками на N-конце гибридного белка интерферона человека.

• Разработана технология восстановления конформации и биологической активности интерферона-о-2Ь человека, позволяющая в 2-3 раза повысить выход биологически активного белка, полученного из бактериального продуцента.

• Разработаны провирусные векторы для продукции рекомбинантного цитокина интерферона-а-2Ь человека в листьях N.benthamicma и установлено, что наиболее эффективна конструкция, в которой ген целевого белка находится под контролем Act2.

• Показано, что синтезированный в разных продуцентах рекомбинантный интерферон-а-2Ь человека обладает противовирусной активностью, свойственной природным аналогам. Интерферон-а-2Ь человека, полученный из растительного продуцента обладает большей стабильностью.

• Полученные в разных продуцентах интерфероны-а-2Ь человека обладают цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеточным линиям melKor.

• Установлено, что уровень цитотоксического эффекта возрастает с увеличением концентрации и/или длительности инкубации опухолевых клеток с полученными рекомбинантными белками.

• Проведено сравнение процессов продукции интерферона-а-2Ь человека в бактериальных продуцентах и в растительной биомассе, на основании которого можно утверждать, что разработанная технология получения чИФН-а-2Ь из растительного продуцента на основе N.benthamiana более перспективна для дальнейшего масштабирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оптимизация процесса получения рекомбинантного интерферона альфа-2б // Материалы VI съезда онкологов и радиологов СНГ, г. Баку, 28 сентября - 1 октября 2006 - С. 298. (Авторы: Кособокова E.H., Косоруков B.C.).

2. Исследование иммуностимулирующей активности рекомбинантного интерферона альфа 2Ь человека при вакцинации кроликов // Сборник материалов конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства и кролиководства России» Москва, 8 июня 2007 - С.209-216. (Авторы: Кособокова E.H., Скрыпник К.А., Косоруков B.C.).

3. Получение субстанции белка рекомбинантного интерферона альфа2б на основе технологии слитных белков // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008. Российский Биотерапевтический Журнал - 2008 - Т.7, №1. - С. 44 - 45. (Авторы: Кособокова Е.Н., Косоруков B.C.).

4. Сравнение уровня экспрессии и эффективности очистки рекомбинантного ИФН-а-2Ь человека с полигистидиновой системой и без нее // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва - Пущино, 21-24 октября 2008 года-С. 51. (Авторы: Кособокова Е.Н.).

5. Оптимизация метода получения высокоочищенного ИФН-а-2Ь // Материалы XII Российского Онкологического Конгресса, Москва, 18-20 ноября 2008 года. - С. 215. (Авторы: Кособокова Е.Н.).

6. Разработка метода получения высокоочищенного рефолдированного ИФН-а-2Ь человека // Материалы Пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы», часть 1 Москва, 16-20 марта 2009 года -С. 154. (Авторы: КособоковаЕ.Н., Косоруков B.C.).

7. Development of a method of production of highly purified refolded human IFN-a-2b // International conférence for studionts of Nature Science "The Coins 2009". Vilnius, 21-25 April 2009 - P. 47. (Kosobokova E.N., Kosorukov V.S.).

8. Разработка метода получения высокоочищенного рефолдированного ИФН-а-2Ь человека // Сборник тезисов докладов XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 811 февраля 2010 года - С. -103. (Авторы: Кособокова Е.Н., Косоруков B.C.).

9. Проблемы эффективности работы энтеропептидазы в процессе получения высокоочищенного рефолдированного чИФН-а-2Ь // Сборник научных трудов по материалам конференции «Первые международные бекксровские чтения» Волгоград, 2729 мая 2010 года, Т.И - С. 125-127. (Авторы: Кособокова Е.Н., Косоруков B.C.).

10. Исследование влияния поли-His доменов на уровень экспрессии и эффективность очистки Интерферона-а-2Ь человека // Российский биотерапевтический журнал. - 2010 -№ 4. - С. 107-112. (Авторы: Кособокова Е.Н., Косоруков B.C.).

11. Интерфероны в онкологии//Врач. - 2010 - № 11.-С. 18 - 21. (Авторы: Кособокова Е.Н., Косоруков B.C.).

Заказ № 109-а/08/2011 Подписано в печать 28.07.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 (/ с/г. ги; е-таИ:т/о@с/г. ги