Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПРИ СЕЛЕКТИВНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭМБРИОНОВ И КОМПЛЕКСНОЙ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ГАМЕТ

На правах рукописи

005052160

КРАСНОЩОКА Ольга Евгеньевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПРИ СЕЛЕКТИВНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭМБРИОНОВ И КОМПЛЕКСНОЙ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ОЦЕНКЕ ГАМЕТ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 АПР 2013

Москва - 2013

005052160

Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории молекулярно-генетических методов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Смольникова Вероника Юрьевна

Научный консультант:

доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Официальные оппоненты:

Назаренко Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО «Московский областной НИИ акушерства и гинекологии», главный научный сотрудник отделения репродуктологии

Серебренникова Клара Георгиевна — доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, профессор кафедры семейной медицины

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «21» мая 2013 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.125.01 при Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова по адресу: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федеоании.

Автореферат разослан

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Улучшение репродуктивного здоровья является стратегической задачей здравоохранения России (Г.Т.Сухих, Л.В.Адамян, 2012). В настоящее время модернизируются подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар, стремительно развивается изучение молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации процесса репродукции человека. Совершенствование метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ), развитие его новых направлений способствуют повышению эффективности лечения бесплодия (Н.Е.Русанова, 2010; M.Brandes, 2010).

Применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) привело к увеличению доли многоплодных беременностей (C.M.Magli, 2008). Учитывая данные об осложнениях, связанных с многоплодием, отмечается тенденция к снижению количества переносимых эмбрионов в циклах ЭКО (В.И.Краснопольский, 2009; Т.А.Назаренко, 2010; U.B.Wennerholm, 2009). Согласно данным мониторинга за ВРТ европейского общества по репродукции человека и эмбриологии (EIM ESHRE), во многих странах внедряется стратегия селективного переноса одного эмбриона (elective single embryo transfer, eSET) (J.de Mouzon, 2010; A.Maheshwari et al., 2011).

Одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ является выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом (О.Л.Тишкевич, 2007). По мнению L.Scott, качество эмбриона определяется состоянием гамет. В процессе фолликулогенеза происходит взаимодействие ооцита с окружающими клетками через ряд регуляторных молекул - цитокинов, факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов (К.Г.Серебренникова, 2010; F.Cillo, 2007; P.Feuerstein, 2007; O.Guzeloglu-Kayisli et al., 2009). Изменение биоактивности сателлитных клеток влияет на качество ооцита и дальнейшее развитие эмбриона (T.Adriaenssens, 2010; Z.Huang, D.Wells, 2010).

Процессы раннего эмбрионального развития прежде рассматривались исключительно с позиции перехода от ооцита к эмбриону (oocyte-to-embryo transition), а сперматозоиду отводилась роль доставки дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) (Y.J.Menezo, 2006; J.-P.Dadoune, 2009). Позднее были получены данные о функциональной значимости спер-мальных матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК) для раннего эмбриогенеза (M.Depa-Martynöw et al., 2007; T.C.Douglas, 2010). Существуют данные о том, что нарушение функции протаминов, осуществляющих организацию спермального хроматина и обеспечивающих взаимодействие материнского и отцовского геномов, влияет на раннее развитие эмбриона (D.Miller et al., 2010). Немаловажным для программ ЭКО и ПЭ является пенетраци-онная способность сперматозоида, зависимая от спермальных белков семейства фертили-нов, или ADAM (a disintegrin and metalloprotease domain) (S.A.Krawetz et al., 2007).

Принимая во внимание то, что разработка и внедрение персонифицированных и не-инвазивных методов диагностики при лечении бесплодия является актуальным, необходимо определить и научно обосновать значение молекулярно-генетических методов для совокупной с морфометрическими данными комплексной оценки гамет, формирующих

эмбрион, изучить эффективность и целесообразность селективного переноса одного эмбриона в программе ЭКО.

Таким образом, целью настоящего исследования явилась оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения с учетом морфологических и молекулярно-генетических характеристик гамет при селективном переносе эмбрионов.

Задачи исследования

1. Провести сравнение клинико-анамнестических данных у пациенток при селективном переносе одного эмбриона, переносе единственного эмбриона и переносе двух эмбрионов.

2. Провести сравнительную характеристику циклов стимуляции суперовуляции у исследуемых групп больных по параметрам фолликулогенеза, стероидогенеза и раннего эмбриогенеза.

3. Проанализировать эффективность реализации программы ЭКО и ПЭ у пациенток с селективным переносом одного эмбриона, переносом единственного эмбриона и переносом двух эмбрионов по частоте имплантации, наступления беременности, многоплодных беременностей и самопроизвольных выкидышей.

4. На основании определения профиля экспрессии мРНК генов факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов, молекул НЬА-О в клетках фолликулярной жидкости и протаминов и фертилина-Р в сперме разработать математические модели прогнозирования исходов ЭКО и ПЭ.

5. Разработать практические рекомендации (алгоритм) по стратегии переноса эмбрионов в полость матки на основании комплексной оценки качества гамет и эмбрионов при применении молекулярно-генетических методов исследования фолликулярной жидкости и спермы.

Научная новизна

На основании проведенного исследования определена эффективность лечения бесплодия при использовании селективного переноса одного эмбриона в сравнении с переносом единственного эмбриона и переносом двух эмбрионов. Представлена и научно обоснована целесообразность применения селективного переноса одного эмбриона женщинам до 35 лет с нормальным овариальным резервом, наличием не более 2-х неудачных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе при фертильной или субфертильной сперме супруга. Показатели имплантации, наступления беременности у этих пациенток сравнимы с аналогичными при переносе двух эмбрионов при общем снижении частоты многоплодной беременности в 10 раз по сравнению с переносом двух эмбрионов.

Впервые определены роль и место молекулярно-генетических методов исследования при проведении комплексной оценки качества гамет в программе ЭКО и ПЭ. На основании изучения уровня экспрессии мРНК факторов роста, про- и антиапоптотических, ферментов, молекул НЬА-в в клетках фолликулярной жидкости, протаминов и фертилина-Р в сперме выявлена их значимость в исходах ЭКО и ПЭ.

Практическая значимость

В результате проведенной работы на основании комплексной оценки качества гамет и эмбрионов при применении молекулярно-генетических методов исследования фолликулярной жидкости и спермы в программах ВРТ разработан алгоритм стратегии переноса эмбрионов в полость матки.

На основании данных молекулярно-генетического исследования фолликулярной жидкости, спермы в день трансвагинальной пункции яичников предложены способы прогнозирования наступления или отсутствия беременности в результате проведения программы ЭКО и ПЭ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эффективность реализации программы ЭКО при селективном переносе одного эмбриона в полость матки сравнима с таковой при переносе двух эмбрионов у пациенток в возрасте до 35 лет с трубно-перитонеальным и/или мужским фактором бесплодия, имеющих нормальный овариальный резерв, не более двух неэффективных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, фертильную и/или субфертильную сперму супруга.

2. Наибольшую значимость для прогнозирования исхода ЭКО и ПЭ имеет комплексное определение уровня экспрессии мРНК факторов роста AREG, EREG, IGF-1, IGFBP-4, антиапоптотического фактора BIRC-5 в клетках фолликулярной жидкости, ADAM-2, соотношения уровня экспрессии мРНК PRM-2.PRM-1 в сперме в день ТВП. Неблагоприятный прогноз программ ВРТ ассоциирован с уменьшением экспрессии мРНК генов ADAM-2, PRM-1 и PRM-2.

3. Для индивидуального определения стратегии переноса эмбрионов в полость матки при проведении программы ЭКО и ПЭ необходима комплексная оценка гамет по морфометрическим и молекулярно-генетическим характеристикам в сочетании с данными о морфологических характеристиках эмбриона. «Благоприятный» прогноз позволяет произвести селективный перенос одного эмбриона, «неблагоприятный» - двух.

4. Исследование молекулярно-генетических характеристик гамет по профилю экспрессии мРНК факторов роста, про- и антиапоптотических факторов, ферментов, молекул HLA-G, экспрессируемых клетками фолликулярной жидкости, спермальных факторов позволяет на основании разработанных математических моделей с диагностической эффективностью более 80% осуществить прогнозирование наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ.

Личный вклад автора

Автором проводилось обследование, лечение методом ЭКО и ПЭ пациентов, вошедших в исследование, выполнялся забор биологического материала, осуществлялось участие в постановке проб на лабораторном этапе, обобщение, систематизация, статистический анализ и публикация полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01-«акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют обла-

сти исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на IV международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011), V Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2011), XXI Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2011), Российско-швейцарском Медицинском форуме (Москва, 2011), цикле семинаров повышения квалификации врачей «Репродуктивная медицина» (Москва, 2012), научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее ВРТ (памяти профессора Б.В.Леонова)» (Москва, 2013), The 4th International IVI Congress «Reproductive medicine and beyond» (Valencia, Spain, 2011), The 14th World Congress on Human Reproduction (Melbourne, Australia, 2011), The 1st Biomarker Meeting in Reproductive medicine: emergence of a new field «The Ovary, Gametes, Embryo and Endometrium» (Valencia, Spain, 2012).

Апробация диссертации проведена на межклинической конференции 22 ноября 2012 г. и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 03 декабря 2012 г., протокол № 17.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Материалы работы используются для практических занятий и лекций со слушателями семинаров Центра, аспирантами и клиническими ординаторами.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в т.ч. 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК России.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 186 страницах текста, содержит 27 рисунков, 32 таблицы. Библиографический указатель содержит 303 источника, из них 47 отечественных и 256 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Для выполнения цели исследования и поставленных задач проводилось изучение эффективности реализации программы ЭКО в зависимости от количества перенесенных эмбрионов у 150 супружеских пар в 155 циклах стимуляции суперовуляции в группах в зависимости от возможности выбора эмбриона.

Основную группу составили 43 женщины, которым производился селективный перенос одного эмбриона в 45 циклах стимуляции суперовуляции (группа eSET).

Группу сравнения № 1 составили 47 пациенток, которым проводилось 49 циклов стимуляции суперовуляции с переносом единственного эмбриона, полученного в результате ЭКО (группа cSET).

Группу сравнения № 2 составили 60 пациенток, которым проводился 61 цикл стимуляции суперовуляции с переносом двух эмбрионов (группа PET).

Все супружеские пары были обследованы в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 26 февраля 2003 г. № 67. "О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия", не имели противопоказаний для проведения ЭКО и ПЭ и отвечали основным критериям включения в исследование: трубно-перитонеальный и/или мужской фактор бесплодия; возраст женщин до 35 лет; нормальный или высокий овариальный резерв; не более двух неэффективных попыток ЭКО/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) в анамнезе; отсутствие патологии эндометрия по данным ультразвукового исследования (УЗИ); миомы матки больших размеров, наружного генитального эндометриоза выше II стадии распространения, синдрома поликистозных яичников, тяжелых соматических заболеваний, представляющих угрозу течению беременности и родов; наличие не менее одного эмбриона, пригодного для переноса в полость матки; фертильной или субфертильной спермы супруга, информированного письменного согласия на участие в исследовании.

Использовались следующие методы исследования: общеклинические (сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотры); стандартный спектр лабораторных исследований выполняли перед программой ЭКО и ПЭ (клинический, биохимический анализ крови, исследование системы гемостаза). У супругов пациенток дважды проводилась оценка спер-мограммы по нормативам ВОЗ, 2010г.: перед началом программы ЭКО и ПЭ и в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП). Гормональное обследование включало определение в сыворотке крови ФСГ, ЛГ, Е2, АМГ перед началом стимуляции и в день ТВП. Эхография органов малого таза при проведении программы ЭКО заключалась в определении положения, размеров матки, яичников перед началом введения гонадотропинов и в процессе стимуляции суперовуляции. Специальные методы исследования включали применение метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для определения профиля экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, GREM-1, HBEGF, IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, LIF, UFR), проапоптотиче-ских факторов {ВАХ, TNF-a) и ингибиторов апоптоза (BCL-2, BIRC-5), регуляторных ферментов (СОХ-2, HAS-2), молекул HLA-G1 и HLA-G5 в клетках 104 образцов фолликулярной жидкости, аспирированных из каждого фолликула, с промывкой иглы после каждого фолликула, в индивидуальные маркированные пробирки без гепарина в соответствии с номером перенесенного эмбриона. Учитывая то, что клеточный состав фолликулярной жидкости преимущественно (на 75%) представлен гранулезными клетками, в настоящей работе в качестве метода выделения клеток фолликулярной жидкости использовалось центрифугирование образцов фолликулярной жидкости при 6000 об/мин в течение 10 минут с последующим применением промывочных буферных растворов, что позволило снизить контаминацию клетками крови образцов фолликулярной жидкости. После центрифугирования в асептических условиях производилось ресуспендирование полученных клеток в 300 мкл ЗмМ раствора гуанидинтиоционата для сохранения РНК, замораживание и хранение при температуре -80°С до начала исследования. Далее выполнялось выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) методом фенольной депротеинизации с последующим осаждением РНК

изопропанолом в присутствии соосадителя и отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составлял 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставили в объеме 40 мкл (для реакции брали 33 мкл образца РНК) в течение 30 минут при температуре 40°С с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95 °С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ и с целью предотвращения деградации ДНК копии ДНК (кДНК) разводили в 5 раз в ТЕ-буфере (Tris (гидрокиметилами-нометан) и Этилендиаминтетрауксусная кислота). Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были подобраны с учетом структуры генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и референсных генов. Реакции амплификации целевых и референсных генов ставили в разных пробирках в двух повторах. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт» с применением парафина. Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°С 30 сек, 94°С 1 мин; 50 циклов -94°С 10 сек, 64°С 20 сек, использовали прибор «ДТ-964» производства ООО «НПО ДНК-Технология». Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°С. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных циклов (ДДСц) с нормировкой на экспрессию референсных генов и значение медианы (Me) в группе успешного исхода программы ВРТ.

Аналогично описанной методике при помощи ОТ-ПЦР проводилось изучение уровня экспрессии мРНК генов протаминов (PRM-1, PRM-2), фертилина-ß (ADAM-2) в 79 образцах спермы, полученных в день ТВП и использованных для оплодотворения. Изучение молекулярно-генетического профиля образцов фолликулярной жидкости и спермы проводилось в лаборатории молекулярно-генетических методов (руководитель лаборатории мо-лекулярно-генетических методов д.б.н. Д.Ю. Трофимов).

Анализ результатов ОТ-ПЦР проводился в зависимости от исхода программы ЭКО. К I группе, составившей группу контроля, были отнесены пациенты с благополучным результатом лечения бесплодия - рождением здорового ребенка (п=24). Среди II группы неуспешного завершения ЭКО и ПЭ было выделено три подгруппы. У пациентов IIa группы в результате применения ВРТ наступила беременность, но закончилась самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков (до 11 недель) (п=13). Группу IIb составили пациенты с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными, при которой на 14 день после переноса эмбрионов уровень ß-субъединицы хориони-ческого гонадотропина (ß-ХГ) составлял не менее 30 мМЕ/мл, т.н. «преэмбрионические потери» (п=24). К Ile группе были отнесены женщины с отрицательным результатом, у которых уровень ß-ХГ был менее 20 мМЕ/мл (п=43).

На эмбриологическом этапе ЭКО проводилась оценка качества ооцитов в соответствии с адаптированной по L.L.Veeck (2005) классификацией клиники Boum Hall. При оценке качества дробящихся эмбрионов на день переноса была произведена градация эмбрионов на 4 класса по количеству бластомеров, соотношению их размеров и степени фрагментации. К группе эмбрионов 1(А) класса относили эмбрионы, имеющие на 3 сутки дробления более 8 бластомеров или находящиеся на стадии морулы с правильной формой бластомеров и отсутствием безъядерных фрагментов. Эмбрионами 2 (В) класса считались

эмбрионы, имеющие 6-8 бластомеров на 3 сутки дробления и/или эмбрионы с неравными бластомерами и/или фрагментами цитоплазмы, занимающими не более 10% объема. Эмбрионы, имеющие более 4, но менее 6 бластомеров на 3 сутки дробления и/или эмбрионы с фрагментацией 10-50%; представляли группу 3 (С) класса. К группе эмбрионов 4 (D) класса относились эмбрионы, имеющие менее 4 бластомеров на 3 сутки дробления и/или с фрагментацией более 50%. Для бластоцист применялась классификация D.K.Gardner и W.B.Schoolcraft (1999). Эмбрионами «хорошего» качества на 3 сутки после оплодотворения считались находящиеся на уровне 1 (А) и 2 (В), на 5 сутки - достигшие стадии бласто-цисты, имеющие примерно 150-200 клеток, компактную внутреннюю клеточную массу и хорошо структурированную трофэктодерму (III и выше стадия по классификации D.K.Gardner, W.B.Schoolcraft, 1999).

Расчет объема выборки проводился в соответствии с руководством по медицинской статистике J.M.Bland (2000). Статистический анализ результатов проводился с использованием пакета прикладных программ «SPSS» v. 17, «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc (США). Применялись различные виды дисперсионного, регрессионного, корреляционного, факторного, дискриминантного анализа. Статистически значимыми считали отличия при р<0,05, максимально значимыми при р<0,01.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

При анализе клинико-анамнестических данных было выявлено, что пациентки статистически значимо не различались по возрасту, соматическому статусу, характеристике менструального цикла, частоте и структуре перенесенных гинекологических заболеваний, репродуктивной функции. Средний возраст пациенток составил 29,9±0,3лет. Сравнительная характеристика клинико-анамнестических данных супружеских пар представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнительный анализ клинико-анамнестических данных обследованных супружеских пар*_____

Параметр Группа eSET(n=43) Группа cSET(n=47) Группа DET(n=60) Всего (п=150)

Средний возраст пациенток, лет (М±т) 29,9± 0,5 30,6 ± 0,5 29,8 ±0,5 29,9±0,3

Вес, кг (М±га) 61,6 ±1,1 61,4±3,2 62,7±1,0 62,1±6,4

Рост, см (М±т) 164,0±0,8 167,0±2,0 166,0±0,7 165,2±4,6

ИМТ, кг/м2(М±т) 22,4±0,4 21,7±1,3 22,3±0,4 22,3±2,3

Средняя длительность бесплодия, лет (М±га) 5,9±0,7 6,8±0,7 6,4±0,7 6,3±0,8

Бесплодие, п (%): - первичное - вторичное 25 (58,1) 18(41,9) 25 (53,1) 22 (46,9) 43 (71,7) 17(28,3) 93 (62,0) 57 (38,0)

Количество циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, (М±т) 1,2±0,1 1,2±0,2 1,2±0,1 1,2±0Д

Средний возраст супругов пациенток, лет (М±т) 33,2± 0,9 32,4 ± 0,6 33,0 ±0,7 33,0 ±0,5

Нормозооспермия, п (%) 20 (46,6) 16(34,0) 35 (58,4) 71 (47,4)

Патозооспермия, п (%) 23(53,4) 31(65,9) 25(41,6) 79(52,6)

Примечание. * - Различия между исследуемыми параметрами статистически не значимы (р >0,05)

Характерным для менструальных циклов обследуемых пациенток было своевременное менархе в 88,7 % случаев и регулярный менструальный цикл на момент обследования у 100% женщин.

Первичное бесплодие превалировало над вторичным в среднем в 1,6 раз. У каждой третьей пациентки (31,6%) с вторичным бесплодием в анамнезе отмечены искусственные аборты. Осложненное течение беременности в анамнезе в виде самопроизвольного выкидыша имели 18 (12%) женщин, трубную беременность в анамнезе - 19 (12,7%). Анализ гинекологической заболеваемости выявил, что наиболее часто диагностируемым гинекологическим заболеванием явился хронический сальпингоофорит, отмеченный в анамнезе в 46%. Инфекции передающиеся половым путем ранее перенесла каждая четвертая (26,9%) из числа обследованных женщин.

Отмечена высокая частота лапароскопических вмешательств на органах малого таза (54,6%) среди обследованных женщин Длительность бесплодия статистически не различалась между группами и составляла в среднем 6,3±0,8 лет. Среди причин бесплодия труб-но-перитонеальный фактор отмечен в 85 % случаев, мужской фактор - в 50%, бесплодие сочетанного генеза - в 37 % случаев Среднее количество неэффективных циклов ЭКО у обследованных пациенток составило 1,2±0,1.

В программе ЭКО и ПЭ применялись три варианта стимуляции суперовуляции: протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ) у 82 женщин; «короткий» протокол с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) у 35; «длинный» протокол с предварительной десенситизацией гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы с использованием препаратов аГнРГ у 38. Распределение протоколов носило равномерный характер и не различалось статистически значимо между группами.

Триггером финального созревания ооцитов являлся препарат хорионического гонадо-тропина (ХГ), доза которого составляла 8000-10000 МЕ, в зависимости от количества доминантных фолликулов. Через 35-36 часов после введения ХГ проводили ТВП.

При стимуляции суперовуляции оценивались длительность стимуляции, стартовые и суммарные дозы вводимых препаратов. Характер распределения полученных величин не являлся нормальным, поэтому применялся непараметрический метод анализа по критерию Круаскала-Уоллиса. Длительность стимуляции суперовуляции составляла 10-11 дней и не различалась статистически между группами (р=0,218). Медиана овуляторной дозы ХГ во всех группах составляла 9000 МЕ (р=0,243). Толщина эндометрия в день введения триггера овуляции в среднем была не менее 10 мм и не различалась между группами (р=0,084). Особенности проведения стимуляции суперовуляции представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Основные показатели стимуляции суперовуляции, Ме (25-75% квартили)_____

Оцениваемые параметры Группа eSET (n=4S) Группа cSET (n=49) Группа DET (п=61) р-value

Стартовая доза препарата рФСГ (МЕ) 150(137,5-150) 175 (137,5-206,3) 150(150-150) 0,158

Длительность введения препарата рФСГ (дни) 10(10-11) И (10-11) 11 (10-11) 0,218

Суммарная доза препарата рФСГ (МЕ) 1125 (993,7-1275) 1350 (1156,3-1743,8) 1200 (1125-1275) 0,110

Овуляторная доза ХГ (МЕ) 9000 (8000-10000) 9000 (8750-10000) 9000 (8000-9750) 0,243

Толщина эндометрия в день введения ХГ (мм) 11 (10,4-11) 10 (9,6-10,5) 11 (10,4-11) 0,084

10,2

10

□ Среднее количество фолликулов в день введения

8,5 7.2 _ 7,9* 8 6;8 □ вреднее количество

5,5 5.5 ооцитов

■ ■ □ Среднее количество зрелых

Д- 1 ,8*|* "5** ооцитов(МП)

■ Среднее количество

оплодотворенных ооцитов

в eSET cSET DET

Рисунок 1 - Сравнительная характеристика фолликуло- и оогенеза * - отличия от основной группы eSET статистически значимы (р <0,05); ** - (р <0,01)

Представленные на рисунке 1 данные по параметрам фолликуло- и оогенеза демонстрируют хороший ответ на стимуляцию суперовуляции во всех группах. Отмечалось статистически значимое снижение количества фолликулов в день введения ХГ и ооцитов, в т.ч. стадии МИ в день ТВП, в группе cSET относительно остальных групп. Данная ситуация, очевидно, связана с наличием т.н. «пустых» фолликулов, т.е. с отсутствием ооцита в фолликулярном аспирате (N.Desai, 2009, L.Matos, 2009). Большинство (80%) полученных ооцитов во всех группах были зрелыми (находились на стадии мейоза II (МП)). Количество незрелых и дегенеративных ооцитов не различалось между группами.

С целью изучения ответной реакции яичников при проведении стимуляции суперовуляции проводилось определение уровней ФСГ, ЛГ, Е2 и АМГ перед началом стимуляции суперовуляции и в день проведения ТВП. Гормональное исследование проводилось в научно-диагностической лаборатории (руководитель лаборатории - д.м.н. Т.Ю.Иванец).

Динамика концентрации ФСГ в крови пациенток всех групп статистически не различалась. Перед проведением ТВП было отмечено снижение уровня ЛГ во всех группах, при этом в группах сравнения это снижение статистически не значимо (р>0,05). Стимуляция суперовуляции сопровождалась значительным повышением уровня Е2, что являлось отражением эндокринной активности гранулезных клеток растущих фолликулов. Во всех группах было отмечено снижение уровня АМГ в ответ на стимуляцию фолликулогенеза, однако оно не было статистически значимым (таблица 3).

Таблица 3 - Динамика уровней ФСГ, ЛГ, Е2 и АМГ в сыворотке крови в процессе

Гормон Группа eSET (п=45) Группа cSET (п=49) Группа DET (п=61)

Дни исследования

1 2 1 2 1 2

ЛГ (МЕ/л) 5,5±0,4 0,7±0,2 4,0±0,7 0,5±0,1 5,5±0,8 1,8±0,7

ФСГ (МЕ/л) 7,3±0,6 7,7±1,4 6,3±1,1 5,6±3,4 7,2±0,4 7,8±0,9

Е2 (пмоль/л) 96,3±25,5 4819,0±323,8 105,3±10,6 3176,0±378,5** р=0,008 123,2±27,9 3725,3±21,6

АМГ (нг/мл) 2,5±0,6 2,2±0,3 1,9±0,3 1,7±0,3 2,0±0,6 1,8±0,4

Примечания. - 1 - Перед стимуляцией суперовуляции; 2 - в день ТВП; ** - отличия от основной группы еБЕТ статистически максимально значимы (р <0,01)

Таким образом, при исходно равных показателях, характеризующих овариальный резерв, изменение показателей гонадотропных гормонов, Е2, АМГ в ответ на стимуляцию су-

11

перовуляции, может свидетельствовать о различной чувствительности рецепторов яичников к экзогенно вводимым гонадотропинам у пациенток.

Оплодотворение проводилось методами стандартного ЭКО (п=72) или с помощью ИКСИ (п=83) (при наличии отклонений спермограммы в день ТВП от нормы по критериям ВОЗ, 2010г.) в равной доле в группах (р=0,833). Метод оплодотворения не оказывал статистически значимого влияния на формирование бластоцисты (отношение шансов (ОШ) 0,7, 95% ДИ 0,2-3,4, р=0,646), наступление клинической беременности (ОШ 1,8, 95% ДИ 0,9-3,9, р=0,118), самопроизвольное прерывание беременности (ОШ 1,2, 95% ДИ 0,4-3,8, р=0,791). Проводилось индивидуальное культивирование эмбрионов. Параметры раннего эмбриогенеза представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Особенности раннего эмбриогенеза у женщин исследуемых групп

Оцениваемые параметры Группа eSET (п=45) Группа cSET (п-49) Группа DET (п=61)

Среднее количество эмбрионов на стадии 2-ух пронукпеусов, М±т 5,5±0,4 1,3±0,2**,р<0,0001 5,5±0,3

Частота оплодотворения, % 76,4 72,2 80,9

Среднее количество эмбрионов «хорошего» качества, М±т 3,9±0,3 1,2±0,1**,р<0,0001 4,0±0,2

1(А)класс 43 (95,6) 26 (53,0)**, р<0,0001 47 (77,0)

2 (В)класс 2 (4,4) 8 (17,4) 10(16,4)

3 (С)класс 0 5 (10,2)*, р=0,032 2(3,3)

4 (D)класс 0 10 (20,4)**, р<0,0001 2 (3,3)

Частота дробления, % 70,9 76,9 72,7

Количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, М±т 2,1 ±0,4 0,2±0,1**,р<0,0001 0,8±0,2**,р<0,0001

Частота формирования бластоцисты, % 53,9 16,7*, р=0,044 27,5*, р=0,002

Криоконсервация оставшихся эмбрионов «хорошег о» качества, п (%) 27 (62,8) 0**, р<0,0001 18 (30,0)**, р=0,003

Количество криоконсервированных эмбрионов, М±т (%) 1,5±0,3 (38,5) 0* р=0,011 0,3±0,09** (7,5), р=0,001

Примечания. * - Отличия от основной группы eSET статистически значимы (р<0,05); ** - р <0,01

В группе eSET осуществлялся перенос одной бластоцисты на 5 сутки. В группе cSET вынужденный перенос одного эмбриона осуществлялся на 3 сутки культивирования, в 9(18,4%) случаях был произведен перенос единственной бластоцисты. В половине циклов в группе DET 34 (55,7%) одновременно были перенесены два эмбриона на 3 сутки дробления. В связи с достаточным количеством эмбрионов «хорошего» качества 20(32,8%) женщинам группы DET был осуществлен т.н. двойной перенос, т.е. на 3 и 5 дни культивирования, 7(11,5%) произведен одновременный перенос двух бластоцист. После переноса эмбрионов в полость матки производилась медикаментозная гормональная поддержка пост-трансферного периода с применением одного из препаратов натурального прогестерона.

На основании бинарной логистической регрессии рассчитано уравнение для оценки коэффициента z: z= -1,846 + 1,390 х (наличие бластоцисты) (1)

Подстановка значения z в уравнение: р = 1Je-z (2)

позволила рассчитать вероятность наступления клинической беременности р (при наличии

бластоцисты р=0,38, при отсутствии - р=0,13). Был проведен ROC-анализ данной модели с оценкой площади под кривой (area under curve, AUC), которая составила 0,667 (95% доверительный интервал (ДИ) 0,568-0,766), р=0,002, что свидетельствует об удовлетворительной прогностической ценности модели (рисунок 2). Превышение значения функции р, равного 0,26 в точке отсечения (cut-off) позволяет с чувствительностью 68,4% и специфичностью 65,0% прогнозировать с диагностической точностью 75,5% наступление беременности у супружеских пар в программе ЭКО и ПЭ при наличии бластоцисты.

Конечная эффективность лечения бесплодия оценивалась по частоте наступления беременности на перенос эмбрионов, которая в целом составила 34,2%. Проводилась оценка частоты имплантации, наступления беременности (ЧНБ), развития многоплодной беременности (ЧМБ), самопроизвольного прерывания беременности, показателя BESST (Birth Emphasizing Successful Singleton at Term), который подтверждает своевременное завершение одноплодной беременности рождением здорового ребенка (J.K.Min, 2004). В группе eSET в результате проведения программы ЭКО и ПЭ своевременно родилось 14 здоровых детей, показатель BESST составил 31,1% в расчете на начатый цикл и был статистически значимо выше аналогичного показателя в группе cSET, где в результате 49 циклов ЭКО и ПЭ в срок родилось 4 ребенка (8,2%) (р=0,009). Значимых межгрупповых различий по показателю BESST между группами eSET и DET не было выявлено. Для группы DET данный показатель составил 18,0% (11/61), что согласуется с данными литературы (D.K.Gardner et al., 2009; D.Glujovsky, 2012) (таблица 5).

Таблица 5 - Эффективность проведения ЭКО и ПЭ у обследованных групп, п (%)

Показатель Группа eSET (п=43) Группа cSET (п=47) Группа DET (п=60) Всего (п=150)

Количество циклов ЭКО и ПЭ, п 45 49 61 155

Биохимические беременности 29 (64,4) 10(20,4)**,р<0,001 35 (57,4) 74 (47,7)

Частота имплантации 21 (46,7) 8 (16,3)**,р=0,001 28 (22,9)**,р=0,001 57 (36,8)

Клинические беременности 21 (46,7) 8 (16,3)*,р=0,003 24 (39,3) 53 (34,2)

Многоплодная беременность 0 0 4(16,7)*, р=0,03 4 (7,5)

Самопроизвольное прерывание беременности 4(19,0) 2 (25,0) 9 (37,5) 15 (28,3)

ВЕБЗТ 14(31,1) 4 (8,2)**,р=0,009 11 (18,0) 29(18,7)

Кривы« ROC

Рисунок 2 - ROC- кривая при прогнозировании наступления беременности по наличию

Примечания. * - Отличия от основной группы еБЕТ статистически значимы (р<0,05); ** - р <0,01

Анализ эффективности реализации репродуктивной функции, а также клинико-эмбриологических данных при проведении ЭКО и ПЭ у пациенток, имеющих относительно благоприятный прогноз наступления беременности, обосновал необходимость поиска новых подходов к диагностике и лечению бесплодия у данного контингента больных. Была изучена связь экспрессии мРНК генов факторов роста, апоптоза, ферментов, молекул НЬА-О

13

в клетках ФЖ с исходами программы ЭКО и ПЭ у супружеских пар с возможностью выбора эмбриона для переноса (таблицы 6, 7).

Таблица 6 - Сравнительный анализ профиля экспрессии генов факторов роста в клетках фолликулярной жидкости в зависимости от исхода программы ЭКО и ПЭ, Ме (25-75% квартили) ___

Ген Группа I Группа Па Группа IIb Группа Ile

Клиническая беременность, п=24 Самопроизвольное прерывание беременности, п=13 Биохимическая беременность, п-24 Беременность не наступила, п=43

A REG 1(0,7-1,4) 1,9 (0,9 - 3,5)*, р=0,023 1,5 (1,0 - 1,9)*, р=0,023 1,4 (0,9 - 2,2)*, р=0,023

EREG 1 (0,7 - 2,7) 0,9 (0,5-4,3) 1,9 (1,3-2,2)-, р=0,024 1,0 (0,6-1,9)

GREM-1 1 (0,5-1,6) 3,4 (0,4-6,1) 1,5(0,9-3,5), р=0,056 1,0 (0,4-5,7)

HBEGF 1 (0,7-1,4) 2,4(0,7-10,5)-, рг0,007 1,3 (1,0-1,9) 0,7 (0,9 - 2,2)

IGF-1 1 (0,5-4,5) 1,6 (0,8 - 2,5)',р=0,0283 1,2 (0,9- 1,8)',р=0,04 0,7 (0,4 - 1,3)

IGF-2 1 (0,5-2,1) 1,1 (0,5-3,4) 0,8 (0,5-1,6) 0,9 (0,3 - 1,7)

IGFBP-1 1 (0,7 - 2,4) 1 (0,3 - 2,8) 2,1 (1,3-3,8) 2,1 (0,7-4,3)

1GFBP-2 1 (0,7-1,2) 0,5(0,3-1,9) 0,9 (0,6 - 1,8) 0,9 (0,7-1,6)

IGFBP-3 1 (0,1-6,5) 4,6 (0,6-11,9) 1,9 (0,5-7, 8) 3 (0,1 - 13,3)

IGFBP-4 1 (0,5-1,5) 0,4 (0,2-1,4) 0,7(0,5-1,3) 0,6 (0,5-0,8), р= 0,0681

LIF 1 (0,6 - 2,9) 0,9 (0,3 - 3,3) 1,9(1,0-3,2) 1,3 (0,6-2,3)

UFR 1 (0,8-1,5) 1,0 (0,2-2,8) 1,4 (0,6-1,8) 1,8 (0,9-2,5)*, р=0,038

Примечания. * - Отличия от контрольной группы статистически значимы (р<0,05); • - отличия от группы с отрицательным исходом ЭКО и ПЭ статистически значимы (р<0,05)

Наиболее значимые различия по уровню экспрессии мРНК в ФЖ в зависимости от исхода ЭКО наблюдались в группе эпидермальных ростовых факторов - амфирегулина (АМЮ), эпирегулина (ЕЯЕО) и гепарин-связывающего подобного эпидермальному фактору роста (НВЕОР), опосредующих функционирование других факторов.

Таблица 7 — Сравнительный анализ профиля экспрессии генов про- и антиапопто-тических факторов, ферментов СОХ-2 и HAS-2, молекул HLA-G в клетках фолликулярной жидкости в зависимости от исхода программы ЭКО и ПЭ, Ме (25-75% квартили)

Ген Группа I Группа Па Группа IIb Группа Ile

Клиническая беременность, п=24 Самопроизвольное прерывание беременности, п=13 Биохимическая беременность, п=24 Беременность не наступила, п=43

BCL-2 1 (0,5 - 1,4) 1,1 (0,6-1,7) 1,1 (0,6- 1,9)',р=0,02 0,5 (0,3-1,2)

ВАХ 1 (0,6-1,8) 1,3 (0,9- 1,7)', р=0,0378 1,1 (0,8-1,9) 0,9 (0,6- 1,2)

BIRC-5 1 (0,6 - 1,8) 1,8(1,2-3,4)«, р=0,0396 1,6(1,4-3,8)*' р*= 0,0177, р'=0,005 0,9 (0,5-1,7)

TNF-a 1 (0,5 - 7,2) 1,3 (0,7-12,1) 1,1(0,5-4,2) 0,7 (0,4-4,1)

СОХ-2 1(0,7-1,7) 0,9 (0,5-1,3) 1,1 (0,7-1,6) 1,3 (0,7-1,7)

HAS-2 1 (0,5-1,6) 0,7 (0,3-1,3) 1,0 (0,7-1,9) 0,7 (0,4-1,4)

HLA-G1 1 (0 - 3,7) 4,9 (2,1-6,1)*' р*=0,029, р-= 0,0033 1,7(0,2-3,8) 0,8 (0,1 - 3,3)

HLA-G5 1 (0,4 - 3,6) 0,8 (0,5 - 39,9) 7,4(0,8-59,1)*' р*=0,025, р'= 0,013 0,8 (0,2 - 6,6)

Примечания. * - Отличия от контрольной группы статистически значимы (р<0,05); • - отличия от группы с отрицательным исходом ЭКО и ПЭ статистически значимы (р<0,05)

Преовуляторный сдвиг баланса регуляторных факторов в сторону медиаторов с проти-воапоптотической активностью (ВСЬ-2, ВШС-5) определяет эффективность имплантации эмбриона и, по-видимому, способствует дальнейшему развитию беременности, что также продемонстрировано работами В.ХУеПв, 2010, К.Бгщшга, 2010. Для группы ферментов статистически значимых различий по уровню экспрессии мРНК гена циклооксигеназы-2 (СОХ-2), отвечающей за синтез простагландинов и регулирующей функцию ростовых факторов и гиалурансинтазы-2 (НАБ-2), ответственной за синтез структурного матрикса внутри фолликула, в зависимости от исхода ЭКО и ПЭ выявлено не было (р>0,05). По мнению Я. Шхго, 2009, экспрессия мРНК молекул ПЬЛ-С материнскими клетками экранирует эмбрион до активации собственного генома и начала синтеза НЬА-О.

Данные анализа корреляционной зависимости экспрессии транскриптов изучаемых факторов во всех группах выявили значимую корреляционную связь средней или умеренной силы между показателями экспрессии мРНК НВЕСР и ГМ^-а (г5|р[=0,574, р=0,032, ^.113=0,609, р=0,047, гБрр ць=0,729, р=0,001, г8,р.„с=0,802, р<0,0001). Активация апоптоза через ТЫР-а приводит к усилению репарационных процессов, поддерживаемых мощным действием ростовых факторов, в т.ч. НВЕОР. Сильная положительная корреляция ВСЬ-2/ВАХ в группе II с неудачным исходом ЭКО и ПЭ (гё^ ц>0,6, р<0,05), отражает изменение баланса факторов программированной клеточной гибели в клетках ФЖ в регуляции финального созревания ооцита в сторону апоптоза, и синхронную с этим их противоапоптоти-ческую направленность функционирования. Резюмируя полученные данные, можно предположить, что клетки ФЖ участвуют в регуляции созревания ооцита посредством синтеза факторов роста, цитокинов с про- и антиапоптотической активностью, что согласуется с работами З.АвБои, 2008, 0.\¥еШ, 2010. Готовность ооцита поддерживать адекватную экспрессию генов в клетках ФЖ может являться механизмом, координирующим собственный потенциал развития.

На данном этапе также проводилось изучение образца спермы, полученной в день ТВП и использованной для оплодотворения, методом ОТ-ПЦР для выявления уровня экспрессии мРНК протаминов, фертилина-Р (таблица 8).

Таблица 8 - Сравнительный анализ уровня экспрессии генов протаминов и фертилина-Р в сперме в исследуемых группах, Ме (25-75% квартили) _

Ген Группа I Группа На Группа IIb Группа Пс

Клиническая беременность п=13 Самопроизвольное прерывание беременности, п=10 Биохимическая беременность, п=19 Беременность не наступила, п=37

ADAM-2 1,0 (0,6-4,0) 0,4 (0,4 - 0,5) 0,2 (0,1 -0,7)**, р=0,002 0,4(0,1 - 1,4)*, р=0,01

PRM-1 1,0 (0,7-1,6) 1,8 (0,4-3,0), 0,3 (0,1 -0,7)*, р=0,023 0,8(0,2-1,3)

PRM-2 1,0 (0,4-1,7) 0,8 (0,4-3,5) 0,1 (0,1 -0,6)**,р=0,01 0,5 (0,2 - 0,8)

PRM-2.PRM-1 1,0 (0,4-2,0) 1,9(1,1-3,9) 1,6 (0,7-6,5) 1,6(0,8-5,0)

Примечания. * - Отличия от рефереис-группы статистически значимы (р <0,05); ** - р <0,01

Полученные данные продемонстрировали значимость снижения экспрессии мРНК протаминов и фертилина-Р при неудачных исходах ЭКО и ПЭ. Нами также был проведен

анализ зависимости уровня экспрессии мРНК АБАМ-2 от исхода ЭКО при различных методах оплодотворения (таблица 9).

Таблица 9 - Уровень экспрессии мРНК АЭАМ-2 при различных исходах ЭКО и ПЭ в зависимости от метода оплодотворения, Ме (25-75%)_

Метод оплодотворения Исход программы ЭКО и ПЭ

Беременность наступила (п=33) Беременность не наступила (п=46)

ЭКО (п=37) (п=12) 2,2 (0,9-3,4) (п=25) 1,9 (0,4- 6,0), р=0,535

ИКСИ (п=42) (п=21) 5,8(1,5-14,2) (п=21) 0,6 (0,3 - 1,2)*, р=0,019

Примечание. * - Статистически значимое отличие выделенного параметра от группы с наступившей беременностью при оплодотворении методом ИКСИ (р<0,05)

При использовании ИКСИ, выявлены статистически значимые различия по уровню экспрессии мРНК АБАМ-2 в случаях наступления беременности и ее отсутствия (р=0,019). Полученные данные позволили выполнить ЯОС-анализ с целью описания уравнения прогнозирования наступления беременности на основе определения уровня экспрессии мРНК АБАМ-2 у пациентов со сниженными параметрами спермы в день ТВП. Площадь под кривой составила 0,825 (95% ДИ 0,6221,0), р=0,017, чувствительность и специфичность модели в точке отсечения, равной 1,76, составляли 83,3% и 76,2%, соответственно. Данная модель имеет высокую прогностическую ценность. Значение уровня экспоессии мРНК АБАМ-2 выше 1.76 свидетельствует в пользу прогноза наступления беременности. Снижение экспрессии мРНК фертилина-Р может свидетельствовать о наличии нарушений в процессе сперматогенеза, что может отражаться на качестве мужских гамет и дальнейшем развитии эмбриона. Полученные нами данные соответствуют предложенной С-Нивгаг и соавт. в 1997г. теории корреляции зрелости мембраны сперматозоида с полноценностью развития ядра. По данным корреляционного анализа изучаемых спермальных мРНК нами выявлена статистически значимая корреляционная зависимость высокой силы АБАМ-2 и РЯМ-2 (г8=0,833, р=0,01) в группе с наступившей беременностью, что дополнительно свидетельствует в пользу подтверждения теории О.НиБгаг.

Выявленные различия профилей экспрессии мРНК фолликулярной жидкости и спермы в зависимости от исхода ЭКО послужило основанием для попытки создания математических моделей на основе дискриминантного анализа, позволяющих объективно оценить качество ооцита и сперматозоида для прогнозирования формирования эмбриона с высоким потенциалом к имплантации. Была подобрана каноническая линейная дискрими-нантная функция (КЛДФ):

КЛДФ-О/76 х ЮРВР-4+0,43 х ЕРЕС - 0,26 х ЮР-1 +0,047 х (РКМ-2:РРШ) - 0,93 х ВШС-5 - 0,87 х АРЕС- 0,79 (3)

Распределение супружеских пар в зависимости от значений КЛДФ представлено на рисунке 4.

КРИВЫ. КОС

Рисунок 3 - ЯОС- кривая при прогнозировании наступления беременности по уровню экспрессии мРНК АБАМ-2 в группах с ИКСИ

ОБеременность в результате ЭКО, роды (п=13)

беременности до 11 недель (п=10)

Д Биохимическая беременность (n= 19)

О Отрицательный результат ЭКО (п=37)

А4 О КЛДФ2 О о

А □ А %А | ❖ п <ко

5 -4 -ЗО -2 t ШЩ □ О ^ 2о 3 >0 в КЛДФ1

А А О \ \ \ \

AT"4" А \ А

Рисунок 4 - Распределение супружеских пар в зависимости от значений КЛДФ Пунктиром показан график результирующей дискриминантной функции

Для оценки диагностических возможностей предложенной модели с использованием КЛДФ был выполнен ROC анализ (рисунок 5).

Площадь под кривой составила 0,853 (95% „оо

ДИ 0,752-0,953), р<0,0001, чувствительность и специфичность модели в точке отсечения, равной 0,22, составляли 83,3% и 81,4% соответственно.

Превышение значения КЛДФ относительно точки cut off 0,22 классифицировалось как наступление беременности в результате ЭКО и Рисунок 5 - Характеристическая ПЭ. ROC-кривая КЛДФ

Для изучения пригодности модели был выполнен комплекс запланированных обследований у 10 женщин, соответствующих критериям включения и исключения, в программе ЭКО, произведена оценка ее эффективности. Полученные данные подтвердили, что разработанный нами способ прогнозирования наступления беременности позволяет с диагностической эффективностью выше 80,0% классифицировать супружеские пары по исходам ЭКО и ПЭ в зависимости от совокупных данных по молекулярно-генетическому профилю фолликулярной жидкости и спермы в день ТВП и может быть использован в качестве дополнительного критерия объективной оценки качества гамет, что особенно важно при проведении селективного переноса одного эмбриона.

Результаты проведенного исследования на основании комплексной оценки гамет по морфологическим и молекулярно-генетическим параметрам фолликулярной жидкости и спермы позволили нам разработать алгоритм обследования и стратегии переноса эмбрионов при лечении пациентов с бесплодием в рамках проведения программы экстракорпорального оплодотворения (рисунок 6).

Рисунок 6 - Алгоритм обследования и стратегии переноса эмбрионов при лечении пациентов с бесплодием в рамках проведения программы экстракорпорального

оплодотворения

Таким образом, использование комплексной системы оценки качества гамет в сочетании с селективным переносом одного эмбриона дополняет современные диагностические методы в области репродукции человека, способствует повышению эффективности ЭКО у определенного контингента больных с бесплодием, снижению числа многоплодных беременностей, что позитивно влияет на улучшение репродуктивного здоровья семьи, как фактора демографического развития России.

выводы

1. Сравнение клинико-анамнестических данных пациенток программы ЭКО с селективным переносом одного эмбриона, вынужденным переносом одного эмбриона, переносом двух эмбрионов показало отсутствие статистически значимых различий по возрасту, структуре причин бесплодия, акушерско-гинекологическому анамнезу.

2. Выполнение селективного переноса одного эмбриона пациенткам младше 35 лет, с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, имеющим не более двух неэффективных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, с нормальным овариальным резервом, фертильной или субфертильной спермой супруга позволяет в 10 раз по сравнению с переносом двух эмбрионов снизить риск многоплодной беременности и не снижает частоту наступления беременности в рамках проведения ЭКО и ПЭ.

3. Снижение эффективности реализации ЭКО и ПЭ у женщин с отсутствием возможности выбора эмбриона для переноса обусловлено сниженными параметрами фол-ликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза по сравнению с пациентками, у которых имеется возможность селекции эмбриона. Наличие двух и более эмбрионов на день переноса, перенос на стадии бластоцисты позволяют достичь высокой результативности ЭКО и ПЭ.

4. Частота наступления беременности при селективном переносе одного эмбриона составляет 46,7%, при переносе двух эмбрионов 39,3%, что статистически значимо не различается, частота имплантации при селективном переносе одного эмбриона в 2 раза статистически значимо выше, чем при переносе двух эмбрионов, что обусловлено хорошим качеством получаемых ооцитов и эмбрионов.

5. Частота самопроизвольного прерывания беременности в 1,9 раз ниже при селективном переносе одного эмбриона, чем при переносе двух эмбрионов и составляет 19,0% и 37,5%, соответственно, что может свидетельствовать о более благоприятных условиях имплантации.

6. Комплексное определение мРНК факторов роста Л К ЕС, ЕКЕС, ЮР-1, ЮРВР-4, антиапоптотического фактора В1ЯС-5 в клетках фолликулярной жидкости, в сочетании с данными транскриптомного профиля генов протаминов (РКМ-1, РЯМ-2), фертилина-р (АОАМ-2) в сперме позволяет прогнозировать наступление беременности в программе ЭКО и ПЭ. «Неблагоприятный прогноз» программ ВРТ ассоциирован со снижением экспрессии АОАМ-2, РКМ-1 и РЯМ-2 в сперме.

7. При сниженных параметрах спермограммы в день ТВП значение уровня экспрессии АОАМ-2 1,76 является пороговым для прогнозирования наступления беременности.

8. «Благоприятный прогноз», определяемый на основании комплексной оценки гамет по морфологическим и молекулярно-генетическим параметрам, позволяет провести селективный перенос одного эмбриона. «Неблагоприятный прогноз» обуславливает возможность проведения переноса двух эмбрионов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенткам с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, в возрасте до 35 лет, имеющим не более двух неэффективных цикла ЭКО и ПЭ в анамнезе, нормальный овариальный резерв, фертильную или субфертильную сперму супруга, при наличии «благоприятного» прогноза по данным молекулярно-генетического исследования фолликулярной жидкости, спермы и возможности выбора эмбриона «хорошего» качества на 5 сутки культивирования рекомендовать селективный перенос одного эмбриона на стадии бласто-цисты.

2. Низкая результативность при отсутствии возможности выбора эмбриона позволяет рекомендовать при проведении следующей схемы ЭКО более интенсивную стимуляцию гонадотропинами для получения более чем одного эмбриона и возможности выбора лучшего.

3. Проводить комплексную оценку гамет по морфологическим и молекулярно-генетическим параметрам с целью определения «благоприятного прогноза» и решения вопроса о селективном переносе одного эмбриона в целях снижения риска многоплодной беременности.

4. При сниженных параметрах спермограммы и уменьшении уровня экспрессии мРНК АБАМ-2 ниже 1,76 в день ТВП рекомендовать выполнение ИКСИ и перенос двух эмбрионов с целью повышения результативности ЭКО и ПЭ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль спермальных мРНК генов Р11М-1, РИМ-2, АБАМ-2 в прогнозировании исхода программ ВРТ / О.Е.Краснощока, О.В.Бурменская, О.С.Непша, В.Ю.Смольникова, Е.А.Калинина, Д.Ю. Трофимов // Мать и дитя: материалы XI Всероссийского научного форума. - М., 2010. - С. 411-412.

2. Вклад спермального эпигенома в прогнозирование исхода программ ВРТ / О.Е.Краснощока, О.В.Бурменская, О.С.Непша, В.Ю.Смольникова, Е.А.Калинина, Д.Ю.Трофимов, Г.Т. Сухих // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4 (13), № 4. -С. 397.

3. Зависимость частоты наступления беременности в программах переноса одного эмбриона от условий культивирования / О.Е.Краснощока, Ю.А.Штыря, В.Ю.Смольникова, Е.А.Калинина // Материалы V международного конгресса по репродуктивной медицине. - Проблемы репродукции. Специальный выпуск,- 2011. - С. 103104.

4. Молекулярно-генетический профиль образцов фолликулярной жидкости, полученных при проведении программ ВРТ при селективном переносе одного эмбриона / В.Ю.Смольникова, Д.Ю.Трофимов, О.Е.Краснощока, О.В.Бурменская, Е.А.Калинина // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний: материалы XXIV Международного Конгресса с курсом эндоскопии. - М., 2011. - С. 168-169.

5. Селективный перенос одного эмбриона / В.Ю.Смольникова, О.Е.Краснощока, Ю.А.Штыря, Е.А.Калинина // Репродуктивные технологии сегодня и

20

завтра: материалы XXI Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 86.

6. Спермальные МРНК как прогностические маркеры исхода программ ВРТ / В.Ю.Смольникова, О.Е.Краснощока, Д.Ю.Трофимов, О.В.Бурменская, Е.А.Калинина, Г.Т.Сухих // Материалы VI международного конгресса по репродуктивной медицине. -Проблемы репродукции. Специальный выпуск,- 2012. - С.48.

7. Смольникова В.Ю., Краснощека О.Е., Калинина Е.А. Перенос единственного эмбриона // Мать и дитя: материалы VI Регионального научного форума. - Ростов-на-Дону, 2012.-С. 227-229.

8. Возможности прогнозирования исходов вспомогательных репродуктивных технологий по уровню спермальных мРНК / В.Ю.Смольникова, О.Е.Краснощока, О.В.Бурменская, Д.Ю.Трофимов, Е.А.Калинина, Г.Т.Сухих // Акушерство и гинекология. - 2012. - № 2. -С. 36-40.

9. Экстракорпоральное оплодотворение в естественном цикле / Л.М.Казарян, К.У.Алиева, В.Ю.Смольникова, О.Е.Краснощока, Е.А.Калинина // Гинекология. -2012. - Т.14, №3. - С.8-10.

10. Краснощека О.Е., Смольникова В.Ю., Калинина Е.А.. Клинические аспекты селективного переноса одного эмбриона в программах вспомогательных репродуктивных технологий с позиции акушерства и перинатологии (обзор литературы) // Гинекология. -2012. -Т. 14, № 3. - С.20-23.

11. мРНК протаминов и фертилина как потенциальные биомаркеры исхода программ вспомогательных репродуктивных технологий / Г.Т.Сухих, О.В.Бурменская, В.Ю.Смольникова, О.Е.Краснощока, Д.Ю.Трофимов, А.Е.Донников, Е.А.Калинина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2012. - Т. 153, № 4. -С.504-506.

12. Diagnostic and predictive value of sperm mRNA profile / V.Yu.Smolnikova, D.Yu.Trofimov, O.E.Krasnoschoka, O.V.Bourmenskaya, E.A.Kalinina // Reproductive medicine and beyond: the best poster abstract and oral presentation on The 4th International IVI Congress. - Valencia, Spain. - April 7-9, 2011.-P.28, P-13.

13. Protamine and Fertilin mRNA: Potential Biomarkers of Assisted Reproductive Technology Outcomes / G.T.Sukhikh. O.V.Bournenskaya, V.Yu.Smolnikova, O.E.Krasnoschoka, D.Yu.Trofimov, A.E.Donnikov, E.A.Kalinina // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - Springer, 2012. - Vol.153, № 4. - P.513-515.

14. Embryology and single embryo transfer (SET) for improving outcome in IVF programmes / V.Smolnikova, Y.Shtyrya, O.Krasnoschoka, E.Kalinina // The 14lh World Congress on Human Reproduction. Melbourne, Australia. - 30 November to 3 December 2011. - P.71.

15. Prognostic impact of sperm mRNA profile / V.Yu.Smolnikova, D.Yu.Trofimov, O.E.Krasnoschoka, O.V.Bourmenskaya, E.A.Kalinina // The 14th World Congress on Human Reproduction. Melbourne, Australia. - 30 November to 3 December 2011. - P.71.

16. Prognostic impact of the follicular fluid MRNA profiling / V.Yu.Smolnikova, D.Yu.Trofimov, O.V.Bourmenskaya, O.E.Krasnoschoka, E.A.Kalinina, G.T.Sukhikh // The Ovary, Gametes, Embryo and Endometrium: poster abstract on The 1st Biomarker Meeting in Reproductive medicine: emergence of a new field. - Valencia, Spain. - March 30-31, 2012 - P.5.

21

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

КЛДФ - каноническая линейная дискриминантная функция

Me - медиана

мРНК - матричная РНК

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ТВП - трансвагинальная пункция яичников

ФЖ - фолликулярная жидкость

ЭКО и ПЭ - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов

ADAM-2 - (a disintegrin and metalloprotease domain), фертилин-p

AREG - амфирегулин

BAX - регулятор апоптоза ВАХ (Bcl-2-подобный протеин-4)

BCL-2 - белок В-клеточной лимфомы-2

BIRC-5 - сурвивин, ингибитор апоптоза бакуловирусов-5

СОХ-2 - циклооксигеназа-2

cSET - вынужденный перенос одного эмбриона

DET - перенос двух эмбрионов

EREG - эпирегулин

eSET - селективный перенос одного эмбриона

GREM-1 - гремлин-1, антагонист костного морфогенетического протеина BMP

и сигнального пути TGF-P

HAS-2 - гилурансинтаза-2

HBEGF - гепарин-связывающий фактор, подобный эпидермальному фактору роста

HLA-G - человеческий лейкоцитарный антиген G

IGFBP-1, 2, 3,4 - белки, связывающие инсулиноподобные факторы роста 1, 2, 3, 4 типов

IGF-1,2 - инсулиноподобные факторы роста 1,2 типов

LIF, LIFR - лейкемия-ингибирующий фактор и рецептор LIF

TNF-a - фактор некроза опухолей альфа

PRM-1,2 - протамины 1, 2 типов

rS - коэффициент ранговой корелляции Спирмена

Краснощока Ольга Евгеньевна

Совершенствование программы экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов и комплексной морфологической и молекулярно-генетической оценке гамет

Автореферат

Подписано в печать 19.02.13. Тираж 120 экз., объем 1 п.л. Заказ №(12) Печать с готового оригинал-макета Санкт-Петербург, "29 КТЦ"