Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патофизиологическая оценка состояния свободнорадикального окисления на этапах раннего эмбриогенеза

А

На правах рукописи

ИСХАКОВ ИЛЬДАР РИНАТОВИЧ

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ НА ЭТАПАХ РАННЕГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 ФЕВ 2015

Нижний Новгород - 2014

005559048

005559048

Работа выполнена, в Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Фархутдинов Рафагат Равильевич Официальные оппоненты: Перетягин Сергей Петрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России (г. Н. Новгород), руководитель отдела экспериментальной медицины.

Шевантаева Ольга Николаевна доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России (г. Н. Новгород), профессор кафедры патологической физиологии.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-уральский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Челябинск).

Защита диссертации состоится 27 февраля 2015 года в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.061.03 при ГБОУ ВПО «Нижегородской государственной медицинской академии» Минздрава России по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО «Нижегородской государственной медицинской академии» Минздрава России по адресу: 603104, Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. За, www.nauka.nizhgma.ru

Автореферат разослан « »_2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Дурново

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Около 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с естественным наступлением беременности (Корсак B.C., 2011).

В последнее время уделяют большое внимание роли свободных радикалов в репродуктивной функции (Tvrdd Е., 2011). Свободные радикалы отличаются высокой химической активностью, образуются в организме при многих жизненно важных физиологических и метаболических процессах. Наиболее часто в организме встречаются активные формы кислорода (АФК) и радикалы, возникающие при перекисном окислении липидов (ПОЛ).

Вместе с тем влияние свободнорадикального окисления (СРО) на ооциты женщин (Kolesnikova L.I., et al., 2012), оплодотворение, а также на последующее развитие -эмбрионов изучено мало (Agarwal A., et al., 2012). Известно, что процессы СРО играют положительную роль в фолликулярной жидкости (Хру-леваН.В, 2011).

Главная сложность при изучении процессов, происходящих с человеческими эмбрионами, состоит в том, что над самими эмбрионами делать какие-либо опыты неэтично. В связи с этим как альтернатива можно проводить изучение продуктов метаболизма эмбрионов человека, которые накапливаются в средах после проведения оплодотворения и культивирования.

Перспективным направлением является изучение метаболизма на этапах раннего эмбриогенеза, что позволит сделать более качественный выбор лучшего эмбриона для переноса в полость матки. На данный момент остается неизвестным влияние сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, а также фолликулярной жидкости на процессы СРО, что и явилось целью нашего исследования.

Цель исследования. Патофизиологическая оценка процессов свободно-радикального окисления, протекающих в питательных средах, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов человека, на ранних этапах онтогенеза, а также в фолликулярной жидкости женщин, участвующих в программах вспомогательных репродуктивных технологий.

3

Задачи исследования:

1. Изучить патогенетическую значимость процессов СРО и антиокси-дантных систем на различных этапах проведения программ вспомогательных репродуктивных технологий в эксперименте.

2. Обосновать степень патогенетической значимости технологических элементов при проведении программ вспомогательных репродуктивных технологий (в частности, сред), а также при оценке изменений активности процессов СРО в эксперименте.

3. Оценить эффективность применения параметров СРО в качестве критерия прогнозирования частоты наступления беременности.

4. На основании проведенных исследований определить наиболее патофизиологически обоснованные пути оптимизации программ вспомогательных репродуктивных технологий с применением параметров СРО.

Научная новизна. На основании анализа деятельности лаборатории экстракорпорального оплодотворения показана необходимость разработки и внедрения дополнительных методов оценки качества эмбриона.

Изучены процессы СРО в модельных системах при добавлении сред, применяемых при оплодотворении, культивировании эмбрионов.

Установлено, что при высокой частоте оплодотворения, высоких показателях дробления эмбрионов и их выходе в бластоцисты степень подавления активных форм кислорода в средах после оплодотворения и культивирования эмбрионов снижена, уровень общей антиоксидантной активности понижен, а содержание ТБК-активных продуктов повышено.

Изучены процессы СРО в модельных системах при добавлении фолликулярной жидкости женщин, участвующих в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Фолликулярная жидкость женщины, прошедшей программу ЭКО и не забеременевшей после ее проведения, не подавляет процессы СРО в модельной системе, генерирующей АФК, данный факт может быть использован с целью прогноза исхода программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Практическая значимость. Дополнительным критерием выбора эмбриона можно считать определение ХЛ в модельных системах при добавлении сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, что позволит по характеристикам СРО провести отбор лучшего эмбриона.

Продленное культивирование позволяет наиболее точно спрогнозировать лидерство эмбриона. При получении достаточного количества яйцеклеток у пациенток 20-34 лет, а также при развитии нескольких эмбрионов хорошего качества, рекомендуется проводить селективный перенос одного эмбриона в полость матки.

В результате проведенных исследований внедрен в практику метод оценки свободнораднкального окисления в средах, используемых при оплодотворении н развитии эмбриона на ранних этапах, позволяющий дополнить существующие методики оценки качества эмбрионов на 5 день, а также метод оценки СРО в фолликулярной жидкости, позволяющий спрогнозировать исход программы ЭКО.

Основные положения выносимые на защиту:

Параметры свободнораднкального окисления в средах после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов и в фолликулярной жидкости служат достоверным дополнительным прогностическим маркером эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Внедрение результатов исследования. Метод оценки свободноради-кального окисления в модельной системе, генерирующей АФК, при добавлении фолликулярной жидкости и сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбриона на ранних этапах, внедрен в практику медицинского центра «Семья». Разработанный метод используется для оценки СРО сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, с целью улучшения результатов программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Материалы, приведенные в данной работе внедрены в учебный процесс по дисциплине «Цитология, гистология, эмбриология», научно-исследовательскую и инновационную деятельность кафедры морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФБГОУ ВПО Башкирский ГАУ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международной научной конференции «Повышение качества жизни пациентов - тренд современной медицины» (Стерлитамак, 2013); на VI международной научно-практической конференции «Современная наука: тенденции развития» (г. Краснодар, 2013); на XXII международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» (Москва, 2014); совместном заседании кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета (26 июня 2014 г., протокол № 66).

Личный вклад автора заключается в самостоятельной постановке и проведении экспериментального и клинического исследования, обработке материалов лабораторного и клинического обследования, а также хемилюминес-центного анализа.

Публикации результатов исследований. Опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рецензируемых ВАК, получен 1 Патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами, 44 рисунками. В библиографический указатель включено 255 источников литературы, из которых 110 - отечественных и 145 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, объем и методы исследования. Общая схема, демонстрирующая этапы проведенного нами исследования представлена на рисунке 1. В исследуемую группу было отобрано 117 женщин, проходивших программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в медицинском центре «Семья» г. Уфы в период с 2009 по 2012 годы включительно. Всем пациенткам проведено комплексное гинекологическое и клинико-лабораторное обследование, УЗИ органов малого таза и эндоскопическое исследование эндометрия (по показаниям).

б

Дизайн исследования

Исследование влияния

сред на СРО 1) Fertilization medium 2) Cleavage medium 3) Blastocyst medium (n=l 17)

Анализ проблем репродуктологии и эмбриологии на примере деятельности лаборатории экстракор-^ поральното оплодотворения, выявивший необходимость поиска дополнительных методов

Связь СРО в исследуемых средах с частотой оплодотворения, качеством дробления, выходом в бластоцисты (п=117)

Влияние фолликулярной жидкости на СРО в модельных системах (п=81)

Исследование

влияния сред на СРО в модельных системах

N

Исследование влияния сред на СРО в модельных системах

Изучение состояния АОА и содержание продуктов ПОЛ

АФК ПОЛ OA А

АФК

ПОЛ

ОАА МДА

ОАА

хл

МДА

АФК

ПОЛ

Рисунок 1 - Дизайн исследования

Всем мужчинам проводились андрологическое и клинико-лабораторное обследование, в том числе исследование эякулята согласно рекомендаций ВОЗ 5 ред. (2010).

Регистрацию ХЛ проводили иа аппарате «Хсмилюминомер-003» с компьютерным обеспечением, изготовленным в Межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований. Это - портативный экспресс-анализатор ХЛ-свечения, возникающего при химических и биохимических реакциях, биологических процессах, сопровождающихся образованием свободных радикалов (Фархутдинов Р.Р., 2010).

Перед измерением свечения исследуемый образец смешивали с 20 мл фосфатного буфера, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5 М, и помещали в светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ в течение 5 мин.

Об интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции судили по ряду параметров, в первую очередь, по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. Полученные результаты обработаны на компьютере с помощью специального пакета программы статистики.

Для регистрации Ре2+-индуцированной ХЛ 0,1 мл фолликулярной жидкости добавляли к модельной системе, генерирующей АФК. В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (КН2РО4 - 20 шМ, КС1 -105 шМ, рН доводили до 7,45 титрованием насыщенным раствором КОН) с цитратом (50 тМ) и люминолом (10"5 М). В течение 10 секунд записывали темновой ток, после чего вносили инициатор образования АФК - 1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа (Ре504х7Н20). Конечная концентрация Ре804 в среде инкубации составляла 2,5 шМ. Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании. При оценке Ре2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения (СпС), продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.

Определение суммарной антиокислительной активности фолликулярной жидкости для оценки женской фертильности включало в себя оценку железоиндуцируемой хемилюминссценции модельной системы, генерирующей АФК, до и после добавления фолликулярной жидкости.

Аналогичным образом проводили изучение сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов на ранних этапах развития, в модельных системах, генерирующей АФК и в которой протекают реакции ПОЛ.

Исследовали среды Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium (SAGE), применяемые на эмбриологическом этапе в программах вспомогательных технологий при оплодотворении и культивировании эмбрионов.

Общую антиоксидантную активность определяли с помощью набора «RANDOX». При взаимодействии реагентов набора образуется радикал катион, и происходит стабильное сине-зеленое окрашивание, которое измеряется при 600 нм. Исследуемые вещества в добавленном образце обусловливают подавление цветной реакции до такой степени, которая пропорциональна их концентрации. Общая антиоксидантная активность вычисляется на основе уровня изменений окрашивания.

Активность перекисного окисления лппидов оценивали набором «Агат» по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, основную массу которых составляет малоновый диальдегид. При высокой температуре в кислой среде последний реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. По интенсивности поглощения определяли уровень малонового диальдегида в исследуемых образцах.

Статистическая обработка результатов проводилась в операционной среде Windows ХР с использованием статистической программы "Statistica 6.0". Характер распределения количественных признаков оценивался по критерию Колмогорова-Смирнова. Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (средняя арифметическая и ее стандартная ошибка - критерий Стьюдента). Для показателей, не имеющих нормального

9

распределения, вычислялась медиана. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Маина-Уитни (Гареев Е.М., 2009).

Результаты исследования и их обсуждение. Нами было установлено, что по возрастной и массово-ростовой характеристике, по виду стимуляции, количеству растущих фолликулов и полученных ооцитов группы забеременевших и иезабеременевших пациенток достоверно не отличались. В то же время полученные результаты указывают на то, что частота наступления беременности при переносе эмбриона на 5-й день была лучше, чем на 3-й день в 1,8 раза, однако оценка морфологии эмбриона, которая остается практически единственным информативным критерием для определения имплантациоиных возможностей не позволила выявить достоверных различий в их структуре в различные сроки переноса (рисунок 2).

40 30 20 10

о

2009

■1 - 3 день -5 день

2010

2011

2012

Рисунок 2 - Частота наступления беременности в зависимости от дня переноса у пациенток с количеством клеток больше 10 (р<0,05)

Нами было проведено изучение СРО в модельных системах, генерирующей АФК и в которой протекают реакции ПОЛ при добавлении фолликулярной жидкости (ФЖ) женщин, прошедших программы ВРТ. ФЖ повышала интенсивность светосуммы, максимальной светимости и вспышки хемилюминесцен-ции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода. Особен-

ю

но это было выражено при добавлении фолликулярной жидкости женщины, не забеременевшей после проведения программы ВРТ (рисунок 3).

Известно, что в фолликуле перед овуляцией накапливаются провоспали-тельные факторы (ПвФ). Увеличение активности процессов СРО в фолликулярной жидкости женщин, прошедших программу ВРТ и забеременевших, свидетельствует о синхронности этих процессов, что подтверждают и другие исследователи (Хрулева Н.В., 2011). Таким образом, выявление АФК в ФЖ достоверно отражает процесс накопления ПвФ, а следовательно степень зрелости фолликулов что позволяет прогнозировать результативность оплодотворения и дальнейшее развитие и имплантации эмбриона (рисунок 4).

%

120 100 80 -60 ч 40 -20 '-! о

93,1

82,4

101,2

□ ФЖ донора ооцитое

□ ФЖ забеременевшей после ЭКО женщины

□ ФЖ не забеременевшей после ЭКО женщины

Рисунок 3 - Свеосумма модельной системы, генерирующей АФК, при добавлении ФЖ

На следующем этапе были изучены процессы СРО в модельных системах, генерирующей АФК и в которой протекали реакции ПОЛ при добавлении сред, используемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов - Fertilization medium, Cleavage medium Blastocyst medium (рисунок 5, слева). Исследуемые срсды уменьшали латентный период и повышали интенсивность светосуммы.

Возможно это связано с тем, что среды, применяемые при оплодотворении и культивировании эмбрионов, способны непосредственно взаимодейство-

11

вагь со свободными радикалами: усиливать генерацию АФК in vitro, го есть обладали проокислительной активностью.

Проокислительная активность этих сред, патогенетически, может быть обусловлена комплексным действием входящих в состав сред компонентов (различные аминокислоты, которые при определенных условиях могут выступать как прооксиданты).

АФК в ФЖ

Ж

Накопление провоспалительных факторов

Рисунок 4 - Механизм влияния АФК на созревание фолликула

После оплодотворения влияние сред на модельную систему увеличилось (рисунок 5, справа). Объяснением данному факту является изменение компонентов среды и вероятно попаданием в нее продуктов метаболизма эмбрионов, что создает лучшие условия для процесса генерации АФК в модельной системе.

5 а.00

Рисунок 5 - Влияние сред Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium на генерацию АФК в молельной системе (а) - до,

(б) - после оплодотворения и культивирования) 1 - контроль, 2-4 - добавление сред, применяемых при оплодотворении, дроблении и росте бластоцист (р<0,05).

Рисунок 6 - Влияние сред после проведения оплодотворения и культивирования на ХЛ модельной системы, генерирующей АФК О - среда, применяемая при оплодотворении, Д - среда, применяемая при дроблении, Б - среда, применяемая при росте бластоцист.

Проведенное исследование показывает (рисунок 6), что после проведения оплодотворения способами ЭКО и ИКСИ светосумма ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, при добавлении сред повышалась. Особенно это было характерно для среды Fertilization medium. В свою очередь в среде для оплодотворения были выявлены существенные различия после ЭКО и ИКСИ. После проведения ЭКО влияние сред на генерацию АФК в модельной системе была выше, чем после ИКСИ.

Максимальная интенсивность ХЛ после проведения ЭКО в среде Fertilization medium вероятно была вызвана двумя факторами: непосредственно процесс оплодотворения способствовал образованию большого количества свободных радикалов или же присутствием в чашке со средой множества сперматозоидов и клеток ооцит-кумулюсного комплекса.

В пользу последнего говорит тот факт, что после проведения ИКСИ (когда в чашке была только среда и оплодотворенные яйцеклетки) интенсивность ХЛ модельной системы также повышалась, но не столь выражено, чем при ЭКО. Интенсивность ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, в средах

после проведения ИКСИ и дальнейшего культивирования были также незначительно выше, чем до оплодотворения и культивирования. Данное увеличение не было статистически достоверным. Этот факт может свидетельствовать о том, что на ранних этапах (до формирования бластоцисты) в эмбрионе протекают метаболические реакции, а также образуются свободные радикалы, но данные процессы идут на минимальном уровне.

При изучении влияния сред Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium на XJI в модельных системах были получены данные только об одной из сторон процессов СРО, протекающих при оплодотворении и культивировании эмбрионов. Для более полного их раскрытия было оценено состояние общей антиоксидантной активности (ОАА) в средах.

Минимальное значение уровня ОАА наблюдали в среде Fertilization medium - в 1,4 раза меньше, чем в среде Blastocyst medium.

При этом уровень ОАА в исследованных средах понижался. Причем чем лучше были частота оплодотворения (>70%), выше качество дробления на 3-й день и лучше выход в бластоцисты (III, IV и V классы), тем сильнее снижался уровень ОАА в средах. Повышение интенсивности процессов СРО способствовало тому, что антиоксидантная система сред ослаблялась (рисунок 7).

Для того, чтобы дополнительно оценить значение процессов СРО в изучаемых средах при оплодотворении исследовали уровень продуктов перекисно-го окисления липидов в них. В культуральных средах после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов повышался уровень МДА. Причем чем лучше были частота оплодотворения (>70%), выше качество дробления на 3 день и лучше выход в бластоцисты (III, IV и V классы), тем выше было содержание МДА в средах. Это подтверждает полученные нами данные о том, что происходит усиление процессов СРО в средах после проведения оплодотворения и культивирования (рисунок 7).

Из рисунка 8 видно, что после оплодотворения интенсивность светосум-мы ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, при добавлении сред повышалась, причем, чем оплодотворение было лучше, тем сильнее.

14

ЫКонтроль

аикси вэко

% от контроля

Рт

Ст

Вт

Рисунок 7 - Уровень ОАА (слева) и ТБК-активных продуктов (справа) в средах до и после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов О - среда, применяемая при оплодотворении, Д - среда, применяемая при дроблении, Б - среда, применяемая при росте бластоцист.

140 п 120 100 80Н 60 40 20 0

115* 100

127* 116*НГ Ц7*128* 108

110

□ Низкое качество ] Среднее качество 1 Высокое качество

Контроль 100%

Рисунок 8 - Влияние СРО на частоту оплодотворения, качество дробления и выход в бластоцисты (за 100% принята интенсивность светосуммы ХЛ модельной системы)

1 - частота оплодотворения, 2 - качество дробления, 3 - выход в бластоцисты Статистически достоверные различия (р<0,05) отмечены *.

НИ <70%

3 >70%.

- контроль.

Это может свидетельствовать как о высокой метаболической активности сперматозоидов и яйцеклеток, так и о том, что в процессе оплодотворения образуется значительное количество свободных радикалов.

Ретроспективно сравнили эффективность программ ВРТ в исследуемой группе женщин при стандартной оценке качества эмбриона и при применении дополнительно методики хемилюминесценции. Выделили хорошие по качеству эмбрионы - бластоцисты III, IV и V классов, средние - I и II классы, к низкие -МО. После этого у этой же группы женщин интенсивность XJI сопоставили с качеством эмбрионов. В этом случае к хорошему качеству относили бластоцисты III, IV и V классов с усилением интенсивности XJ1 более, чем на 125% от контроля (таблица 1).

Таблица 1 - Распределение группы женщин по параметрам СРО и морфологии

Параметры СРО Морфологические параметры

МО, I и II классы III, IV и V классы

! 25 и > % 26 25

117-124 % 23 7

1 16 и <% 32 4

За 100% принята светосумма модельной системы.

На рисунке 9 представлен механизм влияния сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы СРО. Все среды, применяемые при оплодотворении и культивировании эмбрионов, усиливали генерацию АФК, что, по всей видимости, способствовало улучшению качества эмбрионов (повышалась частота оплодотворения, улучшалось качество дробления и выхода в бластоцисты). И, в целом, это выражалось в повышении имплантационных возможностей эмбрионов и увеличении частоты наступления беременности.

In vitro гаметы и эмбрионы подвергаются избыточному влиянию АФК, и при этом отсутствует ферментная антиоксидантная защита, которые в норме есть при естественном оплодотворении. Считается, что свободные радикалы влияют на исходы программ ЭКО и ИКСИ через влияние на ооциты, сперматозоиды и эмбрионы (Gupta S., et al., 2010).

Продукты ПОЛ изменяют барьерные свойства клеточных и внутриклеточных мембран, увеличивают их проницаемость для ионов К+, Н+, ОН", Са" и др. В частности ионы Са++ способствуют активации ЫАОРН-оксидаз и запускают целый каскад реакций.

Рисунок 9 - Влияние сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы СРО

КЛеЬапоГГ БЛ. (1979) показано, что одним из первых событий при оплодотворении сперматозоидом яйцеклетки является резкая активация МАБРН-оксидаз обоих партнеров. Подавление продукции ими АФК приводит к нарушению развития эмбриона.

ИАБРН-оксидаза 5 типа также активируется свободными ионами Са++. Под действием этого фермента образуется супероксидный радикал, который затем способен превращаться в перекись водорода и некоторые другие виды АФК. Таким образом, механизмы влияния АФК на процессы оплодотворения и митогенную активность представлены на рисунке 10.

Есть ряд публикаций, в которых описано стимулирующее влияние АФК на деление различных типов клеток (Чеснокова Н.П., 2004). Процесс усиления СРО оказывает как видно положительное влияние на деление клеток при культивировании эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных тех-

нологий. Считается, что АФК могут активировать такие ферменты, как мито-ген-активируемую киназу р38, а это в свою очередь способствует активации транскрипционного фактора HIF-1 и экспрессии соответствующих генов (Гущина C.B., 2010).

\

Успешное оплодотворение

Рисунок 10 - Механизм влияния АФК на процесс оплодотворения и митогенную активность

Как известно, процессы СРО играют исключительно важную роль в созревании сперматозоидов, капацитации и акросомальной реакции. Тем не менее, эти подготовительные этапы происходят до слияния мужской и женской половых клеток.

Что же касается самого оплодотворения, то после прохождения барьера блестящей оболочки сперматозоид должен слиться с ооцитом и дать начало новому организму. В этом важное значение имеет степень текучести мембраны сперматозоида. Чтобы произошло успешное оплодотворение, она должна быть высокой. Это обеспечивается большим содержанием в ней полиненасыщенных жирных кислот (Wathes D.C., 2007). Изучение мужских половых клеток показало, что АФК способствовали повышению числа проникновений сперматозоидов в яйцеклетки. АФК, ингибируя активность фосфотирозинфосфатазы (рисунок 9), тормозят дефосфорилирование и в связи с этим способствуют повышению активности фосфолипазы А2 (PLA2). Последняя отщепляет от мембранного фосфолипида жирную кислоту и повышает текучесть мембраны. Помимо этого, АФК могут и непосредственно активировать PLA2 (Roldan E.R.S., 2007).

Очевидно, что уровни свободных радикалов должны быть поддержаны на соответствующих уровнях, чтобы гарантировать физиологическую функцию и предотвратить патологическое повреждение.

Равновесие между окислительным и антиокислительным компонентом в питательных средах - залог успешного оплодотворения, нормального развития эмбрионов и наступления беременности, в то же время дисбаланс этой системы - причина отсутствия оплодотворения, остановки в развитии эмбрионов, а порой и в безуспешной имплантации.

Таким образом, среды применяемые при оплодотворении и культивировании эмбрионов, влияют на модельную систему, генерирующую АФК. Процессы инициирования СРО в модельной системе ускоряются в присутствии культуральных сред. Процессы свободнорадикального окисления имеют место в физиологических процессах оплодотворения и развития эмбриона. Кроме того, свободные радикалы образуются при развитии фолликула и тем самым оказывают прямое влияние на качество ооцита. В процессе оплодотворения образуется большое количество свободных радикалов, что связано как с самим оплодотворением, так и с присутствием большого количества других клеток: сперматозоидов и клеток ооцит-кумулюсного комплекса. С другой стороны

19

процессы культивирования эмбриона сопровождаются гораздо меньшим образованием активных форм кислорода, что связано с особенностью эмбриона: в первые дни он метаболически малоактивен. Напротив, при выходе в бласто-цисту в эмбрионе ускоряются метаболические процессы, что сопровождается усиленным свободнорадикальным окислением.

Таким образом, процессы СРО играют исключительно важную роль при оплодотворении и развитии эмбриона в первые дни, что выражается в повышении частоты оплодотворения, качества дробления и выхода в бластоцисты, что в конечном итоге способствует повышению частоты наступления беременности.

ВЫВОДЫ

1. Патогенетическая роль интенсивности процессов СРО и антиоксидант-ных систем в формировании репродуктивных потерь на различных этапах экстракорпорального оплодотворения обусловлена их активным участием в созревании фолликула, оплодотворении и последующем развитии эмбриона, что проявляется в усилении процессов СРО после проведения оплодотворения и культивирования, причем наиболее выраженно в среде Fertilization medium (в 1,21 раза).

2. Степень патогенетической значимости технологических элементов при проведении программ вспомогательных репродуктивных технологий экспериментально обосновывается более интенсивной генерацией активных форм кислорода под влиянием сред, в которых проводилось оплодотворение и культивирование эмбрионов. В средах с высокой частотой оплодотворения, лучшими характеристиками дробления и выхода в бластоцисты генерация АФК была достоверно выше. При этом статистически значимо в средах снижался уровень общей антиокси-дантной активности, а содержание ТБК-активных продуктов повышалось.

3. Параметры СРО, оцениваемые с использованием хемилюминесценции и биохимических методов, является эффективным критерием прогнозирования частоты наступления беременности, так как дополнительное исследование процессов СРО в сравнении со стандартной методикой позволяет определить более качественный эмбрион, что проявилось в повышении эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий.

20

4. Наиболее патофизиологически обоснованным путем оптимизации программ вспомогательных репродуктивных технологий является применение оценки интенсивности свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем с использованием хемилюминесценции, о чем свидетельствует более высокая частота (в 1,3 раза) наступления беременности в сравнении с применением стандартной методики оценки качества эмбрионов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Продленное культивирование до 5 дня развития позволяет определить самый лучший эмбрион по характеристикам дробления у пациенток с числом эмбрионов больше 10.

В качестве дополнительного критерия выбора эмбриона рекомендуется использовать определение хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, при добавлении сред после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов. Это позволяет провести отбор эмбриона с лучшими имплантационными характеристиками.

Предлагается использовать дополнительный метод оценки свободнорадикального окисления фолликулярной жидкости женщин, участвовавших в программах вспомогательных репродуктивных технологий, для прогноза исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Список научных работ, опубликованных но теме диссертации

1. Исхаков И.Р. Влияние факторов оценки качества перенесенных эмбрионов на прогнозирование частоты наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения / Ю.Ю. Громенко // Мед. Вестник Башкортостана. - 2012. - № 2. С. 27-30.

2. Исхаков И.Р. Антиоксидантная активность экстракта прополиса в сперматозоидах при интоксикации ПХБ / Р.Т. Сафаргалиева, И.Н. Антипова, К.А. Исла-наева, А.Ф. Хайруллина // Вопросы теоретической и практической медицины -2007.-С. 125-126.

3. Исхаков И.Р. Распределение экополютантов класса полихлорбифенилов в органах репродуктивной системы и жировой ткани экспериментальных животных / Г.Р. Шарафиев, И.Н. Антипова, Р.Т. Сафаргалиева, К.А. Исланаева, А.Ф. Хайруллина, А.З. Абдуллина // Вопросы теоретической и практической медицины. - 2008. - Том 2. С. 119-121.

4. Исхаков И.Р. Исследование антиоксидангной активности экстракта травы первоцвета весеннего / Р.Т. Сафаргалиева, З.Р. Романова // Вопросы теоретической и практической медицины. - 2008. - Том 1. С. 168-170.

5. Исхаков И.Р. Влияние сред, используемых при искусственном оплодотворении и культивировании эмбрионов, на свободнорадикальное окисление / Р.С. Исхакова, Д.С. Громенко, P.P. Фархутдинов // Научная дискуссия: вопросы медицины. - 2014. - № 2 (18). С. 134-139.

6. Исхаков И.Р. Культивирование эмбрионов человека на ранних этапах и свободнорадикальное окисление / Р.С. Исхакова // Медицина: актуальные вопросы и тенденции развития. — 2013. — С. 126-130.

7. Исхаков И.Р. Нарушение репродуктивной функции женщин и свободнорадикальное окисление / Р.С. Исхакова // Мед. Вестник Башкортостана. — 2013. -№6. С. 33-35.

8. Исхаков И.Р. Оценка состояния свободнорадикального окисления на этапах раннего эмбриогенеза / Р.С. Исхакова, P.P. Фархутдинов // Мед. Вестник Башкортостана. - 2014. - № 4. С. 135-137.

9. Патент РФ на изобретение № 2342942 «Средство растительного происхождения. обладающее аитиоксидантной активностью», 2007.

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

ВАК - высшая аттестационная комиссия

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ИКСИ — интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида

МДА - малоновый диальдегид

ОАА - общая антиоксидантиая активность

ПвФ - провоспалительные факторы

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СпС - спонтанное свечение

СРО - свободнорадикальное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФЖ - фолликулярная жидкость

ХЛ - хемилюмипесценция

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

Вт - Blastocyst medium

Cm - Cleavage medium

Fm - Fertilization medium

NADPH-оксидаза - Никотинамидадениндинуклеотидфосфат-Н-оксдаза PLA2 - фосфолипаза A2

ИСХАКОВ ИЛЬДАР РИНАТОВИЧ

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ НА ЭТАПАХ РАННЕГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» , РБ, г. Уфа, а/я 1293; тел.: (347) 250-81-20; тел./факс (347) 250-13-82.

Подписано в печать 24.12.14 г. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,15. Тираж 100. Заказ № 850.