Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Совершенствование методов стандартизации и разработка антимикробных препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного

На правах рукописи

Макарова Алёна Сергеевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ И РАЗРАБОТКА АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО, ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО И ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

11 АВГ 2015

Самара-2015 005571332

005571332

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Хазиев Рамиль Шамилевич

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Мусина Динара Табрисовна

Официальные оппоненты:

Ханина Миниса Абдуллаевна, доктор фармацевтических наук, профессор, государственное образовательное учреждение высшего образования Московской области «Московский государственный областной гуманитарный институт», кафедра химии, и.о. заведующей кафедры

Сысоева Мария Александровна, доктор химических наук, профессор; федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», кафедра пищевой биотехнологии, заведующая кафедрой

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск

Защита состоится <М> СС/1Пгода в ^^тсов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443079, г. Самара пр. К.Маркса, 165 Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (443001, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171) и на сайте (http://vAvw.samsmu.ru/science/referat3) государственного бюджетного образовательного учреждения, высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан года

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент -¿^Гстёй^ / Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эфиромасличные и флавоноидсодержащие растения составляют основной массив наиболее популярных и широко используемых лекарственных растений (JIP). Интенсивное изучение химического состава этих JIP привело к открытию в них новых групп природных соединений, ответственных за те или иные виды биологической активности. К таким JIP относятся широко применяемые в медицинской практике эфиромасличные растения: виды эвкалиптов (в РФ основной используемый вид -Eucalyptus viminalis Labill.) и шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.). Открытие японскими учеными в начале 80- х годов прошлого века в Eucalyptus globulus L., соединений, названных эуглобалями, дало начало интенсивному изучению этой новой группы природных соединений из класса терпеноидных фенолальдегидов. В шалфее лекарственном были открыты биологически активные вещества (БАВ) - дитерпеновые кислоты и производные розмариновой кислоты. Описанные соединения проявляют различные виды биологической активности, в том числе и антибактериальную в отношении грамположительной микрофлоры.

В РФ официнапьными являются два вида зверобоя - зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый (четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz.) [Киселева Т.Л. и др., 2008; Самылина И.А. и др., 2003; 2010]. Их действующим началом в отечественной практике признаются флавоноиды, по содержанию которых осуществляется стандартизация сырья. С другой стороны, именно отечественным ученым принадлежит приоритет открытия в зверобое продырявленном гиперфорина и его производных (особого класса ацилфлороглюцинов), проявляющих высокую антибактериальную активность.

Согласно существующей в настоящее время для указанных видов сырья нормативной документации (НД) только для листьев эвкалипта прутовидного предусмотрена стандартизация по фенолальдегидам. Оценка качества листьев шалфея и травы зверобоя не предусматривает определение целевых веществ -носителей антибактериальной активности. В связи с этим изыскание новых подходов к стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного является актуальным исследованием с точки зрения усовершенствования оценки качества сырья по целевым компонентам (носителям антибактериальной активности).

В разные годы отечественными учёными были разработаны антибактериальные препараты на основе листьев эвкалипта («Эвкалимин», «Хлорофиллипт», «Гапенофиллипт»), листьев шалфея («Сальвин») и травы зверобоя продырявленного («Новоиманин»), Однако стандартизация большей части из них не предполагала оценку содержания действующих веществ, отвечающих за антибактериальную активность. Стандартизация проводилась по антибактериальному титру в отношении золотистого стафилококка. К сожалению, большинство из упомянутых выше растительных антибактериальных препаратов в настоящее время на рынке отсутствуют. На фармацевтическом рынке РФ

ъ

представлены и занимают устойчивое положение только антибактериальные препараты из листьев эвкалипта прутовидного («Хлорофиллипт» и его аналоги), поэтому расширение исследований по разработке усовершенствованных антибактериальных препаратов на основе указанных видов сырья является современной и назревшей задачей.

Степень разработанности темы. Поиск в химическом составе лекарственного растительного сырья (JIPC) соединений с антибактериальной активностью занимает важное место в современной науке, о чём свидетельствует большой объём публикаций в специализированных научных журналах. В изучении терпеноидных фенолальдегидов листьев эвкалипта (основных носителей антибактериальной активности сырья) выделяются группы японских исследователей (T.Masuda, J.P.Singh, M.Murata и др.). Изучением фенолальдегидов в СССР занималась группа исследователей ВИЛАРа под руководством A.A. Савиной. Разработке препаратов антимикробного действия на основе листьев эвкалипта посвящены работы Н.М. Крутиковой, В.Л.Надтока, И.Н. Зилфикарова. Антибактериальный препарат на основе листьев шалфея лекарственного был разработан научной группой под руководством И.А. Дербенцевой; впервые было показано, что ответственными за антимикробную активность сырья являются дитерпеновые кислоты (кислота карнозоловая). Вопросами стандартизации листьев шалфея лекарственного, а также разработке препаратов на их основе с контролируемыми показателями качества активно занимаются в ЗАО «Вифитех» под руководством И.Н. Зилфикарова. В результате исследования антимикробных веществ зверобоя продырявленного группой научных сотрудников Института микробиологии АН УССР В.Г. Дроботько, Б.Е. Айзенман, П.И. Киселем, М.О. Швейгер и С.И. Зелепухой был изучен и внедрен в медицинскую практаку антимикробный препарат иманин (гиперфорин и его производные). Изучением антимикробных свойств препаратов на основе травы зверобоя продырявленного занимались С.И. Зелепуха, H.A. Дербенцева, A.C. Рабинович и другие. Однако, несмотря на многолетний опыт исследований в области изучения описанных видов ЛРС, задачи по стандартизации сырья и получению усовершенствованных препаратов на его основе решены не в полной мере.

Цель диссертационного исследования. Целью настоящего исследования является совершенствование методов определения групп соединений, обладающих антибактериальной активностью, в листьях эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и траве зверобоя продырявленного и их выделения для

получения антибактериальных препаратов.

Задачи исследования. При достижении поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести аналитический обзор данных литературы по современному состоянию исследований в области анализа листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного и методов стандартизации лекарственных препаратов, разработанных на их основе.

2. Разработать методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного с позиций определения основной группы БАВ, отвечающей за антибактериальную активность.

3. Оценить уровень антибактериальной активности извлечений из листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного в отношении грамположительных микроорганизмов (на примере S. aureus) для изучения возможности получения новых антибактериальных препаратов.

4. Разработать оптимальные условия экстракции БАВ, отвечающих за антибактериальную активность, из изучаемых видов ЛРС.

5. Предложить методы анализа полученных препаратов с антибактериальной активностью

6. Изучить возможность комплексной переработки ЛРС, обладающего антибактериальным действием

Научная новизна. Была показана возможность целевой экстракции действующих веществ эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного, зверобоя продырявленного липофильными растворителями.

Впервые для интерпретации экспериментальных данных, полученных при экстракции дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного, была сформулирована математическая модель взаимодействия целевых соединений с внутриклеточными структурами сырья. В результате апробации модели показано, что общая схема экстрагирования может быть сведена к рассмотрению «свободной» и «связанной» фракций целевых соединений.

Впервые обоснована целесообразность проведения стандартизации листьев шалфея по двум группам природных соединений - дитерпеновым и гидроксикоричным кислотам.

На основании целевой экстракции действующих веществ разработаны спекгрофотометрические методики стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного.

Предложен рациональный способ получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного на основе целевой экстракции фенолальдегидов, активного в отношении грамположительных микроорганизмов, в том числе и антибиотикорезистентных штаммов золотистого стафилококка. Подана заявка на изобретение (№ заявки 2014139368/15, дата подачи заявки: 29.09.2014). Разработаны методы стандартизации препарата по конкретной группе БАВ, отвечающей за антибактериальную активность -фенолальдегидам.

Впервые в рамках изучения возможности комплексного использования травы зверобоя продырявленного предложена схема переработки сырья, включающая в себя две основные стадии: первая - получение антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного на основе целевой экстракции производных гиперфорина; вторая - получение из оставшегося шрота настойки, содержащей соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).

Практическая значимость. Разработанные методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного (по терпеноидным фенолальдегидам), шалфея лекарственного (по дитерпеновым кислотам) и травы зверобоя продырявленного (по производным гиперфорина) используются в учебном процессе на кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «КГМУ» при изучении подходов к стандартизации указанных ЛР (акт внедрения ГБОУ ВПО «КГМУ» от 20.02.2015), апробированы в процессе работы Казанского филиала ФГБУ «Информационно-методического центра по экспертизе, учёту и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (акт внедрения от 20.02.2015) и предприятия ОАО «Татхимфармпрепараты» (акт внедрения от 26.02.2015).

Предложен способ получения антибактериального препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного, показатели качества и методы их оценки. Установлен уровень антибактериальной активности препарата, превосходящий таковую у растительных препаратов - «Хлорофиллипт», «Галенофиллипт». Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного» был отмечен Венчурным фондом РТ в рамках проводимого конкурса «50 инновационных идей для РТ» как перспективный для решения проблемы эффективной и рациональной антибактериальной терапии инфекционных заболеваний, особенно заболеваний, индуцированных микрофлорой, резистентной к большинству часто применяемых антибактериальных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по разработке методов стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного по основным группам БАВ, отвечающих за антибактериальную активность.

2. Математическая модель экстрагирования дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного.

3. Экспериментальные данные по разработке препаратов на основе изучаемых видов ЛРС при рассмотрении фенолальдегидов (листья эвкалипта прутовидного), дитерпеновых и гидроксикоричных кислот (листья шалфея лекарственного) и производных гиперфорина (трава зверобоя продырявленного) в качестве основных веществ, ответственных за антибактериальную активность.

4. Методы, используемые для стандартизации антибактериальных препаратов из листьев эвкалипта прутовидного и травы зверобоя продырявленного.

5. Результаты по оценке антибактериальной активности препарата из листьев эвкалипта прутовидного в отношении штаммов S. aureus, в том числе антибиотикоустойчивых.

6. Схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 86-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл-корр. Академии наук РТ, проф. И.Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012 г.); 87-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных, посвященной 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013); 88-ой

Всероссийской научно-практическая конференции студентов и молодых учёных, посвящённой 200-летию КГМУ (Казань, 26-27 марта 2014); Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.); Российской научно-практической конференции «Эффективная аптека - новые технологии и возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и менеджеров аптек и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014г.).

Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного» стал победителем конкурса «50 инновационных идей для РТ» (Казань, 2014), финалистом «Молодёжного научно-инновационного конкурса» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Казань, 2014).

Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»: «Исследования в области совершенствования контроля качества JIPC, содержащего БАВ различной природы, с учетом перехода их в используемые лекарственные формы» (№ Государственной регистрации 01201174259) и программы «Совершенствование методов стандартизации и разработка антимикробных препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного» (№ Государственной регистрации 114120240054).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 работы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 1 работа в журнале, входящем в базу данных Scopus.

Личный вклад автора. Результаты, изложенные в диссертации, получены на базе экспериментов, проводимых лично автором. В рамках диссертации проведены исследования по разработке подходов к стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного. Разработаны проекты изменения к фармакопейным статьям (ФС) на описанные виды сырья. Комплекс исследований по оценке содержания фенолапьдегидов в извлечениях из листьев эвкалипта прутовидного и микробиологические испытания, проведённые автором, позволили предложить способ получения и методы стандартизации антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного, проявляющего высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных микроорганизмов (на примере S. aureus), в том числе и антибиотикоустойчивых штаммов по сравнению с имеющимися аналогами. Автором предложена схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного, включающая в себя получение препарата антибактериального действия и настойки.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, результаты исследований иллюстрированы 43 таблицами и 34 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общих выводов,

списка литературы, включающего в себя 129 источников, из которых 67 на

иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель и задачи, отмечена научная новизна и практическая значимость работы, изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит систематизированный обзор отечественной и зарубежной литературы по современным исследованиям ЛРС (эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного), обладающего антибактериальной активностью. Систематизированы данные литературы о химическом составе, биологической активности и вопросам стандартизации сырья.

В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования. Описаны методики обнаружения и идентификации, количественного анализа БАВ листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного.

В главе 3-5 приводятся результаты собственных исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС с позиций определения основной группы БАВ, отвечающей за антибактериальную активность; разработке препаратов на основе изучаемых видов ЛРС и методов их анализа; оценке уровня антибактериальной активности извлечений из ЛРС; изучению возможности комплексной переработки сырья.

В приложение вынесены материалы, подтверждающие практическую значимость диссертационного исследования: проекты изменения к фармакопейным статьям на сырьё, акты внедрения.

Результаты, полученные при проведении экспериментальных исследований, обработаны статистически и представлены по тексту диссертации в таблицах, формулах, рисунках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методы исследования

Объектами диссертационного исследования являлось следующее ЛРС: -листья эвкалипта прутовидного: цельные, заготовленные в разные годы в Сирии, Марокко (2007 - 2008 гг.), Абхазии (2007 - 2011 гг.); приобретённые на рынках г. Казани, г. Чебоксары (2012 - 2013 гг.); измельчённые, фасованные различных отечественных производителей (ОАО «Красногорсклексредства», ООО «Фитофарм», ЗАО «Здоровье», образец ОАО «Татхимфармпрепараты»); -листья шалфея лекарственного цельные, заготовленные в ботаническом саду КГМУ (2012 - 2013 гг.), и измельчённые, фасованные различных производителей: (ЗАО «Ст-Медифарм», ОАО «Красногорсклексредства», ООО «Фитофарм», ЗАО «Здоровье», ООО «Фитобот»);

- трава зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого, заготовленные в июне -июле 2010 - 2011 гг. в Республике Татарстан.

Для проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ) применяли силикагелевые пластины «БотЫи ПТСХ-АФ-В" 15x15см и «БогЬА! ПТСХ-АФ-В-УФ" 15x15см. Детектирование проводили в видимом и УФ-свете (при длинах волн 254 и 365 нм).

УФ-спектры записывались на спектрофотометрах LAMBDA-25 (PerkinElmer, США) и Evolution 220 (ThermoScientific, США). Измерения оптических плотностей исследуемых растворов проводили на отечественных спектрофотометрах ПЭ-5300В (НПО «Экрос») и СФ-46.

Для исследования антибактериальной активности извлечений из JIPC был использован метод двукратных серийных разведений в мясо-пептоном бульоне (МПБ) (рН 7,0) с музейными микробами: S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р и штаммами, полученными из носоглотки от здоровых носителей. Исследование антибактериальной активности препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного проводили в сравнении с отечественными аналогами -«Хлорофиллиптом» и «Галенофиллиптом».

2. Совершенствование методов стандартизации и разработка антибактериального препарата эвкалипта прутовидного 2.1. Совершенствование методов стандартизации листьев эвкалипта прутовидного

Вышедшие в последние годы НД различных производителей (ОАО «Красногорсклексредства», ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга», ООО ПКФ «Фитофарм») помимо определения эфирного масла стандартизуют листья эвкалипта прутовидного и по содержанию терпеноидных фенолальдегидов. При небольших различиях метод определения фенолальдегидов в этих НД принципиально один и тот же — фенолальдегиды экстрагируются 70 или 95% спиртом и полученный раствор фотометрируется при 278 нм.

Получаемые данными методиками результаты многократно выше минимального нормируемого уровня (до трех раз), что объясняется влиянием на измеряемую оптическую плотность присутствующих в извлечениях других фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ).

Чтобы избежать влияния на измеряемую оптическую плотность фенольных соединений, для целевой экстракции фенолальдегидов мы использовали липофильный растворитель - гексан.

УФ-спектр гексанового извлечения (рис. 1) имел отчётливый максимум при длине волны 278 ± 3 нм без «плеч» в диапазоне длин волн 320 - 360 нм, что свидетельствовало о наличии фенольных соединений (фенолальдегидов) и об отсутствии в извлечении таких веществ как фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды.

Дополнительно присутствие в гексановом извлечении фенолальдегидов и отсутствие других групп фенолов подтверждали методом ТСХ. На пластинках «Sorbfil» в системе хлороформ - спирт (1:1) были обнаружены после обработки проявляющими реактивами (1% водный раствор железоаммонийных квасцов и 0,5% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 M растворе хлористоводородной кислоты) 3 зоны адсорбции с величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7 (рис. 2). Использование в качестве проявителя железоаммонийных квасцов показало присутствие трёх соединений фенольной природы. Эти же соединения окрасились 2,4-динитрофенилгидразином (специфическим реактивом на альдегидную

группу), что подтвердило их принадлежность к фенолальдегидам. Других окрашенных пятен на хроматограмме не наблюдалось.

Ъ-ОЛ

1^.0.6 • •

Иг-СМ • •

__J___

_ __ 1 2

Рис. 1. УФ-спектр гексанового извлечения из листьев эвкалипта прутовидного

Рис. 2.ТСХ гексанового извлечения из листьев эвкалипта прутовидного. 1 - проявлено 2,4-динитрофенилгидразином; 2- проявлено железоаммонийными квасцами

При разработке метода количественного определения фенолальдегидов в сырье было установлено, что максимальное извлечение достигается при использовании сырья с размером частиц 1 мм, экстракции при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин. и соотношении сырья и экстрагента 1:200. Фотометрирование аликвоты раствора проводят при 278 нм. Для расчета содержания фенолальдегидов использовали удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина равный 720. Ошибка метода составила 2,33%.

В табл. 1 представлены основные показатели и нормы качества листьев эвкалипта прутовидного, которыми могут быть дополнены НД на этот вид растительного сырья.

Разделы ФС Метод анализа Нормы

Фенолальдегиды тех На хроматограмме испытуемого раствора должны наблюдаться пятна оранжевого (2,4-динитро-фенилгидразин в 2 М растворе хлористоводородной кислоты) и тёмно-фиолетового цвета (1% раствор железоаммонийных квасцов), принадлежащие фенолальдегидам с Ш' около 0,4, 0,6 и 0,7.

Спектрофо-тометрия УФ-спектр раствора гексанового извлечения, приготовленного по разделу «Количественное определение», должен иметь отчётливый максимум поглощения при 278 ± 3 нм

Сумма фенолальдегидов^ Спектрофотометр ия Не менее 1,5

2.2. Разработка способа получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного Учитывая хорошую растворимость фенолальдегидов в неполярных растворителях типа гексана, мы изучили динамику высвобождения этих соединений из сырья эвкалипта прутовидного, заменив из экономических соображений гексан на более доступный петролейный эфир 40/70 (рис. 3).

х,.%

Рис. 3. Гистограмма высвобождения фенолальдегидов из листьев эвкалипта прутовидного при экстракции петролейным эфиром 40/70. Черные столбцы - результаты последовательных экстракций при t = 1 час; серые столбцы — результаты последовательных экстракций при t = 30 мин.

На основании полученных результатов был разработан способ получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного, основанный на двукратной экстракции сырья в соотношении 1:50 в экстракционной колбе общей продолжительностью 1 час. Подобный подход позволяет извлечь около 90% всех фенолальдегидов, значительно минимизирует число стадий получения, как следствие повышает сохранность действующих веществ на выходе, исключает использование растворителей с высокой степенью токсичности, обеспечивает устойчивость в процессе хранения в связи с отсутствием чувствительных к действию света хлорофиллов.

2.3. Оценка антибактериальной активности препарата из листьев эвкалипта прутовидного Количественную оценку антибактериального действия препарата из листьев эвкалипта прутовидного (условно названного нами «Флорофелиптом») проводили в сравнении с препаратами «Хлорофиллипт (1% раствор спиртовый) и «Галенофиллипт». Сравнивали показатели минимальной подавляющей концентрации (МПК) препаратов, оказывающей бактерицидное действие на клетку S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р (табл. 2).

Таблица 2.Антибактериальная активность препаратов из листаев эвкалипта

Препарат Максимальное разбавление извлечения, оказывающее бактерицидное действие на клетку,?. aureus МПК препарата, мкг/мл

АТСС 6538-Р MRSA 205-Р АТСС 6538-Р MRSA 205-Р

«Флорофелипт» 1:1280 1:640 7,8 15,63

«Хлорофиллипт 1:512 1:64 19,5 156,25

«Галенофиллипт» 1:256 1:64 39,06 156,25

Полученные результаты показали, что антибактериальная активность «Флорофелипта» на музейном штамме S. aureus в 2,5 раза выше, чем у «Хлорофиллипта» и в 5 раз выше, чем у «Галенофиллипта». Для музейного штамма, устойчивого к метициллину, разница в активности отличалась в 10 раз. 2.4. Подходы к стандартизации «Флорофелипта» - антибактериального

препарата из листьев эвкалипта прутовидного Для включения в раздел «Подлинность» НД на препарат предложены методики обнаружения фенолальдегидов методом ТСХ и УФ-спектрофотометрии. Для количественной оценки фенолальдегидов в препарате предложен метод прямой спектрофотометрии в пересчете на ГСО эвкалимина при 278 нм, ошибка метода не превышает 1,09%. Показатели и нормы качества «Флорофелипта» представлены в табл. 3.

Таблица 3. Основные показатели и нормы качества антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного

Показатель качества

Описание

Подлинность Фенол альдегиды

Антибактериальная активность

Количественное определение Сумма фенол-альдегидов, %

Метод анализа

Визуальный

ТСХ

уф. спектрофотометр ия

Микробиологический метод_

УФ-

спектро-

фотометрия

Нормы

Прозрачная жидкость бледно-желтого цвета, запаха.

без

На хроматограмме испытуемого раствора должны наблюдаться пятна оранжевого (2,4-динитро-фенилгидразин в 2 М растворе хлористоводородной кислоты и тёмно-фиолетового цвета (1% раствор железоаммонийных квасцов), принадлежащие фе-нолальдегидам с ЯГ около 0,4, 0,6 и 0,7

УФ-спектр поглощения раствора препарата, приготовленного по разделу «Количественное определение», в области от 230 до 280 нм должен иметь отчётливый максимум поглощения при 278 ± Знм

Препарат должен подавлять рост тест культуры Я.аигет АТСС 6538-Р в концентрации не менее 7,8 мкг/мл _

Не менее 0,9

3. Совершенствование методов стандартизации и технологии извлечений листьев шалфея лекарственного 3.1. Разработка метода количественного определения дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного В настоящее время стандартизация листьев шалфея НД проводится только по содержанию эфирного масла. Вместе с тем, есть публикации, в которых предлагается стандартизовать это сырье спектрофотометрическим методом по содержанию суммы дитерпеновых кислот (Зилфикаров и др.). Наши исследования показали, что данная методика даёт завышенные результаты, обусловленные вкладом в оптическую плотность раствора других соединений фенольной

природы. На УФ-спектре ацетонового извлечения, полученного в соответствии с

Рис. 4. УФ-спектр ацетонового Рис. 5. УФ-спектр ацетонового очи-

(неочищенного) извлечения из листьев (щенного) извлечения из листьев

шалфея лекарственного шалфея лекарственного

Второй максимум поглощения характерен для гидроксикоричных кислот, которые вносят свой вклад в оптическую плотность раствора, измеряемого при аналитической длине волны (285 ± Знм). После очистки ацетонового экстракта высота этого пика уменьшилась, однако он выражен, следовательно, часть этих соединений осталась в растворе после очистки (рис. 5).

Чтобы избежать влияния на измеряемую оптическую плотность других фенольных соединений, для целевой экстракции дитерпеновых кислот мы использовали липофильный растворитель - петролейный эфир 40/70. УФ-спектр извлечения (рис. 6), не имеет максимумов поглощения в районе 330 нм, а только отчетливый максимум при 285 ± 3 нм.

Рис. 6. УФ-спектр извлечения из листьев S. officinalis, полученного при экстракции петролейным эфиром 40/70

После установления факта избирательной экстракции дитерпеновых кислот петролейным эфиром 40/70 с целью выбора оптимального режима экстракции изучали кинетику извлечения целевых веществ. Более 85% дитерпеновых кислот оказывается в растворе уже к начальному моменту времени (рис. 7). Далее, кривая выхода экстракта растёт в течение 10-20 мин, достигает своего максимального

значения и сохраняет его до конца экстракции, г < 120 мин. Подобное поведение кривой характерно для различных соотношений сырья и экстрагента (рис. 8).

х.%

А

Г9

8

Рис. 7. Динамика экстракции дитерпе-новых кислот при значении £=1:100. Круги - экспериментальные данные, квадраты - сплошная линия - среднее значение (х = 2,4%) по всем экспериментам (при /> 20 мин).

О 40 80 I, мин

Учитывая полученные данные, целевые вещества в сырье (дитерпеновые кислоты) можно условно разделить на две части: "свободная" фракция», (характеризуется слабым взаимодействием с сырьём и выделяется в растворитель к начальному моменту времени) и "связанная" фракция (для извлечения необходимы пониженные концентрации действующих веществ в растворе). Выдвигаемая гипотеза свидетельствует о принципиальной необходимости использования методик, основанных на многократной экстракции, (рис. 9).

х, %

1:50 1:100 1:150 1:200 L, г/мп

Рис. 8. Динамика экстракции дитерпе-новых кислот при различных значениях L. Серые столбцы - t = 20 мин, черные столбцы — / = 60 мин.

Ш ¡L Ib И И

1:100

1:400 L. г/'мл

Рис. 9. Трехкратная экстракция при различных значениях Ь. Черные столбцы - результаты последовательных повторностей экстракции при одном и том же Ь\ серые столбцы - суммарное извлечение для соответствующего соотношения; белые столбцы (заливка) -извлечение для соответствующего соотношения Ь за третью экстракцию. Время каждой экстракции 20 мин.

Установлено, что максимальное извлечение достигается при использовании мелко измельченного сырья (размер частиц менее 200 мкм), двухкратной экстракции при нагревании на кипящей водяной бане продолжительностью 20 мин. каждая и соотношении сырья и экстрагента 1:200. Фотометрирование раствора проводят при длине волны 285 нм. Для расчета содержания суммы дитерпеновых кислот использовали удельный показатель поглощения карнозоловой кислоты равный 40,92. Ошибка метода составила 2,38%.

3.2. Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея лекарственного

Листья шалфея используются в форме спиртовых («Сальвин-ВИФ») и водных (настой) извлечений. Учитывая кислотный характер действующих веществ сырья и их способность образовывать соли, мы предположили возможность совершенствования технологии экстракционных препаратов шалфея исходя из этой особенности. Для спиртовых извлечений использовали предварительное подкисление сырья для перевода солевых форм в свободные (лучше растворяются в органических растворителях), а для водных, напротив, получение солевых форм добавлением гидрокарбоната натрия (табл.4,5). Таблица 4. Антибактериальная активность спиртовых извлечений го листьев шалфея

Экстр агент Степень экстракции,% Количество извлеченных дитерпеновых кислот в % от массы сырья Концентрация дитерпеновых кислот в извлечениях, % Максимальное разбавление извлечения, ин-нактивирующее размножение микроба МПК препарата, мкг/мл

Спирт этиловый 95% 53,96±3,6 3,4±0,22 0,23±0,02 1:256 39,06

Спирт этиловый 95%* 86,09±5,84 5,50±0,23 0,37±0,02 1:512 19,53

■ - сырьё смочено 1% раствором хлористоводородной кислоты

Экстр агент Гидромодуль Степень экстракции, % Количество извлечённых дитерпеновых кислот в % от массы сырья Концентрация дитерпеновых кислот в извлечениях,%

Вода очищенная 1:10 9,72 ±1,15 0,62 ± 0,09 0,06 ± 0,009

1% раствор ЫаНСОз 1:10 33,49 ± 2,29 2,15 ±0,15 0,21 ±0,02

Вода очищенная 1:20 19,77 ± 1,43 1,25 ±0,1 0,06 ± 0,004

1 % раствор ХаНСОз 1:20 69,23 ±5,47 4,34 ±032 0Д2 ± 0,01

Продолжение таблицы 5

Экстр агент Гидромодуль Степень экстракции, % Количество извлечённых дитерпеновых кислот в % от массы сырья Концентрация дитерпеновых кислот в извлечениях,%

Вода очищенная 1:33 24,24 ±2,22 1,55 ±0,1 0,05 ± 0,004

1% раствор NaHCOj 1:33 75,39 ±8,80 4,82 ± 0,59 0,14 ±0,02

Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены параметры оптимальной технологии настоя из листьев шалфея.

Экспериментальные данные показали, что предложенные способы получения извлечений из листьев шалфея в разы повышают их активность в отношении золотистого стафилококка.

Были определены технологические параметры получения настоя из листьев шалфея. Установлено, что максимальное извлечение дитерпеновых кислот достигается при экстракции 1% раствором натрия гидрокарбоната на кипящей водяной бане в течение 15 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:20 (табл. 5). Антибактериальная активность настоя, полученного описанным способом, составила 39,06 мкг/мл.

Для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и водных извлечениях использовали методику, предложенную И.Н. Зилфикаровым с соавторами. Однако, как отмечалось выше, данная методика определяет, скорее всего, суммарное содержание дитерпеновых и гидроксикоричных кислот. Поскольку нами было показано, что дитерпеновые кислоты можно избирательно извлечь из сырья петролейным эфиром, мы провели изучение антибактериальной активности спиртовых извлечений, полученных из сырья, до и после экстракции его этим растворителем (табл. 6).

Таблица 6. Антибактериальная активность извлечений из листьев шалфея лекарственного на культурах S. aureus_

Спиртовый раствор (1:10), полученный БАВ, отвечающие за антибактериальную активность Максимальное разбавление извлечения, инактивирующее размножение S. aureus

АТТС 6538-Р MRSA 205-Р

из листьев шалфея необработанных петролейным эфиром Сумма дитерпеновых и гидроксикоричных кислот 1:256 1:64

из листьев шалфея обработанных петролейным эфиром Гидроксикоричные кислоты 1:64 1:64

растворением сухого отстатка после отгонки петролейного эфира Дитерпеновые кислоты 1:32 1:16

Результаты показали, что антибактериальной активность спиртового раствора, полученного из петролейного экстракта шалфея (содержавшего только

дитерпеновые кислоты без примеси других фенольных соединений) в сравнении с суммарным спиртовым экстрактом была в 8 раза ниже. Эти результаты свидетельствуют о наличии антибактериальной активности не только у дитерпеновых кислот, но и у других фенольных соединений (прежде всего гидроксикоричных кислот), которые остаются в сырье после экстракции его петролейным эфиром. Таким образом, стандартизацию сырья необходимо проводить по двум группам указанных соединений.

3.3. Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного

Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея рационально использовать унифицированный метод определения гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи. Показано, что более 90% действующих веществ выходит в раствор уже по истечению 20 - 30 мин, что позволяет говорить об исчерпывающей экстракции гидроксикоричных кислот за заданное в методике время (рис. 10)

Рис. 10. Динамика экстракции гидроксикоричных кислот при значении Ь= 1:400. Круги - экспериментальные данные, сплошная линия - среднее значение (х = 4,38%)

° °

^ ^ о

о о

О 30 60 90 П

Метод был апробирован как на нативном сырье, так и на сырье, обработанным петролейным эфиром, что послужило дополнительным доказательством того, что в необработанном сырье при использовании данной методики оцениваются только гидроксикоричные кислоты (табл. 7).

Таблица 7. Содержание гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного, %

Листья шалфея Содержание гидроксикоричных кислот, %

необработанные петролейным эфиром 4,25±0,29

обработанные петролейным эфиром листья 4,29±0,19

В табл. 8 представлены основные показатели и нормы качества листьев шалфея лекарственного, которыми могут быть дополнены НД на этот вид растительного сырья.

Разделы ФС Метод анализа | Нормы

Внешние признаки Оставлен без изменений (ст. 22 ГФ XI)

Числовые показатели Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы дитерпеновых кислот и суммой гидроксикоричных кислот

Разделы ФС Метод анализа Нормы

Количественное определение Эфирное масло, % Метод 1 ГФ XI Не менее 0,8

Сумма дитерпено-вых кислот, % Спектрофотометрия Не менее 2,0

Сумма гидроксикоричных кислот, % Спектрофотометр ия Не менее 2,0

4. Совершенствование методов стандартизации и разработка антибактериального препарата травы зверобоя продырявленного 4.1. Совершенствование методов стандартизации травы зверобоя продырявленного

Возможность использования травы зверобоя для получения извлечений с антибактериальной активностью изучали с позиции идентификации гиперфорина в сырье двух видов зверобоя - Я. perforatum и Я. maculatum. Для качественного обнаружения гиперфорина использовали ТСХ-анализ на пластинках марки Сорбфил ПТСХ-АФ-А в системе гексан-этилацетат 9:1. Гиперфорин обнаруживали в виде пятен с Rf около 0,45 по интенсивной сине-фиолетовой флюоресценции в УФ-свете при 360 нм. Гиперфорин был обнаружен только в извлечении из травы Я. perforatum (рис. 11).

Для дополнительного подтверждения наличия гиперфорина в извлечении из Я. perforatum и отсутствия его в Я maculatum, нами были записаны УФ-спектры гексановых извлечений для двух видов зверобоя. УФ-спектр извлечения из Я. perforatum имел четко выраженный максимум при 278 нм, тогда как у Я. maculatum он практически отсутствовал (рис. 12).

-Н. maculatum

--Н. perforatum

В В

Дшна волны, ни

Рисунок 12. УФ-спектры гексановых извлечений из травы Я perforatum и Н. maculatum.

Рис. 11. ТСХ гексановых извлечений из травы Я perforatum (1) и Н. maculatum (2)

!

Присутствие гиперфорина в химическом составе только травы зверобоя продырявленного дополнительно показано при оценке антибактериальной активности извлечений из обоих видов зверобоя. Антибактериальная активность зверобоя продырявленного была в 4 раза выше зверобоя пятнистого (табл. 9).

Таблица 9. Антибактериальная активность извлечений из травы зверобоя продырявленного и травы зверобоя пятнистого (на культуре £ аигемАТТС 6538-Р)_

Спиртовой экстракт (1:20), полученный после удаления гексана Максимальное разбавление извлечения, иннактивирующее размножение S. aureus

Трава зверобоя продырявленного 1:512

Трава зверобоя пятнистого 1:128

При разработке метода количественного определения гиперфорина и его производных в сырье было установлено, что максимальное извлечение достигается при использовании сырья с размером частиц 1 мм, экстракции при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. и соотношении сырья и экстрагента 1:100. Фотометрирование аликвоты раствора проводят при 278 нм. Для расчета содержания производных гиперфорина использовали молярный показатель поглощения 6-10"4 М раствора гиперфорина равный 8200. Ошибка метода составила 1,53%.

В табл. 10 представлены основные показатели и нормы качества травы зверобоя продырявленного, . используемой для получения антимикробных препаратов, которыми могут быть дополнены НД на этот вид сырья.

Таблица 10. Основные показатели и нормы качества травы зверобоя продырявленного

Разделы ФС Метод анализа Нормы

Гиперфорин тех На хроматограмме испытуемого раствора должно наблюдаться пятна пятно с интенсивно-синей флуоресценцией (УФ-свет) с ЯГ около 0,45 (гиперфорин). Возможно присутствие других зон

Спектрофото-метрия УФ-спектр раствора гексанового извлечения, приготовленного по разделу «Количественное определение», должен иметь максимум поглощения при 278 ± Знм

Числовые показатели Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы производных гиперфорина

Количественное определение Сумма производных гиперфорина,% Спектрофотометр ия Не менее 1,0

4.2. Разработка способа получения антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного

Учитывая возможность эксрагироваания производных гиперфорина из травы зверобоя продырявленного гексаном, изучили динамику высвобождения этих соединений из сырья в аппарате Сокслета, заменив из экономических соображений гексан на более доступный петролейный эфир 40/70 (табл. 11).

Таблица 11.Содержание производных гиперфорина в извлечении из травы зверобоя продырявленного при экстракции петролейным эфиром 40/70, % _

Вариант экстракции Степень извлечения производных гиперфорина (% от суммы в сырье) Количество извлечённых производных гиперфорина (% от массы сырья) Концентрация производных гиперфорина в извлечении, %

Экстракция в аппарате Сокслета 96,35 ± 2,98 1,23 ±0,03 0,01 ± 0,003

На основании полученных результатов был разработан способ получения антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного, на основе экстракции сырья в аппарате Сокслета в соотношении 1:100 в экстракционной колбе общей продолжительностью около 3 часов (10 сливов экстрагента).

Предлагаемая технологическая схема антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного в условиях отсутствия готовой лекарственной формы с доказанным антибактериальным эффектом позволяет получить препарат, оказывающий бактериостатическое действие в отношении S. aureus ATCC 6538- Р в разведении 1:512 (19,5 миг/мл).

4.3. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного Для включения в раздел «Подлинность» НД на препарат предложены методики обнаружения производных гиперфорина методом ТСХ и УФ-спектрофотометрии. Для количественной оценки производных гиперфорина в препарате предложен метод прямой спектрофотометриив пересчете на гиперфорин при 278 им, ошибка метода не превышает 1,16%.

Предлагаемые показатели и нормы качества антибактериального препарата на основе травы зверобоя продырявленного представлены в табл. 12.

Таблица 12. Основные показатели и нормы качества препарата из травы зверобоя продырявленного __

Показатель качества Метод анализа Нормы

Описание Визуальный Прозрачная жидкость бледно-желтого цвета, без запаха.

Подлинность Гиперфорин ТСХ На хроматограмме испытуемого раствора должно наблюдаться пятно с интенсивно-синей флуоресценцией (УФ-свет при 360 нм) с Rf около 0,45. Возможно присутствие других зон.

УФ-спектро-фотометрия УФ-спектр поглощения раствора препарата, приготовленного по разделу «Количественное определение», в области от 230 до 280 нм должен иметь максимум поглощения при 278 ± Знм

Антибактериальн ая активность Микробиологический метод Препарат должен подавлять рост тест культуры S. aureus ATCC 6538-Рв концентрации не менее 19,5 мкг/мл

Количественное определение УФ- спектрофото- Не менее 0,2

Продолжение таблицы 12

Показатель качества Метод анализа Нормы

Сумма производных гиперфорина,% в пересчёте на ги-перфорин метрия Не менее 0,2

4.4.Исследование возможности комплексного использования травы зверобоя

продырявленного

Исходя из того, что экстракция петролейным эфиром 40/70 производных гиперфорина из травы зверобоя продырявленного довольно избирательна и другие группы БАВ зверобоя, такие как флавоноиды и дубильные вещества, не растворяются в нем, мы предположили, что шрот можно использовать для получения настойки зверобоя, в которой эти соединения являются активным началом. Из шрота таким образом была получена настойка в соотношении сырья и экстрагента 1:5 методами дробной мацерации и перколяции (табл. 13,14).

Таблица 13. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом перколяции 70% этанолом при настаивании в течение 7 суток_

Настойка (1:5,40% спирт) из травы зверобоя продырявленного Содержание флавоноидов, % (не менее 0,2 %) Сухой остаток, % (не менее 2,8 %)

необработанной петролейной эфиром 0,33± 0,01 3,59 ±0,02

обработанной петролейным эфиром 0,40± 0,01 4,05± 0,04

Таблица 14. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом дробной мацерации 70 % этанолом _

Настойка (1:5,40% спирт) из травы зверобоя продырявленного Содержание флавоноидов, % (не менее 0,2 %) Сухой остаток, % (не менее 2,8 %)

необработанной петролейным эфиром 0,31± 0,01 3,90 ±0,02

обработанной петролейным эфиром 0,45± 0,01 3,96± 0,04

Можно констатировать, что при получении антибактериального препарата из травы зверобоя предложенным экстракцией петролейным эфиром, возможно дальнейшее использование отработанного шрота для получения настойки зверобоя. Использование шрота травы зверобоя, оставшегося после обработки петролейным эфиром, для получения настойки, позволяет получать препарат с более высоким содержанием действующих веществ в сравнении с настойкой, приготовленной по той же технологии из травы зверобоя, необработанной петролейным эфиром

Выводы

1. Предложены подходы к стандартизации сырья и препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного,

заключающиеся в их анализе по основным группам БАВ, отвечающим за антибактериальную активность.

2. Разработаны методики качественного анализа листьев эвкалипта прутовидного и травы зверобоя продырявленного, основанные на обнаружении терпеноидных фенолальдегидов и производных гиперфорина соответственно, с использованием ТСХ-анапиза и УФ-спектрофотометрического метода.

3. С помощью предложенной математической модели экстрагирования дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного объяснены закономерности экстракции липофильных соединений из растительного материала присутствием «свободных» и «связанных» со внутренними структурами фракций сырья.

3. Разработаны методики количественного определения терпеноидных феноальдегидов (листья эвкалипта прутовидного), дитерпеновых кислот (листья шалфея лекарственного), производных гиперфорина (трава зверобоя продырявленного) с использованием метода УФ-спекгрофотометрии. Ошибка единичного определения содержания действующих веществ в сырье не превышает ± 2,33%; ±2,47% и ± 1,53% соответственно.

4. Обоснована необходимость стандартизации листьев шалфея лекарственного по двум группам природных соединений - дитерпеновым и гидроксикоричным кислотам, ответственным за антибактериальную активность сырья.

5. Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея предложено использовать унифицированный метод определения гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи.

6. Предложены способы получения антибактериальных препаратав на основе листьев эвкалипта прутовидного («Флорофелипт») и травы зверобоя продырявленного, заключающиеся в использовании оптимального экстрагента -петролейного эфира 40/70, позволяющего исчерпывающе извлекать основные БАВ, отвечающие за антибактериальную активность

7. Разработаны методики качественного и количественного анализа «Флорофелипта» и антибактериального препарата на основе травы зверобоя продырявленного с использованием ТСХ и УФ-спекгрофотометрического метода.

8. Микробиологические исследования показали высокую антибактериальную активность «Флорофелипта» в отношении S. aureus, в том числе и антибиотикоустойчивых штаммов, в сравнении с существующими аналогами.

9. Предложены технологические подходы к получению препаратов с высоким уровнем антибактериальной активности из листьев шалфея лекарственного, заключающиеся в извлечении БАВ кислого характера в свободной форме (для спиртовых извлечений), в форме солей (для водных извлечений).

10. Предложена схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного, включающая в себя две основные стадии: первая - получение антибактериального препарата на основе целевой экстракции производных гиперфорина; вторая - получение из оставшегося шрота настойки, содержащей соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).

11. На основании экспериментальных данных оформлены проекты изменения к ФС «Листья эвкалипта прутовидного», «Листья шалфея лекарственного», «Трава зверобоя продырявленного».

Практические рекомендации. Результаты диссертационной работы позволяют усовершенствовать методики анализа листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного и могут быть использованы в учебных процессах по курсам «Фармакогнозия» и «Фармацевтическая химия», а также в центрах сертификации и контроля качества ЛС и на фармацевтических предприятиях. Предложенные технологические схемы получения препаратов из ЛРС могут быть использованы на фармацевтических предприятиях в рамках получения лекарственных препаратов антибактериального действия.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования имеют важное научно-практическое значение для фармакогнозии и фармацевтической химии с целью дальнейшего изучения растений, обладающих антибактериальной активностью, разработке препаратов на их основе и современных подходов к стандартизации, заключающихся в анализе препаратов по основным группам соединений, отвечающим за фармакологический (антибактериальный) эффект.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хазиев, Р.Ш. Количественное определение терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного/Р.Ш.Хазиев, М.В.Васильева, А.С.Макарова, Л.Т. Мусина//Химия растительного сырья. - 2013. - № 3. - С. 155 - 159.

2. Хазиев, Р.Ш. Количественное определение производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного/Р.Ш. Хазиев, Л.И. Насыбуллина, A.C. Макарова, Л.Т. Мусина//Химия растительного сырья. - 2013. - № 4. - С. 121 - 125.

3. Хазиев, Р.Ш. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных по содержанию дитерпеновых кислот, и изучение их антимикробной активности/Р.Ш. Хазиев, A.C. Макарова, Л.Т. Мусина//Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 2. - С. 35 -38.

4. Саламатин, A.A. Кинетика экстракции биологически активных веществ из растительного сырья кипящим растворителем/А.А. Саламатин, Р.Ш. Хазиев, A.C. Макарова, С.А. Иванова/УТеорет. основы хим. технологии. - 2015. - Т. 49, №2.-С. 200-206.

5. Хазиев, Р.Ш. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных по содержанию дитерпеновых кислот/Р.Ш.Хазиев, А.С.Макарова// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр. -Пятигорск, 2012. - С. 177 - 178.

6. Макарова, A.C. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных по содержанию дитерпеновых кислот, и изучение их антимикробной активности/86-я Всероссийская студенческая научная конференция памяти чл-корр. Академии наук РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апр. 2012 г.): Сборник тезисов — Казань, 2012. — С. 355.

7. Макарова, A.C. Изучение антимикробной активности извлечений из листьев шалфея/86-я Всероссийская студенческая научная конференция памяти чл-корр.

Академии наук РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апр. 2012 г.): Сборник тезисов. - Казань, 2012. - С. 355-356.

8. Макарова, А.С. Совершенствование анализа листьев эвкалипта прутовидного/87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения JI.O. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. - Казань, 2013. - С. 342 - 343.

9. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности водных извлечений из листьев шалфея/87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. - Казань, 2013. - С. 409.

10. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности препарата из листьев эвкалипта прутовидного/87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. - Казань, 2013. -С. 409-410

11. Макарова, А.С. Совершенствование анализа листьев и препаратов эвкалипта прутовидного/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. МусинаУ/Материалы науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.). - Казань, 2013. - С. 80 - 81.

12. Макарова, А.С. Получение препарата из листьев эвкалипта прутовидного и оценка его антибактериальной активности/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина//Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 16 марта 2013). - Казань, 2013. - С. 149 - 150.

13. Макарова, А.С. Изучение корреляции между содержанием гиперфорина в извлечениях из травы Я. perforatum и Я. maculatum!А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина, Л.И.Насыбуллина//Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 16 марта 2013). - Казань, 2013. - С. 150 - 152.

14. Макарова, А.С. Оценка антибактериальной активности извлечений из листьев Salvia officinalis!А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина, А.Н.Николаева// Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 26 апреля 2014). - Казань, 2014. - С. 28 - 29.

15. Макарова, А.С. Совершенствование количественного анализа листьев шалфея лекарственного/А.С. Макарова, Р.Ш.Хазиев, Л.Т.Мусина, А.Н.Николаева// Материалы Российской науч.-практ. конф. «Эффективная аптека - новые технологии и возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и менеджеров аптек и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014 г.). - Казань, 2014. -С. 49-51.

16. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности извлечений из листьев шалфея лекарственного и эвкалипта прутовидного/88-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых учёных, посвящённая 200-летию КГМУ. - Казань, 26-27 марта 2014 г.): Сборник тезисов. - Казань, 2013.-С. 262-263.

Подписано в печать 28.07.2015 г. Формат 60x84 1Л6 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,5

Отпечатано в множительном центре Института истории АН РТ г. Казань, Кремль, подъезд 5 Тел. (843) 292-95-68, 292-18-09