Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств

На правах рукописи

ФаЙзуллнна Рената Ринатовна

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (Hypericum perforatum L.) ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА И ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

| Плеханова Татьяна Ивановна |

Научный консультант: кандидат фармацевтических наук

Мухамедзянов Рустам Маратович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Людмила Михайлов доктор фармацевтических наук, профессор Хомов Юрий Александрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится » й&с2005 г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 208.06S.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614000, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан« С » 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент

Е. В. Метелева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По данным ВОЗ во многих странах мира отмечен рост вагинальных инфекций, занимающих ведущее место в структуре гинекологических заболеваний. Это смэано с ранним началом половой жизни, частой смене партнеров, бесконтрольным приемом антибиотиков, снижением общего иммунного статуса организма. Чаще всего половая инфекция обусловлена несколькими патогенными факторами—вирусами, микробами, грибами, простейшими.

Традиционное лечение неспецифических воспалительных гинекологических заболеваний не всегда приводит к желаемому результату, т. к. оно зачастую локальное, без функционального, этнопато генетического подхода, что ведет к недостаточной эффективности, применяемых методов лечения и рецидивам.

Тенденция развития лекарственной терапии последних десятилетий характеризуется значительным использованием в медицине фитопрепаратов. Это объясняется прежде всего тем, что препараты растительного происхождения лучше переносятся больными, обычно не вызывают аллергических реакций и не оказывают побочного действия.

Одним из самых широко используемых лекарственных растений, как в народной, так и в научной медицине при различных заболеваниях является зверобой продырявленный (Нурепсщп регГогаАип Ь.). В последние годы возрос интерес к антрахиконовым пигментам зверобоя продырявленного - гиперицинам, т. к. у гиперицинсодержащих препаратов установлена противомикробная, про* тивовирусная и антиканцерогенная активность. В тоже время, несмотря на широкий изученный спектр фармакологической активности зверобоя продырявленного, число существующих официнальных препаратов из него весьма ограничено (настойка, экстракт), а противомикробные средства «Имаиин» и «Ново-иманин» сняты с производства.

Зверобой продырявленный имеет обширную сырьевую базу на территории Республики Башкортостан (РБ) и может служить доступным источником для получения противомикробных препаратов. Это очень важно, т. к. в настоящее время решается вопрос о расширении собственного фармацевтического производства в РБ. Поэтому изучение накопления биологически активных соединений (БАС) в растении в условиях данного региона и предложение методов

стандартизации сырь* в препаратов зверобоя продырявленного по содержанию антрахиноновых пигментов является актуальной задачей.

Перспективным также является разработка рациональной лекарственной формы на основе зверобоя продырявленного для комплексного лечения вагинальных инфекций, обладающей протнвомнкробным, противовирусным, нмму-номодулирующим, противовоспалительным действием.

Цепь и задачи исследования. Целью исследования является фотохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), произрастающего на территории Башкортостана; изыскание дополнительных методов стандартизации сырья и разработка нормативной документации на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного, а также создание оптимальной лекарственной формы на основе полученного полиэкстракта. В связи с этим, предстояло решить следующие задачи:

- провести ф иго химическое исследование зверобоя продырявленного флоры Башкортостана и предложить методы стандартизации по количественному содержанию гиперицинов;

- провести фотохимическое исследование сухого полиэкстракта зверобоя, предложить методы его стандартизации по гнкеркцинам н сумме флавоноидов; разработать нормативную документацию на сухой полюкстракт зверобоя как субстанцию для получения противомикробных лекарственных средств;

- изучить возможность получения рациональной лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя и предложить методы ее стандартизации.

Научная новнзня работы. Изучен состав основных БАС травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана, свидетельствующий о его доброкачественности и возможности использования в качестве источника для получения противомикробных средств. Выделены и идентифицированы: флавононды -рутин, кверцетин, лютеолнн, гиперозид; антраценпроизводные — гиперицин, псевдогнпернцин; фенилпропаноиды — кофейная и хлорогеновая кислоты; кумарин - умбеллиферон. Предложен метод количественного определения гиперицинов для дополнительной стандартизации сырья зверобоя продырявленного, а также сухого полиэкстракта зверобоя.

Впервые с использованием современных методов анализа изучен качественный состав эфирного масла травы зверобоя продырявленного флоры Баш-

кортостаиа. Идентифицировано 85 компонентов и установлено, что в составе эфирного масла преобладают сесквитерпеновые углеводороды, из которых в максимальном количестве содержится кариофиллеи оксид.

Впервые изучен химический состав сухого полиэкстракга из травы зверобоя продырявленного. Выделены н идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к группе флавоноидов (рутин, кверцетии, лютеолин, гилсроэнд), фенилпропаноидов (хлорогеновая и кофейная кислоты), кумарннов (умбеллиферон), антраценпронз водных (гиперяцин, псевдогмперицин).

Теоретически и экспериментально, с использованием метода математического планирования (латинский квадрат без повторных опытов) обоснована возможность получения лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя для применения в гинекологии - пекообразующие вагинальные таблетки. Установлены их показатели качества и срок хранения.

Практическая значимость. Обоснована целесообразность использования зверобоя продырявленного флоры Башкортостана я качестве источника доброкачественного сырья для получения противомикробных препаратов.

Методика количественного определения гнперицинов использовалась в работе ЗАО «Фармацевтическая компания Бионорм» и рекомендована дня включения в нормативную документацию на сырье и препараты зверобоя.

На основе полученных результатов разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Herba Hyperici — трава зверобоя», «Extractura Hyperici siccum - полиэкстракт зверобоя сухой», «Tabuletta vaginalis spumatae cum extracto Hyperici sicco 0,2 — таблетки вагинальные пенообразующие с полиэкстрактом зверобоя сухим 0,2».

Осуществлен выпуск опытной партии пенообралующих вагинальных таблеток с полиэкстрактом зверобоя сухим.

Полученные результаты используются в научных исследованиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапия Башкирского государственного медицинского университета.

Положения» выносимые на защиту:

• результаты фотохимического анализа зверобоя продырявленного флоры Башкортостана;

• результаты фнтохимического анализа сухого полиэкстракта зверобоя;

• результаты исследований по изучению возможности создания и стандартизации ленообразующих вагинальных таблеток с сухим полиэкстрактом зверобоя.

Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 работ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2001—2004 гг.); VI Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002); научно-практической конференции посвященной 20-летию фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2002); региональной научно-практической конференции «Технология выращивания и использование лекарственных культур» (Уфа, 2003); на совместном заседании кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, управления и экономики фармации, технологии лекарственных форм с курсом биотехнологии (Уфа, 2005).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Фармакология и фармация» и является фрагментом исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (номер государственной регистрации № 01990003625), государственной научно-технической программы Республики Башкортостан «Государственные приоритеты здоровья населения республики Башкортостан. Профилактика заболеваний и здоровый образ жизни» (номер государственной регистрации № 01200012029).

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста н состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована 27 рисунками и 38 таблицами. Список литературы включает 126 источников, в том числе -18 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы.

В первой главе приведен обзор литературы, в котором обобщены данные об изучении химического состава травы зверобоя продырявленного,

особенностей накопления БАС на территории Республики Башкортостан; о лекарственных средствах на основе травы зверобоя продырявленного, а также о современных подходах к стандартизации препаратов растительного происхождения.

, Глава вторая посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе приведены данные по фотохимическому исследованию основных групп БАС травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана: флавонондов, антраценпроизводных* дубильных веществ, феннлпропанондов, кумаринов, эфирного масла, микроэлементов.

В четвертой главе изложены материалы по фотохимическому исследованию и разработке методов стандартизации сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного.

В пятой главе представлены результаты изучения возможности получения и стандартизации прообразующих вагинальных таблеток « полиэкстрактом зверобоя продырявленного.

Приложение включает проекты ФСП «Herba Hyperici — трава зверобоя», «Extractum Hyperici siccum - полиэкстракт зверобоя сухой», «Tabuletta vaginalia spumatae cum extracto Hyperici sicco 0,2 — таблетки вагинальные пенообраэую-

4

щне с полиэкстрактом зверобоя сухим ОД» и материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования служили образцы травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforetura L.), собранные в фазу цветения в типичных местообитаниях в различных районах Республики Башкортостан (2001-2003 гг.) и полученный нами в лабораторных условиях сухой полиэкстракт (Extractum Hyperici siccum).

Изучение товароведческих показателей сырья проводили в соответствии с требованиями ГФ СССР XI изд.

Полиэкстракт зверобоя продырявленного получали согласно патенту на изобретение «Способ получения экстракта зверобоя» А 61 К 35/78 от 15.12.93.

Изучение показателей качества полиэкстракта сухого проводили в соответствии с требованиями общей статьи «Экстракты» (ГФ СССР XI изд.).

Для проведения качественного фитохимического анализа использовали химические реакции, методы восходящей бумажной хроматографии и в тонком слое сорбента, УФ-спектрофогометрин, хромагго-масс-спектромстрии, а также определение температуры плавления.

Количественное определение основных групп БАС проводили, используя лприметрические, спектрофотометрические и хромето-спектрофотометрические методы анализа.

Хромато-масс-спектрометрическое исследование выделенных веществ флавоноидной структуры осуществляли в Институте органической химии УИЦ РАН с использованием системы хроматограф — масс-спектрометр — ЭВМ; система обработки данных - НР ChemStation.

ХроматографическнЙ анализ эфирного масла зверобоя продырявленного проводили на базе химического факультета Башкирского государственного университета, с использованием гаэожидкостного хроматографа «Хромоген Кристалл 5000.)». Хромато-масс-спектрометрическое исследование эфирного масла выполняли с использованием хромагго-масоспектрометра «TRIO 1000».

Фотохимическое изучение зверобоя продырявленного флоры Башкортостана

В исследуемых образцах травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана подтвердили присутствие флавоноияов, ажраценпронзводных, кума-ринов, фенилпропаноидов и дубильных веществ.

Методом бумажной хроматографии и хроматографией в тонком слое в сравнении с аутентичными образцами нами установлено присутствие флаво-нондов - рутина, гиперозида лютеолина, кверцитина; кумарина - умбеллифе-рона; фенилпропаноидов - хлорогеновой н кофейной кислот; по величине Rr, флуоресценции и в сопоставлении с литературными данными определили гипе-рицин. Все вещества были препаративно выделены и идентифицированы по температуре плавления (в том числе и «проб смешения») и с помощью УФ — спешрофотомпрни.

В таблице 1 приведены физические характеристики выделенных веществ из травы зверобоя.

Выделенную из травы зверобоя сумму флавонондов подвергли также хро-мато-масс-спектрометрическому и масс-спектрометрическому анализу. На хро-мато-масс-спектре пики осколочных ионов с m/z 13.43,16.15,16.52,23.08 были идентифицированы как триметкленлильные производные D-рибофураиозы (13.43), D-глюкозы (16.15), D-маннозы (16.52), D-глюкуроиовоЙ кислоты (23.08). Присутствие веществ флавононцной структуры на данном спектре установит не удалось.

После расшифровки масс-спектра обнаружено, что пику осколочного иона со значением m/z 518.1594 соответствует ион имеющий следующее строение:

Проведенный анализ показал, что в процессе силнлнровання происходит гидролиз флавокоидных гликозндов, а сахарные остатки подвергаются химическим превращениям, что затрудняет расшифровку спектра.

Для определения количественного содержания флавонондов в пересчете на рутин и гипернцинов использовали спектрофотометрический меток фенил про-паноидов — хромато-спектроф ото метрический; дубильных веществ — титримет-рический (перманганатометрия) и комплексонометркческий методы.

Количественное содержание гиперицинов определяли по двум методикам: 1 — приведенная в немецкой фармакопее «Deutscher Arzneimittel-Codex». — «Johanniskraut» (1986), 2 - описанная Ломаченко Н. В. (1999).

Методика 1 была нами модифицирована: в качестве растворителя вместо метанола нами использовался этанол 96%, как менее токсичный реагент. Сравнение полученных результатов показало допустимость замены в методике метанола на этанол 96%.

О

Таблица 4

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКНЕ И ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА

№ * ВнсшаяВвкл и гряд. УФ-спаоры, X в*1 Окрикашпт Нпюлфмцнроватнк вшкетво

полос* вогл. им Дни АШз в видимом свете ВУФчвете

I 0,19-0,2 (ТСХ, с. А) Св-желтъ»е крнст. 189-190 (этанол) 1 Н 365 260 50 10 Ж&пая Темно-желтая Рутин (кверцетнн-3-О-0-[)-пиражио-б-а-Ь-рамнопиранозид)

2 0,68-0^73 (1СХ, с. А) Желте крнст. 235-237 (мггаюл) 1 11 358 255 53 17 Желтая Темно-зеленая Гиперсшш (кверцетан-3-О-0-1>-галакгопирадозид)

3 0,95-04*6 (ГСХе-А) Яркикелтые ИГОЛЬ. |фНСТ. 314-316 (этанол) 1 11 370 269 61 10 Желта* Желто-зеленая Кверютш (3,5,7Г3',4' - пенгаеж-енфлавон)

4 0,42-0,44 (ТСХ, с. А) Желтые иголь. крнст. 327-329 (метанол) 1 11 348 253 65 25 Желтая Темно-желтая Лкяеовш (5,73,4' -тетраоксиф-лавой)

5 0,79-0,51 (ТСХ, с. А) Темно-красные крнст. 320-321 (этанол) 1 11 589 543 — Красная Ярко-крваш Гипернцив

6 0,87-0,89 (ТСХ, С. А) Темно-красные крнст. 1 11 593 545 Красная Ярко-красная Псевдогипершдш

7 0^65-0^67 (ГСХ,с.2) Бесцветные игопь. крисг. 203-205 (этанол) 1 11 330 250 Свето-голубая Хлорогеговая кислота (5-0-кофеил-О-хиюш)

8 0,83-0,85 (ТСХ, с. 2) Св.-жагше □ласт, крнст. 196-197 (метанол) 1 11 325 299 — Синяя Кофейная кислота (3,4 - диоксн-юзрнчная)

9 030-032 (ТСХ, с. Ж) Бесцвегаые приз мат. крнст. 232-234 (этанол) 1 11 325 252 Ярко-голубая (после обработ.КаОН) Умбеллиферон (7-ошкумарин)

и

По полученным данным нами также проведено сравнение методик 1 н 2 по воспроизводимости (ГФ СССР XI изд.) результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОЙ МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ МЕТОДИКИ 1 И 2 КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРИЦИНА В ТРАВЕ ЗВЕРОБОЯ

Метод Г X, 5 т ((ТО табл. дх с С^РОДтаСл.

1 14 0,088 0,0000005 0,0007 95% 2ДЗ 0,00047 0,59 4,85 2

2 14 0,087 0,000001 0,0010 0,00067 0,76

Согласно полученным данным, заключение о различии воспроизводимости данных методик сделать нельзя, т. к. выполняется неравенство ^(РГ^) и различие значений З1] и Б2! не может быть признано значимым. Учитывая принцип преемственности методов анализа «сырье — препарат», для количественного определения гиоерицинов в траве зверобоя мы предлагаем методику 1 (модифицированную), т. к. на первом этапе анализа получают ацетоновое извлечение из травы зверобоя, а в состав полиэкстракта уже входит ацетоновый экстракт травы зверобоя, что упрощает исполнение анализа.

Для хромато-спектрофотометричсского определения количественного содержания фенилпропаноидов, в пересчете на хлорогеновую кислоту в траве зверобоя нами были подобраны оптимальные условия экстракции: концентрация этанола — 70%, соотношение сырья и экстрагента — 1:50, время экстракции - 45 мни.

Официнальным методом для количественного определения дубильных веществ является перманганатометрический, но он имеет ряд недостатков (способность перманаганата калия окислять многие природные соединения, растянутость перехода окраски при титровании н т. д.). Поэтому нами также был использован комплексонометркческий метод, как более избирательный.

Результаты количественного определения основных групп БАС травы зверобоя представлены в таблице 3.

Таблица 5

СОДЕРЖАНИЕ БАС В ТРАВЕ ЗВЕРОБОЯ ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА

М it/a Групп* БАС Сакриан*,'/«

1 Флавоноиды, в пересчете на ругнн 4,890-3,160

2 Гиоерицины 0,080-0,091

3 Фенилпропаноиды, в пересчете на хлорогеновую кислоту 0225-4262

4 Дубильные вещества пермансанвтометрня комплексономегри*

12,90-1330 4,94-5,10

Нами определены оптимальные условия количественного определения эфирного масла в траве зверобоя ТфОдырявленного флоры Башкортостана методом 2 (ГФ СССР XI изд.). Максимальный выход эфирного масла наблюдается при использовании измельченного сырья, проходящего сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, с навеской 20,0 г и времени перегонки 2 часа. Содержание эфтфвого масла в траве зверобоя продырявленного находится в пределах от 0,13 до 0,17%.

Идентификацию компонентов эфирного масла проводили путем сопоставления масс-спектров электронного удара с базой данных в библиотеке масс-спектров WILEY 275 L и согласно литературным данным (Зенкевич И. Г„ 1996; 1997). Определено присутствие 148 соединений, из которых 85 идентифицировано. Установлено, что в составе изученного нами образца эфирного масла травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана преобладают сесквигерпеновые углеводороды (69,01%), ю которых в максимальном количестве содержится кариофиллен оксид (11,60% от общего состава эфирного масла; 16,81 % от количества сесквитерпенов).

На долю монотерпенов приходится 20,53% от общего состава эфирного масла. Основным компонентом, с содержанием в эфирном масле 6,10% и массовой долей 29,71% я монотерпеновой фракции, является а-пинсн.

Содержание насыщенных углеводородов и высших жирных кислот составило 9,42% от общего состава эфирного масла. Преобладающими соединениями являются пальмитиновая кислота (1,48%) и докозан (1,40%).

Таким образом, установлены числовые показатели травы зверобоя флоры Башкортостана и предложены оптимальные методики их определения (таблица 4). Кроме того, результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать территорию Республики Башкортостан для заготовки травы зверобоя, по-

казатели качества которой соответствуют требованиям существующей НД, что позволит обеспечить производство лекарственных препаратов из изучаемого нами растения на основе местного сырья.

Таблица 4

ЧИСЛОВЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ (Нурепсит рег&гашт Ь.) ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА

Числовые ткмтеш, % Результаты Помткт ■«ВД.% Предлагаемые МНЖНТИН в проект ФСП,%

Содержанке флавоноклое 4,89-5,16 Не менее 1,5 Не менее 1,5

Содержание гиперицинов . 0,08-0,09 Не менее 0,04 Не менее 0,04

Потер« в массе при высушивании 4,01-459 Не более 13,0 Не более 13,0

Экстрактов. вешества(30% этанол) 8,33-9,15 - Не менее 8,0

Примеси Мин. 0,00-0,12 Не более 1,0% Не более 1,0%

Орг. 0,21-0,56 Не более 1,0% Не более 1,0%

Зола Общ. 4^0-7,0» Не более 8,0% Не более 8,0%

н/рвНС1 0,25-0,84 Не более 1,0% Не более 1,0%

Фотохимическое изучение сухого полнэкстр*ктя зверобоя продырявленного Метод получения сухого полиэкстракга зверобоя продырявленного был разработан и запатентован в 1993 г. (Мухамедаянов Р, М., Кулавский В. А., Пушка-рев В. А-, Хасанов Р. А.). Полиэкстраэт был предложен авторами как субстанция для получения противомнкробных препаратов, но до настоящего времени практического применения не нашел. Это связано с отсутствием методов стандартизации и нормативной документации на данный полюкстракг. Необходимым условием для разработки методов анализа сухого полокстракта и лекарегаеннгой формы на его основе является изучение трупп БАС, преобладающих в полиэкстракте, установление их качественного состава и количественного содержания.

Сухой полюкстракт из травы зверобоя продырявленного получали способом последовательного экстрагировали» навески лекарственного растительного сырья экстрагентами с повышением полярности (ацетон 70 и 30% этанол).

В результате хромагго графического изучения каждой фракции сухого полиэкстракта было определено присутствие в ацетоновой фракции флавоноидов (рутина, лкггеолина), антраценпро из в одных (гипернцина, псевдогипернцнна); в эта-

мольных фракциях — флавонондов (рутина, лютеолина, гнперозида, кверцетнна), ашгграценпроизводаых (гипсркцина, гкеадогиперицина), кумарина (умбеллифе-рона), фенилпропаноидов (хлорогеновой и кофейной кислот). Все вещества были препаративно выделены и идентифицированы по хроматографическому поведению и в сравнении с аутентичными образцами, температуре плавления (в том числе и «проб смешения»), максимумам поглощения в УФ-свете.

Для определения возможности использования спектрофото метрических методов количественного определения флавонондов (в пересчете на рутин), нами был проведен УФ-спекграпьиый анализ отдельных фракций сухого пал «экстракта зверобоя в сравнении с рутином, с добавлением н без добавления комплексообра-зующего компонента.

При добавлении комплексообразующего реактива наблюдаются батохром-ные сдвиги с более четким проявлением максимума поглощения, близкого с рутином (420 им н при 336 им); у ацетоновой и 70% этаиольной фракции при 410 нм (ДХ 10 им) и 352 нм <Д\48 нм); у 30%- 415 им (ДХ 6 им) и 369 нм (ДХ 48 км) (рис. 1). Это предполагает возможность использования метода спектро-фотометрического анализа для количественного определения в полнэкстракге суммы флавонондов в пересчете на рутин.

I - рули; 2 - этанопывя фракция (30%); 3 — этанальная фракция (70%); 4 — ацетоновая фракция. Рис. 1. УФ-спектр фракций полиэкстракта зверобоя продырявленного в сравнении с У Ф-спеетром рутина с добавлением комплексообразующего реактива (А1СЬ)

Определение количественного содержания флавоноидов, в пересчет« на рутин проводили по двум методикам: 1 — описанная в ВФС 42-2733-96 «Экстракт зверобоя сухой»; 2 — разработанная Беликовым В.В. с соавт.

Нами было проведено сравнение этих двух методик по воспроизводимости, согласно ГФ СССР XI над. Результаты представлены в таблице 4,

Таблица 5

РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОЙ МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ МЕТОДИК

КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ, В ПЕРЕСЧЕТЕ НА РУТИН В СУХОМ ПОЛИЭКСТРАКТЕ ЗВЕРОБОЯ

Метод Г X* в1 $ Р ((ГОШл. АХ с

1 10 15,38 0,0230 0,1517 95% 2ДЗ (М019 0,64 4,85 5,89

2 10 15,32 0,0039 0,0625 0,0414 0,26

Как видно аз таблицы, вычисленное значение Р больше табличного, поэтому различие дисперсий Бг| и признается статистически значимым с вероятностью Р, что позволяет сделать заключение о более высокой воспроизводимости методики 2. Это можно объяснить тем, что в методике 1 навеска полиэкстракта растворяется в 50% этаноле, в методике 2 — в 70% этаноле, а максимальный выход флавононцов, согласно проведенному исследованию, происходит в 70% этанол. В дальнейших исследованиях мы использовали методику 2.

Нами также было определено количественное содержание гиперицинов, фенилпропанондов, в пересчете на хлорогеновую кислоту, дубильных веществ (рис. 2).

15.30%

Вдубильные вещества Огиперицины

□фенилпропанонды, в пересчете на хпорогенуюеую кислоту Ифлавононды, в пересчете на рутмн

Рис. 2. Количественное распределение основных БАС в сухом полюксгракге зверобоя

На основании проведенных исследований составлен проект ФСП «Ехйас&ип Нурепс1 $1ссит - полиэкстракт зверобоя сухой». Предложенные показатели качества представлены в таблице 5.

Таблица 6

ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА ПОЛИЭКСТРАКТА ЗВЕРОБОЯ СУХОГО

Числовые Роулыягсы анализа обрашм Показателя Предлагаемые

показатели, % полнэкпракга зверобоя поНД ■ проект ФСП

Содержание флавонондов 15,01-5,43 Не менее 8,00 Не менее 13,00

Содержаниегиперицинов 1,02-1,07 - Не менее 0,80

Потеря в массе при высушивании 1,96-2,05 Не более 5,00 Не более 5,00

Содержание тяжелых металлов 0 Не более 0,01% Не более 0,01%

Исследовании по изучению возможности получения

пенообрязующих вагинальных таблеток с сухим полнэкстрактом зверобоя продырявленного

Изучив технологические свойства порошока сухого полиэкстракта зверобоя (сыпучесть, насыпная масса, угол естественного откоса) установили, что при получении таблегированной лекарственной формы с полиэкстрактом зверобоя целесообразно применить гранулирование.

Для разработки оптимальной комбинации вспомогательных веществ для ПВТ с сухим полиэкстрактом зверобоя продырявленного нами был применен метод математического планирования эксперимента — латинский куб второго порядка без повторных опытов. Исследуемыми факторами являлись диаметр гранулята, количество эмульгатора, кислотообразующий компонент.

Таблетирование проводили на настольной таблеточной машине при удельном давлении 50-150 кН. Подученные модельные ПВТ имеют продолговатую форму с закругленными концами, буро-коричневого цвета с мраморными вкраплениями белого вещества и имеют следующие размеры: длина 24,5±0,3 мм, ширина 12,4±0,1 мм, высота 5,1 ±03 мм. Масса полученных таблеток составила 1,7±0,05 г.

Дня оценки качества таблеток определяли распадаемость (мин), ценообразование (мл), прочность таблеток (Н), время полужизни пены (мин). Оценку значн-

моста факторов проводили с помощью дисперсионного анализа экспериментальных данных. Проведенный анализ показал, что ни один из факторов не влияет ни на один из изученных параметров качества ПВТ. Данный результат можно объяснить тем, что значения исследуемых факторов лежат в интервале оптимума, изученного ранее (Мухамединов Р. М„ Лиходеи В. А., 1992).

Учитывая эффект взаимодействия между исследуемыми факторами и невозможностью однозначно определить оптимальную комбинацию вспомогательных веществ, окончательное определение состава модельных таблеток мы проводили с помощью обобщенного критерия оптимизации — функции желательности, которая определена в интервале 0...1 и используется в качестве безразмерной шкалы для оценки уровней параметров сравниваемых объектов.

Наибольшее значение функции желательности и, следовательно, лучший результат получен при использовании винной кислоты, диаметре гракулята 0,5 мм и количестве эмульгатора 0,5%, которые определены как наиболее оптимальные.

Таким образом, был выбран следующий состав ПВТ: Полиэкстракт зверобоя сухой 200 мг Натрия гидрокарбонат 340 мг

Кислота винная 340 мг

Магния стеарат 12 мг

Эмульгатор № 1 3,4 мг

Лактоза достаточное количество до получения

таблетки массой 1,7 г Диаметр гранулята 0,5 мм

Дальнейшую стандартизацию полученных модельных ПВТ с сухим полиэкстрактом зверобоя проводили по количественному содержанию гипернцина и флавонондов, в пересчете на рутин.

Таким образом, для стандартизации ПВТ с сухим полиэкстракгом зверобоя мы предлагаем следующие показатели качества (табл. б).

Таблица 6

ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА ПВТ С СУХИМ ПОЛИЭКСТРАКТОМ ЗВЕРОБОЯ

J* и/п Показатель качества Значение

1 Средняя масса таблетки 1,7±0,05 г

2 Длина 24,5±0,3 им

3 Ширина 12,4±0,1 мм

4 Высота 5,1 ±0,3 мм

5 Распадаемостц не более 15 мин

6 рН раствора, не более 6,0

7 Объем пены, не менее 45 мл

8 Время полужнэнн пены, не менее 40 мин

9 Прочность таблетки, не менее 4 Н

10 Содержание флавоноидов, в пересчете на рутин, не менее 25,0 мг

11 Содержание гиперицинов, не менее 1,0 мг

Методом «ускоренного старения при повышенной температуре» установили срок годности ПВТ с сухим полиэкстрактом зверобоя — 3 года.

Выводы

1. С помощью качественных реакций и хроматографических исследований изучен состав БАС травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Выделены и идентифицированы флавоноиды рутин, ги-перозид, лютеолин, кверцетнн, пшерицин и псевдогипернцин, хлорогеновая и кофейная кислоты, умбеллиферон.

2. Модифицированы методики количественного определения коричных кислот и гиперицинов в траве зверобоя. Установлено количественное содержание основных групп БАС в траве зверобоя продырявленного флоры Башкортостана— флавоноидов, в пересчете на рутин (4,89-5,16%), гиперицинов (0,080,09%), дубильных веществ (4,94-5,10%), коричных кислот (0,24-0,26%).

3. Впервые методом ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией изучен качественный состав эфирного масла зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Индентифицировано 85 компонентов; основным является карнофиплен оксид (11,60% в составе эфирного масла). Опре-

делены оптимальные условия количественного определения эфирного масла в траве зверобоя продырявленного (0,13-0,17%).

4. Впервые изучен качественный состав сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного. Выявлено содержание в нем флавоноидов рутина, гиперознда, лютеолина, кверцетина, гиперицина и псевдогипсрнцина, конденсированных дубильных веществ, хлорогеновой и кофейной кислоты, умбеллиферона. Установлено количественное содержание основных групп БАС сухого полиэкстракга зверобоя продырявленного: флавоноидов, в пересчете на руган (15,01-15,43%), гиперицинов (1,02-1,07%), дубильных веществ (9,89-10,01%), коричных кислот (2,27—2^4%). Предложены методики для оценки качества сухого полиэксгракта зверобоя по количественному содержанию гиперицинов (не менее 0,8%) и флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 13,0%).

5. Впервые получены пенообразукхцие вагинальные таблетки (ПВТ) с сухим полиэкстрактом зверобоя. Методом математического планирования (латинский куб без повторных опытов) установлен оптимальный состав вспомогательных веществ для получения таблеточной массы и проведена стандартизация ПВТ по следующим показателям: распадаемость (не менее 15 мин), ценообразование (не менее 43 мл), прочность (не менее 4 Н), время полужнзнн пены (не менее 40 мин), содержание флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 13%), содержание гиперицина (не менее 0,8%). С помощью метода «ускоренного старения при повышенной температуре» определен срок хранения ПВТ, при котором не происходит изменения показателей качества (3 года).

6. Разработаны проекты ФСП: «Herba Hyperici — трава зверобоя», проект распространяется на траву зверобоя продырявленного как сырье для получения сухого полиэкстракта зверобоя; «Extmctum Hyperici siccum - полнэкстракт зверобоя сухой», проект распространяется на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного как субстанцию для получения против ом и кробн ых препаратов; «Tabuktta vaginal ia spumatae cum extracto Hyperici sicco 0,2 — таблетхи вагинальные пенообразующие с полиэкстрактом зверобоя сухим 0,2».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Файзуллина Р, р. К вопросу о разработке лекарственной формы из зверобоя для лечения гинекологических заболеваний (тезисы). // Вопросы теорс-

тической и практической медицины: Материалы 66-R республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. - Уфа, 2001. - С. 87.

2. Мухамедзянов р. М., Пушкарев В. Л., Файзуллииа Р. Р. Профилактика и лечение некоторых инфекционно-воспалктельных заболеваний в гинекологии препаратами зверобоя (статья) И Разработка и внедрение новых методов и средств традиционной медицин: Сборник статей - Научно-практический центр традиционной медицины и гомеопатии МЗ РФ, 2001 - С.119-120.

3. Плеханова Т. И„ Кудашкина Н. В., Мухамедзянов Р. М., Файзуллииа Р. Р. Лекарственная форма из зверобоя для комплексного лечения гинекологических заболеваний (статья) // Здравоохранение Башкортостана, — Уфа, 2002. - № 2. -С. 98-99.

4. Плеханова Т. И., Файзуллииа Р. Р„ Кудашкина Н. В., Мухамедошов Р. М., Ганиуллина Г. М. Разработка н исследование лекарственной формы из зверобоя для комплексного лечения гинекологических заболеваний (статья) // Итоги и перспективы развитая традиционной медицины в России; Сборник материалов научной юбилейной конференции, посвященной 25-летию со дня открытия в Москве ЦНИИ рефлексотерапии. - М., 2002. - С. 216-218.

5. Файзуллииа Р. Р., Плеханова Т. И., Кудашкина Н. В., Мухамедзянов Р. М., Валиуллина Н. 3., Я щук А. Г. Разработка и исследование лекарственной формы на основе экстракта зверобоя для применения в гинекологической практике (статья) // VI Международный съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 4-6 июля 2002).-СПб., 2002.-С. 155

6. Плеханова Т. И., Файзуллииа Р. Р., Мухамедзянов Р. М., Кудашкина Н. В. Фнтохимическое изучение сухого экстракта из травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) (статья) // Технология выращивания и использование лекарственных культур: Материалы Региональной научно-практической конференции (Уфа, 2-4 июля 2003 года). - Уфа, 2003 - С. 91-93.

7. Кудашкина Н. В., Пушкарев В. А., Файзуллииа Р. Р. Возможность использования гиперицина из зверобоя продырявленного для применения в комплексной терапии гинекологических заболеваний (статья) // Технические и естественные науки: проблемы, теория, эксперимент: Межвузовский сборник научных трудов.- Саранск, 2004. - Вып. 3. - С. 136-137.

8. Плеханова Т. И., Файзуллина Р. Р., Мухамедзянов Р, М., Кудяшкнна Н. В. Компонентный состав эфирного масла травы Нурепсит регСогаШт Ь. флоры Башкортостана (статья) // Лекарственные растения в фармакологии и фармации: Тезисы докладов научной конференции посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета. - Барнаул, 2004. - С. 179—183.

9. Файзуллина Р. Р., Плеханова Т. И., Мухамедзянов Р. М., Кудашкнна Н. В. Определение оптимальной комбинации вспомогательных веществ при изготовлении пенообраэующнх таблеток е Экстрактом зверобоя (статья) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сборник научных трудов (Пятигорская гос. фарм. академия). - Пятигорск, 2004. - Вып. 59. -С. 130-132.

Файэуллкнж Рената Ринатовна

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (Нурегкиш регГогаИпп Ь.) ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА И ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Издательская лицензия № 06788 от 01.II.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450077, РБ, г. Уфа, ул. Ленина, 3, тел./факс (3472) 72-73-50.

Подписано в печать 04.08.2005 г. Формат 60*84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. иеч. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,5. Тираж 100, Заказ № 204.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. По данным ВОЗ, во многих странах мира отмечен рост вагинальных инфекций, занимающих ведущее место в структуре гинекологических заболеваний. Это связано с ранним началом половой жизни, частой смене партнеров, бесконтрольным приемом антибиотиков, снижением общего иммунного статуса организма. Чаще всего половая инфекция обусловлена несколькими патогенными факторами — вирусами, микробами, грибами, простейшими.

Традиционное лечение неспецифических воспалительных гинекологических заболеваний не всегда приводит к желаемому результату, т.к. оно зачастую локальное, без функционального, этиопатогенетического подхода, что ведет к недостаточной эффективности, применяемых методов лечения и рецидивам.

Тенденция развития лекарственной терапии последних десятилетий характеризуется значительным использованием в медицине фитопрепаратов. Это объясняется прежде всего тем, что препараты растительного происхождения лучше переносятся больными, обычно не вызывают аллергических реакций и не оказывают побочного действия.

Одним из самых широко используемых лекарственных растений, как в народной, так и в научной медицине при различных заболеваниях является зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.). В последние годы возрос интерес к антрахиноновым пигментам зверобоя продырявленного — гиперицинам, т.к. у гиперицинсодержащих препаратов установлена противомикробная, противовирусная и антиканцерогенная активность. В тоже время, несмотря на широкий изученный спектр фармакологической активности зверобоя продырявленного, число промышленно выпускаемых официнальных препаратов из него весьма ограничено (настойка, экстракт), а противомикробные средства «Иманин» и «Новоиманин» сняты с производства.

Зверобой продырявленный имеет обширную сырьевую базу на территории Республики Башкортостан (РБ) и может служить доступным источником для получения противомикробных препаратов. Это очень важно, т.к. в РБ в настоящее время решается вопрос о расширении ассортимента собственного фармацевтического производства. Поэтому изучение накопления биологически активных соединений (БАС) в растении в условиях данного региона и предложение методов стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного по содержанию антрахиноновых пигментов является актуальной задачей.

Перспективным также является разработка рациональной лекарственной формы на основе зверобоя продырявленного для комплексного лечения вагинальных инфекций, обладающей противомикробным, противовирусным, иммуномодулирующим, противовоспалительным действием.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью исследования является фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), произрастающего на территории Башкортостана; изыскание дополнительных методов стандартизации сырья и разработка нормативной документации на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного, а также создание оптимальной лекарственной формы на основе полученного полиэкстракта. В связи с этим, предстояло решить следующие задачи:

- провести фитохимическое исследование зверобоя продырявленного флоры

Башкортостана и предложить методы стандартизации по количественному содержанию гиперицинов;

- провести фитохимическое исследование сухого полиэкстракта зверобоя, предложить методы его стандартизации по гиперицинам и сумме флавоноидов; разработать нормативную документацию на сухой полиэкстракт зверобоя как субстанцию для получения противомикробных лекарственных средств;

- изучить возможность получения рациональной лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя и предложить методы ее стандартизации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Изучен состав основных БАС травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана, свидетельствующий о его доброкачественности и возможности использования в качестве источника для получения противомикробных средств. Выделены и идентифицированы: флавоноиды — рутин, кверцетин, лютеолин, гиперозид; антраценпроизводные - гиперицин, псевдогиперицин; фенилпропаноиды - кофейная и хлорогеновая кислоты; кумарин - умбеллиферон. Предложен метод количественного определения гиперицинов для дополнительной стандартизации сырья зверобоя продырявленного, а также сухого полиэкстракта зверобоя.

Впервые с использованием современных методов анализа изучен качественный состав эфирного масла травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана. Идентифицировано 85 компонентов и установлено, что в составе эфирного масла преобладают сесквитерпеновые углеводороды, из которых в максимальном количестве содержится кариофиллен оксид.

Впервые изучен химический состав сухого полиэкстракта из травы зверобоя продырявленного. Выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к группе флавоноидов (рутин, кверцетин, лютеолин, гиперозид), фенилпропаноидов (хлорогеновая и кофейная кислоты), кумаринов (умбеллиферон), антраценпроиз водных (гиперицин, псевдогиперицин).

Теоретически и экспериментально, с использованием метода математического планирования (латинский квадрат без повторных опытов), обоснована возможность получения лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя для применения в гинекологии — пенообразующие вагинальные таблетки. Установлены их показатели качества и срок хранения.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Фармакология и фармация» и является фрагментом исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (номер государственной регистрации № 01990003625), государственной научно-технической программы Республики Башкортостан «Государственные приоритеты здоровья населения республики Башкортостан. Профилактика заболеваний и здоровый образ жизни» (номер государственной регистрации № 01200012029).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Обоснована целесообразность использования зверобоя продырявленного флоры Башкортостана в качестве источника доброкачественного сырья для получения лекарственных препаратов.

Методика количественного определения гиперицинов апробирована в работе ЗАО «Фармацевтическая Компания «Бионорм» и рекомендована для включения в нормативную документацию (приложение 5).

На основе полученных результатов разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Herba Hyperici - трава зверобоя», «Extractum Hyperici siccum - экстракт зверобоя сухой», «Tabuletta spumatae vaginalia cum extracto Hyperici sicco 0,2 - таблетки вагинальные с экстрактом зверобоя сухим 0,2» (приложение 2).

Осуществлен выпуск опытной партии пенообразующих вагинальных таблеток с полиэкстрактом зверобоя сухим (приложение 6).

Результаты исследований используются в научных исследованиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета (приложение 4).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2001 - 2004 гг.); VI Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002); научно-практической конференции посвященной 20-летию фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2002); региональной научно-практической конференции «Технология выращивания и использование лекарственных культур» (Уфа, 2003); на совместном заседании кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, управления и экономики фармации, технологии лекарственных форм с курсом биотехнологии (Уфа, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в которых отражены основные результаты исследования.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью качественных реакций и хроматографических исследований изучен состав БАС травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Выделены и идентифицированы флавоноиды рутин, гиперозид, лютеолин, кверцетин, гиперицин и псевдогиперицин, хлорогеновая и кофейная кислоты, умбеллиферон.

2. Модифицированы методики количественного определения коричных кислот и гиперицинов в траве зверобоя.

3. Количественное содержание основных групп БАС в траве зверобоя продырявленного флоры Башкортостана составило: флавоноидов, в пересчете на рутин (4,89 % - 5,16%), гиперицинов (0,08 % - 0,09 %), дубильных веществ (4,94 % - 5,10 %), коричных кислот (0,24 % - 0,26 %).

4. Впервые методом ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией изучен качественный состав эфирного масла зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Индентифицировано 85 компонентов; основным является кариофиллен оксид (11,60% в составе эфирного масла). Определены оптимальные условия количественного определения эфирного масла в траве зверобоя продырявленного (0,130,17%).

5. Впервые изучен качественный состав сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного. Выявлено содержание в нем флавоноидов рутина, гиперозида, лютеолина, кверцетина, гиперицина и псевдогиперицина, конденсированных дубильных веществ, хлорогеновой и кофейной кислоты, умбеллиферона. Установлено количественное содержание основных групп БАС сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного: флавоноидов, в пересчете на рутин (15,01 % - 15,43 %), гиперицинов (1,02 % -1,07 %), дубильных веществ (9,89 % - 10,01 %), коричных кислот (2,27 % - 2,34 %). Предложены методы стандартизации сухого полиэкстракта зверобоя по количественному содержанию гиперицинов (не менее 0,8 %) и флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 13,0 %).

6. Впервые получены пенообразующие вагинальные таблетки (ПВТ) с сухим полиэкстрактом зверобоя. Методом математического планирования (латинский куб без повторных опытов) установлен оптимальный состав вспомогательных веществ для получения таблеточной массы и проведена стандартизация ПВТ по следующим показателям: распадаемость (не менее 15 мин), пенообразование (не менее 45 мл), прочность (не менее 4 Н), время полужизни пены (не менее 40 мин), содержание флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 25,0 %), содержание гиперицина (не менее 1,0 мг). С помощью метода «ускоренного старения при повышенной температуре» определен срок хранения ПВТ, при котором не происходит изменения показателей качества (3 года).

7. Разработаны проекты ФСП: «Herba Hyperici - трава зверобоя», проект распространяется на траву зверобоя продырявленного как сырье для получения сухого полиэкстракта зверобоя; «Extractum Hyperici siccum -полиэкстракт зверобоя сухой», проект распространяется на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного как субстанцию для получения противомикробных препаратов; «Tabuletta vaginalia spumatae cum extracto Hyperici sicco 0,2 - таблетки вагинальные пенообразующие с полиэкстрактом зверобоя сухим 0,2».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщение и анализ научной литературы показали, что Hypericum perforatum L. является широко распространенным растением, химический состав которого достаточно подробно изучен и отличается большим разнообразием БАС. Однако для подтверждения высокого качества сырья флоры Башкортостана и дополнения показателей его доброкачественности необходимо провести детальное исследование основных групп БАС травы зверобоя продырявленного из различных районов республики.

Применение лекарственных средств из травы зверобоя в России ограничивается использованием настойки, экстрактов и сборов. Создание новых и совершенствование известных лекарственных форм на основе зверобоя продырявленного, разработка современных методов их стандартизации, расширение возможностей применения, в том числе в гинекологии, является актуальным.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

Объектами исследования служили трава зверобоя продырявленного (Herba Hyperici) и полученный нами из нее сухой полиэкстракт — по технологии, представленной в патенте на изобретение № 2067452 «Способ получения экстракта зверобоя» А 61 К 35/78 от 15.12.93.

Образцы лекарственного растительного сырья для фитохимического анализа и изготовления сухого полиэкстракта были собраны в фазу цветения в типичных местообитаниях в различных районах Республики Башкортостан (2001 - 2003 гг.): Уфимском (серия № 1), Стерлитамакском (серия № 2), Гафурийском (серия № 3), Архангельском (серия № 4), Кармаскалинском (серия № 5), Сырье хранилось в соответствии с требованиями нормативной документации (ГОСТ 6077-80, ОСТ 64-070-89 и ГФ СССР XI изд.) при комнатной температуре, в сухом, хорошо вентилируемом помещении, не зараженном амбарными вредителями, без прямого попадания солнечных лучей.

При разработке оптимального состава и технологии пенообразующих вагинальных таблеток использовались материалы, качество которых соответствовало требованиям нормативной документации: сахар молочный (ГФ СССР X изд., ст. 589); магния стеарат (ТУ 6-09-129); натрия гидрокарбонат (ГФ СССР X изд., ст. 430); кислота лимонная (ГОСТ 3652); кислота аскорбиновая (ФС 42-2668-65); кислота винная (ГОСТ 5817-77); метиленхлорид (ТУ 952456-93); эмульгатор № 1 (ФС 42-1596-81), а также сухой полиэкстракт из травы зверобоя.

2.2. Методы исследования

Качественный, количественный анализ и идентификацию природных биологически активных соединений, содержащихся в объектах исследования, проводили с использованием современных методов фитохимического анализа: хроматографического (на бумаге, в тонком слое сорбента, хромато-масс-спектрометрического, ГЖХ, в том числе и в сочетании с масс-спектрометрией), спектрофотометрического и др. Элементный состав сырья и сухого полиэкстракта определяли с помощью электрозондового рентгеноспектрального анализа.

Все расчеты вели на абсолютно сухое сырье.

В соответствии с требованиями к качеству лекарственного растительного сырья определялись числовые показатели травы зверобоя с использованием методик ГФ СССР XI изд.: влажность (ч. 1, с. 285; ч. 2, с. 161); общая зола (ч. 2, с. 24); степень измельченности и содержание примесей (ч. 1, с. 275). Для полиэкстракта, полученного нами из травы зверобоя определяли влажность (ч. 1, с. 285; ч. 2, с. 161); общую золу (ч. 2, с. 24); содержание тяжелых металлов в экстрактах (ч. 2, с. 161).

2.2.1. Методы качественного анализа биологически активных соединений

Качественные реакции на флавоноыды, общие для всех фенольных соединений и специфические, позволяющие установить тип соединений и некоторые особенности структуры, проводили по известным методикам [9, 33,42].

Для проведения качественных реакций на флавоноиды из травы зверобоя продырявленного готовили очищенный экстракт [9, 42]: навеску сырья экстрагировали при соотношении сырья и экстрагента 1:10 96 % этиловом спирте на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Спиртовое извлечение фильтровали, упаривали, густой остаток растворяли в горячей воде и очищали от аликвотной фракции экстракцией хлороформом; в водном остатке осаждали танниды 5 % раствором желатина и полученное извлечение экстрагировали этилацетатом, который затем отгоняли под вакуумом на ротационном испарителе ИР1-М2. Сухой остаток растворяли в 96% этиловом спирте и использовали для качественных реакций.

Обнаружение гиперицинов в траве зверобоя проводили в этилацетатном извлечении, полученном по выше описанной методике, с помощью концентрированной серной кислоты. При наличии гиперицинов раствор окрашивается в желто-зеленый цвет [49].

Качественное обнаружение дубильных веществ проводили по известным методикам в водном (1:10) извлечении травы зверобоя продырявленного (реакция с желатином, формальдегидом и раствором хлорида железа (III)) [33].

Для установления присутствия кумаринов использовали реакции, основанные на образовании окрашенных растворов с диазокрасителями, образовании лактонов и способности флуоресцировать в УФ - свете [52].

Очищенную сумму кумаринов для анализа получали следующим образом: 25,0 г травы зверобоя экстрагировали 100,0 мл 96 % этиловым, спиртом на водяной бане с обратным холодильником в течение двух часов. Извлечение сгущали под вакуумом, очищали с помощью 0,5 % водного, а затем 0,5 % водноспиртового раствора калия гидрооксида. Водно-щелочной раствор разбавляли водой (1:6) и липофильные вещества удаляли диэтиловым эфиром, затем экстракт подкисляли 2,0 % раствором соляной кислоты и смесь кумаринов и органических кислот извлекали диэтиловым эфиром. В делительную воронку с обеими фазами по каплям прибавляли 0,5 % водный раствор калия гидроксида (для удаления кислотной фракции), эфирную фракцию с кумаринами отделяли, растворитель отгоняли. Остаток растворяли в 96 % этиловом спирте и использовали для анализа [53].

Качественное обнаружение коричных кислот проводили хроматографическим методом (на бумаге и в тонком слое сорбента).

Для установления элементного состава в золе использовали электрозондовый анализатор JEOLJXA 6400 с приставкой энергодисперсионного анализа Nozan [87]. Для этого около 1,0 г (точная навеска) травы зверобоя продырявленного и около 0,5 г (точная навеска) сухого полиэкстракта зверобоя сжигали и прокаливали в течение 4 часов при

500 °С в муфельной печи. Полученную золу исследовали на содержание минеральных элементов.

Хроматографические исследования

Хроматографическое исследование травы зверобоя и сухого полиэкстракта зверобоя проводили методами восходящей одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ), бумага - хроматографическая Санкт-Петербургской фабрики № 2 марки «С» и «М»; в тонком закрепленном слое сорбента (ТСХ) - на пластинках «811и1Ы», «8Пи1ух» (Чехия) [27, 52, 56, 82, 100]. При необходимости через хроматограмму повторно пропускали разделяющую систему, что обеспечивало более четкое разделение при близких значениях

Для хроматографического исследования сумму флавоноидов из травы зверобоя получали последовательной экстракцией 40 %, 70 % и 96 % этиловым спиртом (по типу полиэкстракта) для наиболее полного извлечения всех групп флавоноидов. Полученные извлечения объединяли, сгущали, освобождали от липофильной фракции хлороформом и обрабатывали этилацетатом и н-бутанолом [42].

Для анализа гиперицинов сырье предварительно обрабатывали хлороформом и экстрагировали 70 % этиловым спиртом, последний отгоняли и водный остаток обрабатывали этилацетатом. Полученное извлечение использовали для хроматографирования [49].

Коричные кислоты извлекали горячей водой из сырья освобожденного от липофильной фракции хлороформом. Экстракцию повторяли трижды. Водные извлечения объединяли, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат трижды обрабатывали диэтиловым эфиром. Эфирные извлечения объединяли, сушили безводным натрия сульфатом, фильтровали. Эфир отгоняли, сухой остаток растворяли в 96 % этиловом спирте и использовали для хроматографирования [74].

Полученную для проведения качественных реакций сумму кумаринов использовали также и для хроматографического анализа.

Для хроматографического исследования сухого полиэкстракта использовали этилацетатные извлечения из 70 %, 30 % этанольных фракций. Для этого каждую сгущенную водно-спиртовую фракцию обрабатывали этилацетатом и полученные извлечения использовали для хроматографии.

Для выделения суммы флавоноидов из 70 % и 30 % этанольных фракций полиэкстракта этилацетатные извлечения из этих фракций сгущали под вакуумом на роторном испарителе до полного удаления растворителя. Полученный остаток растворяли в 96 % этиловом спирте и использовали для хроматографирования.

Навеску ацетоновой фракции 0,1 г растворяли в 10 мл ацетона и использовали для хроматографирования.

В эксперименте использовались следующие системы растворителей [9, 42, 49, 52, 82]: для хроматографии на бумаге:

1. 15 % раствор уксусной кислоты

2. 2 % раствор уксусной кислоты

3. Н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5)

4. Н-бутанол - уксусная кислота - вода (3:6:1)

5. Толуол - этилформиат - муравьиная кислота (5:4:1)

6. Хлороформ

7. Петролейный эфир для хроматографии в тонком слое сорбента:

A. Этилацетат - 85 % муравьиная кислота (50:6);

Б. Хлороформ - этиловый спирт (8:2);

B. Этилацетат - этиловый спирт - вода (10:2:1);

Г. Этилацетат - уксусная кислота (8:2);

Д. Бензол - уксусная кислота (5:2);

Е. Этилацетат - н-бутанол - муравьиная кислота - вода (5:3:1:1)

Для проявления хроматограмм использовали реактивы: а. Алюминия (III) хлорид, 5 % раствор в этиловом спирте; б. Аммиака 25 % водный раствор; в. Железа (III) хлорид, 3 % водный раствор; г. Натрия гидроксид, 10 % водный раствор; д. Диазотированная сульфаниловая кислота; е. Натрия гидроксид, 10 % спиртовый раствор.

Вещества детектировали просматривая хроматограммы в видимом и УФ-свете, до и после проявления. Для этого использовали ртутно-кварцевую лампу со светофильтром, при длине волны 365 нм.

Для сравнительной хроматографии и идентификации природных веществ использовали аутентичные образцы («свидетели»): кверцетин, гиперозид, рутин, лютеолин; кофейную и хлорогеновую кислоты; умбеллиферон, полученные из Государственного ботанического сада Сибирского отделения РАН, НПО ВИЛАР, Института органической химии (г. Иркутск).

Выделение индивидуальных веществ и их идентификация

Получение индивидуальных соединений группы гиперицинов, флавоноидов, кумаринов и фенилпропаноидов (коричных кислот) проводили методом препаративной хроматографии в тонком слое сорбента силикагеля (пластинки «Silufol UV-254» (Чехия)) [52].

После разделения суммарных экстрактов флавоноидов, кумаринов, гиперицинов и коричных кислот в подходящей системе растворителей хроматограммы детектировали в УФ-свете. Зоны, соответствующие гиперицинам, флавоноидам и коричным кислотам счищали с пластинок. Пятна, имеющие одинаковое значение Rf и сходную окраску (флуоресценцию) в видимом и УФ-свете, объединяли и элюировали этиловым спиртом или другими растворителями.

Индивидуальные вещества очищали многократной кристаллизацией из подходящего растворителя (этиловый спирт, метиловый спирт, их смеси с водой и др.).

Идентификацию всех выделенных веществ осуществляли путем сравнительной хроматографии с аутентичными образцами исследуемых веществ (в том числе пробы смешения), изучением УФ-, хромато-масс-спектров выделенных веществ, установлением температуры плавления.

Исследование УФ-спектров выделенных индивидуальных веществ, а также этанольных, ацетоновых фракций полиэкстракта, полученных по технологической схеме проводили на спектрофотометре марки «БресогсМО» (Институт органической химии УНЦ РАН) при аналитически значимых интервалах длин волн:

• для флавоноидов - 320-380; 240-270 нм

• для коричных кислот - 310-340 нм

• для гиперицинов - 530-640 нм

Хромато-масс-спектрометрическое исследование выделенных веществ флавоноидной структуры осуществляли в Институте органической химии УНЦ РАН с использованием системы хроматограф - масс-спектрометр -ЭВМ: хроматограф - НР 5890 с масс-элективным детектором НР 5972 А; колонка - Ультра2 50 м:0,2 мм (диметилполисилоксан 95 % + дифенилполисилоксан 5 %); температурный режим - 100 °С - 300 °С, скорость подъема 10 °С/мин; газ-носитель - гелий, расход — 1 мл/мин; система обработки данных - НР СЬеп^айоп.

Газохроматографический анализ эфирного масла зверобоя продырявленного проводили на базе химического факультета Башкирского государственного университета, с использованием прибора «Хромоген Кристалл 5000.1», с пламенно-ионизационным детектором в режиме программного контроля температуры (100 °С - 275 °С, со скоростью 5 °С/мин). Неподвижная фаза - 5 % БЕЗО, нанесенный на СЬгошобогЬ. Колонки из нержавеющей стали размером 1500:3 мм. Газ-носитель - гелий (скорость >>

30 см /мин).

Для более полного разделения и идентификации компонентов эфирного масла зверобоя продырявленного провели газохроматографический анализ в сочетании с масс-спектрометрией на приборе «TRIO 1000» в режиме программного контроля температуры (40 °С - 300 °С, со скоростью 4 °С/мин). Колонки (DB-5) из нержавеющей стали размером 60000:0,25 мм. Газл носитель - гелий (скорость 2 см /мин), температура инжектора 260 С. Идентификацию осуществляли путем сопоставления масс-спектров электронного удара с базой данных в библиотеке масс-спектров WILEY 275 L и согласно [43, 44].

Температуру плавления изолированных веществ определяли на блоке Кофлера после многократной кристаллизации выделенных индивидуальных веществ из подходящего растворителя.

2.2.2. Методы количественного анализа биологически активных соединений

Количественное определение флавоноидов в траве зверобоя продырявленного проводили по методике 1, приведенной в ГФ СССР XI изд. (ст. 52 «Herba Hyperici»).

Определение содержания флавоноидов в сухом полиэкстракте из травы зверобоя осуществляли методом дифференциальной спектрофотомерии на приборе СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм с использование двух методик:

Методика 2 - описанная в ВФС 42-2733-96 «Сухой экстракт из травы зверобоя» [25].

Методика 3 - разработанная Беликовым В.В. с соавт. [1]. В основе этих методов лежит способность флавоноидов образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида, что приводит к батохромному смещению максимума поглощения УФ-спектра. Расчет количественного содержания флавоноидов в методиках 1, 2 ведется в пересчете на рутин, как на преобладающий и специфичный флавоноид в траве зверобоя продырявленного, а в методике 3 - на один доминирующий в исследуемом сырье флавоноидов, используя коэффициент пересчета, получаемый делением молекулярной массы рутина на молекулярную массу данного флавоноида. Навеска полиэкстракта для анализа (методика 3) рассчитывалась нами с учетом выхода экстрактивных веществ в полиэкстракт.

Количественное определение гиперицинов проводили по методикам 4 [112] и 5 [62], в основе, которых лежит специфическое поглощение в видимой части спектра раствора гиперицина в метиловом спирте при длине волны 590 нм и в этиловом спирте при длине волны 598 нм. В методике 5 измеряют поглощение непосредственно этанольного (50 %) извлечения из травы зверобоя продырявленного, а в методике 4 вначале получают ацетоновое извлечение из травы зверобоя продырявленного, которое затем растворяют в метаноле и измеряют оптическую плотность полученного раствора. Данная методика была нами модифицирована (гл. 3.3.).

Содержание дубильных веществ определяли с помощью методики 6 -окислительно-восстановительное титрование раствором калия перманганата [31] и методики 7 - метод комплексонометрического титрования [15, 34], основанный на осаждении дубильных веществ аммиачным раствором окиси цинка (по ГОСТ 4564-70), выделении осадка центрифугированием, разрушении комплекса цинк - дубильные вещества уксусной кислотой и титровании катионов цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора — ксиленолового-оранжевого.

Определение количественного содержания суммы фенилпропаноидов (оксикоричных кислот) проводили методом прямой хромато-спектрофотометрии при аналитической длине волны 327 нм по модифицированной нами методике 8 [107].

2.2.3. Методы технологических исследований

Объектом технологических исследований служил сухой полиэкстракт из травы зверобоя, полученный нами последовательным экстрагированием навески сырья растворителями с повышением полярности по «Способу получения экстракта зверобоя», разработанному Мухамедзяновым P.M. с соавт. и изложенному в патенте [79].

В качестве технологических показателей для сухого полиэкстракта из травы зверобоя нами были определены - насыпная масса по известной методике [37]; сыпучесть и угол естественного откоса на приборе ВП-12А [2, 37]. Для определения фракционного состава использовали ситовой анализ [30, 101].

Нами была изучена также возможность получения пенообразующих вагинальных таблеток (ПВТ) с полиэкстрактом зверобоя. Установление оптимального состава вспомогательных веществ ПВТ проводили методом математического планирования эксперимента — латинский куб второго порядка без повторных опытов [73].

Механическую прочность ПВТ определяли методом сжатия «на ребро» (перпендикулярно силе прессования) на разрывной машине 2167 Р-50 [73] в лаборатории механики композиционных материалов и конструкций Уфимского государственного авиационного технического университета. Определение распадаемости осуществляли по известной методике (ГФ СССР XI изд. вып. 2, с. 158). Количество пены определяли объемным методом [21]. В полученном растворе, после определения пенообразования используя иономер ИУ ЭВ-74 устанавливали рН водного извлечения [21].

Установление срока годности ПВТ проводили по ОСТ 42-2-72 «Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности», а также методом «ускоренного старения» в соответствии с инструкцией И-42-2-82 с использованием термостата ТС-80 М2 [24].

Статистическую обработку экспериментальных данных фитохимических и технологических исследований проводили, используя критерии Стьюдента и Фишера с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата (Р=95%) и определением ошибки единичного определения при различных значениях «п» по известным методикам [14, 30].

ГЛАВА III. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА

Как указывалось в главе I, трава зверобоя является перспективным сырьем для получения противомикробных препаратов, фармакологическая активность которых обеспечивается комплексом БАС содержащихся в сырье. Для разработки и последующего внедрения в медицинскую практику новых лекарственных средств необходимо проведение исследований, позволяющих разработать для них нормативы качества. Современные требования к стандартизации лекарственных средств при разработке показателей качества обуславливают использование системной цепи «лекарственное растение — сырье - субстанция - препарат», которая дает возможность объективно обосновывать и разрабатывать характеристики и показатели качества, как сырья, так и лекарственного средства на его основе. Одной из задач данной работы является химическое изучение сухого полиэкстракта зверобоя как субстанции для получения противомикробных препаратов. Источником получения его при разработке и в перспективе для промышленного получения является трава зверобоя, собранная на территории республики Бащкортостан, следовательно, проведение полного фитохимического анализа сырья - травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана — является необходимым этапом стандартизации.

3.1. Определение числовых показателей травы зверобоя

Одной из характеристик доброкачественности растительного сырья являются такие числовые показатели как влажность, зольность, минеральные и органические примеси, значения которых определяли, используя фармакопейные методы (гл. 2.2.). Результаты исследований представлены в таблице 3.1.