Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Оптимизация программ криоконсервирования эритроцитов для резервирования гемотерапевтических средств

На правах рукописи

ХАЛАИЧЕВ Евгений Евгеньевич

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОГРАММ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ РЕЗЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 VСП

Санкт-Петербург 2009

003482586

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Александр Викторович Чечеткин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Игорь Георгиевич Дуткевич доктор медицинских наук доцент Андрей Геннадьевич Максимов Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии имени В.А. Алмазова Росмедтехнологий»

Защита состоится « »__2009 г. в_часов

на заседании диссертационного совета (шифр Д.208.074.01) при Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан « »_2009 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Эритроцитная масса (взвесь) является основной трансфузионной средой для коррекции газотранспортной функции крови при травмах и заболеваниях (Ермолов A.C. и соавт., 1994; Гузовский Е.В., 1999; Полушин Ю.С., 2004; Vincent J.L., et al., 2002). Потребность в ней возрастает при массовых поражениях и катастрофах (Жибурт Е.Б. и соавт., 1999; Данильченко В.В. и соавт., 2001; Dunne J.R. et al., 2006). Существующие способы консервирования позволяют хранить в жидком состоянии эритроцитные гемокомпоненты до 50 дней, что ограничивает рациональное использование трансфузионных сред и их резервирование для оказания медицинской помощи в чрезвычайных ситуациях. Решение этих вопросов предопределяет внедрение в практику учреждений службы крови методов длительного хранения эритроцитов в замороженном состоянии.

К настоящему времени доказана эффективность использования криоконсервирования эритроцитов при создании резерва трансфузионных сред при массовом поступлении раненых и пострадавших (Вильянинов В.Н. и соавт., 1999; Hess J.R., 2003; Gharehbaghian A. et al., 2008), формировании банка редких групп крови (Zhu Z., 2006; Bohonek M.B. et al., 2008; Flegel W.A. et al., 2008; Mo Q. et al., 2008), использовании программ предоперационного аутодонорства (Калеко С.П. и соавт., 1991; Шилов В.В., 1995; Fontaine MJ. et al., 2003; Tsuno N.H. et al., 2008), для карантинизации эритроцитов (Елыкомов В.А. и соавт., 2004; Мельникова В.Н. и соавт., 2007), для хранения эритроцитов с последующим производством реагентов для иммуногематологических исследований (Seo J.W. et al., 2008), a также для обеспечения гемокомпонентами военно-медицинских учреждений при выполнении миротворческих или военных операций (Онуфриевич А.Д. и соавт., 1999; Rosenblatt M.S. et al., 1994; Noorman F. et al., 2006). В этих случаях используют различные методы замораживания эритроцитов в широком диапазоне температур (-25°...-196°С). В последние годы в трансфузиологическую практику внедрены методы замораживания эритроцитов с использованием электрохолодильников (Мельникова В.Н. и соавт., 1990; Орлик В.В., 1999; Вильянинов В.Н. и соавт., 2000; Valeri C.R. et al., 2000; Hess J.R., Thomas M.J.G., 2003; Scott K.L. et al., 2005). Однако в нашей стране криоконсервирование с применением жидкоазотного оборудования широко используется для долгосрочного хранения эритроцитов, что обусловлено особенностями эксплуатации криогенной техники, наличием значительного научно-практического опыта и разработанных нормативных документов, возможностью длительного сохранения морфофункциональных свойств замороженных клеток крови (Рыжков C.B. и соавт., 1973; Багаутдинов Ш.М., 1999; Вильянинов В.Н. и соавт., 2000; Сидоркевич C.B., 2002; Шарова Т.Н. и соавт., 2003; Костяев A.A., 2004).

Между тем, полимерные контейнеры для замораживания и хранения эритроцитов при сверхнизкой температуре (до -196°С) в России серийно не производятся, вопросы их применения с использованием современного криогенного оборудования не разработаны.

Это сдерживает дальнейшее развитие методов криоконсервирования и практическую реализацию стратегии резервирования эритроцитосодержащих трансфузионных сред.

Цель работы - научное обоснование, разработка и исследование эффективности программ криоконсервирования эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием полимерных криоконтейнеров.

Задачи исследования:

1) определить организационные и медико-технические особенности технологии криоконсервирования эритроцитов с использованием жидкоазотного оборудования и полимерных контейнеров на станции переливания крови;

2) изучить морфофункциональные свойства эритроцитов, криоконсервированных в полимерных криоконтейнерах при сверхнизкой температуре;

3) провести сравнительный анализ эффективности программ криоконсервирования эритроцитов в полимерных криоконтейнерах при температуре -190°...-193°С.

Научная новизна. Впервые научно обоснована возможность применения отечественных полимерных контейнеров для замораживания и хранения эритроцитов при сверхнизкой температуре (до -196°С). Получены новые данные о том, что дискретное добавление к эритроцитной взвеси криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М и деглицеринизация с последующими промежуточными экспозициями позволяют повысить сохранность и обеспечить морфофункциональную полноценность размороженных и отмытых эритроцитов.

Разработана новая технология криоконсервирования эритроцитов с использованием полимерных контейнеров отечественного производства при сверхнизкой температуре (до -196°С).

Выявлено, что эритроциты, криоконсервированные по предложенной технологии с использованием полимерных контейнеров и современного жидкоазотного оборудования, после размораживания обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность, устойчивость к гемолитическому воздействию.

Практическая значимость. Конкретизированы медико-гигиенические требования к размещению и организации работы «банка» криоконсервированных эритроцитов, предложены штатные нормативы отделения долгосрочного хранения замороженных клеток крови станции переливания крови и типовой перечень оборудования.

Предложена и апробирована дискретная методика глицеринизации и деглицеринизации эритроцитов, позволяющая обеспечить требуемое качество декриоконсервированной эритроцитосодержащей трансфузионной среды.

Доказано, что криоконсервированные с помощью предложенной технологии эритроциты соответствуют стандартам, которые предъявляются к

качеству эритроцитосодержащих гемотрансфузионных сред, годных к переливанию.

Положения, выносимые на защиту

1. Технология криоконсервирования эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием полимерных криоконтейнеров отечественного и зарубежного производства позволяет снизить затраты времени на подготовку и проведение замораживания и оттаивания компонента, повысить производительность работы отделения долгосрочного хранения клеток крови станции переливания крови.

2. Биологическая полноценность криоконсервированных в полимерных контейнерах при сверхнизкой температуре эритроцитов достигается использованием криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М и применением дискретной методики глицеринизации и деглицеринизации эритроцитов.

3. Замораживание эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием отечественных и зарубежных полимерных контейнеров позволяет резервировать гемокомпоненты, которые соответствуют требованиям, предъявляемым к качеству декриоконсервированных эритроцитосодержащих трансфузионных сред, обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2006), научно-практическом семинаре «Организация работы банка криоконсервированных гемокомпонентов» (Санкт-Петербург, 2006), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), заседании подсекции трансфузиологии Ученого Медицинского Совета ГВМУ МО РФ «Состояние и пути повышения качества производства и безопасности применения компонентов и препаратов крови в военно-лечебных учреждениях» (Москва, 2007), научно-практическом семинаре «Актуальные вопросы криоконсервирования гемокомпонентов» (Санкт-Петербург, 2007), на сборе главных трансфузиологов видов Вооруженных Сил, округов и флотов Министерства обороны Российской Федерации «О состоянии донорства крови и ее компонентов в Вооруженных Силах РФ и основных направлениях по его развитию» (Санкт-Петербург, 2008), IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы исследования реализованы при выполнении в рамках Гособоронзаказа опытно-конструкторской работы «Разработка полимерного контейнера одноразового использования для долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах», шифр «Поликонт», для

нужд Минобороны РФ (Государственный контракт № ВНК/1/1-2002 от 17.06.2002 г.).

Результаты исследования использованы в материалах 2 тем НИР, проводимых в соответствии с планом научной работы ГВМУ МО РФ:

- «Стандартизация производства, применения и контроля качества криоконсервирующих, отмывающих и ресуспендирующих средств в военно-медицинских учреждениях», № VMA.02.06.02.0708/0200;

- «Совершенствование методов криоконсервирования клеток крови в полимерных контейнерах в военно-лечебных учреждениях», № VMA.02.06.02.0709/0176.

Основные материалы исследования опубликованы в 18 научных работах, из них 9 - опубликованы в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

По материалам диссертации внедрено 22 рационализаторских предложений. В Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам зарегистрированы приоритеты на 2 изобретения:

1) Заявка 2008136824 Рос. Федерация. Способ криоконсервирования эритроцитов в парах жидкого азота. -Заявл. 12.09.2008 г.

2) Заявка 2008136823 Рос. Федерация. Способ реабилитации декриоконсервируемых эритроцитов. - Заявл. 12.09.2008 г.

Реализация работы. Результаты работы внедрены в практическую работу СПК Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, СПК Главного военного клинического госпиталя имени Н.Н.Бурденко.

Результаты работы использованы при подготовке акта Государственной комиссии по проведению испытаний полимерного контейнера долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах и регистрационного удостоверения № ФС 01262006/3747-06 от 01 августа 2006 г., выданного Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранении и социального развития «Контейнер полимерный одноразового использования для долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах».

Результаты работы используются в учебном процессе на факультете последипломного и дополнительного профессионального образования ВМедА на циклах усовершенствования «Избранные вопросы трансфузиологии», «Клиническая трансфузиология», профессиональной переподготовки «Трансфузиология».

Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно выполнял сбор материала, осуществлял подготовку к замораживанию, криоконсервирование и размораживание эритроцитов, участвовал в проведении биохимических исследований образцов гемокомпонентов, проводил статистический анализ полученных результатов и подготовку материалов к публикациям.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы,

который включает 88 отечественных и 92 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Материал диссертации основан на результатах анализа морфо-функциональных показателей 118 эритроцитосодержащих сред, заготовленных у доноров резерва и криоконсервированных на станции переливания крови (СПК) Военно-медицинской академии.

Криоконсервирование эритроцитов осуществляли с использованием металлических (алюминиевых) контейнеров КАР-290, полимерных криоконтейнеров Hemofreeze DF-700-3 («Fresenius HemoCare», Германия) и контейнеров одноразового использования для долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах, индекс ККП-500, разработанных ООО «Авангард-МТ» (Россия) (опытная партия № 2-09-2004 от 15 октября 2004 г.). В качестве криопротекторов использовали растворы ЦНИИГПК 115-М, ЦНИИГПК 114.

Криоконсервирование эритроцитов с использованием КАР-290 проводили в соответствии с «Инструкцией по криоконсервированию клеток крови» (1995). Металлические криоконтейнеры с замороженными эритроцитами хранили в жидком азоте (-196°С) в хранилищах биопродукта ХБ-0,5, входящих в состав криогенного оборудования «Биокомплекс II». Размораживание эритроцитов, хранящихся в металлических контейнерах, осуществляли в ванне с водой (температура +42°...+45°С) при механическом покачивании контейнеров до достижения температуры эритроцитов +8°....+10°С.

Размороженную эритроцитную массу из металлического контейнера переводили в систему для отмывания (контейнер полимерный стерильный для отмывания эритроцитов методом центрифугирования К-250), в которой производили все этапы отмывания. Применяли растворы, приготовленные в соответствии с требованиями «Инструкции по криоконсервированию клеток крови» (1995), ресуспендирование эритроцитов осуществляли в растворе ЦНИИГПК 8в.

Замораживание эритроцитов в полимерных криоконтейнерах Hemofreeze DF-700-3 и ККП-500 осуществляли с раствором ЦНИИГПК 115-М при дробной глицеринизации. Перед криоконсервированием эритроцитную взвесь центрифугировали при 4513 g в течение 10 мин при температуре 22°С, супернатант удаляли с помощью плазмоэкстрактора, а к эритроцитам добавляли раствор ЦНИИГПК 115-М. Глицеринизируемые эритроциты подогревали в водяной бане или в сухом тепле до температуры 22-25°С. После добавления к эритроцитам 1/5 необходимого объема криозащитного раствора делали экспозицию в течение 5-10 мин для эквилибрации, следующую такую же остановку делали после добавления 1/3 объема, оставшуюся половину предполагаемого объема раствора медленно добавляли к эритроцитам и проводили последнюю экспозицию в течение 10 мин. Глицеринизированные

эритроциты центрифугировали при 1257 g в течение 10 мин при температуре +22°С, избыток криозащитного раствора удаляли через магистраль так, чтобы объем замораживаемой среды не превышал 350 мл. Оставшиеся эритроциты с соблюдением правил асептики и антисептики через систему-магистраль переливали в контейнер DF-700-3, который герметизировали с помощью запаивателя Hemofreeze Sealer («Fresenius HemoCare», Германия). В отличие от криоконтейнеров DF-700 герметизацию контейнера ККП-500 производили без запаивания: штуцер контейнера плотно закрывали крышкой.

Криоконтейнер паспортизировали, замораживали при температуре жидкого азота (-196°С) в горизонтальном состоянии, что обеспечивало равномерный слой гемокомпонента. В отдельных исследованиях для создания равномерного слоя содержимого криоконтейнера использовали специальные металлические конверты («Fresenius HemoCare», Германия).

Для сравнительного исследования при замораживании части образцов в Hemofreeze DF-700-3 использовали методику быстрого замораживания эритроцитов с раствором ЦНИИГПК 1Ц и с раствором ЦНИИГПК 115-М с быстрой глицеринизацией.

Хранение эритроцитов, замороженных в полимерных криоконтейнерах, осуществляли в металлических холдерах в криохранилищах MVE 1520 HE+FD («Chart», США) в парах жидкого азота (-190°...-196°С). Для этого в криохранилище автоматически поддерживали уровень жидкого азота от 178 мм до 228 мм (по отношению ко дну сосуда). Все данные о состоянии замороженных эритроцитов визуализировались на дисплее системного монитора ТЕС 2000. Автоматическое поддержание установленных уровней жидкого азота в хранилищах осуществлялось через подпитывающие емкости, которые, в свою очередь, через термоизолирующий газопровод заправляли от наружной цистерны ЦТК-2,5.

Для размораживания криоконсервированных в полимерных контейнерах эритроцитов использовали устройство для размораживания криоконсервированных продуктов крови «Плазмотерм-4Э» («НПИФ Гиперион», Россия).

После оттаивания эритроциты из полимерных криоконтейнеров переливали в систему для отмывания (контейнер полимерный стерильный для отмывания эритроцитов методом центрифугирования К-250). В ходе деглицеринизации к оттаянным и подогретым до 22-25°С эритроцитам медленно, малыми порциями, постоянно помешивая, добавляли 50 мл 6% раствора хлорида натрия, причем после добавления каждых 15 мл раствора делали остановку 2-3 мин. Затем в этот же контейнер, медленно, малыми порциями, постоянно помешивая, добавляли 0,9% раствор хлорида натрия с 0,2% раствором глюкозы до максимально полного объема контейнера. После первого центрифугирования и снятия супернатанта производили несколько циклов отмывания 0,9% раствором хлорида натрия с 0,2% раствором глюкозы. Во избежание осмотического повреждения клеток при смене растворов добавление первых порций осуществляли медленно, при постоянном перемешивании (весы-помешиватели «Baxter Optimix Plus»). При повторных

отмываниях процедуру добавления раствора ускоряли, сохраняя принцип порционной добавки с перемешиванием. Количество отмываний определяли по содержанию свободного гемоглобина в супернатанте. Для окончательного отмывания требовалось, как правило, 4 цикла центрифугирования, при этом объем отмывающего раствора составлял около 2 л. После последнего отмывания и снятия супернатанта эритроциты, постоянно помешивая, ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия с 0,2% раствором глюкозы в соотношении 1:1 и хранили при температуре +2°...+6°С до окончания исследования не более 1 суток.

Изучали медико-технические параметры технологии

криоконсервирования эритроцитов, включающие длительность глицеринизации и деглицеринизации, скорость замораживания и др.

Для оценки качества исследуемой эритроцитной взвеси определяли содержание эритроцитов, гемоглобина, гематокрит и эритроцитарные индексы (МСН, МСНС, MCV, RDW) с помощью гематологического анализатора ADVEA 60 («Bayer HealthCare», Ирландия).

Содержание гемоглобина в компонентах с гематокритом выше 0,75 л/л определяли унифицированным гемиглобинцианидным методом. Концентрацию свободного гемоглобина в супернатанте определяли бихроматическим методом. Степень гемолиза в гемокомпоненте оценивали по отношению свободного гемоглобина к количеству общего гемоглобина (Akerblom О., Hogman C.F., 1974).

Относительную вязкость эритроцитов оценивали методом определения вязкости на бумаге по методике А.Ф. Пироговой и В.Д. Джоржикия (1963), модифицированной З.Д. Федоровой и М.А. Котовщиковой (1982). Для исследования деформируемости эритроцитов использовали модифицированный метод Tannert, Lux (1981) (Федорова З.Д. и соавт., 1989).

Рассчитывали сохранность эритроцитов (количество восстановленных клеток) и потери клеток на этапах криоконсервирования (Виноград-Финкель Ф.Р. и соавт., 1980).

Электролитный состав и показатели газотранспортной функции эритроцитной взвеси определяли с помощью газоанализатора Synthesis-45 («Instrumentation Laboratory», США).

Осмолярность исследовали' с помощью микроосмометра Microosmometer Model 3300 («Advanced Instruments», США). Определение остаточного содержания глицерина осуществляли с помощью тест-систем «BIOTEST» на спектрофотометре при длине волны 405-420 нм.

Определение содержания аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) проводили энзимоспектрофотометрическим методом в гексокиназной реакции при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46. Результаты оценивали в абсолютных показателях (мкмоль/г НЬ) и в процентах к исходным данным.

Кислотную резистентность определяли с помощью модифицированной методики И.А. Терскова и И.И. Гительзона (1957).

Морфологические особенности эритроцитов оценивали с помощью компьютеризированной электронно-оптической системы на основе

инвертированного люминесцентного микроскопа БИОЛАМ-П-1 (Россия) с использованием светового канала видимого диапазона и цифровой видеокамеры для анализа формы и ультраструктуры клеток (Кидалов В.Н. и соавт., 2006).

Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали на персональном компьютере с помощью программ Microsoft Excel и Statistica-6 for Windows (Боровиков В.П., 2003).

Результаты собственных исследований

На основании анализа многолетнего опыта работы СПК по вопросам криоконсервирования эритроцитов, с учетом медицинских и технических нормативов были разработаны медико-гигиенические требования к размещению «банка» замороженных эритроцитов с использованием современных криохранилищ нового поколения типа MVE. Установлено, что количество размещаемых криоконтейнеров для замораживания эритроцитов в исследуемых криохранилищах было несколько больше (на 7%), чем в хранилищах ХБ-0,5. Температура хранения эритроцитов в MVE-1520 регулировалась автоматически и составляла -190±1,5°С. При этом исследуемый криобанк являлся более экономичным: для его заполнения требовалось в 4,4 раза меньше жидкого азота по сравнению с ХБ-0,5. Наименьшая испаряемость жидкого азота зарегистрирована при использовании MVE-1520: этот показатель был в 1,8 раза ниже по отношению к аналогичному показателю ХБ-0,5. Время дозаправки хранилищ MVE-1520 было в 1,3 раза меньше чем ХБ-0,5.

Штатные нормативы отделения долгосрочного хранения замороженных клеток крови СПК были введены более 15 лет назад и к настоящему времени не учитывают изменившиеся условия работы персонала, технические характеристики современного криогенного оборудования и требований нормативных документов по трансфузиологии. На основании анализа опыта работы и экспертной оценки предложена ориентировочная штатная численность персонала отделения долгосрочного хранения клеток крови (криоконсервирования) в зависимости от емкости «криобанка». При емкости «криобанка» до 1000 доз эритроцитов штат персонала целесообразно определить в количестве 6 человек, при емкости от 1000 до 2000 доз - 9 человек, при емкости более 3000 доз - 12 человек. Предложенное количество должностей позволит обеспечивать своевременное замораживание и размораживание эритроцитов в оптимальном объеме. В зависимости от режима работы отделения (в 1 или 2 смены), а также от числа нуждающихся в трансфузионной терапии штатная численность может быть увеличена путем придания соответствующих специалистов (врач-трансфузиолог, медицинская сестра) из других подразделений по решению руководителя СПК.

Были исследованы медико-технические показатели процедур замораживания, хранения, размораживания и отмывания эритроцитов с использованием различных криоконтейнеров. В качестве группы сравнения (контрольной группы) рассматривали показатели технологии криоконсервирования эритроцитов с использованием алюминиевых

криоконтейнеров КАР-290. Установлено, что длительность подготовки эритроцитов к глицеринизации была практически одинаковой при использовании БР-700 и ККП-500 (табл. 1) и в среднем требовала в 3 раза меньше времени по сравнению с показателем контрольной группы.

Таблица 1- Медико-технические показатели процесса замораживания

эритроцитов

Показатель КАР-290 БР-700 ККП-500

Длительность подготовки к глицеринизации компонента, мин 141,2+5,6 47,8+2,2* 46,5±4,6*

Длительность глицеринизации эритроцитов, мин 23,0±2,2 40,8 ±3,2* 38,5±0,8*

Средняя скорость глицеринизации эритроцитов, мл/мин 10,8±1,0 6,9+0,2* 5,3±0,2*

Общее время подготовки эритроцитов к замораживанию, мин 164,0±7,2 140,5±6,0* 133,7±3,7*

Длительность замораживания, сек 130±5 283±10* 240±21*

Скорость замораживания, градус/мин 78,4±3,2 42,3+1,9* 50,2±4,5*

Примечание: *- р<0,05 по сравнению с образцами, замороженными с использованием КАР-290.

Затраты времени только на подготовку к использованию и стерилизацию одного нового алюминиевого криоконтейнера КАР-290 составляли 106,0±5,0 мин, в то время как непосредственная подготовка эритроцитов и маркировка занимала 35,2±2,8 мин. Длительность глицеринизации эритроцитов при использовании БР-700 была больше в 1,8 раза, ККП-500 - в 1,7 раза по сравнению с показателем контрольной группы. Данное различие обусловлено особенностями предложенной методики дробной глицеринизации с несколькими экспозициями, физиологически более обоснованной, так как насыщение клетки глицерином происходит очень медленно. Глицеринизация эритроцитов в алюминиевых контейнерах производилась путем медленного единовременного добавления глицерина с последующей экспозицией криоконтейнеров.

Средняя скорость глицеринизации, рассчитываемая с учетом первых двух экспозиций, в случае дробного добавления криозащитного раствора (БР-700 и ККП-500) была меньше, чем при работе с алюминиевыми криоконтейнерами на 56% и 100% соответственно, причем при использовании БР-700 средняя скорость оказалась на 23% больше, чем ККП-500. Общее время подготовки эритроцитов к замораживанию, в котором учитывались все манипуляции от момента получения крови из экспедиционного отделения и ее регистрации до замораживания в емкости с жидким азотом, было на 15% и 20% меньше при работе с криоконтейнерами ББ-700 и ККП-500 соответственно, чем с алюминиевыми криоконтейнерами. Общее время подготовки эритроцитов к замораживанию в полимерных криоконтейнерах между группами образцов при использовании БР-700 и ККП-500 существенно не отличалось. Длительность замораживания глицеринизированных эритроцитов в БР-700, помещенном в

металлический холдер, погруженном в жидкий азот, была в 2,2 раза больше, а в КПП-500 - в 1,9 раза больше времени замораживания в металлическом криоконтейнере. При этом замораживание эритроцитов в ККП-500 происходило в 1,2 раза быстрее, чем в криоконтсйнерах БР-700. Скорость замораживания, эритроцитов в БР-700 была в 1,9 раза меньше, в ККП-500 - в 1,6 раз по сравнению с таким же показателем контрольной группы образцов.

Время размораживания эритроцитов при использовании 0р-700 (180,3±9,4 с) было на 44%, ККП-500 (142,2+3,6 с) - на 29% больше, чем алюминиевых криоконтейнеров (100,8±10,2 с). В то же время длительность размораживания эритроцитов в полимерных контейнерах из различных материалов отличалась: при использовании ОР-700 она была на 21% больше, чем ККП-500. Различия во времени размораживания эритроцитов связаны с толщиной слоя и площадью согреваемой поверхности и с особенностями материала, из которого изготовлен контейнер, в частности с его теплопроводностью.

Общее время подготовки размороженных эритроцитов к деглицеринизации при использовании ОР-700 (26,0±1,8 мин) было меньше в 3,4 раза, ККП-500 (22,2±1,2 мин) - в 4 раза по сравнению показателем контрольной группы (88,5±3,3 мин). Длительность процедуры деглицеринизации существенных различий не имела и составляла при использовании металлических контейнеров 25,2±2,3 мии, Е>Р-700 - 23,5+0,7 мин, ККП-500 -23,1 ±0,8 мин.

Количество добавляемого ресуспендирующего раствора было больше при использовании ВР-700 на 50%, ККП-500 - на 36%, вес приготовленной среды был соответственно больше на 54% и 41% по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы.

Общее время, необходимое для размораживания, деглицеринизации, отмывания и ресуспендирования эритроцитов, было меньше при использовании ОР-7(Ю на 10% (229,2+5,3 мин), ККП-500 - на 14% (220,5±4,5 мин), чем при использовании алюминиевых контейнеров (254,3±15,6 мин).

Установлено, что длительность процесса размораживания криоконсервированных эритроцитов в полимерных контейнерах вручную в металлической ванне была на 22% меньше по сравнению с автоматическим размораживанием. Производительность аппаратной методики была в 3,1 раза выше по сравнению с ручной.

С целью совершенствования методики криоконсервирования эритроцитов было проведено исследование количественного и качественного состава эритроцитной взвеси, замороженной с помощью стандартной методики с использованием в качестве криофилактических растворов ЦНИИГПК П4 и ЦНИИГПК 115-М с конечной концентрацией глицерина в замораживаемой среде 15% и 20% соответственно. Замораживание эритроцитов проводили с помощью криоконтейнеров ЭР-700. После процедуры оттаивания-отмывания статистически значимых различий между гематологическими показателями образцов декриоконсервированных эритроцитов не выявлено. Более того,

значения всех исследованных показателей соответствовали требованиям отечественного, а содержание гемоглобина в дозе компонента соответствовало требованиям европейского стандартов. При этом содержание свободного гемоглобина в надосадочной жидкости в дозе гемокомпонента было более чем в 3 раза ниже максимального допустимого международным стандартом уровня.

Количество необратимо измененных форм эритроцитов в исследуемых группах статистически не отличалось, а содержание дискоидных и других обратимо измененных клеток в гемокомпонентах после размораживания и отмывания было более 90%. Сохранность клеток после размораживания и отмывания при использовании растворов ЦНИИГПК 114 (88,1+1,9%) и ЦНИИГПК 115-М (89,3±1,1%) существенных различий между группами образцов не имела.

С целью оптимизации процесса криоконсервирования и соответствия объема замораживаемого гемокомпонента объему криоконтейнера нами предложена методика замораживания эритроцитов в виде эритроцитного концентрата (с неполным удалением надосадка) с использованием криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М (так называемая методика «дискретной гяицеринизации»), которая обеспечивает более физиологичное насыщение эритроцитов криофилактиком до замораживания и длительную деглицеринизацию их после оттаивания.

Были проведены сравнительные исследования количественного и качественного состава эритроцитной взвеси, криоконсервированной в полимерных контейнерах БР-700 с использованием двух методик глицеринизации, деглицеринизации и отмывания. Первую группу образцов (контрольную) составили компоненты, глицеринизацию, деглицеринизацию и отмывание которых осуществляли по стандартным методикам, изложенным в «Инструкции по криоконсервированию клеток крови» (1995). Образцы эритроцитной взвеси второй группы глицеринизировали, деглицеринизировали и отмывали по усовершенствованной дискретной методике.

При сравнении значений гематологических показателей двух групп образцов выявлено, что при использовании усовершенствованной методики гематокрит эритроцитной взвеси был выше на 17%, содержание эритроцитов -на 7,5%, концентрация гемоглобина - на 16%, содержание гемоглобина в дозе гемокомпонента - на 21% по сравнению с образцами, глицеринизацию-деглицеринизацию-отмывание которых проводили по стандартной методике (табл. 2). Концентрация свободного гемоглобина в надосадочной жидкости исследуемых образцов эритроцитной взвеси была ниже на 29%, содержание свободного гемоглобина в дозе гемокомпонента - на 36%, степень гемолиза -на 46% по сравнению с контрольной группой.

При исследовании эритроцитарных индексов отмечено, что в образцах при использовании усовершенствованной методики глицеринизации-деглицеринизации-отмывания средний объем эритроцитов был на 8,5% ниже, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах было выше на 9,5%, ширина

распределения эритроцитов по объему - на 12,8% меньше по сравнению с образцами контрольной группы.

Таблица 2 - Гематологические показатели декриоконсервированной эритроцитной взвеси при использовании различных методик глицеринизации-деглицеринизации-отмывания (после добавления взвешивающего раствора в соотношении 1:1)_

Показатель Стандартная Усовершенствованная

методика методика

Гематокрит, л/л 0,35±0,01 0,41 ±0,01*

Содержание эритроцитов, х 10и/л 3,75±0,11 4,03±0,08*

Концентрация гемоглобина, г/л 114,6±4,5 132,3±1,9*

Содержание гемоглобина, г/доза 38,2+3,1 46,2±1,0*

Концентрация свободного гемоглобина, г/л 0,295+0,020 0,208±0,012*

Содержание свободного гемоглобина 0,064±0,005 0,041±0,003*

в дозе, г

Степень гемолиза, % ОД 1 ±0,02 0,07±0,02

МСУ, фл 94,5±1,3 86,7±1,0*

МСН, пг 30,6±0,5 30,9±0,5

МСМН, г/л 325,7±8,2 356,9±5,3*

шж% 16,4±0,5 14,3 ±0,3*

Примечание: * - достоверность различий между исследуемыми группами.

Следует заметить, что значения гематологических показателей образцов эритроцитной взвеси двух групп соответствовали стандартам, принятым в службе крови РФ.

Сохранность клеток декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси при использовании усовершенствованной методики глицеринизации-деглицеринизации-отмывания (92,1±2,1%) была незначительно выше по сравнению с аналогичным показателем (89,3±1,1%) контрольной группы образцов. При сравнении с контрольной группой в образцах, глицеринизацию-деглицеринизацию-отмывание которых осуществляли по усовершенствованной методике, необратимо измененных форм эритроцитов было меньше в 2 раза, а дискоидных клеток на 4,5% больше.

При оценке показателей кислотной резистентности эритроцитов в образцах исследуемой группы содержание сфероцитов и низкостойких форм клеток было в 1,4 раза меньше, а время 50%-ного гемолиза - на 24% больше по сравнению с образцами контрольной группы. Кроме того, использование усовершенствованной методики глицеринизацки-деглицеринизации-отмывания эритроцитов сопровождалось улучшением реологических свойств декриоконсервированных клеток: индекс деформируемости эритроцитов был на 19% выше по сравнению образцами контрольной группы.

При сравнительном анализе эффективности программ криоконсервирования эритроцитов в полимерных криоконтейнерах при сверхнизкой температуре исследовали 3 группы образцов

декриоконсервированных эритроцитов. В качестве контрольной группы рассматривали эритроциты, замороженные в алюминиевых ребристых криоконтейнерах КАР-290 по стандартной методике с использованием криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М. Исследуемую группу составили эритроциты, криоконсервированные в полимерных криоконтейнерах отечественного (ККП-500) и зарубежного (1)Р-700) производства с использованием аналогичного криофилактического раствора по методике дискретной глицеринизации.

Установлено, что вес, гематокрит, содержание эритроцитов и гемоглобина существенных различий между группами образцов не имели и соответствовали требованиям нормативных документов (табл. 3).

Таблица 3 - Гематологические показатели декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси (после добавления взвешивающего раствора в соотношении 1:1)___■

Показатели КАР-290 п = 15 0р-700 п = 38 ККП-500 п= 10

Гематокрит, л/л 0,39±0,01 0,41±0,01 0,41 ±0,02

Содержание эритроцитов, х 10п/л 3,89±0,06 4,03±0,08' 4,09±0,05

Концентрация гемоглобина, г/л 129,4±2,2 132,3+1,9 128,8±4,4

Содержание гемоглобина в дозе, г 45,3+0,4 46,2±1,0 41,4±2,9

Концентрация свободного гемоглобина, г/л 0,85±0,08 0,21 ±0,01* 0,39+0,03*' **

Содержание свободного гемоглобина в дозе, г 0,182±0,010 0,041+0,003* 3,085+0,006*'**

Степень гемолиза, % 0.24+0,09 0,07+0,02* 0,12+0,07*'**

Примечание: * - достоверность различий по отношению к группе контроля (КАР-290); ** - достоверность различий ■ между исследуемыми группами (Ьр-700 и ККП-500).

Концентрация свободного гемоглобина была в 4 раза ниже при использовании для замораживания криоконтейнеров БР-700 и в 2,2 раза меньше при замораживании эритроцитов в криоконтейнерах ККП-500 по сравнению с образцами контрольной группы.

Степень гемолиза была значительно ниже при использовании для замораживания полимерных контейнеров: при замораживании в БР-700 - в 3,4 раза, в ККП-500 - в 2 раза по сравнению с компонентом, замороженным в КАР-290. При этом замораживание эритроцитов в полимерных контейнерах ВР-700 сопровождалось меньшей степенью гемолиза (в 1,7 раза) по сравнению с полимерными контейнерами ККП-500.

Сохранность клеток после смешивания эритроцитов с консервантом, замораживания, отогрева и отмывания при использовании полимерных контейнеров БР-700 (92,1±2,1%) и ККП-500 (91,2±1,6%) была выше по

сравнению с аналогичным показателем (87,5±2,0%) контрольной группы образцов (рис. 1).

% 10090 -80 -7060 -50 -40 -30 -20 -10 0

КАР-290 ОБ-700 ККП-500

Рисунок 1 - Сохранность эритроцитов после размораживания и отмывания (% от исходного количества)

Биохимический состав супернатанта декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси не имел существенных различий в зависимости от технологии криоконсервирования (табл. 4). Осмолярность супернатанта декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси во всех наблюдениях не превышала рекомендуемых величин и не имела различий между контрольной и исследуемыми группами образцов. Содержание остаточного глицерина в супернатанте размороженной и отмытой эритроцитной взвеси в 2,6-2,8 раза было ниже контрольного показателя, установленного нормативным документом.

Таблица 4 - Биохимические показатели декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси (после добавления взвешивающего раствора в соотношении 1:1)__

Показатели КАР-290 ББ-700 ККП-500

п = 15 п = 38 п = 10

Ыа+, ммоль/л 157,0±1,5 157,3±0,7 155,8±0,8

К+, ммоль/л 1,13±0,05 1,11+0,03 1,21 ±0,06

Саммоль/л 0,15±0,02 0,16±0,06 0,14+0,01

С1', ммоль/л 135,3+1,2 134,4±0,4 138,3±1,5

Осмолярность, мОсм/л 307,3±2,6 313,9x2,1 314,0±2,7

Остаточный глицерин, 0,35±0,02 0,38+0,01 0,37±0,01

г/%

Содержание АТФ в эритроцитах, криоконсервированных с использованием полимерных криоконтейнеров ОР-7(Ю (4,10+0,12 мкмоль/гНЬ), было больше на 22%, ККП-500 (3,96±0,13 мкмоль/г НЬ) - на 18% по сравнению с контрольной группой (3,35+0,21 мкмоль/г НЬ) (рис. 2).

мкмоль/г НЬ 5

4 -3 -2

1 н

о

■н

КАР-290

0р-700

ККП-500

Рисунок 2 - Содержание АТФ в эритроцитах после замораживания, размораживания и отмывания

По отношению к исходному содержанию АТФ в эритроцитах, замороженных в ЭР-700, сохранялось 93Д±1,2%, ККП-500 - 90.2+2.3%, КАР-290 - 81,4+2,1% этого важнейшего макроэргического соединения, отражающего энергетический потенциал клеток и коррелирующего с их приживаемостью.

Установлено, что значения показателя рН в размороженной и отмытой эритроцитной взвеси, при замораживании которой использовали полимерные контейнеры БР-700 и ККП-500, были выше по сравнению с контрольной группой. Дефицит оснований был менее выражен в эритроцитной взвеси, криоконсервированной с использованием 0р-700, на 41% и ККП-500 - на 30% по сравнению с контрольной группой образцов. Эти данные свидетельствует о более выраженном ацидозе в группе образцов, для замораживания которых применяли алюминиевые контейнеры.

Значения показателей газотранспортной функции эритроцитов -напряжение кислорода и углекислого газа, содержание оксигемоглобина, а также расчетное значение сатурации крови кислородом в контрольных и исследуемых образцах эритроцитной взвеси существенно не различались. Общая концентрация кислорода была больше в образцах эритроцитной взвеси, замороженной с использованием БР-700 и ККП-500, соответственно на 18% и 17,5% , и кислородная емкость - на 22% и 20% по сравнению со значениями аналогичных показателей контрольной группы. Вместе с тем, общая концентрация кислорода в эритроцитной взвеси в контрольной группе

составляла 73%, при использовании Г)Р-700 - 86%, ККП-500 - 85%, а кислородная емкость соответственно - 59%, 68% и 71% от ее уровня в свежеприготовленной (1 сутки с момента заготовки) эритроцитной взвеси.

Значения показателя Р50 в контрольных (44,2+2,6 мм рт. ст.) и исследуемых (0р'-700 - 43,1+2,2 мм рг. ст., ККП-500 - 42,1±2,3 мм рт. ст.) образцах эритроцитной взвеси существенно не различались (рис. 3). При этом они соответствовали 88,5 - 93,2% от его уровня в свежеприготовленной (1 сутки с момента заготовки) эритроцитной взвеси (47,6+2,3 мм рт. ст.).

мм рт. ст. 50 т

40 -

30 -

20 -

10 -

КАР-290 DF-700 ККП-500

Рисунок 3 - Показатель Р50 в эритроцитной взвеси после замораживания, размораживания и отмывания

Изменения морфологических показателей, кислотной резистентности и реологических свойств декриоконсервированных эритроцитов в исследуемых группах образцов декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси представлены в таблице 5. При сравнении с контрольной группой в образцах, замороженных с использованием криоконтейнеров DF-700, необратимо измененных форм эритроцитов было меньше в 1,9 раза, при использовании КПП-500 - в 2,3 раза, а дискоидных клеток - на 4,02% и 4,69% больше соответственно.

Кислотная резистентность криоконсервированных эритроцитов в полимерных контейнерах была выше, чем в алюминиевых. В исследуемых образцах отмечалось увеличенное количество высоко- и среднестойких клеточных форм: по сравнению с КАР-290 в образцах, замороженных в ККП-500, их было больше на 14,6%, а в DF-700 - на 18,7%. Содержание низкостойких форм в образцах, замороженных в ККП-500, по сравнению с алюминиевыми контейнерами было меньше на 39%, а в группе DF-700 - на 62%. Значение показателя Т50 в образцах, замороженных в полимерных контейнерах, по сравнению с КАР-290 было больше на 10% (при использовании DF-700) и 11% (при использовании ККП-500).

Реологические свойства декриоконсервированной эритроцитной взвеси сохранялись лучше в образцах, замороженных в полимерных контейнерах, по сравнению с КАР-290: индекс деформируемости эритроцитов был выше (на 33,3% при использовании ОБ-700 и на 44% - ККП-500), а коэффициент вязкости меньше (на 10% при использовании БР-700 и на 14% -ККП-500).

Таблица 5 - Морфологические показатели, показатели кислотной резистентности и реологические свойства декриоконсервированной и отмытой эритроцитной взвеси____

Показатели КАР-290 п= 15 БР-700 п = 38 ККП-500 п= 10

Морфологические показатели

Необратимо измененные формы эритроцитов, % 8,37±0,36 4,32±0,40* 3,68+0,30*

Дискоидные и другие обратимо измененные эритроциты, % 91,63+0,40 95,68±0,60* 96,32±0,80*

Кислотная резистентность

Предгемолитические и низкостойкие формы (А, В), % 37,6±5,2 23,3±1,9* 27,1+2,02*

Высоко- и среднестойкие формы (С, Б),% 62,4±5,2 76,7± 1,91* 72,9+1,16*

Т5о.мин 3,07+0,01 3,56±0,05* 3,52±0,05**

Реологические свойства

ИДэ.отн. ед. 1,20±0,07 1,65±0,10* 1,73±0,10*

КВэ,, отн. ед. 2,45+0,04 2,22±0,20* 2,15+0,20*

Примечание: * - достоверность различий по отношению к группе контроля (КАР-290).

При анализе микрофотографий обнаружена локальная перестройка мембраны декриоконсервированных эритроцитов. В отдельных размороженных эритроцитах при микроскопии визуализировались участки неравномерной конденсации внутриклеточного содержимого. Однако во всех исследуемых группах препаратов такие изменения были минимальными, что позволяет считать по этому признаку проанализированные образцы эритроцитной взвеси пригодными к трансфузии.

Выводы

1. Разработана технология криоконсервирования эритроцитов с использованием отечественных полимерных криоконтейнеров при сверхнизкой температуре (-190...-196°С), позволяющая резервировать эритроцитную взвесь для терапевтических целей.

2. Методом выбора криоконсервирования эритроцитов в полимерных контейнерах при сверхнизкой температуре является использование

ограждающего раствора ЦНИИГПК 115-М. Дискретное добавление к эритроцитной взвеси этого криофилактического раствора и дсглицеринизация с последующими промежуточными экспозициями обеспечивают более высокую степень биологической сохранности эритроцитов при криоконсервировании по сравнению со стандартной методикой глицеринизации и деглицеринизации.

3. Криоконсервированные по предложенной методике в полимерных контейнерах эритроциты после размораживания соответствуют критериям стандартов качества эритроцитосодержащих трансфузионных сред. Подготовленные к переливанию такие эритроциты обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность, более устойчивы к гемолизу по сравнению с клетками, криоконсервированными в металлических контейнерах.

4. Оптимальная организация технологии криоконсервирования эритроцитов с использованием полимерных контейнеров предусматривает рациональное размещение «криобанка» в соответствии с разработанными медико-гигиеническими требованиями, поддержание взаимодействия с другими подразделениями станции переливания крови и налаживание системы лабораторного контроля качества декриоконсервированных трансфузионных сред.

Практические рекомендации

1. При организации деятельности станции переливания крови по криоконсервированию клеток крови требуется учитывать медико-гигиенические условия размещения криогенного оборудования и рабочих мест, осуществлять выбор наиболее совершенного технологического оборудования и рассчитывать штатные нормативы персонала отделения долгосрочного хранения клеток крови (криоконсервирования) в зависимости от емкости «банка».

2. Резервирование эритроцитных гемокомпонентов при сверхнизкой температуре целесообразно осуществлять с использованием полимерных криоконтейиеров отечественного производства и современного криогенного оборудования.

3. Для замораживания эритроцитов в полимерных контейнерах целесообразно использовать ограждающий раствор ЦНИИГПК 113-М, обеспечивающий конечную концентрацию глицерина в эритроцитной взвеси 20%.

4. Для получения высокого качества декриоконсервированных эритроцитов глицеринизацию и деглицеринизацию эритроцитной взвеси следует осуществлять по дискретной методике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Багаутдинов Ш.М. Совершенствование организации долгосрочного резервирования гемокомпонентов в многопрофильном военно-лечебном учреждении / Ш.М. Багаутдинов, А.В. Чечеткин, Г.И. Петренко, Е.Е. Халайчев,

Н.С. Кузьмин, С.П. Калеко // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2006. - № 1 (15): Прил. - С. 226-227.

2. Чечеткии A.B. Обеспечение инфекционной безопасности при эксплуатации криоконтейнера «Hemofreeze bag DF-700» / А.В.Чечеткин, Е.Е. Халайчев, Г.И. Петренко, С.Н. Кононенко // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - СПб., 2007. - Вып. 38. - С. 112-112.

3. Чечеткин A.B. Способ криоконсервирования эритроцитов с применением электронных весов / A.B. Чечеткин, С.Н. Кононенко, Ш.М. Багаутдинов, Е.Е. Халайчев // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - СПб., 2007. - Вып. 38. - С. 113-114.

4. Халайчев Е.Е. Применение новых полимерных криоконтейнеров для замораживания эритроцитов при ультранизких температурах / Е.Е. Халайчев, A.B. Чечеткин, В.Н. Вильянинов, С.Н. Кононенко, Г.И. Петренко II Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - № 1 (17), ч. П: Прил. - С. 729-729.

5. Багаутдинов Ш.М. Автоматизация замораживания и хранения гемотерапевтических средств в многопрофильном лечебном учреждении / Ш.М. Багаутдинов, Е.Е. Халайчев, A.B. Чечеткин, С.Н. Кононенко // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - № 1 (17), ч. II: Прил. - С. 728-729.

6. Чечеткин A.B. Медико-гигиенические аспекты деятельности «банка» криоконсервированных клеток крови и костного мозга / A.B. Чечеткин, Ш.М. Багаутдинов, Е.Е. Халайчев, С.Н. Кононенко, Н.С. Кузьмин // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - № 4 (20): Прил. - С. 76-76.

7. Халайчев Е.Е. Опыт использования пластиковых криоконтейнеров при замораживании эритроцитов в жидком азоте / Е.Е. Халайчев, В.Н. Вильянинов, Г.И. Петренко, Н.М. Шишов // Трансфузиология. - 2007. - Т. 8, № 1/2.-С. 70-70.

8. Багаутдинов Ш.М. Совершенствование организации работы банка длительного хранения гемотрансфузионных средств / Ш.М. Багаутдинов, Е.Е. Халайчев // Трансфузиология. - 2007. - Т. 8, № 1/2. - С. 56-56.

9. Халайчев Е.Е. Криоконсервирование эритроцитов в полимерных контейнерах одноразового использования отечественного производства / Е.Е. Халайчев, Н.С. Карпова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тез. науч.-практ. конф. молодых ученых СПбМАПО. - СПб.: СПбМАПО, 2006. - С. 242-243.

10. Багаутдинов Ш.М. Применение новых полимерных криоконтейнеров для замораживания эритроцитов при ультранизкой температуре / Ш.М. Багаутдинов, A.B. Копелец, A.B. Чечеткин, Е.Е. Халайчев, Н.М. Шишов, H.A. Анисимов // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: материалы науч.-практ. конф. - Киров, 2008. - С. 2021.

11. Багаутдинов Ш.М. Лабораторные исследования эритроцитной взвеси при замораживании и хранении при ультранизкой температуре с использованием новых полимерных криоконтейнеров / Ш.М. Багаутдинов, A.B.

Чечеткин, Е.Е. Халайчев, В.Н. Вильянинов // Актуальные проблемы лабораторной диагностики: материалы Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2008.

- С. 5-6.

12. Данилова A.B. Повышение иммунологической безопасности средств трансфузионной терапии / A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, Е.Е. Халайчев, A.B. Копелец, А.Д. Касьянов // Весгн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2008. - № 2, ч. II: Прил,-С. 642-642.

13. Багаутдинов Ш.М. Профилактика бактериальной контаминации при длительном хранении клеток крови в замороженном состоянии / Ш.М. Багаутдинов, A.B. Чечеткин, Е.Е. Халайчев, С.Н. Кононенко // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2008. -№ 2, ч. II: Прил. - С. 644-644.

14. Чечеткин A.B. Возможности карантинизации донорских гемокомпонентов в военно-медицинских учреждениях / A.B. Чечеткин, A.B. Данилова, Е.Е. Халайчев, В.Н. Семелев, Д.В. Уваров // Система профилактики ВИЧ/СПИДА в Вооруженных Силах: материалы междунар. науч.-практ. конф. -СПб., 2008.-С.70-70.

15. Вильянинов В.Н. Комбинирование методов дооперационного резервирования компонентов аутокрови в плановой хирургии / В.Н. Вильянинов, A.B. Чечеткин, С.М. Романенко, Е.Е. Халайчев, В.А. Артюх // Вестн. хирургии им. Грекова. - 2008. - Т. 167, № 4. - С. 90-94.

16. Багаутдинов Ш.М. Использование новых полимерных криоконтейнеров для замораживания эритроцитов при ультранизкой температуре / Ш.М. Багаутдинов, A.B. Копелец, A.B. Чечеткин, Е.Е. Халайчев, Н.М. Шишов, С.М. Романенко // Гематология и трансфузиология. - 2009. - № 1.

- С. 25-25.

17. Багаутдинов Ш.М. Новые технологии замораживания и хранения эритроцитов при сверхнизкой температуре / Ш.М. Багаутдинов, A.B. Чечеткин, С.Н. Кононенко, Е.Е. Халайчев // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2009. - Ks 1(25), ч. I: Прил.-С. 172-172.

18. Багаутдинов Ш.М. Качество эритроцитов, замороженных при сверхнизкой температуре с использованием полимерных криоконтейнеров / Ш.М. Багаутдинов, С.Н. Кононенко, Е.Е. Халайчев // Трансфузиология. -2009. -№1/2. -С. 11-11.

Список сокращений

АТФ аденозинтрифосфорная кислота

ИДЭ индекс деформируемости эритроцитов

КВэ, коэффициент вязкости эритроцитов

СПК станция переливания крови

Т50 время гемолиза 50% эритроцитов

МСН среднее содержание гемоглобина в эритроците

МСМН средняя концентрация гемоглобина в эритроците

MCV средний объем эритроцитов

Pso напряжение кислорода в крови при насыщении гемоглобина

RDW ширина распределения эритроцитов по объему

Подписано в печать «26» октября 2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офа-пия. Печать офсетная. Усл. печ. л .1. Тираж 100 экз. Заказ №_

Типография »Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, I.

Актуальность исследования. Эритроцитная масса (взвесь) является основной трансфузионной средой для коррекции газотранспортной функции крови при травмах и заболеваниях (Ермолов А.С. и соавт., 1994; Гузовский Е.В., 1999; Полушин Ю.С., 2004; Vincent J.L., et al., 2002). Потребность в ней возрастает при массовых поражениях и катастрофах (Жибурт Е.Б. и соавт., 1999; Данильченко В.В. и соавт., 2001; Dunne J.R. et al., 2006). Существующие способы консервирования позволяют хранить в жидком состоянии эритроцитные гемокомпоненты до 50 дней, что ограничивает рациональное использование трансфузионных сред и их резервирование для оказания медицинской помощи в чрезвычайных ситуациях. Решение этих вопросов предопределяет внедрение в практику учреждений службы крови методов длительного хранения эритроцитов в замороженном состоянии.

К настоящему времени доказана эффективность использования криоконсервирования эритроцитов при создании резерва трансфузионных сред при массовом поступлении раненых и пострадавших (Вильянинов В.Н. и соавт., 1999; Hess J.R., 2003; Gharehbaghian A. et al., 2008), формировании банка редких групп крови (Zhu Z., 2006; Bohonek М.В. et al., 2008; Flegel W.A. et al., 2008; Mo Q. et al., 2008), использовании программ предоперационного аутодонорства (Калеко С.П. и соавт., 1991; Шилов В.В., 1995; Fontaine M.J. et al., 2003; Tsuno N.H. et al., 2008), для карантинизации эритроцитов (Елыкомов В.А. и соавт., 2004; Мельникова В.Н. и соавт., 2007), для хранения эритроцитов с последующим производством реагентов для иммуногематологических исследований (Seo J.W. et al., 2008), а также для обеспечения гемокомпонентами военно-медицинских учреждений при выполнении миротворческих или военных операций (Онуфриевич А.Д. и соавт., 1999; Rosenblatt M.S. et al., 1994; Noorman F. et al., 2006). В этих случаях используют различные методы замораживания эритроцитов в широком диапазоне температур (-25°.-196°С). В последние годы в трансфузиологическую практику внедрены методы замораживания эритроцитов с использованием электрохолодильников (Мельникова В.Н. и соавт., 1990; Орлик В.В., 1999; Вильянинов В.Н. и соавт., 2000; Valeri C.R. et al., 2000; Hess J.R., Thomas M.J.G., 2003; Scott K.L. et al., 2005). Однако в нашей стране криоконсервирование с применением жидкоазотного оборудования широко используется для долгосрочного хранения эритроцитов, что обусловлено особенностями эксплуатации криогенной техники, наличием значительного научно-практического опыта и разработанных нормативных документов, возможностью длительного сохранения морфофункциональных свойств замороженных клеток крови (Рыжков С.В. и соавт., 1973; Багаутдинов Ш.М., 1999; Вильянинов В.Н. и соавт., 2000; Сидоркевич С.В., 2002; Шарова Т.Н. и соавт., 2003; Костяев А.А., 2004).

Между тем, полимерные контейнеры для замораживания и хранения эритроцитов при сверхнизкой температуре (до -196°С) в России серийно не производятся, вопросы их применения с использованием современного криогенного оборудования не разработаны.

Это сдерживает дальнейшее развитие методов криоконсервирования и практическую реализацию стратегии резервирования эритроцитосодержащих трансфузионных сред.

Цель работы - научное обоснование, разработка и исследование эффективности программ криоконсервирования эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием полимерных криоконтейнеров.

Задачи исследования:

1) определить организационные и медико-технические особенности технологии криоконсервирования эритроцитов с использованием жидкоазотного оборудования и полимерных контейнеров на станции переливания крови;

2) изучить морфофункциональные свойства эритроцитов, криоконсервированных в полимерных криоконтейнерах при сверхнизкой температуре;

3) провести сравнительный анализ эффективности программ криоконсервирования эритроцитов в полимерных криоконтейнерах при температуре-190°.-193°С.

Научная новизна. Впервые научно обоснована возможность применения отечественных полимерных контейнеров для замораживания и хранения эритроцитов при сверхнизкой температуре (до -196°С). Получены новые данные о том, что дискретное добавление к эритроцитной взвеси криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М и деглицеринизация с последующими промежуточными экспозициями позволяют повысить сохранность и обеспечить морфофункциональную полноценность размороженных и отмытых эритроцитов.

Разработана новая технология криоконсервирования эритроцитов с использованием полимерных контейнеров отечественного производства при сверхнизкой температуре (до -196°С).

Выявлено, что эритроциты, криоконсервированные по предложенной технологии с использованием полимерных контейнеров и современного жидкоазотного оборудования, после размораживания обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность, устойчивость к гемолитическому воздействию.

Практическая значимость. Конкретизированы медико-гигиенические требования к размещению и организации работы «банка» криоконсервированных эритроцитов, предложены штатные нормативы отделения долгосрочного хранения замороженных клеток крови станции переливания крови и типовой перечень оборудования.

Предложена и апробирована дискретная методика глицеринизации и деглицеринизации эритроцитов, позволяющая обеспечить требуемое качество декриоконсервированной эритроцитосодержащей трансфузионной среды.

Доказано, что криоконсервированные с помощью предложенной технологии эритроциты соответствуют стандартам, которые предъявляются к качеству эритроцитосодержащих гемотрансфузионных сред, годных к переливанию.

Положения, выносимые на защиту

1. Технология криоконсервирования эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием полимерных криоконтейнеров отечественного и зарубежного производства позволяет снизить затраты времени на подготовку и проведение замораживания и оттаивания компонента, повысить производительность работы отделения долгосрочного хранения клеток крови станции переливания крови.

2. Биологическая полноценность криоконсервированных в полимерных контейнерах при сверхнизкой температуре эритроцитов достигается использованием криофилактического раствора ЦНИИГПК 115-М и применением дискретной методики глицеринизации и деглицеринизации эритроцитов.

3. Замораживание эритроцитов при сверхнизкой температуре с использованием отечественных и зарубежных полимерных контейнеров позволяет резервировать гемокомпоненты, которые соответствуют требованиям, предъявляемым к качеству декриоконсервированных эритроцитосодержащих трансфузионных сред, обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля

Вооруженных Сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2006), научно-практическом семинаре «Организация работы банка криоконсервированных гемокомпонентов» (Санкт-Петербург, 2006), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), заседании подсекции трансфузиологии Ученого Медицинского Совета ГВМУ МО РФ «Состояние и пути повышения качества производства и безопасности применения компонентов и препаратов крови в военно-лечебных учреждениях» (Москва, 2007), научно-практическом семинаре «Актуальные вопросы криоконсервирования гемокомпонентов» (Санкт-Петербург, 2007), на сборе главных трансфузиологов видов Вооруженных Сил, округов и флотов Министерства обороны Российской Федерации «О состоянии донорства крови и ее компонентов в Вооруженных Силах РФ и основных направлениях по его развитию» (Санкт-Петербург, 2008), IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы исследования реализованы при выполнении в рамках Гособоронзаказа опытно-конструкторской работы «Разработка полимерного контейнера одноразового использования для долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах», шифр «Поликонт», для нужд Минобороны РФ (Государственный контракт № ВНК/1/1-2002 от 17.06.2002 г.).

Результаты исследования использованы в материалах 2 тем НИР, проводимых в соответствии с планом научной работы ГВМУ МО РФ:

- «Стандартизация производства, применения и контроля качества криоконсервирующих, отмывающих и ресуспендирующих средств в военно-медицинских учреждениях», № VMA.02.06.02.0708/0200;

- «Совершенствование методов криоконсервирования клеток крови в полимерных контейнерах в военно-лечебных учреждениях», № VMA.02.06.02.0709/0176.

Основные материалы исследования опубликованы в 18 научных работах, из них 9 - опубликованы в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

По материалам диссертации внедрены 22 рационализаторских предложения. В Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам зарегистрированы приоритеты на 2 изобретения:

1) Заявка 2008136824 Рос. Федерация. Способ криоконсервирования эритроцитов в парах жидкого азота. - Заявл. 12.09.2008 г.

2) Заявка 2008136823 Рос. Федерация. Способ реабилитации декриоконсервируемых эритроцитов. - Заявл. 12.09.2008 г.

Реализация работы. Результаты работы внедрены в практическую работу СПК Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова, СПК Главного военного клинического госпиталя имени Н.Н. Бурденко.

Результаты работы использованы при подготовке акта Государственной комиссии по проведению испытаний полимерного контейнера долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах и регистрационного удостоверения № ФС 01262006/3747-06 от 01 августа 2006 г., выданного Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Контейнер полимерный одноразового использования для долговременного хранения клеток крови и костного мозга при сверхнизких температурах».

Результаты работы используются в учебном процессе на факультете последипломного и дополнительного профессионального образования ВМедА на циклах усовершенствования «Избранные вопросы трансфузиологии», «Клиническая трансфузиология», профессиональной переподготовки «Трансфузиология».

Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно выполнял сбор материала, осуществлял подготовку к замораживанию, криоконсервирование и размораживание эритроцитов, участвовал в проведении биохимических исследований образцов гемокомпонентов, проводил статистический анализ полученных результатов и подготовку материалов к публикациям.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология криоконсервирования эритроцитов с использованием отечественных полимерных криоконтейнеров при сверхнизкой температуре (-190. -196°С), позволяющая резервировать эритроцитную взвесь для терапевтических целей.

2. Методом выбора криоконсервирования эритроцитов в полимерных контейнерах при сверхнизкой температуре является использование ограждающего раствора ЦНИИГПК 115-М. Дискретное добавление к эритроцитной взвеси этого криофилактического раствора и деглицеринизация с последующими промежуточными экспозициями обеспечивают более высокую степень биологической сохранности эритроцитов при криоконсервировании по сравнению со стандартной методикой глицеринизации и деглицеринизации.

3. Криоконсервированные по предложенной методике в полимерных контейнерах эритроциты после размораживания соответствуют критериям стандартов качества эритроцитосодержащих трансфузионных сред. Подготовленные к переливанию такие эритроциты обладают высокими реологическими характеристиками, сохраняют газотранспортную функцию и морфологическую полноценность, более устойчивы к гемолизу по сравнению с клетками, криоконсервированными в металлических контейнерах.

4. Оптимальная организация технологии криоконсервирования эритроцитов с использованием полимерных контейнеров предусматривает рациональное размещение «криобанка» в соответствии с разработанными медико-гигиеническими требованиями, поддержание взаимодействия с другими подразделениями станции переливания крови и налаживание системы лабораторного контроля качества декриоконсервированных трансфузионных сред.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При организации деятельности станции переливания крови по криоконсервированию клеток крови требуется учитывать медико-гигиенические условия размещения криогенного оборудования и рабочих мест, осуществлять выбор наиболее совершенного технологического оборудования и рассчитывать штатные нормативы персонала отделения долгосрочного хранения клеток крови (криоконсервирования) в зависимости от емкости «банка».

2. Резервирование эритроцитных гемокомпонентов при сверхнизкой температуре целесообразно осуществлять с использованием полимерных криоконтейнеров отечественного производства и современного криогенного оборудования.

3. Для замораживания эритроцитов в полимерных контейнерах целесообразно использовать ограждающий раствор ЦНИИГПК П5-М, обеспечивающий конечную концентрацию глицерина в эритроцитной взвеси 20%.

4. Для получения высокого качества декриоконсервированных эритроцитов глицеринизацию и деглицеринизацию эритроцитной взвеси следует осуществлять по предложенной дискретной методике.