Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Совершенствование клинико-морфологической диагностики лимфом кожи в военно-лечебных учреждениях МО РФ

На правах рукописи

ЖУКОВ Александр Сергеевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИМФОМ КОЖИ В ВОЕННО-ЛЕЧЕБНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ МО РФ

14.01.10 - кожные и венерические болезни 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 [ :ДГ: 2014

Санкт-Петербург — 2014

005547752

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители

доктор медицинских наук профессор Самцов Алексей Викторович

доктор медицинский наук Белоусова Ирена Эдуардовна

Официальные оппоненты:

Ключарева Светлана Викторовна доктор медицинских наук профессор

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры дерматовенерологии

Шелехова Ксения Владимировна доктор медицинских наук

ФГБУ "НИИ онкологии имени H.H. Петрова" Министерства здравоохранения Российской' Федерации, старший научный сотрудник отдела морфологии опухолей

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита состоится с7 2014 г. в /¿у'часов на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 на базе Федерального государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны России (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке и на сайте http://www.vmeda.org Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова

Автореферат разослан « _2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед! зофессор

Пономареш колаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Лимфомы кожи (ЛК) представляют собой гетерогенную группу злокачественных заболеваний лимфоидной ткани, отличающихся по клиническим проявлениям, течению, прогнозу и подходам к лечению [Кубанова А.А. и соавт., 2008; Song S.X., Kim Y.H., Willemze R. et al., 2007; Willemze R., 2011; Sarantopoulos G.P., Palla В., 2013]. Особенностью данной группы заболеваний является первичное развитие клональной пролиферации лимфоцитов в эпидермисе, дерме и гиподерме с возможностью вторичного распространения на другие органы и ткани [Белоусова И.Э. и соавт., 2007; Kim Y.H., Willemze R. et al., 2007].

Вследствие клинической и морфологической разнородности и относительно редкой встречаемости диагностика ЛК бывает невозможна без применения дополнительных методов исследования [Самцов А.В. и соавт., 2006; Willemze R-, 2012; Рорре L.M., 2013; Benton Е.С. et al., 2013; Cerroni L., 1994; Pimpinelli N. et al., 2005; Stevens S.R., Ke M.S., 2003; Тарасенко Г.Н. и соавт., 2006].

Для диагностики лимфопролиферативных заболеваний колеи недостаточно только клинического обследования пациентов [Оркин В.Ф. и соавт., 2006]. Гистологическая диагностика является ценным вспомогательным методом, но её возможности также ограничены [Massone С., Kodama К., 2005; Santucci M., Biggeri А., 2000]. Способы определения реаранжировки гена Т-клеточного рецептора клеток инфильтрата с помощью ПИР или блоттинга по Саузерну не являются универсальными из-за невысокой чувствительности и специфичности в начальных стадиях ЛК. [Kandolf Sekulovic L. et al., 2007; Ponti R. et al., 2008; Bachelez H. et al., 1995; Xu C., Tang Y., 2010; Goeldel A.L., 2010]. В настоящее время получил широкое распространение и все чаще используется иммуногистохимический метод диагностики, позволяющий проводить идентификацию клеточного состава пораженной кожи [Бабиченко И.И. и соавт., 2008; Ламоткин И.А. и соавт., 2005; Berger et al., 2002; Der-Petrossian M. etal., 2011].

Грибовидный микоз (ГМ) является самой распространенной формой Т-клеточных ЛК Заболевание встречается во всех возрастных группах с преобладанием у людей старше 50 лет, соотношение мужчин и женщин составляет от 1,5:1 до 2:1 [Keehn С.А., Hwang S.T., 2008; Wilson et al., 2012; Thomas B.R., 2012; Assaf C„ 2007; Yamashita T., 2012; Bittencourt A.L. et al., 2013]. За последние годы отмечается рост случаев заболевания, как ЛК, так и ГМ, в частности. По данным Weinstock и соавторов с 70-е по 90-е годы XX века заболеваемость ГМ в США увеличилась в 2,5 раза [Weinstock M.A. et al., 1988; Criscione V.D., 2007].

Трудности диагностики ГМ отражены в исследовании Е.М. Лезвинской и соавторов, в котором показано, что диагноз ГМ устанавливается при первичном посещении врача лишь у одного из четырех пациентов [Лезвинская Е.М. и соавт., 2000]. В работе Н.В. Кунгурова и соавторов также выявлено, что

средний срок до установления диагноза, даже у пациентов с классической формой ГМ, составляет около 5 лет, и может значительно удлиняться при других вариантах его течения [Кунгуров Н.В. и соавт., 2010].

Наиболее часто дифференциальную диагностику пятнистой стадии ГМ проводят с бляшечным парапсориазом (БП), имеющим сходные клинические и патоморфологические изменения [Lazar А.Р. et al., 1989; Kikuchi A. et al., 1993; Arai R. et al., 2012]. До настоящего времени не выявлено четких клинических и гистологических дифференциально-диагностических критериев, позволяющих разделить эти заболевания, что определяет необходимость их дальнейшего изучения.

Таким образом, задача совершенствования диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи представляется актуальной для современной научной и практической дерматологии и патологической анатомии.

Степень разработанности темы

Вопросам изучения дифференциальной диагностики и патогенеза грибовидного микоза посвящены исследования и публикации многих отечественных ученых — И.М. Разнатовского, А.Н. Родионова, Д.В. Казакова, Е.М. Лезвинской, Е.В. Братцевой, и зарубежных коллег — R. Willemze; L.M. Poppe, Е.С. Benton, L. Cerroni, N. Pimpinelli.

Оценка гистологической картины кожи больных грибовидным микозом A.B. Ackerman, L. Cerroni, G. Burg и других исследователей позволила выполнить дифференциальную диагностику грибовидного микоза с доброкачественными хроническими дерматозами, имеющими сходные клинические проявления. Работы по определению реаранжировки гена Т-клеточного рецептора с использованием ПЦР позволили выявлять моноклональные лимфоциты, которые определяются у 90-100% больных бляшечной и опухолевой стадией грибовидного микоза. Иммуногистохимическое исследование опухолевых клеток дало возможность проводить детекцию их фенотипа у больных грибовидным микозом, что также способствовало более точной диагностике заболевания.

Вместе с тем, находящиеся в распоряжении дерматолога методы исследования не всегда достаточны для дифференциальной диагностики пациентов с ранними стадиями грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза, что определяет актуальность дальнейшего поиска дифференциально-диагностических маркеров этих заболеваний.

Целью исследования является комплексная клинико-морфологическая характеристика больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом для совершенствования их дифференциальной диагностики.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клинических признаков у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.

2. Провести анализ гистологических характеристик кожи у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.

3. Исследовать количество пролиферирующих Т-лимфоцитов у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.

4. Проанализировать уровень экспрессии маркеров дендритных клеток Ьапяегнз/СБ207 и СЭ83 в коже больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.

5. Оценить диагностическую значимость эпидермо-дермального отношения пролиферативной активности клеток (Ш-67+) в коже больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.

Научная новизна

Наиболее информативными клиническими признаками, на основании которых можно дифференцировать больных пятнистой стадией грибовидного микоза от пациентов с бляшечным парапсориазом, являются слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи). Менее значимыми клиническими признаками являются: распространенность высыпаний и феномен одновременного прогрессирования и регрессирования отдельных элементов.

Обнаружено, что относительная площадь экспрессии СВЗ+Кл-67+-клеток у больных пятнистой стадией грибовидного микоза (0,32% [0,27-0,41]) в 10,7 раз превышает данный показатель у пациентов с бляшечным парапсориазом (0,03% [0,01-0,04]).

Выявлено, что у больных пятнистой стадией грибовидного микоза значительно преобладают незрелые дендритные клетки с маркером Ьап£епп/С0207 и зрелые с маркером СЭ83.

Коэффициент эпидермо-дермального отношения Кь67+-клеток у больных пятнистой стадией грибовидного микоза (3,84) в 1,4 раза, а у больных бляшечной и опухолевой стадиями заболевания (2,42) в 2,2 раза ниже, чем у пациентов с бляшечным парапсориазом (5,43) (р<0,05).

Теоретическая и практическая значимость

Установлены закономерности распределения лимфоцитов и маркеров дендритных клеток в эпидермисе и дерме больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом. Выявлено, что в дерме больных грибовидным микозом наблюдается увеличение количества Ьаодепп+-, СБ83 +-д ендритных и СОЗ+-Ю-67+-клеток. Определено, что при прогрессировании грибовидного микоза идет повышение содержания дендритных клеток (СБ207- и С083-) в пораженной коже.

Научно обоснована необходимость детекции дендритных клеток с использованием иммуногистохимического метода исследования для совершенствования диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза. При выявлении относительной площади экспрессии Ьа^епп-позитивных дендритных клеток >0,9%, определяется высокая диагностическая информативность данного маркера при установлении диагноза грибовидного микоза (8Е 0,87, 8Р 0,90), и может успешно использоваться в дифференциальной диагностике с бляшечным парапсориазом. Определено, что

при значении относительной площади экспрессии СБ83-позитивных дендритных клеток >0,5% определяются средние показатели чувствительности (БЕ 0,71) и специфичности (БР 0,82) при установлении диагноза грибовидного микоза.

Установлен высокий показатель специфичности (БР 0,89) и умеренный чувствительности (БЕ 0,63) метода двойной маркировки при определении пролиферирующих Т-лимфоцитов (СБЗ+Кл-67+-клеток) в диагностике пятнистой стадии грибовидного микоза.

Применение высокоспецифичных гистологических маркеров — эпидермальных лимфоцитов (БЕ 0,75, 5Р 0,86), лимфоцитов с церебриформными ядрами (БЕ 0,67, БР 0,85) позволят дифференцировать начальные стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого клинического исследования. Использовались клинические, инструментальные, лабораторные, статистические методы исследования.

Положения, выносимые на защиту

1. Ведущими клиническими признаками в дифференциальной диагностике пятнистой стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза являются слабо шелушащиеся пятна (размерами больше 6 см), расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи).

2. Наибольшую специфичность для дифференциальной диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза с бляшечным парапсориазом имеют следующие гистологические признаки: эпидермальные лимфоциты крупнее дермальных, лимфоциты в эпидермисе и дерме с церебриформными ядрами.

3. Относительная площадь экспрессии маркеров: СОЗ-Кл-67, Ьапяепп/СВ207, СВ83 — имеет высокую диагностическую значимость при дифференциальной диагностике больных начальной стадией грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза.

4. Количества пролиферирующих Т-лимфоцитов, СБ207- и СБ83-дендритных клеток в коже нарастает при прогрессировании грибовидного микоза.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обусловлена

репрезентативностью и достаточностью выборки пациентов, включенных в исследование, объемом проанализированного материала, адекватностью методов исследования. Методологические подходы, использованные в исследовании, корректны и своевременны. Лабораторные исследования осуществлялись на сертифицированном и проверенном оборудовании.

Результаты и материалы исследования были доложены и обсуждёкы на Научно-практической конференции с международным участием

«Терапевтическая школа С.П. Боткина и ее вклад в развитие отечественной клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2012 г.), XXX юбилейной Научно-практической конференции с международным участием «Рахмановским чтениям 30 лет: достижения и перспективы в дерматологии» (Москва, 2013 г.), 22 Конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Турция, Стамбул, 2013 г.), VII Научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г.), Международной научно-практической конференции по военной медицине (Санкт-Петербург, 2013 г.), XXXI Научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения» (Москва, 2014 г.)

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России.

Полученные результаты и рекомендации успешно используются в лечебно-диагностической и учебной работе кафедры и клиники кожных и венерических болезней ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, кафедры и клиники кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России.

Личное участие автора в получении результатов

Настоящее диссертационное исследование лично проводилось автором в его полном объеме с формированием базы данных и осуществлением статистической обработки ющнико-морфологического материала и последующим обобщением полученных результатов.

Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, а также в организации и проведении лабораторного и инструментального исследований. Автором проведены гистологические и иммуногистохимические исследования биопсийного материала всех пациентов, включенных в исследование.

Автором сформулированы цель, задачи и основные идеи планирования исследования, разработана методика исследования, выполнены сбор, статистическая обработка материала.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (включающих обзор литературы, характеристику методов исследования, результаты собственных наблюдений и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и трех приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 218 литературных источников, из которых 37 отечественных и 181 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Исследование групп больных проводили в клинике кожных и ^венерических болезней Военно-медицинской академии им, С.М. Кирова.

Обследован 21 больной ГМ: мужчин - 18 (86%), женщин - 3 (14%), 21 больной БП: мужчин - 18 (86%), женщин - 3 (14%) (таблица 1). В качестве контроля изучали группу 16 здоровых людей, не имеющих ГМ и БП: мужчин -12 (67%), женщин-4 (33%).

Таблица 1 — Общая характеристика исследуемых групп

Категория исследуемых групп Кол-во пациентов Возраст пациента Пол

среднее М±т медиана Me (0,5L-0,5U) мужской женский

Здоровые лица 16 53,3±2,5% 54,2 (47,0-61,0) 12 (67%) 4 (33%)

БП 21 61,3±2,1% 63,0 (55,0-67,0) 18 (86%) 3 (14%)

ГМ пятнистая стадия 9 62,0±3,2% 58,0 (57,0-65,0) 8 (88,9%) 1 (11,1%)

ГМ бляшечная и опухолевая стадии 12 67,8±2,6% 68,5 (60,5-72,0) 10 (83,3%) 2 (16,7%)

Объектами исследования были пораженные участки кожи, взятые методом панч-биопсии. Препараты, окрашенные гематоксилином-эозином, подвергались микроскопическому исследованию. Использовался световой микроскоп «Olympus ВХ-51» (Япония), оборудованный цифровой камерой «Olympus ХС-10» и программным обеспечением «Cell А». Исследование эпидермиса и дермы проводилось на увеличении xlOO, х200 и х400. В гистологических препаратах определяли патоморфологические изменения в эпидермисе, дерме и гиподерме.

Для иммуногистохимической детекции субпопуляций лимфоцитов, дендритных клеток и пролиферативной активности клеток применяли первичные мышиные и кроличьи моноклональные античеловеческие антитела (таблица 2). Для детекции клеток использовали полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена использовали диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция), и двойную систему визуализации Multivision Polymer (Thermo Fisher Scientific, США).

Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выраженное в процентах.

Индекс пролиферативной активности определяли как отношение количества К1-67-позитивных клеток к общему количеству ядерных клеток в поле зрения, выраженное в процентах.

Таблица 2 - Первичные античеловеческие антитела

Антиген Антитело (клон) Разведение антител Способ демаскировки антигена Производитель антител

CD3 F7.2.38 1:600 трис-эдта буфер, РН 9,0 Thermo Fisher Scientific, США

CD83 NCL-CD83 1:70 трис-эдта буфер, РН 9,0 Novocastra, Великобритания

Langerin (CD207) NCL-Langerin 1:50 трис-эдта буфер, рН 9,0 Novocastra, Великобритания

Ki67 SP6 1:600 трис-эдта буфер, РН 9,0 Thermo Fisher Scientific, США

Коэффициент эпидермо-дермального отношения определяли как отношение площади, занимаемое выявляемым маркером в эпидермисе, к

площади этого маркера в дерме.

Для оценки непараметрических различий между больными и здоровыми применяли и-критерий Манна-Уитни. Для оценки диагностической значимости определяемых маркеров в дифференциальной диагностике больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом были составлены таблицы сопряженности, по которым были получены статистически значимые различия. По данным таблицам были рассчитаны основные показатели надежности диагностических критериев: чувствительность (БЕ) и специфичность (БР). Различия считали достоверным при р< 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

ТТянные клин ччег-.кпгп обследования. Слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, наблюдались у 67% пациентов с пятнистои стадиен ГМ (БЕ 0 56, БР 0,65). Пойкилодермия (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи) наблюдалась у 4 (44%) пациентов (БЕ 0,50, БР 0 68) Феномен одновременного прогрессирования и регрессирования отдельных высыпаний наблюдался у 3 (33%) больных (БЕ 0,32, БР 0,52) Вовлечение двух и более анатомических областей выявлялось у 8 (оУ /о)

пациентов (БЕ 0,28, БР 0,50).

Для бляшечной стадии ГМ были наиболее характерны уплотненные шелушащиеся красно-коричневые бляшки (80%), реже наблюдались единичные папулы (20%). В 100% случаев у больных опухолевой стадиен ГМ наблюдались опухолевые узлы, расположенные на различных участках тела.

У 67% пациентов с бляшечным парапсориазом поверхность пятен напоминала «папиросную бумагу» (явление псевдоатрофии). Пятна больше 6

см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, наблюдались у 67%. Явление пойкилодермии у 29% пациентов.

Таким образом, наиболее значимыми клиническими признаками, на основании которых можно дифференцировать больных пятнистой стадией ГМ и пациентов с БП являются: слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, (БЕ 0,56, БР 0,65) и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи) (БЕ 0,50, 8Р 0,68).

Данные гистологического исследования. В пятнистой стадии ГМ у 2 пациентов (22%) эпидермис был не изменен, у 3 (33%) случаях обнаружен акантоз, у 2 (22%) - атрофия эпидермиса. В эпидермисе 6 (67%) больных наблюдались лимфоциты, по размеру крупнее дермалышх. Лимфоциты, окруженные светлым перинуклеарным ободком, обнаружены у 7 (78%) пациентов. Лимфоциты, расположенные цепочкой (более 3-х лимфоцитов), обнаружены в 4 (44%) случаях. Лимфоциты с церебриформными ядрами выявлены у 6 (67%) пациентов. У большей части больных лимфоцитарный инфильтрат был умеренно выражен, распологался периваскулярно. Фиброз дермы выявлен у 4 (44%) пациентов. В большинстве случаев 7 (78%) спонгиоз отсутствовал, или был слабо выражен 2 (22%). При оценке диагностической значимости гистологических характеристик выявлено, что наибольшая чувствительность и специфичность характерны для следующих показателей: эпидермальные лимфоциты крупнее дермальных (ЭЕ 0,75, 8Р 0,86), лимфоциты с церебриформными ядрами (БЕ 0,67, 8Р 0,85).

В бляшечной стадии ГМ, кроме изменений, характерных для пятнистой стадии, наблюдалось скопление лимфоцитов в эпидермисе с формированием микроабсцессов Потрие у 6 (60%) пациентов. В верхней части дермы преобладал плотный полосовидный инфильтрат, в котором доминировали малые церебриформные клетки у 10 (100%) больных.

В опухолевую стадию ГМ наблюдался плотный очаговый или диффузный инфильтрат по всей дерме в коже 2-х (100%) пациентов, в одном случае проникающий в подкожную жировую клетчатку.

При БП выявлялся умеренный акантоз у 21 (71%) пациента. В роговом слое эпидермиса встречались чешуйко-корки. Лимфоцитарный инфильтрат умеренной плотности располагался периваскулярно' в верхних слоях дермы. Экзоцитоз лимфоцитов в области слабо выраженного спонгиоза встречался только в двух случаях. У 19 (90%) пациентов были выявлены лимфоциты, окруженные светлым перинуклеарным ободком. Отек сосочковой части дермы встречался у 5 (24%) больных. Лимфоидные клетки с неправильным контуром ядра выявлены не были.

Результаты иммуногистохимического исследования. Относительная площадь экспрессии Ьаг^епп-позитивных ДК в коже больных пятнистой стадией ГМ (1,18% [0, 98-1,29]) была в 1,4 раз больше, чем у больных БП -(0,85% [0,79-0,91]) (р<0,05) и в 5,2 раза больше, чем в коже здоровых лиц (0,22% [0,18-0,29]) (р<0,05) (таблица 3). У больных бляшечно-опухолевой стадией ГМ экспрессия Ьа^епп-позитивных ДК составляла 1,55% [1,19-1,82].

Установлено, что при выявлении относительной площади экспрессии Ьах^епп-позитивных ДК>0,9% определяется высокая диагностическая информативность данного маркера при установлении диагноза ГМ (8Е 0,87, 8Р 0,90).

Таблица 3 - Относительная площадь экспрессии Ьап§епп+-клеток в коже больных грибовидным микозом, парапсориазом и здоровых людей

Категория исследуемых групп Относительная площадь экспрессии, %

общая эпидермис дерма коэф Э/Д

Здоровые лица 0,22 [0,18-0,29] 0,21 [0,16-0,27] 0,01 [0,009-0,02] 14,1 ПЗД-15,5]

БП 0,85 [0,79-0,91] 0,64 [а,56-0,72] 0,21 [0,18-0,29] 3,08 [2,5-4,2]

ГМ1 1,18* Г0,98-1,29] 0,90* [0,81-1,08] 0,28 Г0,15-0,331 3,2 [2,6-3,9]

ГМ2 1,55* П,19-1,821 0,92* [0,78-1,24] 0,63* [0,45-0,86]^ 1,46* [1,2-1,91

Примечание: * - статистически значимые различия между группами вольных 1М и г>и, р<0,05, ГМ1 - больные пятнистой стадией ГМ; ГМ2 - больные бляшечно-опухолевой стадией ГМ; Коэф. Э/Д - коэффициент эпидермо-дермального отношения экспрессии маркеров.

Анализ распределения ДК в коже показал, что 93% Ьа^егш+-клеток у здоровых лиц локализуется в эпидермисе, 7% - в дерме. В биоптатах больных БП распределение Ьаг^епп+-клеток отличалось более высоким содержанием клеток Лангерганса в дерме - 25%, в эпидермисе они составляли 75%. В коже больных пятнистой стадией ГМ расположение Ьап^епп+-клеток было; в дерме 24%, в эпидермисе 76%, а в бляшечно-опухолевую стадию - в дерме 41%, в эпидермисе 59%.

При проведении анализа относительной площади экспрессии маркера СБ83 в коже установлено, что его содержание у больных с пятнистой стадией ГМ (0,61% [0,51-0,71]) в 2,4 раза превышает показатели пациентов с БП (0,25% [0,17-0,35]%) и в 3 раза больше, чем в коже здоровых людей (0,2% [0,12-0,29]) (р<0,05). Показатели экспрессии маркера СБ83 у пациентов с бляшечно-опухолевой стадией составляет 0,72% [0,64-0,29] (таблица 4).

Выявлено, что метод определения относительной площади экспрессии СБЯЗ-позитивных ДК при значении >0,5% имеет средние показатели чувствительности (БЕ 0,71) и специфичности (БР 0,82) при установлении диагноза ГМ.

Таблица 4 — Относительная площадь экспрессии С083+-клсток в коже больных грибовидным микозом, бляшечным парапсориазом и здоровых людей

Категория исследуемых групп Относительная площадь экспрессии, %

общая эпидермис дерма коэф. э/д

Здоровые лица 0,20 [0,12-0,29] 0,10 [0,02-0,19] 0,10 [0,01-0,18] 0,7 [0,4-1,2]

БП 0,25 [0,17-0,35] 0,10 [0,05-0,14] 0,15 [0,11-0,19] 0,66 [0,4-1,1]

ГМ1 0,61* Г0,51-0,71] 0,21* [0,18-0,28] 0,40* [0,31-0,491 0,52 [0,3-0,8]

ГМ2 0,72* [0,64-0,29] 0,18* [0,12-0,23] 0,54* [0,48-0,61] 0,33 [0,2-0,5]

Примечание: * - статистически значимые различия между группами больных ГМ и БП, р<0,05, ГМ1 - больные пятнистой стадией ГМ; ГМ2 - больные бляшечно-опухолевой стадией ГМ, коэф. Э/Д - коэффициент эпидермо-дермапьного отношения экспрессии маркеров.

Анализ тканевого распределения маркера СБ83 показал следующее распределение позитивных клеток у здоровых лиц: в эпидермисе содержалось 51%, в дерме - 49%; у больных БП - 40% в эпидермисе и 60% в дерме, у больных ГМ с пятнистой стадией - 34% и 66%, соответственно, у пациентов бляшечно-опухолевой стадией ГМ — 25% и 75%, соответственно.

При БП наблюдается увеличение в коже преимущественно незрелых 1.аг^егш+-ДК, в то время как численность СБ83+-клеток статистически значимо не отличается от показателей у здоровых людей.

Индекс пролиферативной активности у пациентов с ГМ бляшечно-опухолевой стадией (3,04% [2,86-3,31]) был почти в 2 раза выше, чем у больных БП (1,57% [1,33-1,75]) (р<0,05). В то же время, различия между больными БП (1,57% [1,33-1,75]) и пятнистой стадией ГМ (1,87% [1,64-2,02]) не были статистически значимы (р>0,05) (таблица 5).

Выявлено, что диагностическая значимость определения маркера К1-67+-клеток для дифференциальной диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза низкая (БЕ 0,26, БР 0,57), при показателе относительной площади экспрессии Кл-67+-клеток >1,73%.

Коэффициент эпидермо-дермального отношения пролиферирующих клеток у здоровых людей составил — 10,9, у больных БП он был ниже — 5,43 (р<0,05), у пациентов с пятнистой и бляшечно-опухолевой стадией ГМ его значение было наименьшим — 3,84 и 2,42, соответственно (р<0,05 при каждом сравнении) (рисунок 1).

Таблица 5 - Индекс пролиферативной активности в коже больных грибовидным микозом, бляшечным парапсориазом и здоровых людей

Категория исследуемых групп Индекс пролиферативной активности, %

общий эпидермис дерма коэф. Э/Д

Здоровые лица 0,49 [0,31-0,65] 0,46 [0,3-0,57] 0,04 [0,02-0,06] 10,90 [9,8-12,2]

БП 1,57 Г1,33-1,75] 1,32 [1,2-1,66] 0,24 Г0,11-0,321 5,43 [4,9-6,4]

ГМ1 1,87 [1,64-2,02] 1,48 [0,31-0,65] 0,39 [0,28-0,51] 3,84* [ЗД-4,7]

ГМ2 3,04* [2,86-3,31] 2,15* [2,02-2,38] 0,89* [0,58-1,04] 2,42* [1,9-2,9]

Примечание: *- статистически значимые различия между группами БП и ГМ, р<0,05, коэф. Э/Д - коэффициент эпидермо-дермального отношения экспрессии маркеров, ПУП - больные пятнистой стадией ГМ; ГМ2 - больные бляшечно-опухолевой стадией ГМ

здоровые БП ГМ1 ГМ2

лица

исследуемые группы

Рисунок 1 - Коэффициент эгшдермо-дермального отношения в коже больных грибовидным микозом, бляшечным парапсориазом и здоровых лиц, ГМ1 - больные пятнистой стадией ГМ, ГМ2 - больные бляшечно-опухолевой стадией ГМ.

Метод определения коэффициента эпидермо-дермального отношения Кл-67+-клеток >4,5% обладает значительной чувствительностью и высокой специфичностью при установлении диагноза ГМ (вЕ 0,60, ЭР 0,85).

Двойные позитивные клетки СОЗ+Кь67т не встречались в коже здоровых лиц. У пациентов с БП СВЗ+К1-67+-клетки локализовались только в дерме - 0,03% [0,01-0,04], у больных ГМ площадь экспрессии маркера СОЗ+Ю-

67+ была выше и составила при пятнистой стадии 0,32% [0,27-0,41] (р<0,05), при бляшечно-опухолевой - 0,48% [0,39-0,58] (р<0,05) (Таблица 6).

Диагностическая значимость выявления относительной площади экспрессии СБЗ+К1-67+-клеток >0,15% характеризуется высокой специфичностью и умеренной чувствительностью (БЕ 0,63, БР 0,89).

Различия экспрессии маркеров СОЗ-И-67 между пятнистой (0,32% [0,270,41]) и бляшечно-опухолевой стадией ГМ (0,48% [0,39-0,58]) не достигли статистической значимости в связи с малочисленностью сравниваемых групп. У больных ГМ СВЗ+К1-67+-клетки встречались не только в дерме, но и в эпидермисе.

Таблица 6 - Относительная площадь экспрессии СБЗ+К1-67+-клеток в коже больных грибовидным микозом, бляшечным парапсориазом и здоровых людей

Категория исследуемых групп Относительная площадь экспрессии СОЗ+К1-67+, %

всего эпидермис дерма коэф. э/д

Здоровые лица 0 0 0 0

БП 0,03 [0,01-0,04] 0,00 0,03 [0,01-0,041 0

ГМ1 0,32* [0,27-0,41] 0,02 [0,01-0,031 0,29* [0,21-0,37] 0,08 [0,04-0,13]

ГМ2 0,48* [0,39-0,58] 0,04 [0,02-0,05] 0,44* [0,37-0,52] 0,08 [0,05-1,11]

Примечение. * — статистически значимые различия между группами БП и ГМ, р<0,05, коэф. Э/Д — коэффициент эпидермо-дермального отношения экспрессии маркеров, ГМ1 — больные пятнистой стадией ГМ, ГМ2 - больные бляшечно-опухолевой стадией ГМ.

В ходе исследования пациентов с ГМ нами обнаружено наибольшее увеличение ДК в дерме, где происходит деление злокачественных Т-лимфоцитов. Можно предположить, что дермальные клетки Лангерганса, секретирующие цитокины и факторы роста, и зрелые С083+-ДК, несущие на своей поверхности наибольшее количество костимулирующих молекул, являются необходимым микроокружением для осуществления пролиферации лимфоцитов в коже.

Увеличение индекса пролиферативной активности у больных с БП и ГМ не имеет диагностического значения, учитывая тот факт, что достоверной разницы между наиболее трудно диагностируемыми БП и пятнистой стадией ГМ не выявлено, а статистически значимые различия между пятнистой и бляшечно-опухолевой стадиями не пригодны для применения.

Максимальное значение эпидермо-дермального отношения К1-67+-клеток наблюдается у здоровых людей. У пациентов с БП и ГМ этот показатель многократно уменьшается за счет нарастания пролиферативной активности клеток дермальных инфильтратов и, возможно, снижения пролиферации

кератиноцитов. Уменьшение эпидермо-дермального отношения К1-67+-клеток кожи у больных ГМ, по сравнению с БП, свидетельствует о более интенсивной пролиферации дермальных Т-лимфоцитов при их злокачественной трансформации.

Применение метода двойной маркировки с маркерами СОЗ+Кл-67+ позволило выявить статистически значимое преобладание их экспрессии у пациентов с ГМ над больными БП и здоровыми лицами. Использование иммуногисто химического исследования с двойной маркировкой СОЗ+К1-67+, направленного на детекцию пролиферирующих Т-лимфоцитов, достаточно информативно при проведении дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи. Применение данного метода позволяет достоверно оценить уровень пролиферативной активности лимфоцитов и обнаружить более значимые отличия при БП и ГМ, чем при использовании только одного маркера И-67.

Таким образом, для дифференциальной диагностики ГМ и БП необходимо выполнять клиническое обследование пациентов, гистологическое исследование пораженной кожи и ее иммуногистохимический анализ маркерами, обладающими высокой диагностической информативностью С0207/1агщепп, СБ83 и СБЗ-Ю.-67.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наиболее значимыми клиническими признаками у больных пятнистой стадией грибовидного микоза являются пятна, размерами больше 6 см, со слабо выраженным шелушением, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению (чувствительность - БЕ 0,56, специфичность - БР 0,65), пойкилодермия (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи) (БЕ 0,50, ЭР 0,68), имеющие кардинальное значение для диагностики с бляшечным парапсориазом.

2. Ведущими гистологическими признаками при дифференциальной диагностике пятнистой стадии грибовидного микоза от бляшечного парапсориаза являются: эпидермальные лимфоциты, лимфоциты с церебриформными ядрами.

3. Количество пролиферирующих Т-лимфоцитов (СВЗ+Кл-67+-клеток) у больных пятнистой стадией грибовидного микоза - в 10,7 раз, а бляшечно-опухолевой - в 16 раз выше, чем у пациентов с бляшечным парапсориазом и имеют высокую специфичность и среднюю чувствительность при дифференциальной диагностике больных (БЕ 0,63, 8Р 0,89).

4 У больных грибовидным микозом по сравнению с больными бляшечным парапсориазом отмечается статистически значимое преобладание незрелых дендритных клеток с маркером Ьа1^епп/СБ207, а также зрелых дендритных клеток с маркером СБ83 в пораженной коже.

5. Эпидермо-дермальное отношение пролиферативной активности клеток (К1-67+) кожи у больных грибовидным микозом на всех стадиях ниже, чем у здоровых людей и пациентов с бляшечным парапсориазом.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При дифференциальной диагностике бляшечного парапсориаза и грибовидного микоза необходимо в первую очередь обращать внимание на такие клинические признаки как слабо шелушащиеся пятна больше 6 см в диаметре, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению и явления пойкилодермии. Такие гистологические характеристики, как эпидермальные лимфоциты крупнее дермальных, лимфоциты с церебриформными ядрами помогут дифференцировать пациентов с начальной стадией грибовидного микоза от больных бляшечным парапсориазом.

2. При отсутствии возможности дифференцировать больных пятнистой стадией грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза на основании клинико-морфологических признаков, следует использовать иммуногистохимическое исследование с определением CD207/langerin, CD83 и CD3+Ki-67+-JtneTOK.

3. При дифференциальной диагностике бляшечного парапсориаза и грибовидного микоза необходимо определять значение эпидермо-дермального соотношения Кл-67+-клеток.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Для совершенствования дифференциальной диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза необходимо расширить иммуногистохимическую панель, включив в исследование Foxp3-, CD45RA- и CDllc-маркеры.

Для осуществления вероятностного прогнозирования особенностей клинического течения грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза перспективным направлением работы является анализ генетических полгал орфизмов CDKN2A, FAS, и JUNB генов, а также детекция экспрессии подтипов микро-РНК (микро-РНК-155, микро-РНК-203 и микро-РНК 205).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самцов, A.B. Аспекты иммуногистохимического исследования Т-клеточных лимфом кожи / A.B. Самцов, И.Э. Белоусова, A.C. Жуков // Сборник тезисов Научно-практической конференции с международным участием «Терапевтическая школа С.П. Боткина и ее вклад в развитие отечественной клинической медицины». - Санкт-Петербург 2012. - С. 104.

2. Жуков, A.C. Роль Т-регуляторных клеток в патогенезе грибовидного микоза / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Самцов // Сборник тезисов XXX юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Рахмановским чтениям 30 лет: достижения и перспективы в дерматологии» - Москва 2013. - С. 54-55.

3. Жуков, A.C. Клетки Лангерганса — как участники микроокружения малигнизированных лимфоцитов при грибовидном микозе. / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Самцов // Сборник тезисов XXX юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Рахманобским

чтениям 30 лет: достижения и перспективы в дерматологии» — Москва 2013.— С. 56-57.

4. Жуков, A.C. Роль лангеринпозитивных и CD83+ клеток в патогенезе грибовидного микоза/ A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, В.Р. Хайрутдинов, A.B. Самцов // Вестник дерматологии и венерологии. — 2013. — № 4. — С. 38-43.

5. Zhukov, A.S. CD83+-dendritic cells in the pathogenesis of the mycosis fungoides/ A.S. Zhukov, I. Belousova, A. Samtsov // 22th European Academy of Dermatology and Venereology Congress, Abstract Book - Istanbul. Turkey. - 2013. — P475.

6. Zhukov, A.S. The role of T-regulatory cells in the pathogenesis of mycosis fungoides/ A.S. Zhukov, I.E. Belousova, V.R. Khairutdinov, A.V. Samtsov // 22th European Academy of Dermatology and Venereology Congress, Abstract Book — Istanbul. Turkey. - 2013. - P508.

7. Жуков, A.C. Дендритные клетки в дифференциальной диагностике грибовидного микоза и парапсориаза / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Самцов // Тезисы 7НПК Санкт-Петербургские дерматологические чтения. - СПб, 2013.-С. 33-34.

8. Жуков, A.C. Маркер Ki-67 и его роль в диагностике грибовидного микоза. / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Самцов // Тезисы VII НПК Санкт-Петербургские дерматологические чтения. — С-Пб, 2013. - С.35-36.

9. Жуков, A.C. Роль иммуносупрессивного влияния Т-регуляторных клеток на развитие грибовидного микоза / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Самцов // Тезисы VII НПК Санкт-Петербургские дерматологические чтения. — Санкт-Петербург, 2013. - С. 36-37. •

10. Самцов, A.B. Роль определения дендритных клеток как иммуногистохимического маркера грибовидного микоза в военно-лечебных учреждениях МО РФ / A.B. Самцов, A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, A.B. Чаплыгин // Тезисы Международной научно-практической конференции по военной медицине. — Санкт-Петербург, 2013. — С. 357-358.

11. Хайрутдинов, В.Р. Определение Ю-67+-клеток у военнослужащих МО РФ как нового дифференциально-диагностического маркера Т-клеточных лимфом кожи // / В.Р. Хайрутдинов A.B. Самцов, A.C. Жуков, И.Э. Белоусова // Тезисы Международной научно-практической конференции по военной медицине. — Санкт-Петербург, 2013. — С. 371-372.

12. Самцов, A.B. Совершенствование медицинского обеспечения ВС РФ в целях улучшения диагностики лимфопролиферативных заболеваний / A.B. Самцов, A.B. Стаценко, В.Р. Хайрутдинов, A.C. Жуков // Тезисы Всеармейской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск (сил) на стратегических направлениях». — Санкт-Петербург, 2013. - С. 83.

13. Жуков, A.C. Значение определения пролиферативной активности клеток в диагностике Т-клеточных лимфом кожи / A.C. Жуков // Сборник тезисов XXXI научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения» — Москва 2014. — С. 23.

14. Жуков, A.C. CD207+- и С083+-клетки - новые иммуногистохимические маркеры грибовидного микоза / A.C. Жуков // Сборник тезисов XXXI научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения» — Москва 2014. — С.22.

15. Жуков, A.C. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов при грибовидном микозе и бляшечном паралсориазе / A.C. Жуков, И.Э. Белоусова, В.Р. Хайрутдинов, И.Н. Теличко, A.B. Самцов // Вестник дерматологии и венерологии. - 2014. - № 1. - С. 30-36.

Формат 60x84/16 Заказ № 286

Подписано в печать 14, 04;. 14. Обьем1п.л. Тираж 100 экз.

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.