Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Совершенствование иммунодиагностики гнойно-воспалительных и септических заболеваний при помощи новых эритроцитарных реагентов
- Ученая степень
- доктора медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Автореферат диссертации по медицине на тему Совершенствование иммунодиагностики гнойно-воспалительных и септических заболеваний при помощи новых эритроцитарных реагентов
!29 г, В 9 2,'
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ, МИКРОБИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
На правах рукописи
ДЕРЯБИН ПАВЕЛ НИКОЛАЕВИЧ
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИКИ
ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИ ПОМОЩИ НОВЫХ ЗРИТРОЦЙТАРНЫХ РЕАГЕНТОВ
14.00.36 — Аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Алма-Ата, 1992
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан.
Научный консультант — доктор медицинских наук, профессор Б. В. КА-РАЛЬНИК.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук В. А. ШАМАРДИН;
доктор медицинских наук, профессор И. Л. КАСАТКИНА;
доктор медицинских наук, профессор В. А. СНОПКОВА.
Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи РАМН.
Защита диссертации состоится « 3 » ¿1*49Л-£_1992 года
в « » часов на заседании специализированного совета Д 079.05.01. в НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан (480002, г. Алма-Ата, ул. Ма-катаева, 34).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан, г. Алма-Ата.
Автореферат разослан « $ » й^й*^_1992 г.
Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук
Н. М. НУРКИНА
; ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКШ
/;.'.■', . | АКГУАЛЬЮСТЬ ТЁШ. В настоящее время в патологии человека • -------наблюдается значительное увеличение удельного веса гнойно-воспалительных и септических заболеваний (ГВСЗ), вызванных условно-патогенными микроорганизмами. В СИГ, как и во всех, в том числе - развитых странах,, ежегодно госпитализируются миллионы больных людей с ГВСЗ со значительной летальностью; Наблюдается также рост внут-рибольничных ГВСЗ /В.И.Стручков и'др.,1983; С.В.Прозоровский,Л.А. Генчяков,1983; Л.А.Генчиков и др.,1985; Р.Х.Яфаев,Д.П.Зуева,1989; М. Л. Лившиц,Е.В.Брусина, 1992 и др./. До'минируйцйми возбудителями ГВСЗ в хирургических, травматологических, акушерско-гинекологичес-ких„ урологических стационарах являются стафилококки (прежде всего б*. ШШЩ и $/ерМ}(б>и7игС¡л ), псевдомонады- (прояще всего
сшгщиъоьа, ) и протеи, причем в значительной части случат ев, особенно ..при, хронических .процессах, у больных выделяются не ■ монокультуры, а ассоциации этих микроорганизмов. Отражением значимости этих микроорганизмов является в частности то, что большинство работ I Всесоозной научно-практической конференции "Проблемы клинической'микробиологии в неинфекционной клинике"(Винница,1933} и II Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клилике"(Бариаул,1988) посвящено этим микроорганизмам.
В отличие от инфвхций, возбудителями которых являются патоа генные микроорганизмы, при зсех заболеваниях, вызванных условко-патогеиньш микробами, их выделение от больного еще не доказывает их причинной ро л и /3. М. Андрее ва, Е. К .Левина, 1963/ и не может ориентировать врача а выборе эффективных средств лечения. Во многих случаях выделение возбудителя'при ГВСЗ зитруднено недостаточной . доступностью очага, воспаления. По ряду причин, в частности в связи с широким применением антимикробных средств, значительно (до 4&%) вырос удельный вес проб, из которых ни один микроорганизм не вьделен, несмотря на наличие активного гнойно-воспалительного прот цесса. у больных /Акт.вопр. клин.микробиологии в не гаф клинике, К., 1988/. Поэтому необходимым условием расшифровки этиологической структуры ГВСЗ является регистрация иммунного.ответа, развивающегося на антигены возбудителя. В связи с этим обследование больных ГВСЗ должно быть комплексным с использованием как бахтериологичес-
кке, так н иммунологических меяодоа. Иммунологические метода являются на дополнительными, а равиоправкшм, а в некоторык случаях и единственно возможным способом установления этиология ГШЗ.
Наиболее часто для иммунологической диагностики ксиользуйт определенна активности (титра) сиворототаьсг антител. В свяги с народов распространенностью уеловно-патогеннык микроорганизмов каждый человек постоянно контактирует с ними, переносив то ила иное (часто латентное) заболеваний, вызванное этими микробами. Поэтому при оценке результатов серологической диагностики необходимо учитывать "естес-'^вздашй" уровень актизкости антител в тем иди т. антигенам условно-патогенных микроорганизмов и ориентироеаяься на корректно выбранный показатель. Наряду с обоснованным значением условно-диагностического титра (УДТ) оценку результата» можно асу-«ествлять со выявлении нарастания титра антител в динамике заболевания. Но у значительной части больных,ГБСЗ трудно уловить начало заболевания ш кх обследование проводится уже на фоне развившегося антительного ответа, что сказывается на частоте выявяенияиараста-нкя титра антител* Поэтому лучше всегояриыекять «баподхода.
В настоящее время возможности серодиагностики этиологической • роли вшеназванныа групц микроорганизмов весьма ограничены. Используемые для этой- цели в практических лабораториях методы - реакция нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфа-токсина (РНГ) и реакция бактериальной агглютинации с аутопггаммом или эталонной культурой - не удовлетворяет возросшим требованиям, вследствие невысокой чувствительности, использования нестабильных ингредиентов» щ в ряде случаев недостаточной специфичности методов. Возможности высокочувствительных и специфичных методов, таких как радиоиыыунный(РИА) и иммуноферментныйШФА) анализы, судаственно ограничены трудностями их кассового прадедами* « праятичесхихяа-бораториях (необходимость «ложной м дорогостоящей аппаратуры я препаратов, относительно большое время на выполнение анализа), Не нашли пока широкого применения продемонстрированные рядом исследователей возможности применения реакции пассивной гемагглгоинации (РПГА) дяя диагностики стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций у больных ГВСЗ /С.Й.Бидненко,19а5; И.А.АленС8адрова и др. ,1986; Р.ОЫЬц. и о1. ,тц т.кли. и а&. ,1965 и др./ Практически не изученный остается вопрос об эффективности иммунодиагностики ассоциированных форм стафилококковой, протейной и сн~
- з -
нешойкой инфекций у больных различными формами ГВСЗ.
В последние годы показано, что выявление у больных с различными заболеваниями антигенсвязываедих лимфоцитов (АСЛ), специфичных а отношении бактериальных н тканевых антигенов, является дозса-за-гел^стгок имиунного ответа на эти антигены.. /Ф.О.Гаркб и др., 197691983»1969 и др./. Следует отметить, что использование таких эксоксчувствигельнкх к специфичных методов.ветвления АСЛ, как метод адсорбции радиоактивкомеченных антигенов на лимфоцитах, метод адсорбции лимфоцитов на антигенсодержшцих колонках, технически слоянй и недоступно для широкого применения. О специфичности существующих более простит методов выявления АСД - паркой агглютинация и непрямого розеткообразования - высказываются различные 'суждения/?. В. Петров и Л.А.Захарова,1976;В.И.Афанасьев,1983;Ф.Ю,Гариб и др., 1988/. Поэтому необходима специальная проверка эффектигнос-ти подобного,подхода. Применение нативных эритроцитов для розетко-образования значительно снижает стабильность и универсальность метода непрямого розеткообразования. Поэтому следует попытаься разработать стабильные реагенты для такого метода.
Рядом исследователей продемонстрирована диагностическая значимость индикации стафилококковых, протейных и псевдоыонадных антигенов в крови или ввделениях больных ГВСЗ /Г.В.Ьулава и др. ,1982, 1983,1984,1987;Г.А.Фокенко и др. ,1982;0.<3-й?с4 ЛЕ.Яа&Щ^оО ■> 1982$(L.80Z0u%Ä£fi£ß£,I984 и др.)/. Однако отсутствуют надежные доказательства специфичности этого, метода.
По сочетанию важнейших критериев эффективности метода (чувствительность, специфичность, стабильность иммунореагентов, доступность для массового применения, стоимость анализа, быстрота получения результата) наиболее удобными являйтся реакции с эритроци-яарншя иммунореагентамя. ......
ЦВДЬ И ОСШВШВ ЗАДАЧИ ИССВДЭВАНИЯ. Дельв настоящего исследования явилось совершенствование иммунологической этиологической диагностики ГВСЗ при помощи новых эрятроцитарных иммунореагентов.
Исходя из поставленной цели бьяи, определены задачи настоящего исследования:
- разработать антигенные эритроцктарные диагностияумы ОД) из различных антигенов стафилококков, протеев и синегнойной палочки для определения активности антител;
- изучить диагностическую эффективность выявления СФафпяойок-
новой, протейной и синегнойной инфекций у больных различными ГБСЗ по определению активности сывороточных антител соответствующей специфичности;
- разработать способ получения и ЭД для определения АСЛ филоаонковой, протейной и псевдомонадной специфичности и определить оптимальные условия постановки и оценки результатов реакции непрямого розеткообразования (PHR3);
- изучить диагностическую эффективность выявления стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций у больных различными ГБОЯ по определению АСЛ;
- разработать способ определения и изучить субпопуяяционнуо принадлежность АСЛ у больных ГБСЗ;
- разработать антительные ЭД для выявления, протейных и псевт домонадньос антигенов и оценить диагностическую эффективность индикации этих антигенов; •
- изучить факторы, влияющие на эффективность иммунологическое го обследования больных ГБСЗ;
- оценить эффективность комплексного шшунодиагиостического обследования больных'с учетом формы и характера инфекционного процесса при ГВСЗ и разработать рациональную тактику иммунологического обследования больных ГБСЗ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Обоснована возможность оптимальной стандартизации РНРО на основе получения стабильных высокоэффективных эритроцитарных иммунореагентов для выявления АСЛ у человека и других млекопитающих (АС СССР № 1634284). -
Разработаны оригинальные высокоэффективные ЭД из тейхоевой кислоты (ТК) золотистого стафилококка, стафилококкового анатоксин на (СА), вкзотоксина А (ЭТА) и яипополисахаридов (ЛПС)Я4. cu/ta- * qinoia, и протейных ШС. Впервые получены антигенные ЭД из белко< вого внеклеточного антигена (БВА)& омщиШа. и "гидроксилами^ новых" (ГА) антигенов протеев и антительные ЭД для индикации 3í| и BBkfk.auu^utoiit. и О-антигенов протеев основных серогруцп. ?
Доказано раннее появление и высокая диагностическая ценносц* выявления ACS для определения в ранние сроки этиологической po-^ji стафилококков, протеев и синегнойной палочки у больных ГВСЗ. V
Обоснован аффективна способ определения субпопуляциониой принадлежности ACS в реакции смешанного розеткообразования (Кода-
»отельное решение .ЕШИГПЭ по заявке на изобретение .М 4874655/14/ 102793 от 27.09.91г.Ь
Показано, что АСЛ относятся к Г, В и 0 популяциям лимфоцитов. Субпопуляционкая принадлежность АСЛ зависит от остроты гнойно-воспалительного процесса и не зависит от места выделения лимфоцитов (кровь а миндалина). В динамике острого заболевания или вакцинального процесса происходит не только изменение их количества, но и изменение их популяционной принадлежности: количество Т-АСЛ уменьшается, а 0-АСЛ увеличивается.
Впервыз «оказана непараллельность динамики АСЛ в периферической крови и лимфоццных органах у морских свикох с экспериментальной стафилококковой инфекцией. У больных хроническим тонзиллитом и морских свинок с экспериментальной стафилококковой инфекцией частость выявления и количество АСЛ стафилококковой специфичности в ближайших а очагу поражения скоплениях лиыфоидной ткани больше, чем соответствующие показатели в периферической крови.
Прн помощи различных иммунодиагностических приемов доказано, что у чАстй больных хроническими ГВСЗ инфекционные процессы синегнойной я протейной этиологии носят острый, а не хронический характер, и наслаиваются на хронический инфекционный процесс стафилококковой Этиологии.
Впервые при комплексном иимунодйагностическом обследовании больных ГВСЗ показана высокая эффективность, иммунологического выявления стафилококковой, протейной и синегнойной этиологии ГВСЗ не только при моноинфекционных процессах, но и при ассоциированных формах инфекции. .
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧШСТЬРА50'|Ш. Разработан новый способ повы-'шения чувствительности и специфичности ЗД, получаемых с использованием1 коньвгирущих агентов (АС СССР № 1420703).
Показано, что при конструировании стафилококковых, протейных и псевдононадных ЭД для каздого сенситина необходим индивидуальный подбор оптимального коньвгярующего агента.
Для иммунологической диагностики стафилококковой, протейной и синегнойной этиологии ГВСЗ по определении активности антител и содержанию' АСЛ подобраны оптимальные сочетания разработанных ЭД соответствущей специфичности, обеспечивающие максимальную • эффективность РИГА или РНРО.
Подобраны оптимальные условия постановки и учета РНРО, обес-
печиващие максимальную эффективность выявления ACI и возможность индивидуальной оценки результата.
Показано, что индикация протейных антигенов в моче является надекньш доказательством протейной этиологии гнойно-воспалительных процессов у урологических больных; ■ '
Определены факторы, влияющие на эффективность иммунодиагностики стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций у больных ГШЗ и с учетом этих факторов предложена рациональная схема имыу-нодиагностичесхого обследования больны* ГВСЗ.
Показано, что одновременное определение активности антител и АСЛ различной видовой (родовой) специфичности в динамике заболевания позволяет дифференцировать сроки возникновения ассоциированных форм инфекционного процесса при ГЁСЗ.
АПРОБАЦИЯ РАБОЗД. Фрагменты -работы доложены на: У конференции аллергологов и иммунологов Казахстана и республик Средней Азии (Алма-Ата,1986), Всесоюзном симпозиуме "Современное состояние проблемы стафилококковой инфекции" (Саратов,1986), 31 Всесоюзном съезде хирургов (Ташкент,1986), Всесоюзной конференции "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Ангарск,1987), заседании Республиканского научного общества иммунологов и аллергологе» (Алма-Ата,1988), II Всесоюзной -конференции "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Барнаул,1988), конференции молодых ученых, посвященной 50-летию КирПШ "Иммунный гомеостаз в норме и патологии" (Фрунзе,1989), ХУIII съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Алма-Ата,1989), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи,1989), научно-практической конференции Центральной больницы Л00 при Совете Министров КазССР "Сепсис. Клиника, диагностика, особенности течения в современных условиях* Принципы лечения"(Алма-Ата,1990)* расширенном заседании кафедры травматологии и ЩХ АГМИ и клиники травматологии 4 ГКБ (Алма-Ата, 1990), Всесоюзной конференции по сепсису (Тбилиси, 1990), 1У Всесоюзном съезде урологов (Москва, 1990), У Объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана (Алма-Ата,199I). Диссертация апробирована на совместном заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии, михробиологии и инфекционных болезней и общества иммунологов и аллергологов (Алма-Ата, 1992).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме работы опубликовано 32 печатные работы, в том числа методические рекомендации и информационное письмо. По результатам работы получено 3 АС СССР и положительное решение ВНИИГИЭ на изобретение.
основше шдоашя,тшсишЕ на защиту.
1. ¡Максимальная эффективность стафилококковых, протейных и псевдомоиадньн ЭД достигается индивидуальным подбором коныогируп-щих агентов для каждого используемого в качестве сенситина-анти-гена; o6ocnocsinib-M выбором видовой принадлежности эритроцитов и метода их фиксации.
2. Определение активности сквороточнмх антител при помощи РПГА и содержания АСЯ при помощи PHF0 с разработанными антигенными ЭД являются высокоэффективными методами диагностики моно- и ассоциированных форм стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций у больных.различными ГВСЗ.
3.' РПГА с антительными ЭД является эффективным методом индикации антигенов в вьделенных культурах и моче урологических больных.
4. Эффективность иммунологического выявления стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций у больных ГВСЗ зависит от особенностей используемого метода иммунодиагностики и иммунореагентов, сроков и кратности обследования больного, особенностей гнойно-воспалительного процесса (острота и локализация) и правильного учета особенностей обследуемых групп больных, в частности вакцинального анамнеза.
5. Имыунодиагностические приемы с применением разработанных ЭД молено использовать не только для определения этиологии ГБСЗ, но и для оценки остроты инфекционного процесса у больных ГВСЗ и сроков возникновения ассоциированных форм инфекций или смены возбудителя.
6. АСЛ^пэ данным реакции смешанного розеткообразования^относятся к Т, В и 0 популяциям лимфоцитов. Субпопуляционная пршад-лежность АСЛ зависит от остроты инфекционного процесса и не зависит от места вьделения лимфоцитов (кровь и миедалина). У больных ГВСЗ в динамике острого инфекционного процесса и иммунного ответа при вакцинации происходит не только изменение их количества, но и субпопуляционной принадлежности.
7. В этиологической структуре острых гнойно-воспалительных
заболеваний брюшной полости (острый холецистит, острый перитонит, острый панкреатит, острый аппендицит) высок удельный вес стафилококковой инфекции (19-61$).
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАКШ. В соответствии, с планом основных организационно-методических мероприятий Министерстве здравоохранения Республики Казахстан при проведении двух Республиканских семинаров по комплексной лабораторной диагностики кишечных и гноЛ-.но-септичаских инфекций (Караганда, июль 1989; Балхаш, июнь 1990) разработанным методам иммунодиагностики стафилококковых, протейной и смнегнойной инфекций обучено 96 врачей-лаборантов и 20 врачей-клиницистов (хирурги, травматологи, акушер-гинекологи).
Изданы методические рекомендации "Серологические методы выяв-^ ления. этиологии гнойно-септических эаболеваний'Ч Алма-Ата, 1983) и Ииформ Листок- КазНИИШ "Иммунодиагностика гнойно-воспалитедьних и септических заболеваний"(Алма-Ата,1990).
Разработанные методы выявления стафилококковой, протейной и синегнойной этиологии ГВСЗ внедрены в работу отделений хирургического, травматологического, урологического и акушерско-гинекодо-гического профиля пяти больниц г.Алма-Аты« четырех кафедр Алма-Атинского госмединститута, лабораторий ожоговых инфекций ШЙШ им.Гамалеи (г.Москва) и лаборатории биохимии ЩШЙВС им.иечникова (г.Москва). Получено 15 актов внедрения.
По поданным заявкам на изобрегения получено 3 АС СССР я Положительное решение ВНДОГЩ.
Комитетом Вакцин й сывороток при Министерстве здравоохранения СССР утверждена документация по научно-технологической разработке диагностикумов стафилококковых эритроцитарнка антигенных жидких (протокол № 6, от 03.12.86г. ). Подготоьдзны иутверадеаыУчонда Советом НЭДЭМИБ три Инструкции по изготовлению и контролю протейных типоспецифичесхих, псевдоыонадиых типоспецифических в псевдо-монадных видоспецифических эцитроцитарнкх диарностихулюв (прото- : кол № 16, от 10.II.88г.). С 1989 г. на базе группы по производству эритроцитарных реагентов. НИИЭМИВ организовано производства ди-агностикуыов стафилококковых антигенных эритроцитарных для выявления антител к видоспецифическим антигенам золотистого (эпидер- . мального) стафилококка и эритроцитарные реагенты для выявления АСД при стафилококковой инфекции.
ОВЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация включает введение, обзор литературы, главу "Материалы и методы1', четыре главы собст-
венных исследований, заключение, выеоды, практические рекомендации, указатель литературы, приложения. Работа содержит страниц текста, 93 таблиц. В указателе приведено 359 отечественных и зарубежных источников. В 37 приложениях приведены результаты определения активности антител у здоровых доноров, исследования стабильности ЭД, динамики иммунного, ответа у зараженных животных и дисперсионного анализа полученных данных.
Выполненная! работа является фрагментом НИР "Разработать новые методы диагностики стафилококковой, протейной и псевдомонадноной инфекции у человека с использованием антигенсвязывающих лимфоцитов» Оформить техническую документацию на диагностические препараты", !? гос.регистрации 01870006034 и "Эпидемиология, диагностика, профилактика бактериальных инфекций (кишечных, стафилококковых). Диагностика бактериальных (затяжная, хроническая дизентерия, салмонеллез, цитробактер инфекция, гнойно-воспалительные и септические, дифтерйя) и паразитарных заболеваний при помощи сенсибилизированных эритроцитов", № гос.регистрации 01830086075.
■ МАТЕРМН И ШШК.. В работе использованы ,
209Р, Софт. I, X¿¡иЖ/иъосЬ'Л , ССМ 2124 и 12В,/У. аС -
Хи^ишя,, ?А-7 (ОН серогруппа по), 85(01), 87(03), 103 (06), 185(02/05), 192(011) , ^-П?(серовар 03Н2),
£"-771(028Н2), £"-73(010ЙЗ), 2"-219<013Н4) £"-162(023НЮ), £"-458 (026НЗ), ^*-384(030Н1) и ^-485(016Н14); солянокислые экстракты (СЭ) стафилококков, полученные по методу/.СкАти^Цои (1928) в нашей модификации (П.Н.Дерябин,1985);очищенные препараты ТК (ШШЧ, ХА/ооЛ- 46 и 209Р, предоставленные Н.П.Банеезой(ЦНШВС им. Мечникова); "очищенный СА и стафилококковый токсин (ИЗМ им.Гамалеи, г.Москва); ЛПС и гомогенные препараты ЗТЛ и БВкРъ.ОУШ^циМ* предоставленные А.Д. и И.А.Александровыми (ИЗМ им.Гамалеи); активированные щелочь» илеактивированные ЛПС протеев, полученные по методу Вестфаля (см.Е,А.Петроеян,1951); ГА антигены протеев, получение по методу Н.И.Синяшина и др.(1970); сухая протейная вакцина (ЦНИИВС им.Мечникова); агрегированный и неагрегированный человека; стафилококковые гипериммуннъв антимикробные кроличьи сыворотки; стандартная противостафилококкозая сыворотка (ГИСК им.Тарасевича, г.Москва); кмыунныэ сыворотки к ЛПС, ЭТА и БВА Рз.алъидйиЯа., У из анти-ЭТА и анти-БВА сывороток и- специфические антитела из анти-ЭТА сыворотки, предоставленные А.Д. и И.А.Александровыми (ИЗМ им.Гамалеи); протейные агглютинирующие
- ю - •
адсорбированные (0 и Н) и неадсорбированньте(О) сыворотки (предприятие "Антиген", Московская обл.); кроличьи шмунные сыворотки против ГА антигенов протеев, предоставленные К.Г.Кавериной (ЦНИИВС им. Мечникова); формаликиэированнке т!1\Мки%$си.1ь (1959) эритроциты барана!ФЭБ) и кур(ФЭК); стабильные эритроциты.барона для выявления Е-РОК (Каральник В.В. и Лещинскоя Л.Ц.,1991); сенсибилизированные комплементом частицы, зимозана для выявления лимфоцитов с СЗв рецепторами.
При получении антигенных ЭД применяли следующие методы нагрузки эритроцитов: без посредников (см. Б.В.Каральник,1976)» при яомоци танина, амидола, хлорида хрома, глутарового альдегида и риванола (В.А.Шамардин,Б.В.Каральник, 1981). Антительнда ЭД получали путем сенсибилизации ФЭК иммуиоглобулиновыми препаратами при помощи амидола.
Заражение экспериментальных-животных проводили путем внутривенного, внутримышечного или внутрикостного введения стафилококков, протеев и синегнойной палочки.
Выделение лимфоцитов из периферической крови я лимфоедных органов проводили по «етодуЛ.'бс^илг. (1958). Инактивацию^ Н антител осуществляли при помощи 2-меркаптоэтанола(2-МЭ)///.£"50г££&у1 ,ЛМог-■¿ОП ,1958/„ Содержание АСЛ определяли при помощи РНРО, а активность сывороточных антител - при помощи РИГА с антигенными ЭД.' Индикацию антигенов в моче проводили при помощи РИГА с антительными ЭД и реакции нейтрализации антител (РЙАт) с антигенными ЭД.
РОГА, РНАт, реакцию нейтрализации антигена (РНАг), реакцию торможения пассивной гемагглатинации (РТПГА) и реакцию угнетения пассивной гемагглютинации (РУПГА) ставили микрометодом в полистироловых пластинах..
Эффективность отдельных диогностикумов, их сочетаний, методов иммунодиагностики, а также влияние различных факторов (сроки и кратность обследования, локализация и острота патологического процесса, обработка сывороток 2-МЭ и др.) на эффективность иммунодиагностики при обследовании больных оценивали по двум условным показателям: частости положительных результатов иммунологического обследования у больных, от которых вьделены гомологичные ыикроорг ганизмы (харктеризует чувствительность) и частости положительных результатов иммунологического обследования у больных, от которых вьделены гетерологичные микроорганизмы (характеризует специфичность). -Чем больше первый показатель и чем меньше второй, тем. вы-
-lime эффективность' иммунодиагностики.
Всего обследовали 1217 больных, в том числе 307 - хроническим и 25 - острые остеомиелитом, 128 - острый холециститом, 90 -острыми и 10 - хроническими гнойными заболеваниями мягких тканей, 71 - бактериальным эндокардитом, 84 - острым лактационным маститом, 63 - ожоговой болезнью, 85 - хроническим пиелонефритом, 57 -хроническим тонзиллитом, 15 - острым и 8 - хроническим парапрок-титом, 37 - панкреатитом и холецистопанкрёатитом, 15 - сепсисом, 18 - острый-аппендицитом, 91 - острым перитонитом, 9 - острым ли»фоаденитоме 14 - другими ГХЗ (нагноительнке заболевания легких, острый тромбофлебит,' гнойный бурсит, острый периостит); 24 здоровые родильницы; 800 взрослых здоровых доноров; 33 кролика и 18 морских свинок.
При выборе оптимальных методов получения ЭД проведено 780 опытов гемосенсибилизации. Всего проведено'иммунологических реакций; -РИГА - 27193; РНАт - 768; РИГА - 327; РНАг - 30; РУПГА - 24; РНЮ .- I0I03», смешанного розеткообразования - 130.
При статистической обработке использовали следующие методы: сравнение серий по способам связанных и несвязанных выборок с вычислением критериев достоверности (£или<а£), определение доверительных интервалов, одно-, двух- и трехфакторнкй дисперсионный анализ, частотный анализ, регрессионный и корреляционный анализ, сравйение двух.кривых, частное сравнение сераЯ после дисперсионного анализа. Для всех серий результатов находили средние геоыетрй-. чоскиз или средние арифметические величины и их средние кводрати-ческнз ошибки /В.Ю.Урбах,IS75/, '
- СОДЕРЖАНИЕ РАЕО'Ш
При получении, антигенных ЭД в качестве сенситинов использовали СдЛаилШб \\SsjM¡UtrmxÜ& , ТК $. (Шит, , СА, ЭТА и БЕА aVUlCj'ul&l(b, обладающие видовой специфичностью, а тахдз ?S.âe, ■ UtflùlûS&-\\ ЛПС и ГА антигены протеев, обладающие групповой специфичностью. Известно, что не только чувствительность, но и специфичность ЭД зависит от метода сенсибилизации эритроцитов (Б.З.Ка-ральних,1982; В.А.Шамардин и Т.И.Тугамбаев,1389 и др.). При получении ЭД из ЛПС применяли общепринятый метод - нагрузку эритроцитов без посредников, а при использовании других антигенов сравнили эффективность различных методов сенсибилизации. 3 ряде случаев неспецифичзская агглютинация ЭД, полученных с использованием конь-
югирующих агентов, может быть обусловлена наличием на.поверхности эритроцита свободных активных групп коньюгкрующего агента, не блокированных антигеном-сенситином. В этой связи нами предложено проводить дополнительную сенсибилизацию (догрузку) антигенного ЭД, полученного с использованием коньюгирующего агента, тем же. антигеном в условиях, соответствующих примененному методу нагрузки, но без повторного использования коньюгирующего вещества. Это вело к блокированию свободных активных групп коньюгирующего вещества на поверхности ЭД и тем самым - к повышению специфичности ЭД. Метод был успешно применен при получении J^ % ЭД с помощью риЕанола и стафилококковых ЭД из СЭ при помощи амидола. Дополнительная нагрузка повышала не только, специфичность, но и увеличивала чувствительность этих ЭД. На "Способ получения эритроцитарного диагностика" получено АС СССР К" 1420703 на изобретение.
Использование догруженного ty % ЭД позволило обнаружить наличие белка А у штаыма S. ашшд , \Vood 46, что совпадает с данными других исследователей о том, что штамм Woo&bо не является полностью дефектным по белку A {J.^mjuuL e>t ,1984;.//. Зш^.^и-ШчшСЛШ).
Ранее в ограниченных опытах мы не обнаружили белка А в СЭ стафилококков (11.Н'.Дерябин, 1905). Однако дальнейшие исследования с использованием РЛГА. и РУПГА с догруженным Jfl ^ ЭД выявили присутствие белка А в CSS.cwceub' в. агглютинирующей или неагглютини-. рующей форма. Поэтому возникла, необходимость изучения специфичности ЭД .из СЭ J аилещ в связи с присутствием в них. белка А. Различными приемами показано,-что белок А в СЭ находится в комплексе с другими видоспецифическими антигенами S. Сшлии, , в частности .р ТК, а сенсибилизация эритроцитов СЭ Сшлцц при помощи .-амидола позволяв*-исключить экспонирование на поверхности ЭД белка А, способного взаимодействовать с -фрагментом молекулы ^.
Оценку используемых методов сенсибилизации эритроцитов проводили по чувствительности полученных ЭД в РЛГА я, дополнительно, по расходу сенситина. Для каждого антигена при всех использованных катодах нагрузки подбирали оптимальную сенсибилизирующую дозу.
Ранее было показано и настоящим исследованием подтверждено, • что оптимальным методом сенсибилизации эритроцитов СЭ стафилококков является нагрузка при помощи амидола. Нагрузка при помощи хлорида хрома оказалась наиболее эффективным методом получения ЭД из ТК &. сиишц> ; она обеспечивала в 1,6-14,7 раза большую чувст-
вительность РПГА, чем использование других методов сенсибилизации. Сравнение эффективности ЭД, полученных из СЗ и ТК разлиедых штам-^ мов (ШЛШЬ (209Р и ШосеС 46), показало, что выбор метода сенсибилизации зависел от характера антигена, а не от особенностей штамма-продуцента. При помощи различных серологических реакций (РПГА, РНАт, РТПГА) показано, что ЭД' из ТК и СЭ обладают, выраженной видовой сПецгфичностыо. 3 то же время обнаружено также выраженное внутривидовое различие антигенных препаратов из штаммов Л сашш, ,209Р и У/ооЬ 46, причем при использовании СЭ это различие более выражено, чем при использовании препаратов ТК. Следует отметить, что ЭД из СЭ 209Р оказался более эффективным, чем из ТК того же штамма, а ЭД из ТК 46 более эффективным, чем из СЭ 46. Применение амидола, по сравнению с другими методами сенсибилизации, в той числе широкоприменяеиыы - при помощи танина, не только в 1,2-6,5 раз повышало чувствительность ЭД из СА, но и в 4 раза снижало расход сенситина,
Из ЛПС7 наиболее распространенных серогрупп протеев и ЛПС 5 наиболее распространенных серогрупп ШЩиийЬа, были получены как моно-, тах и поливалентные ЭД. Полученные ЭД обладали выраженной 0-групповой специфичностью, а поливалентные ЭД нэ уступали по чувствительности моновалентньи.
Оптимальный по чувствительности и расходу сенситина оказалось получение ЭД и» ЭТА Ру ШЛЩиФЮ, при помощи хлорида хрома н из БЕА
H.сиш^иияси - при помощи глутарового "альдегида. Высокая специфичность и антигенная неидентичность этих ЭД подтверждена в перекрестных РИГА и РНАт.
Нагрузка эритроцитов ГА антигенами протеев при помощи амидола в 1,1-13,0 раз повышала чувствительность РПГА и в 2-16 раз снижала расход сенситина, по сравнению с другими использованными методами сенсибилизации. Полученные ЭД обладали выраженной 0 и Н специфичностью. Более высокая активность у них N компонента в сравнении с С в большей степени зависела от способа сенсибилизации эритроцитов, максимальной она была при нагрузке с помощью амидола и глутарового альдегида.
Все полученные нами антигенные ЭД, за исключением ЭД из Б8А Ру.алгифлмз,, обладал» высокой стабильностью и сохраняли чувствительность при хранении в жидком виде с азидом натрия не менее
I,5 лет. Чувствительность ЭД из БВА существенно снижалась к третьему месяцу хранения.
Таким образом, проведенные нами исследования показали необходимость индивидуального подбора оптимального метода сенсибилизации эритроцитов при получении ЭД из стафилококковых,, протейных и псеидомонздных антигенов. Нам не удалось выявить закономерности
в подборе коныогирупщих агентов для антигенов, различающихся по_______
химической природе и видовому происховдению. Коньюгацил при помощи хлорида хрома оказалась оптимальной для углеводного антигена - ТК • .и для белкового антигена - ЭТА, в то же время для других белковых антигенов оптимальным оказалось применение амидола (СА) или глута-рового альдегида (БВА). Выбор коныэгируюедего агента, особенно при использовании комплексных антигенов (СЭ, ГА антигены), влиял на только на чувствительность, но и на специфичность получаемых ЭД.
Правильный выбор метода гемосенсибилизацин для каэдого сенси-тина важен как при получении эритроцитарных реагентов для РДГА, так и для РНЮ. При получении ЭД.-для гЯРО необходимо учитывать, что использование ряда коньюгируюцих агентов, например, танина, может привести к изменений адгезивных свойств эритроцитов, используемых в качестве основы реагента.
Специфичность эритроцитарных реагентов для выявления АСЛ зависит не только от правильного подбора сзнситвна и метода сенсибилизации, но и от особенностей эритроцитоа, используемых в качестве основы. С отой точки зрения применение рядом авторов в качестве основы иммунореагентов эритроцитов барана или человека КО) группы вызывает серьезные сомнения из-за их способности к спонтанному и ауторозеткообразовонш с лимфоцитами человека. Наибольший интерес представляет использование эритроцитов кур, которые не только не образуют спонтанных розеток с лимфоцитами человека, во легкодоступны », в отличие от эритроцитов быка, морфологически легко отличимы от эритроцитов барана, что позволяет использовать их в реакциях смешанного розеткообразовадия без каких-либо дополнительных маток. При получении ЭД для определения АСЛ, кроме учета видовых особенностей эритроцитов, важную роль играет способ их фиксации. Известно, что фиксация эритроцитов ацетальдегидом меньше, чем формальдегидом или глутаоапэдегадоы влияет на их. адгезивные свойства. Нами был подобран оптимальный,режим фиксации эритроцитов кур - обработка 10% взвеси натквных эритроцитов 14,4% раствором ацетальдегвда в течение «¿4 часов при 37°С. Фиксированные таким образом эритроциты (ЙАЭК) отвечали заданным требованиям: на образовывали спонтанных розеток с лимфоцитами человека и обладали
способностью сенсибилизироваться оптикальным для используемого антигена способом. С использованием ФАЭК и оптимального метода нагрузил нами были получены иммунореагенты для выявления АСЛ из СЭ S.cumui 205? uS.ejUcUjmudt* .CCM2I24; IЪ S.cUHmt./ WoocL 46; CA; ЭТА ' и mzh.M.Wfiwía, ; ШС и ГА антигенов протеев. Из ЛПС были получены как moho-, так и поливалентные ЭД. Все полученные ЭД практически не уступали по чувствительности ЭД соответствующей специфичности, полученных с применением ФЭБ, и были стабильными при хранении в жидком виде с азидом натрия в течение не менее 1,5 лет. На "Способ получения эритроцитарного игаунореагента для выявления антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции розетко-образования" получено АС СССР Р 1634284 на. изобретение.
Из ^ высокоактивных сывороток к ЭТА и БВА h. at/tufyinOíCL. получены строго, специфичные антительные ЭД, способные выявлять в РИГА эти антигены в концентрациях соответственно I и 3 нг белка/ ил. РПГА с этими антк^ельньтыи ЭД оказалась более чувствительный методом индикации ЭТА, чем РНАт, реакции латекс- и коагглютинации и ИЗА и более чувствительным методом индикации БВА, чем РНАт.
Полученные из протейных неадсорбированных О сывороток основных серогрупп антитольшга ЭД обладали 0 специфичностью и не обладали Н специфичностью. Их чувствительность колебалась от 21 до 98 нг ЛПС/мл. Чувствительность протейных ^¡севдомонаднкх антительных ЗД зависела от активности (титра) соответствующих по специфичности антител в исходной ссторотке.
Эффективность выявления антител, АСЛ й антигенов, кроме особенностей используемых иммуиореагектов, зависит от условий проведения реакции и применяемой методики учета результатов. Если для РПГА и других использовании« для определения антител и индикации антигенов реакций методики их постановки vt учета результатов определены и не дискутируются, то о режимз постановки, учете и оценке результатов PKFO для выявления АСЛ единое мнение отсутствует. В этой связи мы жучили влияние двух режимов постановки РНРО ("иммунного" л "спонтанного"), различных соотношений эритроцит/лимфоцит, используемых в реакции, количества просчитываемых в мазке лимфоцитов и критериев учета РНЮ на эффективность выявления АСЛ. Показано, что наибольшая эффективность выявления АСЛ достигается при постановке РНЮ в режиме "спонтанного" розеткообразования, использовании равных объемов 0,2& взвеси ЭД и взвеси лимфоцитов в концентрации 2x10® клеток/мл и просчете в мазке количества роэет-
кообразушцих хлэток в 7 сотнях лимфоцитов порознь. Поэтому в дальнейшей работе применяли вышеназванные условия постановки и оценки результатов РНРО,
Полученные нами результаты подтвервдают данные Ы.Ю. Чоудхури (1986) о большей специфичности режима "спонтанного" розет^ообра-эования при выявлении АСЛ, а также показывают неправомерность предлагаемого рядом авторов (Ф.Ю.Гариб,и Ы.В.Залялиева,1989 и др.) просчета 2-3 сотен лимфоцитов при определении АСЛ. Такой подход значительно снижает эффективность РНРО, особенно при оценке индивидуальных результатов обследования больных.
При анализе результатов иммунодиагностнческого обследования больных и экспериментальных животных важное значение имеют используемые критерии оценки полученных покряателей. Правильный выбор этих критериев позволяет оценивать индивидуальные результаты иммунологического обследования, что особенно важно пру практическом применении методов иммунодиагностики. .
Ранее нами было показано, что для оценки, результатов определения активности антистафилококковых антител у больных необходимо использовать два критерия: УДТ и нарастание титра антител в динамике (П.Н.Дерябин,1985). При определении УДТ необходимо учитывать, что уровень "есте'ственной" активности.антител в стафилококковым, протейным и псевдомонадныи антигенам зависит от особенностей шму-нореагента, поэтому определение УДТ нужно обязательно проводить для каждого используемого диагностикума. Это требование легко выполнимо при использовании стабильных кммунореагентов. При промышленном выпуске таких диагностикумоз УДТ определяется только производителем. Определение нарастания тмтрз соответствующих антител является доказательством стафилококковой, протейной или псеадош-надной этиологии ГВСЗ, независимо от абсолютного значения титра антител. С учетом Бьиескасинного при оценке диагностической эффективности РПГА у больных мы ь-сдолазоваяи два критерия - УДТ и нарастание титра антител э дин«ша»м>. Цри оценке, антителького ответа у эксперимзнтальньк животныхучитывали только динамику активности антител.(положительным результатом РПГА считали не менее, чем 4-кратное увеличение активности антител). Определение 2ДГ в данном, случае нецелесообразно ввиду очень высоких затрат на его определение при недостаточной информативности этого показателя в эксперименте.
Малопригодной представляется рекоме!^уемая рядом авторов
• - 17 -
(Г.В.Булава и др.,1982; Ф.Ю.Гариб и М.В.Залялиева,1989 и др.) оценка результатов определения АСЛ и индикации антигенов с учетом средних показателей их содержания у здоровых людей. Такой подход не обеспечивает надежной индивидуальной оценки результатов, поскольку при этом не учитываются различные, не связанные с антиген. ной специфичностью реагента, факторы (например, неспецифическая адгезия - при определении АСЛ, и антиглобулияовые факторы - при определении антигенов)активность которых зависит от особенностей обследуемого больного.
Для правильной индивидуальной оценки результатов определения АСЛ в РНРО и индикации антигенов в РПГА с антитвльнкми ЭД необходимо использовать контрольные иммунореагенты. В 1ЯРО в качестве контрольного реагента применяли нзсенсибйлизированные ФАЭК, что позволило дифференцировать антиг'енспёцифическое розеткообразование от неспецифическая адгезии, имеющей место, хотя и на очень низком уровне, даже при использовании эритроцитов кур. Положительным результатом определения-АСЛ считали достоверное превышение количес-, тва розеткообраэущих лимфоцитов с опытным ЭД, по сравнении с контрольны.!. Такой прием позволил оценить диагностическую значимость результатов РНРО в каждой.исследуемой пробе лимфоцитов.
При индикации антигенов в РПГА с антительными ЭД в качестве контрольного реагента использовали эритроциты, сенсибилизирован-! ныэ иммуноглобулиновыми препаратами из нормальных сывороток в режиме, использованном при получении соответствующих антительных ЭД. Постановка РПГА с контрольным и антительныи ЭД позволяет дифференцировать специфическую и не специфическую (за счет онтиглобулиновых факторов) агглютинация», что на всегда достигается истощением исследуемого материала несенсибилизированными эритроцитами. Положительным результатом индикации антигеноз в РПГА считали не менее, чем 4- кратное превышение титра агглютинации с антительным ЭД, по сравнению с контрольным.
При Еыборе метода иммунодиагно стиче с ко го обследования необходимо учитывать динамику изучаемых показателей иммунного ответа. Надежно оценить динамику иммунного ответа на антигены возбудителя можно при обследовании экспериментально зараженных животных. Поскольку существуют противоречивые сведения о соотношении сроков выявления антител и АСЛ, мы изучили динамику активности сывороточных антител и АСЛ у 23 кроликов, зараженных стафилококками, протеями и синегнойной палочхой. Проведение такого эксперимента показало
- 18 - . высокую специфичность выявления антител и АСЛ при помогди разработанных нами иммунореагентов. Ни у одного из обследованных кроликов до заражения и при использовании гетерологичных ЭД после заражения АСЛ не обнаружены; не отмечено также достоверного иараста- > ния активности гетерологичных антител. При использовании гомола- ' гичных ЭД АСЛ и достоверное нарастание обшей и «37/ -резистентной I активности антител обнаружено у-всех обследованных животных. Час. тость их выявления зависела от. сроков обследования заразкенных животных. Обнаружена достоверная непараллелькость динамики АСЛ и как общей, так и SH ^резистентной активности сывороточных антител. , АСЛ в' периферической крови выявлялись существенна раньше', чем значимое увеличение активности соответствующих по специфичности сывороточных антител. У 44% животных АСЛ обнаружены уже на следующий день после заражения, а через три дня после заражения АСЛ выявлялись уже у кроликов, в то время как достоверное увеличение активности сывороточных антител отмечено лишь на 7-Ю день после ■ заражения. Эти результаты свидетельствуют, «то определение АСЛ можно использовать для ранней диагностики стафадококковой, протейной и синегиойиой инфекций. 8 отличие от С.А.Бобровника с соавт. (1982,1988) мы не обнаружили влияния способа заражения ни на ди- -наыику АСЛ, ни на динамику активности антител. На динамику активности антител и АСЛ не влияло предшествующее заражение животных микробом другого вида. Повторное заражение животного одним и тем же микроорганизмом вызывало увеличение периода циркуляции АСЛ в периферической крови. Динамика АСЛ, в отличие от динамики антител, зависела от видовой принадлежности микроба-возбудителя,. При заражении Pi. а&шфмм. отмечен более короткий период выявления ACJI а периферической крови, чем при заражении стафилококками и протеями. В общем можно отметить, что до 7-го дня поело заражения более эффективным методом регистрации иммунного ответа оказалось определение АСЛ, а начиная с 10-го дня у кройиков, зараженных Pi. iWux§i~ шко., и с 21 дня у кроликов, зараженных стафилококка«! и протеями, эффективность определения обией и SH-резистентной активности антител уже превосходила эффективность определения АСЛ.
Поскольку отсутствует единое мнение о распределении ACS по , , лиыфоидным органам, нами была изучена динамика АСЛ в крови и лим-фоидных органах (лимфоузлы, тимус, селезенка, костный мозг) морских свинок с экспериментальной стафилококковой инфекцией. При использовании гомологичного, но не гетерологичного, ЭД АСЕ обнару-
жены как а крови, так и во всех лимфовдных органах, включая тимус. Динамика и содержание АСЛ зависели от места ввделения лимфоцитов. Наиболее рано, уже через 12 часов после заражения, антмгенсвязыва-ющие клетки обнаружены в лимфоцитах, выделенных из наиболее приближенной к счагу поражения лимфоидной ткани.
Для оценки эффективности иммунодиагностики стафилококковой инфекции по определению активности антител и содержаний АСЛ было обследовано: при помощи РПГА - 979, при помощи PHF0 - 428 больных. 352 из них были обследованы с использованием одновременно обоих методов. Положительные результаты РПГА и РНРО с ЭД из СЭ CGM 2124 ■ получены соответственно у 66 и I00J5 больных с бакподтвертденной S.£{luU%Midti - инфекцией и лишь у 4 и 2% больных, от которых выделены другие микроорганизмы, что свидетельствует о высокой эффект' тявности выявления $. tyMiutMtdU - инфекции При помощи разработан' ных ЭД. Положительные результаты РПГА и PHF0 с ЭД из антигенов Л ttMAWb (СЭ 209Р, НС Wood 46, С А.) получены соответственно у 5175 н 60-78^ больных с бахподтвераденной &.СШАШ1 -инфекцией и лить у 7-13 и 6-I£*S больных, от которых выделены другие микроорганизмы. Сравнение диагностической.эффективности ЭД из разных антигенов S. . aivvuiA показало, что,в целом, независимо от нозологической формы . ГБСЗ,. как при определении активности антител в РПГА, так и при определении содержания АСЛ в РНГО применение ЭД из СА было существенно менее эффективным при выявлении S. аилеш.- инфекции, чем использование ЭД из СЭ и Ж. В то же время следует отметить отсутс-. твие различия эффективности РПГА с этими тремя ЭД у больных хроническим остеомиелитом и ожоговой болезнью. Эффективность ЭД из СЭ 209Р и IK ИДкЙб практически не различалась при определении как антител, так и АСЛ. Одновременное использование этих диагностику-мов достоверно на 12-14$ увеличивало частость Положительных результатов РПГА и РНРО без ухудшения их специфичности, что, вероятно, обусловлено продемонстрированной зья® антигенной неодентичнэстью штаммов 5. Сишил,, 209Р и Wozcb 46. Применение других сочетаний ЭД из LziviUib оказалось менее эффективным. Таким образом, наиболее эффективным для диагностики &.сиШШ инфекции оказалась пос-" тановка РПГА и РНРО с ЭД из СЭ 209Р и ТК Wood 46.
Для оценки эффективности иммунологического выявления синего • нойноЕ инфекции при помощи РПГА обследовали 324 больных, а при .помогай РНРО - 294 больных различными ГВСЗ; 170 из Них бши обследованы при помощи обеих реакций. Положительные результаты РПГА и
РНРО о разработанными псевдомонадными ЭД получены соответственно у 62-87 и 50-88& больных с бакподтвержденной синегнойной инфекцией и лишь у 2-15% больных, от которых выделены микроорганизмы других видов, что свидетельствует о высокой эффективности иммунодиагностики синегнойной инфекции. Сравнение диагностической эффективности ЭД из различных антигенов показало более высокую диагностическую эффективность определения антител к ЭТА, чем к БВА. Применение поливалентного ЭД, по сравнению с. набором моновалентных ЭД, существенно снижало частость положительных результатов РПГА (на 24,3%) и РНРО (на 37£). Как в РЛГА, так и в РНРО в группах больных с бакподтвервденной синегнойной инфекцией не обнаружено соответствия результатов реакций с ЭД из ЭТА и ЭД из Л11С (как поливалентным, так и набором моновалентных) • Одновременное определение АСЛ или антител к ЭТА и ЛПС существенно на 1156 увеличивало чувствительность РНРО и на 9-12& чувствительность РПГА без ухудшения специфичности обеих реакций. Это вероятно обусловлено тем, что не все штаммы Ь.силщ&ла,, продуцирующие ЭТА, относились к использованным нами .5 О-серогруплам Ь. ияшд-иша,, и, наоборот, не все штаммы Ь-вМифлош,, относящиеся к этим 5 0-се-рогруппам, продуцировали ЭТА. В целом частость положительных результатов РПГА и РНРО при использовании сочетаний ЭД из ЭТА и ЭД из ЛПС (поли) и ЭД из ЭТА и набора ЭД из ЛПС (монб) значимо не различалась. Однако использование поливалентного ЭД вместо набора моновалентных ЭД иэ ЛПС в 3,0 раза сокращало объем исследований в РПГА и в 2,3 раза - в РНРО. Поэтому оптимальной для диагностики синегнойной инфекции по определению антител и АСД оказалась постановка реакций с ЭД из ЭТА и поливалентным ЭД из ДОС.
Для диагностики протейной инфекции у больных ГВСЗ мы использовали поли- и моновалентные ЗД из Ж1С 7 наиболее распространенных О-серогрупп протеев. При.помощи РПГА обследовали 346, при помоги РНРО - 230 больных различными ГВСЗ, 160 больных обследовано с использованием обеих реакций. Положительные результаты РПГА и РНРО получены соответственно у 90-97 и 83-9155 больных с бакподтвержденной протейной инфекцией и лишь у 10-12 и 9-1255 больных, от которых ввделены гетерологичные микроорганизмы, что свидетельствует о высокой эффективности разработанных ЭД. Применение поливалентного ЭД как в РПГА, так и РНРО не уступало по эффективности иен пользованию набора моновалентных ЭД, но объем исследований при этом сокращался в 4-7 раз.
При параллельном обследовании одних и тех же больных выявлена высокая степень соответствия результатов РПГА и РНЮ со стафилококковыми, псевдомонадными и протейный ЭД 6,96-17,50; Р< 0,01). Эффективность этих двух методов практически не различалась: положительные результаты РПГА и РНРО получены соответственно у 89-93 п 77-95^ больных, от которых ввделены гомологичные микроорганизмы, и лишь у 10-13£ больных, от которых' ввделены гете-рологичные микроорганизмы. Одновременное использование РПГА н • РНК) улучшало эффективность выявления только J. cut&ui'j инфекции.
Сравнений полученных результатов иммунодиагностического обследования больных ГВСЗ с данными других исследователей (Г.Б.Булава и др.,1982,1983,1985;.ЯЛ. Vu,g~uujk da£„ 1981,1933; U. V/fu-at etat, 1983,1985 и др.) показало, применение нами методов иммунодиагностики стафилококковой, синегнойной и протейной инфекций с использованием разработанных эритроцитарных реагентов не уступало по эффективности таким высокочувствительным, но гораздо более дорогостоящим, методам определения активности антител, как ИФА и РИА.
Представляло интерес оценить влияние микроорганизмов других видов (при ассоциированной инфекции) на эффективность иммунологического выявления стафилококковой, синегнойной и протейной этиологии ГВСЗ и возможности комплексного иммунодиагностического об- . следования больных. С этой целью 303 больных различными ГВСЗ обследованы с одновременным использованием ЭД стафилококковой, протейной и псевдомонадной специфичности. 166 из них параллельно обследовали бактериологически. Эффективность иммунологического выявления стафилококковой, протейной я синегнойной инфекций у больных ГВСЗ была высокой и практически не различалась, как при moho-, так и ассоциированных формах инфекционного процесса (рис.1). Положительные результаты иммунологического обследования при ноио-и ассоциированных формах инфекций получены соответственно у 93 и IOOíS больных, от которых вьделены гомологичные микроорганизмы, и лишь у 2-10 и 2-23Й больных, от которых гомологичные микроорганизмы не выделены.
В целом нужно отметить, что при изучении эффективности разработанных нами методов выявления моно- и ассоциированных форм стафилококковой, протейной й псевдомонадной инфекций по определению антител й АСЯ обнаружена высокая степень соответствия результатов
Рис.1. Эффективность выявления moho и ассоциированных-форм стафилококковой, синегнойной и протейной инфекций,
больных: монокультуры - группа больных, от которых вцделены стафилококки, синегнойная палочка или протеи в монокультурах; ассоциации - группа больных, от которых выделены ассоциации выиеназ- . ванных микроорганизмов; другие микробы - группа больных, от которых выделены отличные.от вышеназванных микроорганизмы; стерильно -группа больных со стерильными посевами; не исследований - группа больных, не обследованных бактериологически. САчУ) - больные, у которых иммунологически выявлена стафилококковая, синегнойная или протейная мбноинфэкция. \fyCty - больные, у которых иммунологически выявлены ассоциированные формы стафилококковой, сийёгнййной и протейной' инфекций. . .-.
иммунологического и бактериологического обследования больных ( 37,II - 314,90; Р<0,01). Полное совпадение результатов бактериологического и иммунологического обследования при коноинфекционных процессах получено у 81% больных, частичное совпадение г у 11$ больных, а при ассоциированных формах - у 04 и 16$ .больных соответственно. Несовпадение результатов бактериологического и иммунологического обследования получено- липа, у больных с моноин-фекционньыи процессами. Редкие случаи несовпадения результатов бактериологического и иммунологического обследования больных могут быть обусловлены: не выявленной бактериологически микст-инфекцией с участием изучаемых видов микроорганизмов; наличием перек-'рестнореагирующих антигенов у изучаемых и других видов микроорганизмов; остаточным иммунным ответом на возбудитель (изучаемого вида) ранее перенесенного заболевания; наличием сопутствующего не диагносцированного гнойно-зоспалительиого процесса, выззанного микроорганизмами, изучаемых видов. Применение иммунологический методов позволило выявить этиологию гнойно-воспалительного процесса у 44/о больных, от которых не было выделено ни одного микроорганизма.
Проведенные исследования показали, что определение содержания АСЛ и активности сывороточных антител к стафилококковый, протейным и псчвдомонаднкм антигенам при помощи РНРО и 'РПГА с разработанными нами ЭД-является высокоэффективным методом, диагностики стафилококковой, протейной и синегнойиой инфекций у больных ГВСЗ.
Важное значение как для диагностики, так и для оценки роли АСЛ в иммуногенезу имеет изучение кх субпопуяяционной принадлежности, тем более,¡что в литературе отсутствует единое мнение по этому запросу. Практически не изученным остается вопрос об изменении субпопудяцконной принадлежности АСЛ в динамике иммунного, ответа. Результаты оценки субпопуляциокной принадлежности в значительной мара зависят от .методических особенностей определения принадлежности АСЛ ¡{ основным популяциям лимфоцитов. Как показали исследования, проведенные в нашей лаборатории, малопригодным для этой цели является используемое многими исследователями определение субпопуляционной принадлежности АСЛ методом фракционирования. Нами разработан вариант реакция смешанного розеткообразования с использованием стабильных эритроцитов барана (для выявления Г лимфоцитов), сенсибилизированных комплементом частиц зикозана (для выявления В лимфоцитов) и сенсибилизированных антигеном ЙАЭК (для
выявления АСЛ), позволяющий с высокой степенью надежности определять субпопуляционную принадлежность АСЛ. При обследовании больных острым стафилококковым лактационным маститом, хроническим стафилококковым тонзиллитом и больных едекомой простаты, иммунизированных протейной вакциной,, показано, что АСЛ относятся к. Т, В и О популяциям.лимфоцитов. В начале заболевания у больных, острым . маститом и в первые дни после вакцинации у больных аденомой простаты доля Т-АСЛ составляла 49 й 51% соответственно, а доля В-АСЛ была значительно меньше (б и 95? соответственно). В динамике инфек-цио}шого процесса у больных маститом на фоне уменьшения общего содержания АСЛ доля В-АСЛ возрастала (До 35&), а доля Т-АСЛ, наоборот* снижалась до 24$. В динамике иммунного ответа на протейную вакцину у больных аденомой простаты количество АСЛ возрастало, однако содержание Ь-АСЛ увеличивалось больше, чем Т-АСЛ, что приводило к увеличению доли В-АСЛ до 17% и уменьшению доли Т-АСЛ до 52%. Выявлена независимость динамики общих и антигенсвязывающих субпопуляций Т, Б и 0 лимфоцитов как у больных, так и у вакцинированных людей. У больных стафилококковым.тонзиллитом содержание и субпопуляционную принадлежность АСЛ определяли не только в крови,, но и в небных миндалинах. Обнаружена высокая степень соответствия результатов определения Api в крови и миндалинах (^"=»33,75; Р<0,01). Однако частость выявления (67,2+5,255) и среднее содержание £2,29_+0,05%) АСЛ стафилококковой специфичности е миндалинах были достоверно большими, чем в крови (50,7+6,1% и 2,06+0,0055 соответственно). Это может быть связано с возможностью получения лимфоцитами антигенной информации в миндалинах - очаге воспаления (А.Е.Вериигора и др. ,1978;М.Р.Салин,19с37). С учетом данных, полученных з эксперименте, можно сказать, что определение АСЛ в лим-фовдной ткани, расположенной в очаге воспаления или близко от него, позволяет улучшить эффективность иммунодиагностического обследования больных. Соотношение Т-, В-и 0-АСЛ в крови, больных тонзиллитом, существенно отличалось от соотношения этих клеток в крови больных острым стафилококковым маститом, обследованных в начале заболевания, и практически не отличалось от соотношения Т-, В-и О-АСЛ у этих больных, обследованных в конце заболевания. Субпо-пуляционная принадлежность АСЛ в крови и ымдалинах больных тонзиллитом практически не различалась. Таким стразом, можно сказать, что,субпопуляционная■ принадлежность АСЛ зависит от стадии и формы гнойной-воспалительного процесса, ¿ определение принадлежности
АСЛ. к Т и В клеткам можно использовать для уточнения длительности заболевания и остроты инфекционного процесса у больных ГЕСЗ,
Для оценки эффективности индикации ЭТА и ББА (ó. at-tugírUMA, в ввделенных культурах микроорганизмов рода P-íCudcmota¿ при помощи РПГА с антительннии ЗД из анти-ЭТА ty j и анти-БВА $ f исследовали супернатанты 311 штаммов Pi. ciHU$¿nOi&- и 15 штаммов РшиСсмо-ИМ других ввдов. БВА обнаружен у достоверно большего числа штаммов P¿. CtJUtUQlima. (95%), чем ЭТА (02Í). Специфичность индикации обоих антигенов подтверждена перекрестной РШГА с акти-ЭТА и анти-БВА сыворотками. Ни тот, ни другой антиген не обнаружены у псевдомонад других видов. Частота их выявления не зависела от 0-серогрупповой принадлежности штаммов ?¿. cwmQinxucL . Следовательно, индикация ЭТА и БВА при помощи РПГА с полученными антительными ЭД может использоваться для видовой идентификации эццеленных культур- PiUU¿Cmow&, Проведение полуколичественной оценки содержания ЭТА в супернатантах разных штаммов fi.üPtu^in^iCL, полученных на разных этапах культивирования этих микроорганизмов, показало, что РПГА с.анти-ЭТА антительным ЭД может бкть использована как экспресс метод контроля за токсинопродукцией штаммов fs.cc&u¿-ginCSil , при их культивировании и для отбора штаммов ашл, -по их способности и продукции ЭТА, С учетом ранее полученных данных по применению стафилококковых актительных- ЭД видовой слэцнфичности (П.Н.Дерябин,1985) можно сказать, что РПГА с видо-специфическимя антительными ЭД является эффективным методом видовой идентификации|ввделенных культур микроорганизмов.
Для оценки диагностической эффективности индикации протейных антигенов при помои» РПГА с О-антительными ЭД и РНАт с ©-антигенными ЭД исследовали пробы мочи от 48 больных хроническим пиелонефритом.' Оба метода обладали практически одинаково высокой эффективностью: антиген обнаружен у 95$ больных, из моча которых выделены протеи, и достоверно (Р< 0,001), в 3,5-7,1 раза, рояе у больных, из .мочи которых вь-делены другие микроорганизмы. Обнаружена высокая степень соответствия (^337,30; Р< 0,01) результатов индикации антигенов в РПГА н РНАт и достоверная (Р<0,05) связь мезду титрами антигена в этих реакциях. Специфичность индикации протейных антигенов в моче лодтвер.-.тдека высокой степень» соответствия результатов индикации протейных антигенов и бактериологического исследования мочи (^=»20,8-25,21; Р< 0,01), а также индикации антигена, а моче и определения в крови АСЛ (>^21,5-27,0;
Р<0,01) или активности антител (;Л>27,9-33,6; Р<0,01), специфичных к 0-&нтигенам протеев, и наличием достоверной свя&и(Р< 0,05) между титром 0-антигена в моче и количеством вкровй АСЛ и титром сывороточных антител к 0-а.чтигекам протеев. .
Приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности серологической индикации О-антигенов протеев в моче при.помощи РПГА и РНАт с раэрсиботанкыми 0 антительными и антигенными протейными ЭД для выявления протейной инфекции у урологических больных.
При исследовании проб мочи 40 человек с ожоговой болезнью не получено ни одного положительного результата РПГА с антительными ЭД из анти-ЭТА 9 и анти-ББА % , хотя у 6С% этих больных в периферической крови выявлены АСЛ или увеличение активности антител к ЭТА Рл. йелщрлма,. Следовательно, индикация антигенов возбудителя в моче больных ГЗСЗ в нрлшх исследованиях была эффективна только при расположении очага поражения в мочевыделительной системе, то есть у урологических больных. Известно, что при ряде инфекций, локализующихся вне моче вэдедитеяьного тракта (дизентерия, салмонедлез), определение актнгенов возбудителя в моче применяется как метод их иммунодиагностики Ш.Л.Царевский и др.,1979; Б.В.Карадьиик.и Н.М.Нуркша,1983 и др.). В этой случае наличие; антигенов з моче обусловлено антигенемией, имеащей место при этих заболеваниях. Возможно, что у обследованных нами ожоговых больных антигенемкя отсутствовала. Не исключено также, что возможность индикации антигенов в моче связана нз только с антигеиемией, а к с какими-либо особенностями природы определяемых анткгенов.
Для заработки рациональных подходов (тактики) х иммунодиаг-' ностичесг.ому обследованию больных ГЗСЗ. нами бая проведен анализ факторов, влияющих на диагностическую эффективность выявления антител и АСЛ стафилококковой, протейной и псевдомонадной специфичности у обследованного .контингента больных. .
Показгио", что определение в РПГА только активности >ГН -резне-, ■гентных(пра>;ыу^,2ственно ) антител, по сравнению с определе-
нием общей активности антител, существенно менее эффективно.Степень снижения эффективности зависела от химической природа использованных в качестве сенсятиноз антигенов, при использовании белковых сенситинов она была меньше, чам при применении полисахаридов. Полученные результаты согласуются с имеющимися, данными о существенно большей активности М, по сравнению, с , антител в РПГА (Д.А.Берзофски и Л.Д.Берковер, 1939; ¡О.МьЬмбя (¿а£., 1967)
\
н о том, что антительный ответ на полисахаридные антигены в большей степени, чем на белковые, обудовлен Уд М антителами (Б.В.Ка-ралъник,1988).
Как уже говорилось выше, для оценки результатов РПГА у больных, обследованных не менее 2 раз, им использовали два критерия: УДТ и нарастание титра антител в динамике. У больных острыми ГВСЗ частость выявления этих двух критериев практически не различалась, а их одновременное использование существенно повышало эффективность HITA. У больных хроническими ГВСЗ УДГ определялся чаще, чем нарастание активности антител, но кратность этого превышения зази-села от видовой специфичности используемых ЭД. При использовании стафилококковых ЭД УДГ определялся в 2,6 раза чаще, чем нарастание активности антител, а одновременное применение этих двух критериев значимо не увеличивало частости положительных результатов РПГА даже у больных с обостением хронических процессов. При применении псевдомонадных и протейных ЭД для обследования больных с обострением хронических процессов, во-первых, кратность превышения час* тости выявления УДТ, по сравнению с нарастанием активности антител, была меньше (1,6 и 2,1 раза), во-вторых, применение этих двух критериев существенно увеличивало частость положительных результатов РПГА. Показано, что нарастание активности антител к стафилококковым антигенам у больных острыми ГВСЗ обусловлено з основном увеличением общей активности антител, а у больных хроническими ГВСЗ - в основном увеличением активности SH-резистентных антител. Нарастание активности антител к протейным и, особенно, псеэдомонаднкм антигенам (рис.2) у Сольных хроническими ГВСЗ значительно (в 2-3 раза) чаще, чем увеличение активности антител к стафилококковым антигенам, определялось преимущественным ростом общей активности антител. Выл проведен анализ влияния сроков т остроты ГВСЗ на диагностическую эффективность РПГА и. РНРО со стафилококковыми, протейными и псевдомонаднкми ЭД. При определении активности антител обнаружена зависимость от остроты ГВСЗ влияния сроков обследования больных на результаты РПГА. У больных острили ГВСЗ УДТ антител к стафилококковом антигенам при первом обследовании обнаружен достоверно реже, а у больных хроническими ГВСЗ, наоборот, значимо чаще, чем при повторном. Частость выявления УДТ антител к протейным и псепдомонодным антигенам у больных хроническими ГВСЗ при первом и повторном обследовании достоверно на различалась. Влияние срокоа обследования больных на результаты РНРО не
ОСТРЫЕ ГВСЗ
ХРОНИЧЕСКИЕ ГВСЗ
Стафилококковые ЭД
Стафилококковые ЭД Псевдомонаднда Протейные ЭД
ЭД
I
8
Г ] - группа больных с преимущественным увеличением общей активности антител { - группа больных с преимущественным увеличением БН- резистентной активности антител
Рис.2. Структур3 иэотилоэой принадлежности антител
зависело от остроты ГВСЗ. Во всех обследованных грушах больных АСЛ при первом обследования обнаружены достоверно чаще, чем при повторном. Двухкратное, по сравнений с однократным, обследование увеличивало частость положительных результатов РЛГА со стафилококковыми ЭД у больных острыми ГВСЗ и частость положительных результатов РЛГА с псевдомонаднкми ЭД у больных хроническими ГВСЗ и не влияло на частость положительных результатов РПГА со стафилококковыми и- протейными ЭД у больных хроническими ГВСЗ, а также на частость положительных результатов РНРО бо всех обследованных группах больных. Таким образом, хотя в целом диагностическая эффективность РПГА я РНРО оказалась равноценной, определение АСЛ, в отличие от определения активности антител, поэзоляло уже при поступлении больного в стационар диагносцировать этиологию ГВСЗ не только у больных хроническими, но и острыми гнойно-воспалительными процессами.
Полученные результаты показали неоднотипность инфекционных процессов стафилококковой, протейной и псевдомонздной специфичности у больных хроническими ГВСЗ. Сопоставление динамику, иммунного ответа на протейные гасевдомонадньте антигены у больных хроническими ГВСЗ и динамики иммунного ответа на стафилококковые антигены у больных острыми и хроническими Г'ВСЗ с учетом сроков выявления антител и АСЛ в эксперименте и данных о изотипоаой принадлежности антител у больных острыми и хроническими процессами позволили предположить,1 что у части больных хроничэскими ГВСЗ мы го/ели дело не с хронической и, особенно, сикегнойной инфекциями, а с острыми инфекционными процессами данной специфичности, развившимися, на фоне ранее! существовавших гнойно-воспалительных процессов другой этиологии. |Следует отметить, что определение параллельно с общей и -резистентной активности антител к стафилококковым, протейным и псевдймонаднкм,антигенам, хотя и.на увеличивало частость положительных результатов РПГА, позволяет в части случаев более точно охарактеризовать остроту инфекционного процесса данной этиологии при ГВСЗ.
Определение антител к стафилококковому альфа-токсину и СЭX Ои/дгли,, 209? в РЛГА с разработанными нами ЭД оказалось более эффективным .методом выявления стафилококковой инфекции, чем определение соответствующих антител при помощи РНГ и веточного имыу-нозлектрофорзэа. Эффективность выявления стафилококковой и синег-нойной инфекций по определению общей активности антител к ГК
awicm и БВА Ps. a&Uifincüa, в РИГА-и ty ^ антител той же специфичности, в ИФЛ практически не различалась.Обнаруженное несоответствие результатов РПГА и ИФА связано с-преимущественным выявлением в РИГА í/f М,. a d ИФА - только „^J*.антител. Одновременное применение этих двух методов существенно увеличивало эффективность серодиагностики стафилококковой и синегнойной инфекций у больных ГВСЗ. Эффективность РПГА и ИФА■стафилококковой специфичности зависела от формы ГВСЗ. При острых .(мастит, холецистит) и подострых. (эндокардит). ГВСЗ, где преобладала.активность М антител, более эффективной оказалась РДГА, а при хронических (остеомиелит), когда активностьантител не уступшт активности З^ М йнтител -ИФА. Одинаковая эффективность и несоответствие результатов РПГА и ИФА псевдомонадной специфичности при обследовании'больных хроническими ГВСЗ подтверздает.предположение о наличии у части обследованных, больных оотрой, а не хронической.синегнойной инфекции* Проведенные исследования[показали.одинаково высокую эффективность серодиагностики стафилококковой и синегнойной инфекций у больных ГВСЗ при помощи РПГА и ИМ я подтвердили качественную неоднородность этих методов при использовании в ИФА только антиконь-югатов.
•Для того, чтобы оценить влияние специфической иммунопрофилактики на эффективность ишунодиагностики у борных ГВСЗ мы проанализировали результаты обследования 24 здоровых родильииц, 14 из которых были вакцинированы во время беременности СА, й 60 женщин с острым лактационным маститом, развившимся в точение первого месяца по&йвродов,"32 аз которых во время беременности были закци-нированы-СА. Показано, что при использовании ЭД из клеточных антигенов X cuvau¿ (ТК и СЭ) профилактическая вакцинация беременных пр&ктически не влкялана. эффективность иммунологического выявления стафилококковой этиология мастита, как при" определении сн~ тител, так к при определении АСЛ (рас:3). Применение ЭД из СА практически не позволяло дифференцировать иммунный ответ, развивающийся в результате стафилококкового инфекционного процесса или вакцинации СА. Следовательно, яри анализе.результатов имуунодиаг-ностического обследования больных.ГВСЗ необходимо знать их вакцинальный анамнез. Правильный выбор используемых иммунореагентов с учетом антигенных особенностей вакцины может помочь дифференцировать иммунный ответ на антигены возбудителя инфекционного процесса и на антигены вакцины.
а - здоровые родильницы
Х//А * больные маститом
Рис. I. Влияние вакцинации стафилококковым анатоксином
нет эффективность иммунодиагностики аилмм инфекции
Полученные данные об этиологической структуре различных нозологических форм ГВСЗ, в основном, совпадают с имеющимися в литературе данными о результатах бактериологического обследования тех же групп больных. У обследованных больных с острыми ГВСЗ преобладала стафилококковая моноинфекция, удельньтП вес которой зависел от нозологической.формы ГбСЗ. Наиболее ярким примером острого моноинфекционного процесса при ГВСЗ являлся лактационный мастит, причиной которого, по данным иммунологического обследования, в 90100% случаев являлся S. СШАЛШ> . Частость выявления синегнойной и протейной инфекций при острых ГВСЗ была невелика и составляла в зависимости от нозологической формы от 0 до 16$. Очень редко, л» у 4% обследованных больных с острыми процессами, обнаружены ассоциированные формы инфекции. В то же время проведенное нами иммуно-диагностическсе обследование выявило значительно более высокий (31,3-60,9%) в сравнении с имеющимися данными бактериологического исследования (15-2^5)(Я.Х.Джалашев к В.И.Кочзровец,.1993; А.И.Косине ц и др.,1988; И.И.Колкер к Ж.Ш.Жумадилов, 1908 и др.)удельный вес стафилококковой инфекции у больных с острыми гнойно-воспалительными заболеваниями брюшной полости (острый перитониту острый холецистит, острый аппендицит). Нам не известны работы, в которых была бы документирована стафилококковая этиология острого панкреатита. Наши данные, однако, позволяют отметить, что почти у каждого пятого больного с таким заболеванием (18,955) выявлена стафилококковая инфекция уже на дооперационном этапе. По данным наоего иммунологического обследования этиологическая роль стафилококков, протеев и синегнойной палочки выявлена у 865? больных с хроническими ГВСЗ, причем у больных обнаружен иммунный ответ одновременно на антигены двух или трех изучаемых видов микроорганизмов, что подтверждав? данные о существенном увеличении роли ассоциаций микроорганизмов при хронизации гнойно-воспалительных процессов. Наряду с сохранением значительной роли стафилококковой инфекции у больных хроническими ГВСЗ существенное.по сравнению с острыми • ГВСЗ, место в этиологии занимала так называема;; вторичная микрофлора (протеи и, особенно,Н-ШАЩих^^) * Al. аш^л^й являлась ведущим возбудителем моноинфекционнкх процессов при хронических ГВСЗ, что, вероятно, обусловлено выраженным антагонистическим действием этого возбудителя На другие микроорганизмы, особенно на стафилококки ( ЛлсЬаа е1л£,,1991). Учет и анализ различных показателей иммунного ответа (антитела и АСЛ) на стафилококковые
и псевдомонадныз антигены при динамическом обследовании больных хроническими ГВСЗ показал, что у значительной части больных сине-гнойная инфекция, как уже говорилось выше, носит острый характер и развивается на фоне существующего хронического гнойно-воспалительного процесса стафилококковой этиологии. Таким образом, использование иммунологических методов обследования больных ГВСЗ не только позволяет улучшить расшифровку этиологической структура этих заболеваний, но и позволяет более точно охарактеризовать остроту и динамику инфекционного процесса у больных.
Приведенные вше результаты исследований показывают, что тактика и объем иммунодиагностического обследования больных в значительной мере определяются целью обследования и особенностями обследуемых групп больных.
Для установления этиологии гноРно-воспалительного процесса у больных ТВСЗ, Поступивших в стационар, целесообразно проводить определение общей активности антител в РПГА и содержания в периферической крови АСЛ в РНРО. У больных с урологическими ГВСЗ можно проводить индикацию антигенов в моче при помощи РПГА с антительными ЭД или РНАт, а у больных хроническим тонзиллитом - определение АСЛ а небных миндалинах. При получении положительного результата хотя бы по одному из этих показателей дальнейшее обследование можно не проводить, а подученный-результат использовать-для обоснования специфического.этиотропного лечения больных. При отрицательных результатах всех анализов через 7-10 .дней проводят повторное определение активности сывороточных антител и содержания АСЛ.
Алгоритм или Последовательность выполнения м учета результатов применяемых реакций при данной схема обследования определяется необходимостью ¡возможно более раннего получения положительного результата, хотя бы по одному из изучаемых показателей: з день забора материала производят постановку и учет результатов РПГА (через 1,5- 2 часа) для определения активное?« сывороточных антител, которую оценивают по УДТ; выделение лимфоцитов, постановку РНРО и приготовление мазков; истощение проб дачи (при выявлений УДГ антител выполиенве других тестов можно не продолжать, при отрицательных результатах определения УДТ продолжают проведение других тестов); на следующий день фиксируют и красят приготовленные накануне мазки, учитывают и оценивают результаты РНРО; проводят определение антигенов в моче. В случае необходимости все исследования второго дня можно проводить и в день'забора материала, при
этом истощение исследуемых проб мочи проводится в течение Г часа при 37°С.
Ассортимент видовой специфичности используемых якмунореагентов для данной тактической схемы определяется особенностями этиологической структуры ГВСЗ у обследуемых групп больных. При тех нозологических формах ГВСЗ, где протеи и синегнойнал палочка практически не играют роли в возникновении гнойно-воспалительных процессов, например при остром лактационном мастите, остром холецистите, острых гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей, применение нммунорсагентов протейной и псеэдомонадной специфичности не обязательно. .
Проведение иммунодиагностического обследования больных ГВСЗ. в динамике заболевания (не менее 2-х раз с интервалом 7-10 дней) с определением общей и -резистентной активности антител, определением содержания АСЛ с учетом их субпопуляционной принадлежности и использованием эритроцитарных иммунореагентов различной видовой специфичности позволяет не только диагностировать этиологию ГВСЗ, но и уточнять остроту инфекционного процесса, диагностировать смену возбудителя или присоединение вторичной микрофлоры, а также определять последовательность возникновения ассоциированных форм инфекции.
Последовательность выполнения и учета результатов применяемых реакций при данной тактической схеме практического значения не имеет, так как результаты иммунологического обследования оцениваются после получения всех изучаемых показателей.
Таким образом, в результате проведенных исследований удалось разработать высокоэффективные эритроцитарные иммунореагенты стафилококковой, псевдомойадной и протейной специфичности для определения активности антител, содержания АСЛ и индикации антигенов и усовершенствовать методы их применения. Применение разработанных иммунореагентов и методов для обследования больных различными формами ГВСЗ позволило разработать рациональные подходы и этиологической иммунологической диагностики ГВСЗ, показать их высокую эффективность и расширить сферу применения иммунодиагносткчвских-методов при обследований больных ГВСЗ, что.привело к улучшению расшифровки этиологической структуры ГВСЗ.
- 35 -
ВЦ В О Д ц
1. Разработаны» в том числе с использованием новых способов получения иммунореагентов, стабильные высокоэффективные оригинальные стафилококковые,, псевдомонвдные и протейные зритроцитарныа ди-агностикукы для определения активности антител и, впервые с использованием эритроцитов кур - для выявления АСЛ. Показана необходимость индивидуального для каждого сенситкна подбора условий получения стафилококковых, протейных и псевдомонадных эритроцитар-ных реагентов.
2. При обследовании больных ГБСЗ и экспериментальные зараженных животных показано, что динамика активности антител не зависит. от вида возбудителя, способа заражения и этиологии предшествующего инфекционного процесса, ко определяется особенностями различных антигенов одних и тех же. бактерий.
3. Повышена эффективность диагностики по выявлению АСЛ ка основе совершенствования условий постановки, учзта и оценки результатов РНРО.
Л. Экспериментально доказано, что динамика выявления АСЛ неодинаков?, для ГВСЗ различной этиологии и не зависит от.способа заражения. При любой нозологической форме и этиологии ГВСЗ у больных и у зараженных животных АСД выявляются и исчезают раньше сывороточных антител. Определение АСД является методом ранней ди-' агностики ГВСЗ. |
5. Впервые выявлены различия динамики АСЛ в периферической крови и лнмфоидных| органах у морских свинок с экспериментальной стафилококковой инфекцией и больных хроническим тонзиллитом. Частость выявления и содержание АСЛ в ближайших к очагу поражения скоплениях лимфовдноп ткани больше, чем в периферической крови.
6. Разработан оригинальный способ определения субпопуляцион-иой принадлежности АСЛ. АСЛ в крови и лимфовдных органах больных ГВСЗ относились н Т,. В и 0 популяциям лимфоцитов. Соотнооениэ различных популяций АСЛ изменяется в динамике иммунного ответа у больных острыми ГВСЗ и вакиинированных людей, но не зависят от места выделения лимфоцитов.
?. Повышение эффективности диагностики ГВСЗ (в том числе дифференциации -ответа на возбудитель ГВСЗ и вакцину, а также уменьшение трудовых затрат) обеспечивается использованием оптимальных иммунореагентов или их сочетаний, выбранных на основе выявленных особенностей ответа на различные антигены одного возбу-
дителя.
8. Показана высокая эффективность иммунологического выявления у больных ГВСЗ не только moho-, но и ассоциированных форм стафилококковой, протейной и синегнойной инфекций. Комплексное ии-мунодиагностическое обследование позволило доказать, что у части больных хроническими ГВСЗ протейная и синегнойная инфекции имеют не хронический, а острый характер.
9. Разработка нозых иммунореагентов и обоснование способов их применения обеспечила улучшение диагностики этиологии и остроты ыоно- и смешанных стафилококковых, псовдомонадных и протейных процессов у больных ГВСЗ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ Р£КОиЕНДАЩИ
1. Для установления этиологии ГВСЗ у больных целесообразно проводить определение активности антител при помощи РИГА и содержания АСЛ при помощи РНРО. У больных с урологическими ГВСЗ ыохно рекомендовать определение антигенов возбудителя в моча. Предпочтительным метода»« иммунодиагностики у больных острыми ГВСЗ является определение АСЛ.
2. Для уточнения остроты инфекционного процесса и сьоваремек-ной диагностики присоединения вторичной микрофлоры рекомендуется проводить комплексное обследование (с определением общей я SH-резистентной активности антител, содержания АСЯс учетом их популя-ционной принадлежности) в динамике (не менее 2 раз).
3. Дяя обеспечения наибольшей эффективности иммунодиагностики по активности антител, особенно при острых ГВСЗ, рекомендуется двухкратное обследование больных (при поступлении к повторно через V - 10 дней), а по АСЛ - однократное обследование больного, но обязательно в первые (1-4) дни поступления в стационар,
4. При определении ассортимента используем« реагентов необходимо учитывать структуру ГВСЗ у обследуемых групп болышх и их вакцинальный анамнез. При остром лактационном ?«астите, острых гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей, остром холецистите обязательным является использование иммунореагентов стафилококковой и на обязательным протейной и псевдомо^адной специфичности. У больных хроническими ГВСЗ обследование должно проводиться с использованием как стафилококковых, так и псевдомонаднкх и протейных ЭД. \
5. При выявлении АСЛ в РНРО рекомендуется режим "спонтанного"
— 37 -
розеткообразования при концентрации лимфоцитов 2x10 клеток/мл и
0.255.взвеси эритроцитарного диагностикука. Для эффективной индивидуальной оценки результатов РНРО необходимо использовать контрольный реагент - несенсибилизированные ФАЭК; просчитывать а каждом фиксированном и окрашенном мазке порознь по 7 сотен лимфоцитов. Положительный результатом выявления АСЛ является достоверное превышение числа розеткообразущих лимфоцитов с опытным по сравнению с контрольный ЭД.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. Каральник Б.В. ,И1ыутер М.Ф..Нуркина И.М.,Дерябин П.Й. и др.-Дциный.стабилизатор для эритроцитарных диагностикумов //Лаб.дело, 1985, » 3, с.163-166;
2. Дерябин П.К..Каральник Б.В. .Пальгов К.А. и др.- Серологическая диагностика стафилококковой этиологии гнойно-септических заболеваний у хирургических больных //Сборник тезисов, докладов и сообщений 31 Всесоюзного съезда хирургов. Ташкент,1986, с.96-97;
3. Каральник Б.Б.,Нуркина Н.М.,Дерябин П.Н. - Выявление смешанных инфекций при помощи эритроцитарных иммунораагентов //В кн."Смешанные инфекции", М. ,1986, с.40-42;
4. Дерябин П.Н.,Каральник Б.В. .Ванеева Н.П. и др.- Серологическая диагностика гнойнс-септических заболеваний стафилококковой этио- ■ логии//Н. микробуол., 1987, »7, с.38-41;
5. Каральник Б.В. тодологическне и с
Кузькин D.A..Дерябин П.Н. и др.- Некоторые ме-рганиэационные вопросы массовых иммунологических обследований И/ В кн."Методология, организация и итоги.массовых иммунологичес! их обследований". Тез. докл. Всес.конф., Москва-Ангарск, 1987, с.Е2-53;
6. Гусманов С.З. ,1ой И.Г. .Дерябин П.Н - Характер микробной сенсибилизации по даннь(м кожных тестов при остром холецистите, осложнено» перитонитом ]//Б кн. "Перитонит", Караганда,1987, c.I37-Ï42;
7. Дерябин П.Н.,Каральник Б.В..Акатов А.К. « Серологическая диагностика стафилококковых инфекций //И.микробиол..1988, » I. с. 94-102;
8. Дерябин П.Н. .Каральник Б.В, .Ванеева Н.П. - Особенности серологической диагностики некоторых форм стафилококковых гнойно-аоспа-лительных заболеваний // В кн. "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционкой клинике", 4.1, М.,1988, с.44-45;
- 38 - _
9. Прасолова Л.А.,Карельник Б.В.,Дерябин П.Н. и др.- О возможности определения ангигенсвязывагацих лимфоцитов для выявления этиологии острых гнойно-воспалительных заболеваний // Там же, с.45-46;
10. Егизова С.А.,Александрова И.А..Дерябин П.Н. и др.- Использование эритроцитарных иммунореагентов для диагностики синегнойной инфекции // Там же, с.80-82;
11. Китарова Г.К..Дерябин П.Н.,Александрова И.А. и др.- Тохсигек-ность штаммов синегнойной палочки, ввделенных в хирургических стационарах // Там же, 4.2, с.182-184;
12.Дерябин П.Н..Каральник Б.Б..Пальгов К.А. и др.- Серологическая, диагностика стафилококковой этиологии остеомиелитов // Хирургия, 1968, » 8, с.39-42;
13. Дерябин П.Н. ,Каральних Б.В. - 0 специфичности стафилококковых эритроцитарных диагностикумов в связи с присутствием белка А в препаратах сенситинов./Д. микробиол. ,1988, № II, с.85-89;
14.£гйзова С.А..Дерябин П. Н..Каральник Б.В. и др.- Получение зри-троцитарного диагностикума из экзотоксина А Р. //Там же, 1988, № 12, с.38-41; .
15. Каральник Б.В. Деплухин Ю,В.,Дерябин П.Н. и др.- Способ получения эритроцитарного диагнсстикуыа // АС СССР № 1420703 (ДСП);
16. Каральник Б.В. Деплухин Ю.В..Дерябин П.Н. - Способ определения изотипа антител //АС СССР № 1516981 (ДСП);
17. Дерябин П.Н.,Ванеева Н.П.,Ковалева М.А и др.- Сравнение эффективности различных серологических методов диагностики стафилококковой инфекции //В кн."Вопросы клинической иммунологии и иммунологической диагностики", Алма-Ата,1988, с.21-24;
18. Дерябин П.Н. .Александрова И.А. .Каральник Б.В, и др.- Зритро-цитарныа диагностикума для выявления экзотоксина А Р. // К.микробиол.,1989, № 2, с.32-36;
19. Айтбаева Я.Т,»Дерябин П.Н.,Каральник Б.В. и др.- Эритроцитар-ные диагностикумы для определения антител к О-антигенаы протеев// Там же, 1989, Р 5, с. 16-20;
20. Дерябин П.Н. .Каральник Б.В. .Егизопа С.А., идр.- Иммунодиагностика гнойно-воспалительных и септических заболеваний // Материалы ХУШ съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, Москва-Алма-Ата, 1989, с.43-45;
21. Дерябин П.Н. .Прасолова Л.А. .Айтбаева К.Т, и др.- Определенна антигенсвязыващих лимфоцитов и сывороточных антител у больных остеомиелитом //В кн."Иммунный гомеостаз в норне и патологии",
- 39 -Фрунзе, 1989, с.27-28;
22. Дерябин П.Н. .Прасолова Л.А..Айтбаеаа Ж.Т. и др.- Динамика иммунного ответа у экспернмешгалькохзараяенныя животных //В кк. "Аллергология и клиническая иммунология", Алма-Ата, 1989, с.104-107:
23. Прасолова Л.А..Егизова С.А. .Дерябин П.Н. и др.- Эффективность выявления антигенсвязывающих лимфоцитов и антител для диагностики синегнойной инфекции //Там же, с.ИО-114;
24. Дерябин П.Н..Прасолова Л.А..Айтбаева Ж.Т. и др.- Антигенсзя-зывшмцие лимфоциты при гяойно-сгптических заболеваниях //Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Тезисы докладов, т.Х)„М.,IS890 с.212; .
25. Дерябин П.Н.»Каральник Б.В.,Мороз А.Ф. и др.- Серологические методы.выявления этиологии гнойно-септических заболеваний //Методические рекомендации, Алма-Ата, 1988, 26 с.;
26.'Дерябин П.Н..Каральник Б.В.„Прасолова Л.А. - Эритроцитарные иммунореагенты для выявления стафилококковой этиологии гнойно-септических заболевания //Тезисы Всесоюзной конференции по сепсису, Тбилиси, 1990;
27. Дерябин П.Н.,Айтбаева К.Т..Каральник Б.В. и др. - Динамика иммунного ответа у урологических больных, иммунизированных протейной вакциной //Материалы Ш Всесоюзного съезда урологов, II. ,1990, с 282-283; | -
28. Айтбаева В.Т.»Дарябин П.Н. .Каральник Б.В. и др.- Иммунодиагностика протейной Инфекции у урологически« больных при помощя арн-троцитарных реагентов // Там »в, с.300-301;
29. Егизова С.А..Дёрябин П.Н. .Каральник Б.В.. и др.- Диагностическая эффективность рр^ реагентов из различных антигенов синегнойной пвлочкц//14|«|сробиол^, 1990, В II, с.30-33;
30. Каральник В. В.^Дврябкн П.Н. .Прасолова Л.А. м др.- Способ получения имыукореагеита для выявления антигенсвязыващнх лимфоцитов
а реакции роэеткосбразования // АС СССР 9 1634284, Бэл.изобр., хт, 9 10;
31. Дерябин Л,Н..Каральник Б.В..Турубарова А.В. и др.- Определение антигенсвязывающих лимфоцитов и их популяционной принадлежности у болышя со стафилококковой инфекцией //Материалы У Объединенного съезда гигиенистов. эпидемиологов, микробиологов, паразитологов ¡» инфекционистов Казахстана. Т.У1. Иммунодиагностика, Алма-Ата, J99I, с.25-26;
32. Айтбаева й.Т. .Дерябин П.Н..Каральник Б.В. к др.- Диагностика
протейной инфекции.у урологических больных по индикации антигенов в моче // Там ке, с.3-4;
33. Дерябин П.Н.,Каральник Б. В.,Прасолова Л.А. я др.- Стабильны^ эритроцитарные реагенты для выявления антигенсвязывающих лимфоцитов //Лаб.дело, 1991, № 5, с.47-50;*
34. Дерябин П.Н..Каральник Б.В.,Айтбаева S.T. и др.- Мммуйодиаг-ностика гнойно-воспалительных и септических заболеваний //Информ Листок КазНИИНТЙ, Алма-Ата, Î930, 5с.;,
35. Каральник Б.В..Дерябин П.Н..Прасолова Л.А. и др.- Способ определения антигенсвяэывагащих лимфоцитов //Положительное решение ВНИИШ по заявке » 4874655/14/102793 от 27.09.91 г., приоритет от 16.10.90г.
36. Дегтева Г.К.,Дерябин П.Н.»Беляева Е.В. и др.- Получение эрит-роцитарного диагностикума на основе стафилококковой протеиназн// Лаб.дело, 1991, Я II, с.69-73.