Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Диагностика протейных гнойно-септических заболеваний при помощи эритроцитарных иммунореагентов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КАЗАХСКОЙ ССР

НАУТО-ИССЖДОВАТтСКИЯ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ, МИКРОБИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

На правах рукописи УДК 616,94:579.842.22/-078.73

АЙТЕАЕВА ЖАННАТ ШЕУГАЛИЕВНА

ДИАГНОСТИКА ПРОТЕЙНЫХ ГГОЙНО-СШИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИ ПОМОЩИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ИММУНОРЕАГЕНТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученоП степени кандидата медицинских наук

А 1т- Ата - 1991

Рабата выполнена э Научно-исследовательской институте эпидемиологии, микробиологии и инфехгюннюс болезней Министерства здравоохранения Ка-ахстй ССР,

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор

Б.В.КАРАЛЬНЙК - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник П.Н.ДЕРЯБИН

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор

Г. С, СУХО ДОЕВА - доктор меди;мнских наук, профессор И.Л.КАСАТКИНА.

Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Защита диссертации состоится " ^ " ¿у Л? ¿сЯ- 1991 года в " часов на заседании специал, зированного совета К 079.05.01 в НИИ эпидемиологии, микробис :огии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Казахской ССР (460002, г.Алма-Ата, ул.Пастера, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Казахской ССР, г.Алма-Ата.

Автореферат разослан " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

Н.М.НУРКДОА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние годы в патология человека наблюдается значительный рост гнойно-воспалительных и септических заболеваний (ГВСЗ), вызванных бактериями рода Рго[1Ш (Тезисы докладов Всесоюзных научно-практическлх конференций "Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике", 1903; "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неин-^кционной клинике", 1988). Наиболее высок удельный вес протеев у больных с урологическими заболеваниями, осложненной травмой, ожоговой инфекцией и, особенно, при внутрибольнич-ных формах 1X3 (А.С.Змушко и др.. 1976; Е.Б.Брусина и др., Г.И.Сухомлинова и др., 1988; Р.Х.Яфаев и Л.П.Зуева,

1989).

Эффективность этиогрспнога лечения больных с протейной инфекцией, особенно при использовании иммунотерапии, во многом зависит от быстрого и тс-шого этиологического диагноза. Применяема сейчас бактериологические методы диагностики отличаются многоэтапностью и вслэдстеиз этого - зн!чительной продолжительностью. Кроме' того, в ряде случаев выделение возбудителя затруднено в связи с ранним применением антибактери-'альных препаратов и труднодосгупносгью очага воспаления. В связи с этим возрастает роль иммунологических методов установления этиологии заболевания.

Отсутствие в литературе сведений о выделении из Pгote■ui и активности антигенных компонентов родовой или видовой специфичности затрудняет иммунодиагностику протейной инфекции. При разработке иммунодиагностичееких препаратов обычно ее голь-эуют антггенкые препараты комплзкеной 0- и Н-слепифичности. В частности, показана высокая диагностическая эЗтЬективность выявления протейной этиологии у больных с раз лчными ГВСЗ при помощи реат-ции пассивной гемагглютинаиии (РИГА) с поливалентным эритроцитарным диагностИкумом (ЯД) из смеси "ультразвуковых" дезинтегратов итаммов протеев, обладающих III, Н2, НЗ и Н4 антигенами (С.И.Бидненко, 1?В5; Е.П.Бернасовская и др., 19<35; И.Г.Дунач И др., !ПВ5). Получение очищенных препаратов Н-антигенов - сравнительно сложней и .трудоемкий процосс. Поэтому представляет интерес применение для иммунодиагностики протейной инфекции О-антигвнов, так как для их выделения и очистки разработаны доступные и Иодорогостоящио методы, в час-

тности получение липополиеахарвдов (ЛПС) по катоду Вестфаля. Диагностическая эффективность РИГА с О-антигенныыи ЭД остается не изученной.

В последние годы показана возможность выявления антиген-связызающих лимфоцитов (АСЛ) при помощи реакции непрямого ро-зеткообразования (РРО) при различных инфекционных заболеваниях (А.и'-.Ахмедов, 1981; СЛ.Доскожаева, 1987; А.Ы.Мухатаева, 1908; А.Г.Беленький и др., 1989 и др.). Болькинство исследователей оценивают этот тест как метод ранней диагностики, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (Ш.С.Ус-манова, 1981; Й.Ю.Гариб и др., 1933; Мд.й.Чоудхури,' 1986; Н.Й.ГурариЯ и др., 1989; Л.Я.Османова и Н.Й.Гурарий, 1989; Л.А.Прасолова, 1990). При протейной инфекции возможность выявления АСЛ не изучалась.

Работами ряда исследователей показана высокая эффективность кндикаиии протейных антигенов при обследовании больных с протейной инфекпизП при помощи иммунсферментного анализа (Г.В.Булава и др., 1984; 1387;'Е.В.Мельницкая, 1935; 1986; Г.В.Булааа, 1985). Остается не изученной диагностическая эффективность индикации протейных антигенов у больных ГВСЗ, в том числе в моче урологических больнух, с использованием эритроцит арных реагентов.

Высокая резистентность протеев к большинству антибактериальных препаратов обусловила необходимость разработки и применения протейной вакцины для профилактики и лечения гнойно-воспалительных осложнений протейной этиологии {Л.С.Крзйнин и др., 1981; 1963; К.".Каверина и др., 1989). Показана ее высокая иммунологическая эффективность у доноров и больных с различными ГВСЗ. Иммунологическая эффективность изучалась только по активности 0-антител (Л.А.Левина и др., 1983; 1986; 1987; Л.К.Здановская, 198о; К.Г.Каверина, 1990). Поскольку данная вакцина, полученная при помощи солянокислого гидроксиламина, содержит как 0-, так и Н-антигены, при оценке ее иммунологической эффективности представлялось целесообразным применение ЭД из "гидроксиламинавых" антигенов (ГА).

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗЛДА^К ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось совершвнствоваиио методов иммунологической диагностики протейной инфекции и оценка иммунологической эффзк-

тибмости протейной вакцины у больных ГВСЗ.

Дэя достижения этой цели были определены следующие задачи:

- разработать ЭД для индикации протейных О-антигенов основных серогруня и определения содержания АСЛ и активности сывороточных антител к ним;

- разработать ЭД для определении содержания 'АСЛ и активности сывороточных антител к ГА прот а;

- изучить диагностические возможности разработанных ЭД при обследовании экспериментально зараженных и иммунизированных протейной, вакциной крол/ков;

- '.пучить возможность выявления протейной инфекиии у больных с различными ГВСЗ по определен;'.; оэ,держания АСЛ и активности сывороточных антител к О-ангигенам протеев и дать сравнительную оценку их диагностической эффективности;

-• изучить возможность выявления протейной инфекции у больных с урологичв'кими заболеваниями по индикации О-ангигеноя прогеез в моче и дать сравнительную оценку диагностической эффективности выявления протейной ин4екшш у урологических больных по регистрации иммунного ответа на О-аитигены протеев и йздикапли этих антигенов а моче;

- изучить иммунологическую эффективность протейной вакцины по определению содержания АСЛ и активности сывороточных антител у урологических больниц;

- изучить популянионную принадлежность АСЛ у иммунизированных протейной вакциной больных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИШСТЬ РАЮ1Ы. Впервые получены эритроцитарнье реагенты протейной специфичности для выявления АСЛ. На "Способ получения итуиорвагента для выля-ления антигенсвязыванщих лимфоцитов в реакции розеткообразо-бнния" получено положительное решение на изобретение по заявке № 4470627/30-13 (97157) от 10.07.89.

Разработаны оригинальные ЭД для определения активности сывороточных антител к О-антигенам и ГА протеев и индикации Q-ангигенов протеев в исследуемых пробах от больных. Показано, что 0- и Н-компсненты в ГА связаны между собой, а выра-желность Н-сп8цифич:рости ЭД иэ ГА зависела от метода сенсибилизации оритроцитов и штаммовых особенностей протеен, используемых для получения антигена.

При обследовании больных ГВСЗ, экспериментально заражен-

ных и вакцинированных кроликов пс,..азано, что АСЛ при протейной инфекции и при иммунизации протейной вакциной появляются раньше, чем отмечается достоверное нарастание титра сывороточных антител.

Показано, что ACJ] у иммунизированных протейной вакциной больных принадлежали к Т-, В- и О-поп.уляциям лимфоцитов. В динамик, при о б ар м возрастании содержания АСЛ, содержание В-АСЛ увеличивалось больше, чем содержание О-АСЛ и Т-АСЛ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Показано, что определение содержания АСЛ при помощи РРО и активности сывороточных антител при помощи РИГА с разработанными поли- и моновалентными О-антигеншми ЭД является надежным методом выявления протейной инteкпии у больных с различными ГВСЗ. Выявление АСЛ может быть рекомендовано для ранней диагностики протейной инфекции.

Показана возможность выявления протейной инфекции у урологических больных по индикации антигенов протеев в моче при помощи РПГА с О-антительными ЭД и реакции нейтрализации антител (РНАт) с антигенными ЭД из ЛПС протеев.

Определение содержания АСЛ и активности сывороточных антител при помощи разработанных ЭД позволило надежно оценить иммунологическую эффективность протейной вакцины и подтвердить обоснованность выбора штамма протеев для получения вакцины и применяемой cxevu профилактической вакцинации,

АПРОБАЦИЯ PABOÏU. Отдельные фрагменты доложены: на конференции молодых ученых КазНШИ (Алма-Ата, 1988), заседании Республиканского общества иммунологов и аллергологов (Алма-Ата, 1988), научной конференции молодых .ученых КирГШ (Фрунзе, ~9Ü9), расширенном заседании к&йедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирург;:и АГШ (Алма-Ата) 1.990), Диссертация апробирована на заседании отдела инфекционной иммунологии и аллергологии НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ КаэССР (Алма-Ата, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. Но теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе I методические рекомендации.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД. Все разделы работы автором выполнены самостоятельно.

НА ЗАЩУ МЮСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ГОЛОЙЕНИЯ:

I. При получении ЭД из ЛПС протеев целесообразно использовать нагрузку эритроцитов без посредников, а из ГА протеев -

при помощи амидола,

2.Определение содержания АСЛ при помощи РРО и активности сывороточных антител при помощи РПГА о разработанными 0-< генными ЭД является надежным методом выявления протейной инфекции у больных ГВСЗ.

3. Индикация антигенов протеев в моче при помощи РПГА с разработанными О-антительными ЭД и РНАт с О-антиГенными ЭД является эффективным методом выявления протейной инфекции у .урологических больных.

4. Выязленние АСЛ и достоверное нарастание активности сывороточных антител при помощи разработанных ЭД у больных, иммунизированных протейной вакциной, подтвердили высокую иммунологическую эффективность протейной вакцины и у урологических больных.

5. По данным реакции смешанного розеткообразования АЛ у иммунизированных протейной вакциной больных относились к Т-, В- и О-популяииям лимфоцитов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАН)ТЫ. Разработанные методы внедрены в работу 4 стационаров г.Алма-Аты, на 3 кафедрах АГШ. Изданы методические рекомендации "Серологические методы выявления этиологии гнойно-септических заболеваний", Алма-Ата, 1988. Получено 8 актов внедрения.

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация включает введение, обзор литературы, главу ''Материалы и методы", шесть глав собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы. Работа Содержит страниц текста, 37 таблиц, 24 рисунка. В указателе литературы приведено 175 отечественных и зарубежных источников.

Выполненная работа является фрагментом НИР "Разработать новые методы диагностики стафилококковой, протейной и псевдо-монадной инфекции у человека с использованием антигексвязываю-щих лимфоцитов. Оформить техническую документацию на диагностические препараты", № Государственной регистрации 01870006034 и "Эпидемиология, диагностика, профилактика бактериальных инфекций (кишечных, стафилокоКкоЁЫхЬ Диагностика бакФериальных (затяжная, хроническая дизентерия, салмонеллез, цитробактер инфекция, гнойно-воспалительные И сеггчческие, дифтерия) и паразитарных заболеваний при помощй сенсибилизированных эритроцитов", № Государственной регистрации 01860086075.

- б -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД*. В работа попользовали штаммы й Р—117 (серовар 03Н2), Р-771 (026Н2), Г-73 (ОЮНЗ), Г-210 (013Н4), Г-1Й2 (023Н1), Г-458 (026НЗ), Г-384 (ОЗОН1), Г-485 (016Н14); активированные щелочью и неактивированные ЛИС, полученные из аштошзысушенной микробной маосы перечисленных штампов по методу Вестфаля (Е,А.Петросян, 1961); ГА, полученные обработкой микробных клеток перечисленных штаммов солянокислым гидроксиламином (Н.И.Синяшин и др., 1970); сухую протейную вакцину; кроличьи иммунные сыворотки против ГА (производства ЦНИИЕС им.И.И.Мечникова, г.Москва); кроличьи иммунные неадсор-бирэваннке 0-сыворотки и коммерческие протейные агглютинируюсь адсорбирование 0-' и Н-сыворотки (предприятия ПО производству бакпрепаратоа "Антиген", г.Москва); фиксированные ацет-альдегидом эритроциты барана (Б.В.Каральник и А.Ц.Лещинекая, 1981) и кур (ФАЭК); формалинизированные по Я. (1959)

эритроциты барана (ФЭВ) и кур (ФЭК).

Суммарный иммуноглобулин из иммунных сывороток выделяли при помощи метанола (В.А.Шамардуч и Б.В.Каральник, 1961).

Сенсибилизацию ФЭБ (для РЛГА) и ФАЭК (для РРО) ДПС проводили без коньюгирующих агентов по модифицированному методу М.И. Соколова-А.Т.Кравченко (В.В.КаральНик, 1976), а ГА - при помощи амидола (Ю.А.Кузьмин й др.', 1981). Антительные ЭД • .лучали путем сенсибилизации ФЭК иммуноглобулиновыми препаратами при помощи амидола.

Заражение кроликов проводили путем енутрикостного и внутри-мшечного введения клеток, протеев штаммов Лп/'га&'&Л Г-771 (серовар 026Н2), Р-73 (ОЮНЗ), Р-485 (016Н6). Вакцинацию людей 1.роьодили в соответствии с инструкцией.

Вьщеление лимфоцитов из периферической крови проводили по методу А.&оуат (1968). Содержание АСЛ определяли при помощи РРО с антигенными ЭД. В качестве контрольного диагностик,ума использовали несенсибилиэированные ФАЗК. Популяционную принадлежность АСЛ определяли в реакции смешанного розеткоОбраЭова-ния с использованием фиксированных аиетальдегидом эритроцитов барана, сенсибилизированного комплементом зимозана и сенсибилизированных ГА 016Н6 ФАЭК. Активность сывороточных антител определяли при помощи РИГА с антигенными ЭД. Для определения ^-резистентной активности антител сыворотки обрабатывали 0,1 М раствором 2-мерхаптоэТанола (2-МЭ) (/И/. Ье.и1сЬ,

1958), Индикацию антигенов в моче проводили при помощи РПГА с антительнкми ЭД и РНАт с антигенными ЭД.

PIFA, РНАт, реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТЛГА), реакцию нейтрализации антигенов (РНАг) выполняли по обычной методике, микрсметодом.

Обследовано 100 практически здоровых взрослых доноров, 177 больных с различными ГВСЗ (.урологические заболевания, обос-трьние хронического остеомиелита, острый холецистит, острый лактационный мастит), 24 иммунизированных протейной вакциной больных с аденомой предстательной железы. Диагностическую эффективность иммунологических методов оценивали по двум показателям: частоте положительных результатов у больных с бактериологически подтвержденной протейной инфекцией (характеризует чувствительность метода) и частоте положительных результатов у больных, от которых вьделены Другие микроорганизмы (характеризует специфичность метода).

При выборе оптимальных методов получения ЭД проведено 1136 опытов гемосенсибилизаций. Всего проведено иммунологических реакций (без учета предварительных опытов): РРО - 4409, смешанного розоткообразования - 420, РПГА - II386, РТПГА - 100, •РНАт - 888, РНАг - 168.

При с.агистической-обработке использовали следующие методы: сравнение серий по способам связанных и несвязанных выборок с вычислением критериев достоверности {t или d ); корреляционный и регрессионный анализ}сравнение двух кривых; двухфак-торный дисперсионный анализ; частотный анализ; опр" эление доверительных интервалов (В.Ю.Урбах, 1975).

СОДЕРЖАНИЕ РАШШ Получение и характеристика ЭД из ЛПС протееЕ При получении О-антигенных ЭД использовали ЛПС 7 наиболее распространенных серо групп протс (03, 010, 013, 023, 026, 028, 030). В качестве основы при получении ЭД для определения активности сывороточных антител при помощи РПГА использовала ФЭБ, а для выявления ACJI при помощи РРО - ФАЭК, которые, как было показано предварительными исследованиями, практически но давт спонтанного розеткооОразования с лимфоцитами человека и могут эффективно сенсибилизироваться различными антигенами с использованием оптимального для применяемого антигена способа нг.гр,. i-

- е -

1700 ^ Обратный

ти'г

РШ

При помощи танина Без посредников

4&°С-90 мин 100°С-30 мин 4о°С-1 час Ю0°С -30 мин

Г I - активированный УаОИ ЛПС

®Ц- неактивированный ЛПС

РисЛ. Эффективность О-антигенных ЗД, приготовленных различными способами ки эритроцитов. Испытали различные температурные режимы сенсибилизации таниэированных и нетаниэированных ФЭБ активирован-ними М)0Н и неактиЕИрованными ЛПС (рисЛ). Активация щелочью ЛПС приводила к снижению их оптимальной сенсибилизирующей дозы (ОСД) в 4-32 раза. Ни повышенна температуры с 4э°С до Ю0°С в процессе сенсибилизации ни танизаиия эритроцитов не повышали чувствительности ЭД и не снижали расход сенситина. Поэтому при получении О-антигенных ЭД использовали сенсибилизацию ФЭБ и 1'АЭК активированными щелочью ЛПС без посредников при 4Ь°С. Получены по I поливалентному и по 7 моновалентных ЭД. Для при готовления поливалентных ЭД эритроциты нагружали раствором, содержащим все 7 ЛПС в концентрациях в 2 раза меньших, чем ОС

каждого из этих антигенов. Групповая специфичность моновалент-нкх ЭД подтверждена результатами перекрестной РПГА с агглютинирующими адсорбированными 0-екБорот:'ами и РНАт. Обратный титр ШГА с гомологичной сывороткой был е 25,6-177,4 раза больше, чем с готерологичнкми. В РНАт минимальная нейтрализующая доза гомологичных ЛИС была в 32,1-246,5 раза ниже соответствующей дозы гетерологичных ЛПС. Поливалентные ЭД не уступали по чувствительности моновалентным. Полученные ЗД были стабильными при хранении в жидком виде с азидом натрия в течение 1,5 лет (срок наблюдения).

Экспериментальное обоснование диагностической зф<^зктивнсс-ти выявления АСД и определения активности антител Дополнительно эффективность О-аятигенных ЭД изучали при обследовании 6 кроликов, зараженных путем внутрикостного или внутримышечного введения клеток протеев различных штаммов.

При использовании гомологичных ЭД у всех зараженных ж постных выяглены АСЛ и значительное нарастание (в 5,7-16 раз) общей и »^'-резистентной активности антител. АСЛ регистрировались через 1-3 дня после заражения, а достоверное нарастание .активности антител - через 7 дней. Гомологичные АСЛ выявлялись до 1'-21 дня после заражения. Титры общей и .^-резистентной активности антител к гомологичным антигенам на 28 дань практически не отличались от таковых до заражения. Не выявлено влияния способа введения микробных клогок на динамику АСЛ и активности сывороточных антител. При использовании гетерологичных ЭД АСЛ не выявлены ни у одного из зараженных кроликов. Как общая, так и Д'-резистентная активность антител к гетерологичным антигенам не изменялась.'

Таким образом, разработаны стабильные, чувствительные и специфичные протейный О-антигенине ЭД для выявления АСЛ при помощи РРО и определения активности сывороточных антител дри помощи РПГ'А. Обследование экспериментально зараженных животных подтвердило высокую чувствительность и специфичность ЭД, обосновало возможность их применения для обследования больных.

Диагностика протейной инфекции у больных по показателям иммунного отаета

При помощи РГО и РПГА с О-антигенными.ЗД обследовали 177

-10 - , больных с различными ГВСЗ, Выявлена высокая степень соответствия результатов бактериологического и иммунологического обследования больных. Но протейная инфекция иммунологически была установлена чаще (у 28,&+3,6<ъ больных), чем бактериологически (у 21,1+3,больных). Положительные рззультаты РРО с набором монаваленгиых ЭД получены у 91,2+4,9^ больных с бак-териолг-*ически подтвержденной протейной инфекцией и лишь - у 17,4+2,6® больных, ст которых ввделены другие микроорганизмы; а с поливалентным ЭД ~ у 82,4+6,5$ и 4,8+2,1% больных соответственна (рис.2). Положительные результаты И1ГА с поливалентным и набором моновалентных ЭД получены соответственно у 91,2+ 4,9% и 97,1+2,9$ больных с бактериологически подтвержденной протейной инфекцией и..соответственно лишь - у 5,8+2,3^ и 7,7+ 2,6л больных, от которых выледенк другие микроорганизмы (рис. 3). Незначительное число положительных результатов РРО и РПГА у больных, от которых ввделены другие микроорганизмы, по-ввди-мому, связано с наличием перекрестнореагирумцих антигенов у протеев и других кикрооргг-яизлов, или сменой возбудителя, или микст-инфекцией, не выявленной бактериологически. Обнаружена высокая степень соответствия результатов выявления АСЛ и определения активности сывороточных антител. Выявлена высокая степень соответствия результатов как РРО, так и РПГА с набором моновалентных ЭД и поливалентным ЭД, что обосновала возможность применения поливалентных ЭД для сокращения объема проводимых исследований в 4-7 раз практически без снижения диагностической эффективности методов.

При использовании набора моновзлентных ЭД положительные результаты РРО и РИГА с двумя и более ЭД получены у 71,1+6,Щ й 64,0+6,8$ больных. Это, го-видимому, обусловлено наличием перекрестных реакций между ЛПС протеев.

Обработка сывороток 2-МЭ существенно снижала диагностическую эффективность РПГА.

При оценке результатов РПГА использовали два критерия: определение условно-диагностического титра (УДТ) и нарастание активности антител и динамике заболевания. У больных, обследованных двухкратно, УДТ выявлен достоверно (Р<0,05) чаще, чем нарастанне активности антител. Это, по-видимому, связано с тем, что у большинства обследованных больных гнойно-воспалительный

30

Г*1

рц

к и к 0) ■е* >е< сз

с мсновалентными ЭД

с поливалентным . ЭД

} ] - у больнь"' с бакподтвержденнсй протейной инфекцией - у больных, от которых выделены другие микроорганизмы Рис. 2. Эффективность выявления протейной инфекции по выявлению АСЛ к О-энтигенам протеев

70 60 50 '(О 30 20 10

ю ж н к о •е<

сЬ

Г+

с моноьалзнтными ЭД

с поливалентным ЗД

и

Рис

- у больных с бакнодтгертденной, прс: зйной инфекцией

- у больных, ог которых выделены другие микроор-анизмы . 3. Эффективность виявления протейной инфекции по

определении активности сывороточных антител к О-аптпгеиом протес?

в 1-3 дни на 7-Ю дни в 1-3 дни и

на 7-10 дни

I I - РРО ШШ- РПГА

Рис.4. Эффективность выявления протейной этиологии ГВСЗ в зависимости от сроков и кратности обследования больных

процесс носил хронический характер. Одновременное Применение двух критериев оценки результатов РПГА достоверно (Р<0,05) по вышало эффективность серодиагностики.

Представляло интерес сравнить эффективность выявления про тейной этиологии ГВСЗ по определению содержания АСЛ и актив-носа и сывороточных антител с учетом сроков и кратности обследования больных (рис. 4). Частость положительных.результатов РРО при первом обследовании (в 1-3 дни посла поступления боль Ного в стационар) была больше, чем частость положительных результатов РПГА. При повторном обследовании (на 7-10 дни), нас борот, положительные результаты РПГА получены чаще, чем РРО. Двухкратное ойследование больных Достоверно (Р<0,0о) повышалс частость положительных результатов РПГА и практически не влш ло на частость положительных результатов рро» Следовательно, учетом данных» Полученных в эксперименте с зараженными животными, необходимо отметить, что выявление АСЛ может быть "с-полЬзовако для ранней диагностики протейной инфекции. Для эффективного выявления протейной этиологии ГВСЗ по определению

Обострение хроничес- Урологические кого остеомиелита заболевания

I I - у всех обследованных больных

ШШ - у больных с баилодтверзденной протейной инфекцией

Рис. 6. Эффективность выявления протейной этиологии в зависимости от локализации ГВСЗ

активности сывороточных антител желательно двухкратное обследование больных в динамике.

Эффе: тивность выявления протейной инфекции по определению содержания АСЛ и активности сывороточных антител практически не зависела от локализации ГБСЗ (рис.5).

Таким образом, выявление АСЛ при помощи РРО и определение активности сывороточных антител при помощи РЛГА с разработанными О-антигенными ЭД являются эффективными методами диагностики протейной инфекции у больных ГВСЗ.

Получение и характеристика антительных ЭД

При получении антительных ЭД использовали протейные иммун-

ные неадсорбкрсванные О-ешоротки (03 , 010 , 013 , 026 , 028 , 030). ЭД получали путем сенсибилизации ФЭК иммуноглобулиновьми препаратами при помощи акедола. Применение в качестве сенситинов суммарного иммуноглобулина повышало чувствительность антительных ЭД в 18,4-47,6 раза, по-сразнению с использованием сывороток при одинаковых для обоих сенситинов ОСД. Выраженная 0-спе-цифичность разработанных антительных ЭД _>ыла подтверждена результатами перекрестной РИГА с неактивированными ЛПС. Минимальная агглютинирующая доза гомологичных ЛПС была в 950-3600 раз меньше гетерологичных ЛПС. Полученные антительные ЭД были стабильными при хранении в жидком виде с азидом натрии в течение I месяца.

Диагностика протейной инфекции по индикации антигенов

Представляло интерес изучить возможность индикации 0-анти-генов протеев в мочз урологических больных при помощи РПГА с антительными ЭД к ШАт с антигенными ЭД из ЛПС протеев и оценить диагностическую эффективность этих кетодаи.

Обследовали 48 больных с различными урологическими заболеваниями. Выявлен^. высокая степень соответствия результатов бактериологического исследования мочи и индикации протейных 0-ан-тигеноа. Но антигены в ыоче обнаруживались чаще (у 54,2+7,2% больных), чем высевались протейные культуры (у 39,6+7,1% больных) . Положительные результаты РПГА с О-антительнкми ЭД и РНАт с 0-антигенными ЭД получены у 94,7+5,1% больных, из мочи которых выделены протеи, и лишь соответственно у 26,6+11,4^ и 13,3+9,08^ больных, из иочи которых ввделены другие микроорганизмы (рис.б). Обнаружена высокая степень соответствия результатов РПГА и Н1Ат. Специфичность индикации протейных 0-антигенов в моче подтверждалась достоверной связью между результатами РИГА и РНАт.

У всех больных параллельно определяли содержанке АСЛ и активность сывороточных ануител. Обнаружена высокая степень соответствия результатов выявления протейной инфекции по регистрации иммунного ответа на О-антнгены протеев с результатами индикации эткх антигенов в моче как при помощи РПГА, так и при помощи РНАт. Выявлена достоверная связь между титрами сывороточных антител, содержанием АСЛ и титрами антигена в моче, что подтверждает специфичность индикации протейных анти-

90 80 70 50

50 40 30 20 10

п: я к н

и

•йн о

Г+1

РИГА РНАг

I |- у больных, из мочи которых выделены протеи

ЩЩ - у больных, из мочи которых ввделены другие микроорганизмы

Рис.6. ¡^фективноочъ выявления протейной инфекции у урологических больных по индикации 0-антигенов в моче

генов.

Таким образом, разработаны чувствительные и специфичные 0-¡-¡л'ителыше ЭД. Показана высокая эффективность выявления протейной инфекции у урологических больных по индикации 0-анти-генов протеев в моче при помощи РПГА с антительными ЗД и РНАт с антигенными ЭД из ЛЛС протеев.

Получение и характеристика ЗД из ГА протеев

Для оценки иммушлогиче кой эффективности протейной вакцины представлялось необходимым получение ЭД из ГА протеев. Сравнили б методов сенсибилизации ЗОЕ ГА (рис.7), Наиболее эффективной как по чувствительности ЭД, таи и по расходу сенситина оказалась нагрузка эритроцитов при помощи амидола. Били получены ЭД из ГА 016Н6 (вакцинного штамуа), ОЮНЗ, 03Н2 и 028К2. Выраженная ОН-специфичность ЭД из ГА была подтверждена результатами перекрестной РПГА с агглютинирующими адсорбированными 0- и Н-сывсротками. Обратный титр РПГА с гомологичными сыво-

Ери помощи: I - амидола; 2 - глугароного альдегида;

3 - хлорида хрома; 4 - танина; 5 - риванола;

6 - без посредников

1111 - расход сенситика (мг/л 10^ ЭД) Рис. 7. Эффективность различных методоз получения ЭД из ГА

ротками был в 4-64 раза больше, чем с гетерогэгичныки.

Наличие ГА с общим Н-антигеном, ко различными 0-антигона-ми позволило оценить выраженность 0- и Н-специфичности ГА. Было показано, что в ГА 0- к Н-анткгены находятся в комплексе, а выраженность Н-специфичности ЭД из ГА зависела от метода сенсибилизации эритроцитов и вггаммовых особенностей протеев, используемых для получения антигенов. Полученные из ГА 8Д были стабильными при хранении в жидком виде с азидом натрия в течения 1,5 лег (срок наблюдения).

- 17 -

Опенка иммунологической эффективности протейной вакцины

в эксперименте

Эффективность использования разработанных ЭД из ГА для определения содержания АСЛ и активности сывороточных антител изучали в эксперименте у иммунизированных протейной вакциной кроликов. Исследования выполнены на б кроликах, вакцинированных одно-, двух- и трехкратно.

Для того, чюбы сравнить динамику иммунного ответа у вакцинированных животных и людей к ГА и ЛПС, дополнительно были разработаны ЭД из ЛПС 016.(вакцинного гатамма), которые получали сенсибилизацией ФЭБ (для РИГА) и ОАйК (для PPQ) баз посредников, Специфичность ЭД из ЛПС 016 была подтверждена результатами перекрестной РЛГА с гом~ и гегерологичными агглютинирующими адсорбированными О-сывопотками.

У всех вакцинированных кроликов выявлены АСЛ и значительное нарастание активности сывороточных антител к гомологичным ГА QI6H& и ЛПС 016. АСЛ регистрировались через 1-3 дня после первой иньекции вакцины, а достоверное нарастание -.ктивности антител - через 7 дней. Максимум содержания АСЛ и титра анти тел отмечен через 7 дней после последней инъекции вакцины. При двух- и трехкратной вакцинации кроликов, в отличие от однократной, во-первых, увеличивались максимальное содержанке АСЛ и максимальные титры антител, во-вторых, АСЛ и достоверное нарастание активности антител выявлялись более длительное время (до 21-28 дня пойле последней инъекции вакцины). При двух- и трехкратной вакцинации кроликов, в отличие от однократной, выявлены АСЛ и нарастание активности антител и к гэтерологичным антигенам.

Таким образом, разработаны стабильные, зысокочувсвительные и специфичные ЭД из ГА протеев для выявления АСЛ при помощи FP0 и определения активности сывороточных антител при помощи РЛГА. Проведенные на животных исследования обосновали возможность применения. ЭД из ГА 0I6HS и ЛПС 016 для изучения иммунологической эффективности протейной вакцины у больных.

Динамика иммунного ответа у больных, иммунизированных

протейной вакциной

Обследовали 24 вакцинированных больных с аденомой предста-

тельной железы. Вакцину вводили двухкратно за 6-8 дней и 2 дня до операции. Ни у одного из обследованных больных гнойно-воспалительных осложнений в послеоперационный период не было.

К 4-6 дню после первой иньекши протейной вакцины у всех иммунизированных больных выявлены АСЛ и более чем двухкратное нарастание активности антител к гомологичным ГА 016Н6 и ЛПС 016. Повторная инъекция вакцины приводила к дальнейшему нарастанию содержания АСЛ и активности сывороточных антител к гомологичным антигенам. Максимальное содержание АСЛ и максима,"- чые титры антител у иммунизированных протейной векциной больных выявлены на 3-10 Дни после операции (через 5-12 дней после второй инъекции), т.е. в дни наиболее вероятного присоединения послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений. У всех иммунизированных больных до последнего дня стационарного лечения выявлялись АСЛ и достоверное нарастание активности сывороточных антител к гомологичным ГА 016Н6 л ЛПС 016. Следует отметить, чтц у всех больных иммунизированных протейной вакциной, в послеоперационный период (на 3-10 дни после операции) выявлены АСЛ и более чем четырехкратное нарастание активности антител и к гетеролог'ичным О-антигенам протеев.

Таким образом, Наряду с результатами, полученными в эксперименте, изучение динамики иммунного ответа у иммунизированных протейной вакциной кроликов и больных по определению содержания АСЛ и активности сывороточных антител к ГА и ЛПС Протеев позволило показать высокую иммунологическую эффективность протейной вакцины и подтвердить обоснованность выбора штамма протеев для получения вакцины и использованной схемы профилактической иммунизации больных.

Представляло интерес оценить популяцчоннуга принадлежность АСЛ у иммунизированных протейной вакциной бол!Ных в динамике.

АСЛ, выявленные у больных на 4-6 день после первой инъекции протейной.вакцины, относились к Т-, В- и О-популяпиям лимфоцитов (рис.8). Содержание Т-АСЛ (п среднем 1,21+О.Щ) и 0-АСЛ. (в среднем (),6чр,0Ш было достоверно (Р<0,05) большим, чгм содержание В-АСЛ (в среднем 0,17+0,06^). На долю Т-АСЛ приходилось 61,Г+4,9£ всех АСЛ, а доля 0-АСЛ (30,3_»_4,6^) и особенно В-АСЛ (8,6+2,3%) была существенно меньшей. В динамике, при общем возрастании содержания АСЛ, содержание В-АСЛ увеличивалось больше, чем содержание Т-АСЛ и 0-АСЛ.

- 19 -

30,3+4, Ш5 61.1+4,9%

20,9+4,6% 51,8+5,0^

2,0 1,5 1,0 0,5 V

Содержание

АСГЙ)

1?,3+3,М

__ т-лсл

0--АСЛ

В-АСЛ

на 4-6 дни

после I тгьенции вакцины

на 5-12 дни

после 2 инъекции вакцины

Рио.8. Популяционная принадлежность АСЛ у больных, иммунизированных протейной вакциной

Таким образом, показана высокая эффективность выявления ротейной инфекции у больных ГВСЗ по определению содержания СЛ при помощи РРО и активности сывороточных антител при помои РПГА с разработанными О-антигенными ЭД, а. также высокая зф-ективность индикации протемных антигенов в моче урэлогичес-их больных при помощи РИГА с О-антительНыми ЭД И РНАт с анти-енными ЭД из ЛИС Протеев. Изучение динамики АСЛ и активности ывороточных антител при помощи разработанных ЭД Из ГА и ЛПС ротеев у иммунизированных протейной вакциной больных подтвер-ило высокую иммунологическую эффэктивность вакцины, а также боснованность выбора штамма протеев для получения вакцины и спользованной схемы профилактической вакцинации.

.4

- 20 -выводи

1. Разработаны оригинальные протейные (основных серогр.упп) С-антигенные юно- (групповой специфичности) и поливалентные О-эригроиитарные диагностику»; для определения активности сывороточных антител и, впервые, для определения содержания анти-генсвязывающих лимфоцитов. Поливалентные оритроцитарные диаг-ностикумы не уступали по чувствительности моновалентным.

2. Впервые из "гздрокгкяаминовых" антигенов получены протейные 0Н-зрятроцетаряке диагностикуш для определения содержания антг.генсБязызаащих лимфоцитов и активности сывороточных антител. Оптимальным иетодом нагрузки эритроцитов "гидрсксил-аминовыми" антигенами оказалась конъюгация при помощи амидола. Соотношение 0- и Н-специфичности диагностикумов из "гидроксил-аминовых" антигенов определялось методом сенсибилизации эритроцитов и штаммовыми особенностями протеев, Используемых для получения "гвдроксилалмновкх- антигенов.

3. При использовании неадсорбированных агглютинирующих 0~ сывороток получены специфичные и достаточно чувствительные ан-тительныэ эригроцитарше диагностику™.

4. Разработанные антигенные эритроцитарные диагностику™ были стабильными при хранена*: в жидком виде с 0,051 аэвда натрия в течение 1,5 лет (срок наблюдения), а антительные - в течение I месяца.

5. При экспериментальном заражении животных протеем при помощи разработанных эритроштарных диагностикумов обнаружено достове]пое нарастание активности сывороточных антител и появление антигенсвязываи^их лимфоцитов.

6. Показано, что определение содержания антигенсвязываю-щих лимфоцитов при помощи реакции непрямого розеткообразования и активности сывороточных антител при помощи реакции пассивной гемагглютинации с разработанными поли- и Моновалентными О-антигенными эритроцитариьми диагностикумами является высокоэффективным методом выявления протейной инфекции у больных с различными гнойно-воспалительными и септическими заболеваниями. Применение поливалентных эритроцитарных диагностикумов позволило в 4-7 раз сократить объем исследований без снижения эффективности диагностики.

7. Выявление антигенсвязывающих лимфоцитов в крови является, в сравнении с определением активности антител, методом ран-

- 21 -

ней диагностики протейной инфекции,

8. Показана диагностическая значимость выявления антигенов протеев в моче, урологических больных при помощи реакции пассивной гемагглютинации с О-антительными эритроцитарнкми диагностиками и реакции нейтрализации антител о 0-антиген-ными эритроцитарными диагностикумами. Еьшвлена прямая связь между активностью антигенов протеев в моча и показателями иммунного ответа на эти антигены у больных.

9. Изучение динамики антигексэязнвающих лимфоцитов и активности сывороточных антител при помощи разработанных гомо-и гетерологичных зритроцитарных диагностикумов из "гидроксил-аминовых" антигенов и липополисе.харидов у вакцинированных животных и людей подтвердило высокую иммунологическ.'о эффективность протейной вакцины, а также обоснованность выбора штамма для получения вакцины и используемой схемы профилактической вакцинации.

10. Антигенсвлзывающие лимфоциты у иммунизированных протейной вакциной людей принадлежали к Т-, В- и 0-популяциям лимфоцитов. В динамике, при общем возрастании содержания анти-генсвязывающих лимфоцитов, содержание В-антигенсзкзызэющих лимфоцитов увеличивалось больвв, чем содержание О-антигенсвя-зывающих лимфоцитов и Т-антигенсвязывающих лимфоцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

3 начале заболевания (или и 1-3 дли после поступления больного в стационар) для диагностики протейной инфекции у больных ГЗСЗ необходимо провести определение содержания АСЛ и (или) активности сывороточных антител и (или) индикацию протейных антигенов а моче (у больных с урологическими заболеваниями). При наличии положительного результата при использовании хотя бы одного метода с изится диагноз протейной инфекции. При отсутствии положительных результатов всех иммунологических методов необходимо провести повторное (на 7-Ю дни) определение активности сывороточных антител. Диагноз протейной инфекции ставится е том случае, если выявлен УДТ или не менее чем четырехкратное нарастание титра антител, независимо ст его абсолютного значения.

- 22 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Айтбаеэа Ж.Т., Каверина К.Г. Получение и испытание эритроцитарных дкагностияуыов из гедроксиламиновых антигенов протеев // Вопросы клиничзской иммунологии и иммунологической диагностики. - Алма-Ата, 1988. - С,31-36.

2. Дерябин H.H., Каральник Е.З., Мороз А.Ф., Ванеева Н.П., Александрова И.А., Егизова С.А., Айтбаева Ж.Т., Прасолова JI.A., Александров А.Д., Каверина К.Г. Серологические методы выявления этиологии гнойно-септических заболеваний // Методические рекомендации. - Алма-Ата, 1986. - 26 с.

3. Айтбаева Ж.Т., Дерябин ПЛ., Каральник Б.В., Каверина К.Г. Эритроцигарныэ диагностиками для определения антител к О-антигенам протеев // И. микробиол. - 1989, - № 5. - С. 1620.

.4, Айтбаева Ж.Т. Приготовление и эффективность протейных О-антигенных эритроцитарных диагностикумов // Аллергология и клиническая иммунология. - Алма-Ата, 1989. - С. Ю7-П0.

5. Дерябин П.Н., Прасолова Л.А., Айтбаева К,Т., Егизова С.А. Динамика иммунного ответа у экспериментально зараженных животных // Аллергология и клиническая иммунология. - Алма-Ата, 1989. - С.104-107.

6. Дерябин П.Н., Прасолова Л.А., Айтбаева Ж.Т., Егизова С.А., Лмбарцумов A.A., Галиева Л.Д. Антигексвязьтаюгцие лимфоциты при гнойно-септических заболеваниях // Первый Всесоиз. иммунологический съезд. Тез.докл. - М., 1989.- Т.I. - С. 212-212.

7. Дерябин П.Н., Прасолова Л.А., Айтбаева Ш.Т., Егизова С.А., Апбарцумов А. w, Галиева Л.Д. Определние антигенсвязы-веиощих лимфоцитов и сывороточных антител у больных'остеомиелитом // Иммунный гомеостаз в кормэ и патологии. Тез. докл. конференции молодых ученых, посвященной 50-летию института. -Фрунзе, 1989. - С.27-28.

8. Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Егизова С.А., Айтбаева Ж.Т., Прасолова Л.А., Ванеева Н.П., Александрова И. А,, Алек-, сандров А.Д., Мороз А.Ф., Каверина К.Г. Иммунодиагностика гнойно-воспалительных и септических заболеваний // Материалы ХУШ съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. -Моска - Алма-Ата, 1989. - С.43-43.

- 23 -

9. Каральник Б.В., Дерябин П.Н., Прасолова Л.А., Айтбаева Ж.Т., Егиэова С.А., Грюнберг В.В., Кугач И.В. "Способ получения иммунореагента для выяьления антигенсвязыроющих лимфа -цитов в реакции розеткообразования". Положительное решение ЗНМГПЭ ка изобретение по заявке № 4470627/30-13(9715?) от 10.07.89.

10. Айтбаева И.'Г., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Коган

Б.А., Сагинтаева Д.М., Коган В.Б. Иммунодиагностика протейной инфекции у урологических больных при помощи зритроцитарных реагентов // Материалы 1У.Всесо»з. съезда урологов. - М., 1990. - С.300-301.

11. Дерябин П.Н., Айтбаева Ж.Т., Каральник Б.В., Сагик-таеаа Д.М., Коган Б.А., Коган В.Б. Динамнха иммунного ответа

у урологических больных, иммунизированных протейной вакциной // Материалы 1У Всесоз. съезда урологов. - М., 1990. - С.282-283.

12. Прасолова Л.А., Айтбаева Ж.Т., Егизова С.А. Изучение динамики сывороточных антител и антигенсвяэывашцих лимфоцитов у экспериментально зараженных животных // Сб. трудов КазШЕИ: Вклад•молодых ученых Казахстана в решении Продовольственной программы страны.- Алма-Ата, 1988. - Био'логр. указ. ВИНИТИ "Депонированные научные работы". - №., 1990. - 4 (222). -С. 143-143.