Автореферат и диссертация по медицине (14.01.03) на тему:Состояние врожденного иммунитета при полипозном риносинусите

На правах рукописи

4839879

Давудова Башарат Хасановна

Состояние врождённого иммунитета при нолипозном риносинусите

14.01.03 - болезни уха, горла и поса

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2011

О з мдр 2011

4839879

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Научно-клинический центр оториноларингологии» ФМБА России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дайхес Николай Аркадьевич, доктор медицинских наук, профессор Саидов Марат Зиявутдинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры детской оториноларингологии педиатрического факультета ГОУВПОРГМУ им. Н. И. Пирогова

Гаращенко Татьяна Ильинична

доктор медицинских наук, Караулов Александр Викторович

профессор, член-корр.РАМН, заведующий кафедрой клинической иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И. М. Сеченова

Ведущая организация: Московский областной научно- исследовательский

клинический институт им. М.Ф.Владимирского

Защита состоится «15» 2011 года в 12 часов на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.059.01 при ФГУ « Научно-клинический центр оториноларингологии» ФМБА России по адресу: 123098. г. Москва, ул. Гамалеи, д.15.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии» ФМБА России по адресу: 123098. г.Москва, ул. Гамалеи, д.15.

Автореферат разослан «'14 » ОА. 2011 года.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема полипозного риносинусита (ПРС) не теряет актуальности до настоящего времени. Все методы лечения дшот высокий процент ближайших рецидивов носовых полипов (от 20 до 60 %). Значительные нарушения дыхательной функции, развитие у 50-60% больных ПРС бронхиальной астмы существенно ухудшает качество жизни пациентов и обуславливает социальный аспект этой проблемы (Г.М.Портенко, 2002, А.И.Муминов с соавт. 1990].

Участники регулярно проводимых Международных консенсусных конференций по полипозному риносинуситу (2008 г.) до сих пор не могут прийти к единому мнению об этиологии, патогенезе и обоснованных стандартах лечения и ведения подобной группы пациентов.

Тем не менее, в соответствии с решениями Международных консенсусных конференций, эта форма воспалительного процесса представляется как хроническое продуктивное Th-2-зависимое эозинофильное воспаление, приводящее к ремоделированию слизистой оболочки носа, её отёку с последующим пролапсом слизистой оболочки и формированием носовых полипов [M.J.Ramanathan et al., 2008, P.Gevaert, 2006].

Воспаление и отёк при ПРС, прогрессирующий рост носовых полипов, формирование двустороннего полипозного процесса в носу и околоносовых пазухах имеет уникальные особенности, связанные в первую очередь с нарушением местного и системного иммунного гомеостаза [Ф.Г.Волков с соавт. 2008, A.M.Rampey et al. 2007]. Уникальность этого патологического процесса состоит в том, что интерпретация местного эозинофилыюго продуктивного воспаления связывается со всеми достижениями фундаментальной иммунологии и, прежде всего с изменениями адаптивного иммунитета.

Однако, в связи с последними данными о роли врождённого (innate) иммунитета в индукции АГ-специфического, приобретенного (adaptive) иммунного ответа, интерпретация иммунопатогенеза ПРС претерпела существенные изменения. Речь идёт о том, что, в соответствии с современными представлениями, врождённый иммунитет является достаточно специализированным отделом иммунной системы, имеющим эволюционно закреплённый и генетически детерминированный рецепторный аппарат, специфическое взаимодействие которого с консервативными компонентами внешней оболочки микроорганизмов, приводит к мощной активации механизмов адаптивного иммунитета [Р.М.Хаитов с соавт. 2009, RMedzhitov et al. 2007]. Рецепторы врождённого иммунитета (паттерн-распознающие рецепторы, или PRR-рецепторы),

представлены, в частности, TLR 1-10 и Nod -2 -рецепторами. Эти белки принимают активное участие в индукции антиген (АГ) - специфического (адаптивного) иммунного ответа. Современные концепции иммунитета отводят PRR-рецепторам фундаментальную роль в регуляции иммунного гомеостаза [R.Medzhitov et. al., 2007, S.Akira et al., 2006]. По отношению к ПРС показано усиление экспрессии м-РНК TLR -2 и TLR - 4-рецепторов и др. по сравнению с группой сравнения [C.F.Lin et al. 2007]. На эпителии носовых полипов отмечена экспрессия TLR -2, 3 и 4 рецептора, сопровождающаяся усилением выработки хемокинов, ростовых факторов и ИЛ-8 [J.Wang et al. 2007]. Дендритные клетки (С0208-позитнвные), которые являются важнейшим компонентом врождённого иммунитета и локализуются в слизистой оболочке носа, при ПРС интенсивно экспрессировали TLR - 2, TLR - 4 и CD 14, что является свидетельством активации этого типа клеток [A.M. Rampey et al. 2007]. Эти и другие результаты исследований подтверждают активное участие механизмов врождённого иммунитета в патогенезе ПРС.

Таким образом, значение иммунных процессов в патогенезе ПРС несомненно. Не менее важно и то, что изучение врождённого иммунитета при ПРС позволит предложить новые лечебно-профилактические мероприятия этим больным. Однако клинико-иммунологических работ по изучению изменеш1й показателей врождённого иммунитета при ПРС, основанных на современных информативных и высокоспецифичных методах научных исследований, мы не встретили.

Цель исследования:

На основании данных комплексного клинико-инструменталыюго и лабораторных методов исследования изучить особенности течения полипозного риносинусита и дать оценку патогенетической значимости некоторых показателей системного и местного врожденного иммунитета у данной категории больных.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное клинико-инструментальное и лабораторные исследования у больных полипозным риносинуситом и оценить особенности клинического течения заболевания.

2,Определить значимость исследования различных функций носа в оценке степени тяжести заболевания и качества хирургического вмешательства у больных полипозным риносинуситом.

3. Провести иммуногистохимические исследования экспрессии TLR 1-10 и Nod -2 рецепторов на клетках воспалительного инфильтрата в операционном материале носовых полипов больных полипозным риносинуситом.

4.Изучить экспрессию TLR 1-10 и Nod-2-рецепторов на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах больных полипозным риносинуситом методом проточной лазерной цитофлуориметрни.

5.Оценить изменения показателей врождётшго иммунитета в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов.

б.Изучнть корреляционную взаимосвязь экспрессии TLR 1-10 и Nod-2-рецепторов на клетках периферической крови и на клетках воспалительного инфильтрата носовых полипов.

Научная новизна:

1. В работе впервые представлены данные экспрессии TLR 1-10 Nod- 2 -рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови больных ПРС; 2. Впервые представлены данные иммуногистохимического изучения наличия и клеточной плотности TLR 1-10-позитивных клеток в составе воспалительного инфильтрата ткани носовых полипов; 3. Полученные результаты проанализированы с точки зрения наличия эозинофилии периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов, дана оценка клинической значимости этой информации; 4. Впервые получены данные наличия и/или отсутствия прямой сильной и достоверной корреляционной взаимосвязи между уровнем TLR 1-10-позитивных моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов периферической крови и TLR 1-10 -позитивными клетками в ткани носовых полипов как в общей группе обследованных больных, так и в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов; 5. Полученные данные позволили оценить патогенетическое значение нарушений механизмов врождённого иммунитета при ПРС. Интерпретация полученных данных проведена с учётом самых последних данных в области клинической иммунологии заболеваний JIOP-органов, что позволило рекомендовать новые подходы к лечению ПРС, а также обосновать дальнейшие перспективные исследования в этой области.

Практическая значимость:

Практическая значимость полученных результатов состоит в том, что на основании новых данных об иммунопатогенезе ПРС открываются новые возможности модуляции активности системы врождённого иммунитета при ПРС. Это касается как местного, так и системного врождённого иммунитета. С учётом отсутствия в настоящее время специфических методов лечения ПРС, подобное направление в системной и/или местной иммунотрошюй терапии ПРС, несомненно, актуально и перспективно.

На основании анализа полученных данных оценена информативность показателей врождённого иммунитета в клинической практике. Рекомендуется при комплексной оценке системы иммунитета больных с патологией JIOP-органов, в т. ч. и при ПРС, обязательно включать изучение местного и системного врождённого иммунитета методами иммуногистохимии и проточной цкгофлуориметрии.

Результаты настоящей работы, полученные на основании новых методологических подходов к изучению проблемы ПРС, отражают фундаментальные механизмы иммунопатогенеза этого заболевания, а также перспективные способы модуляции экспрессии рецепторов врождённого иммунитета.

Личное участие автора в получении результатов исследования

Автором разработаны индивидуальные карты обследования больных, оформление медицинской документации, проведены диагностические исследования, операции и послеоперационное наблюдения. Также автором освоены методы иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии, проведен анализ полученных результатов и статистическая обработка.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Воспалительный инфильтрат при ПРС характеризуется наличием активированных клеток, экспрессирующих рецепторы врождённого иммунитета - с TLR -1 по TLR -10. Наибольшей клеточной плотностью отличались TLR -5, TLR -6, TLR -7 и TLR -10 позитивные клетки.

2. Клетки периферической крови больных ПРС экспрессируют PRR рецепторы с разной интенсивностью. В гранулоцитарной популяции достоверно увеличивается экспрессия TLR - 4,5,9 рецепторов и угнетается экспрессия TLR -7 и TLR -10 рецепторов. В моноцитарной популяции достоверно увеличивается экспрессия TLR-3,4,5 и угнетается экспрессия TLR -7 рецептора. В лимфоцитарной популяции -усиление экспрессии TLR -3 и 5 рецепторов и угнетение - TLR -6 и 7 рецепторов.

3. Эозинофилия периферической крови больных ПРС, а также патоморфологический тип носовых полипов сопровождается достоверными изменениями интенсивности экспрессии спектра PRR- рецепторов. Это касается, в частности, TLR -3, 4, 5 и 9 рецепторов.

4. На основании наличия сильных, достоверных, положительных корреляционных взаимосвязей у больных ПРС можно заключить, что в ткани носовых полипов при уровне эозинофилов в крови свыше 150 кл/мкл и отёчном типе носовых полипов увеличивается уровень TLR -3 позитивных клеток; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов увеличивается уровень TLR -1 и TLR -9 позитивных клеток; при

уровне эозинофилов до 150 кл /мкл увеличивается уровень TLR -2 позитивных клеток. Все клетки гематогенного происхождения.

Внедрение результатов исследования в практику: Полученные результаты используются при комплексной оценке иммунной системы больных ПРС в JIOP-отделении 67 клинической больницы г. Москвы, в ринологическом отделении Республиканской клинической больницы г. Махачкалы.

Апробацпя работы:

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- XXVI Международной конференции молодых оториноларингологов (Санкт-Петербург, Дом Ученых, 26-27 мая 2010г.); - The 44th Congress of the Polish Society of Otorhinolaryngologists, Head and Neck Surgeons (Варшава 9-12 июня 2010г.)

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 6 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками, 30 таблицами и 8 диаграммами. Список литературы включает 184 источника, из них 80 отечественных и 104 иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В работу включены больные, находившиеся на обследовании и лечении в JIOP-отделении 67 клинической больницы г. Москвы. Кроме этого была обследована группа больных, также находившаяся на обследовании и лечении в ринологическом отделении Республиканской клинической больнице г. Махачкалы. Группа включала 34 пациентов. Контрольная группа практически здоровых людей составила 14 человек. Все больные находились в стационаре с диагнозом хронического полипозного риносинусита или гаймороэтмоидита с рецидивами или без рецидивов.

У всех пациентов проводился сбор анамнестических данных, изучение объективного статуса, состояния JIOP-органов, изучение особенностей течения заболевания. При этом особое внимание уделялось наличию и количеству рецидивов, эффективности лечения и сочетанию ПРС с бронхиальной астмой, аллергическим ринитом, муковисцидозом и др. системными заболеваниями. На каждого больного,

помимо ведения истории болезни, заполнялась индивидуальная карта наблюдения, куда вносились все данные лабораторно-инструментальных методов исследования, представленные в настоящей работе.

Лабораторно-инструментальные данные включали в себя общий анализ крови, общий анализ мочи, время свёртывания крови, данные ЭКГ, рентгенологические исследования (снимки носовой полости и придаточных пазух), КТ-исследования в двух-трех проекциях, результаты эндоскопических методов исследования носовой полости. Все исследования проводились в соответствии со стандартами, принятыми в нашей стране. Эндоскопия проводилась при помощи эндоскопа фирмы «Karl Storz» 0;30;45 гр. оптики, диаметрами эндоскопов в зависимости от обследуемых отделов от 1,6мм; 2,7мм; 4мм. Была оценена степень обтурации общих и средних носовых ходов полипозной тканью, наличие отделяемого и выраженность отека слизистой оболочки, степень распространения в носоглотку.

Для оценки носового дыхания применялись следующие методы: проба с пушинкой по Воячеку, зеркальный тест Глатцеля, передняя активная ринометрия, акустическая риноманометрия. Также проводилось исследование обоняния, определение общего Ig Е, а также показатели врождённой иммунной системы в соответствии с целью и задачами данной работы.

По клиническим и анамнестическим данным пациентам ставился диагноз полипозного риносинусита или гаймороэтмоидита с рецидивами или без рецидивов. Всем больным, в соответствии с клиническими показаниями, была проведена операция полипотомии носа. Весь операционный материал исследовался на патоморфологию в патологоанатомическом отделении, а также на все иммуногистохимические показатели. В первом случае материал подвергался стандартной формалиновой фиксации и заливке в парафин. Во втором случае использовался свежезамороженный материал с приготовлением криосрезов.

Иммуногистохимические исследовании проводились с применением высокоспецифичной и чувствительной двухэтапной системы EnVision+Dual Link System-HRP, (DAB), Dako с применением моноклональных антител (МАТ) и вторичных антимышиных и антикроличьих AT, соединённых с энзим-коньюгированным полимерным носителем. В качестве энзима выступала пероксидаза хрена. Для тестирования TLR 1-10 и Nod- 2 рецепторов использовались моноклональные и поликлональные антитела фирм SeroTec (Великобритания) и Alexis (США), которые адаптированы для иммуногистохимических исследований. Необходимо отметить, что эти антитела также использовались нами и в проточной

щшшетрии в соответствующих разведениях. Рабочее разведение антител подбиралось экспериментально по наиболее оптимальной окраске препаратов; использовались разведения в диапазоне от 1.100 до 1:500. В качестве контроля использовались гистологические срезы биоптата иитакгной слизистой оболочки носовой полости, полученной во время операций. Все ИГХ-исследования были проведены на 4-микрошшх крпосрезах, полученных со свежезамороженного материала на криостате «Leica» и зафиксированных в ацетоне.

Наиболее демонстративные препараты сканировались в световом микроскопе "Leica DMLB" со встроенной видеокамерой по программе "Leica QWin Colour (GB) for Image Analysis". Видеоизображения переносились на флеш-карту и воспроизводились в тексте работы. Все препараты были подвергнуты морфометрии. Морфометрические показатели определяли путем подсчета количества TLR- 1-10 и Nod- 2-позитивных клеток в нескольких полях зрения при ув.400 с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типичные для данного препарата поля зрения.

Цитофлуориметрнческне исследования клеток периферической крови проведены на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) в ГНЦ - Институте иммунологии ФМБА России, в отделе клинической иммунологии (зав. - проф. Б.В.Пинегин). Пробоподготовка для проточной цитометрии проводилась по стандартной процедуре с применением фиксирующего/пермеабилизирующего раствора (FACS Permeabilizing Solution). Использовались вторичные анти-мышиные антитела, меченные FITS (зелёное свечение) или РЕ (красное свечение). В качестве изотипического контроля цитометрических замеров использовали IgG-фракщпо от неимунизированных мышей. Проточную лазерную цитофлуориметрию проводили на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США), с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой клеточной взвеси выводили на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме "dot-plot". Анализ интенсивности флуоресценции и процента флуоресцирующих клеток проводили в зелёной области (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой области (РЕ) FL2 (585 нм). Клетки анализировались в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/сек. Среднюю интенсивность флуоресценции клеток выражали в условных единицах флуоресценции (УЕФ). Данные обрабатывались с помощью программы "Cell Quest".

У каждого нациста одновременно проводились и ИГХ-исследования операционного материала, и цитофлуориметрические замеры экспрессии PRR-рецепторов на клетках периферической крови.

Статистическая обработка результатов исследований. Значения параметров исследуемых групп описывались с помощью медианы (Me) и 25;75-процентилей. При сравнении двух групп использовался Т-критерий Манна-Уитни. При множественных сравнениях - критерии Крускала-Уолеса и Данна. Корреляционную взаимосвязь между изученными параметрами определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Значения р<0,05 рассматривались как статистически значимые. Патогенетически значимые зависимости выводились на основании наличия сильных ( г>0,7 и более), достоверных (р<0,05) и положительных корреляционных взаимосвязей. В работе использовались компьютерные программы Microsoft Office Excel и «Биостат 4.03» (С. Гланц, Медико-биологическая статистика, «Практика», Москва, 1999).

Основные результаты исследования и их обсуждение Общая клиническая характеристика обследованных больных и виды хирургических вмешательств.

В результате проведенного обследования нами была выделена группа с хроническим неспецифическим полипозным риносинуситом. В анамнезе у многих больных (23чел.) были гнойные гаймороэтмоидиты. Общая клиническая картина заболевания у всех пациентов не отличалась какими-либо особенностями. Больные жаловались на прогрессирующее нарушение носового дыхания, как правило, двустороннее, от периодического закладывания носа до полной обструкции, чувство постоянного присутствия вязкого секрета в носоглотке, который трудно было удалить. Это нарушение дыхания часто ассоциировалось с нарушением обоняния и других функций носа. По результатам проведенной ольфактометрии у исследуемой группы пациентов (у 70,6%) наблюдалась 2-3 степень гипосмии. При исследовании мукоцилиарного клиренса время продвижения слизи составило в среднем 37-45 ±12 минут. У некоторых больных частичная заложенность носа переходила в полную блокаду носового дыхания во время сна. В результате они становились беспокойными, появлялись жалобы на головные боли, преимущественно в лобной области, ощущения сухости в глотке и чувство першения в горле. Деформации лицевого скелета не отмечалось. Группе пациентов проводилось ранее оперативное лечение (18чел), а также назначались топические глюкокортикостероиды интраназально (назонекс, фликсоназе ), остальная часть пациентов подверглась хирургическому вмешательству впервые.

У 7 пациентов имелись проявления аллергической настроенности. При наличии сопутствующего аллергического компонента наблюдались явления

пщерреактивности при проведении эндоскопических исследований, манипуляций и проявлялись многократным чиханием, обильными серозными выделениями из носа, в секрете отмечалось повышение количества эозинофилов. Уровни общего Ig Е в среднем составили 171,2 ± 2,3 кЕ/л. У всех 7 пациентов преобладала сенсибилизация к бытовым и эпидермальным аллергенам (клещ, домашняя и библиотечная пыль, на шерсть кошки, собаки, овцы). Большое вшшание уделялось выяснению связи ПРС с БА. Из 34 обследованных нами пациентов верифицированный диагноз БА не встречался. Рецидивы носовых полипов определялись у 18 пациентов (51%). Длительность заболевания составила в среднем 5,9 лет.

В работе присутствует блок данных по экспрессии PRR-рецепторов в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови. Наличие эозинофилии констатировалось по абсолютному количеству эозинофилов в 1 мкл периферической крови, превышающем 150 кл/мкл.

Клинический диагноз ставился на основании жалоб больных, анамнестических данных, объективного статуса и состояния JIOP-органов. Данные передней и задней риноскопии, эндоскопии определяли наличие носовых полипов, выглядевших как гладкие, блестящие, сероватые образования слизистой оболочки, подвижные, не спаянные с окружающими тканями, не кровоточащие при контакте с зондом. При эндоскопическом исследовании полости носа можно было видеть 3 степени полипоза носа в зависимости от степени обструкции общего носового хода: 1 степень-верхние отделы полости носа до уровня средней носовой раковины; 2 степень-полипы, доходящие до уровня нижней носовой раковины; 3 степень-полная обтурация полипами полости носа (5 пациентов).

При эндоскопическом осмотре у большинства пациентов полипоз охватывал все структуры остиомеатального комплекса (крючковидный отросток, решетчатую буллу, соустье в/ч пазухи, среднюю носовую раковину, верхние отделы носа). При рентгенологическом исследовании носовой полости и околоносовых пазух определялась полиморфная картина, но характерным были затемнения пятнистой структуры. Эти затемнения имели овальную форму или неправильные очертания, обусловленные формой отдельных более крупных полипов и/или наложением теней других более мелких полипов. Рентгенологическое исследование не давало полного представления о вовлечении околоносовых пазух в воспалительный процесс. Всем больным в предоперационном периоде проводилось КТ исследование околоносовых пазух в двух или трех проекциях. У большинства пациентов (20) отмечена картина локализации процесса преимущественно в верхнечелюстной пазухе (отечность,

утолщение слизистой), в полостях решетчатого лабиринта, у всех отмечались изменения в средних носовых ходах. Верхние носовые ходы были заполнены отечной слизистой. В лобных пазухах отмечалось частичное снижение пневматизации с включениями воздуха.

Предоперационного медикаментозного лечения не проводилось.Все пациенты поступали в плановом порядке для оперативного лечения.

По клиническим показаниям всем больным была проведена операция полипотомии носа полипной петлей под местным обезболиванием, либо эндоскопическая полисинусотомия под общим обезболиванием. Под эндотрахеальным наркозом и внутривенным потенциированием производилась резекция крючковидного отростка. Обратным выкусывателем и щипцами Блексли расширялось соустье верхнечелюстной пазухи. Пазуха промывалась физиологическим раствором. Полипы из решётчатой воронки и из среднего носового хода удалялись щипцами Блексли под контролем 0 и 45 гр. оптики. Освобождался лобный карман, и расширялось соустье лобной пазухи кпереди. Вскрывались клетки решётчатого лабиринта, и удалялась полипозно-изменённая слизистая. В средний носовой ход устанавливался гемостатический тампон. Удаление тампонов производилось на 2 сутки после операции. В послеоперационном периоде назначались антибиотики (амоксициллин, цефтриаксон по 1г 2 раза в день 5-7 дней, либо дополнительно линкомицин по 1г 3 раза в день) на 7 дней. После удаления тампонов назначалось персиковое либо вазелиновое масло для закапывания в нос по 5 капель 5 раз в день в течении 2 недель, спрей Полидекса по 2 дозы в каждую ноздрю 3-4 раза в день в течении 7 дней, а также промывание носа устройством «DOLPHIN» 2 раза в день в течении 2 недель с использованием физиологического раствора. Через 2 недели после операции назначался топический кортикостероид (назонекс, фликсоназе) по 1-2 дозе (50-100мкг) в каждую половину носа 2 раза в день в течении 2-х недель, затем по одной дозе (50мкг) 1-2 раза в день в течении 3-6 месяцев. Пациентам с повышенным уровнем общего IgE на 2 месяца назначался Эриус по 1таблетке 1 раз в день. На 5-7 сутки после операции больные выписывались из стационара.

Операционный материал отправлялся на патоморфологическое исследование. Патоморфологический тип носовых полипов был положен в основу фрагмента нашей работы по изучению состояния врождённого иммунитета у больных ПРС. За основу были взяты два вида носовых полипов - отёчный и фиброзно-отёчный. Подобное деление носовых полипов является общепринятым в патологоанатомической практике, наиболее распространено в клиническом здравоохранении.

Характеристика параметров системного и местного врожденного иммунитета у больных полипозным риносинуситом

Состояние местного врождённого иммунитета изучалось нами по экспрессии конкретных РЯЯ на клетках воспалительного инфильтрата в ткани носовых полипов. В делом, на клетках воспалительного инфильтрата тестировалась экспрессия всех десяти ТоП-иодобных рецепторов. Распределение ТЬЯ-позитивных клеток соответствовало топографии воспалительного инфильтрата. Как правило, они располагались диффузно, занимая практически всю ткань носовых полипов с тенденцией к большей клеточной плотности вокруг сосудов. Эти процессы имели место на фоне выраженного отёка ткани носовых полипов. Морфологически БАВ-позитивная реакция определялась на клетках напоминавших макрофагоподобные, гранулоциты и мононуклеары. ТЬЯ- 1, 2, 5, 6 и 9 позитивные клетки обнаруживали тенденцию к большей клеточной плотности в субэпителиальной области. Эпителий давал позитивную реакцию на все МАТ за исключением ТЬЯ-1. Максимально выраженная реакция покровного эпителия ткани носовых полипов определялась по отношению к ТЬЯ -5, 6 и 7 рецепторам. Преимущественное скопление ТЪЯ-позитивных клеток в периваскулярном пространстве указывало на гематогенное происхождение части этих клеток. ОАВ-позитивная реакция, отличающаяся чёткой контрастностью, была характерна для ТЬЯ- 1,3,5,7 и 10-позитивных клеток. На рис. 1 представлен препарат ткани носовых полипов, на котором видно, что БАВ-позитивные клетки располагались диффузно с тенденцией к некоторой очаговости. На некоторых препаратах эти клетки локализовались преимущественно в периваскулярных зонах. На рис.2 видно, что покровный эпителий ткани носовых полипов является чётко ОАВ-позитивным.В данном случае на покровном эпителии экспрессируется ТЬЯ-5 рецептор.

Рис.1

ТЬЯ-З позитивные клетки в носовых полипах, ув.400

Рис.2

ТЬЛ-5 позитивная реакция эпителия в носовых полипах, ув.200

Достаточно чёткая ЭЛВ-позитивная реакция позволила провести морфометрические подсчёты клеточной плотности всех ТЬЯ-позитивных клеток при ув. 400 в нескольких полях зрения с выведением средней арифметической. Максимальная плотность приходилась на ТЫ1-5 [15 (10;24)], на ТЫ1-7 [14 (11;17)], на ТЬЯ-б [12 (6;15)] и на ТЪЯ-Ю-позитивные клетки [17 (13;20)]; указаны медиана показателей плотности ТЬК-почитивных клеток с 25 и 75 процентилями. Интересно, что именно эти рецепторы максимально экспрессированы на поверхностном эпителии носовых полипов. Экспрессия остальных рецепторов на клетках воспалительного инфильтрата была менее выражена по морфометрическим данным, а №с1-2-позитивные клетки отсутствовали вовсе.

Результаты цитометрического анализа экспрессии Т1.Я -1-10 и N0(1-2 рецепторов на моноцитах периферической крови больных ПРС представлены в табл. 1.

Таблица 1

Экспрессия Т1Л11-10 и N0(1 -2 -рецепторов на моноцитах периферической крови больных ПРС, данные проточной цитометрии,

Рецепторы Условные единицы флуоресценции

больные ПРС п=25 контрольная группа п=14

Т1А1 71 (44;87) 30 (26;57)

ТЬЯ 2 105 (91;164) 75 (69; 146)

тью 186 (79;214)* 73 (58;104)

Т1Л4 125 (81; 168)* 78 (64; 124)

Т1Л5 814 (659;1722)* 486 (382;537)

ПЛ6 166(144;200) 166 (151;200)

Т1Л17 191 (179;214)* 275 (161;344)

ТЬЯ 8 40 (39;48) 42 (40;58)

Т1Л 9 452 (390;686) 332(271:391)

■шио 197 (186;204) 160 (141; 177)

N0(12 74 (70;91) 78 (72;98)

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контрольной группой (Т-критерий Манна-

Уитни).

Видно, что достоверное повышение интенсивности флуоресценции моноцитов было зарегистрировано для ТЬЯ-3,4 и 5- рецепторов по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Очевидно, что факт усиления экспрессии этих рецепторов на моноцитах периферической крови при ПРС несёт в себе, прежде всего, патогенетическую нагрузку. Напротив, экспрессия ТЫ1-7 рецептора на моноцитах была достоверно снижена (р<0,05). Тенденция к увеличению экспрессии была

определена для 'П.Я-1,2,9 и 10-рецепторов. Интересно, что на этом фоне экспрессия П,К-8 и №)с1-2-рецепторсш практически не отличалась от контрольной группы. Иная картина определялась на гранулоцитах периферической крови больных ПРС. Результаты отражены в табл.2.

Таблица 2

Экспрессия TLR 1-10 и Nod 2 -рецепторов на гранулоцитах периферической крови больных ПРС, данные проточной цнтометрин, Me (25;75процентшш)

Рецепторы Условные единицы флуоресценции

больные ПРС п=25 контрольная группа п=14

TLR1 49 (43;56) 28 (21;63)

TLR2 69 (49,19) 51 (31;58)

TLR3 441 (282; 1074) 338 (222;516)

TLR4 89 (74; 101)* 58 (50;72)

TLR5 3383 (3514;8122)* 2357 (2191;2577)

TLR6 25 (20;47) 42 (29;53)

TLR7 266 (224;333)* 504 (369;637)

TLR8 220 (205 ;313) 245 (210;304)

TLR9 772 (510;1251)* 510 (452;564)

TLR 10 190 (181;202)* 553 (392;711)

Nod 2 242 (224;271) 310 (276;364)

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контрольной группой (Т-критерий Манна-

Уитни).

Видно, что изменения экспрессии РИД. - рецепторов носят разнонаправленный характер. Определяется достоверное увеличение экспрессии ТЬК-4,5 и 9-рецепторов у больных по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Напротив, экспрессия Т1_К-7 и Т1Л-10 была достоверно ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Тенденцию к снижению экспрессии обнаруживали ТЬЯ-6,8 и N0(1-2 - рецепторы, тенденцию к усилению экспрессии - ПЛЫ и 3 - рецепторы. Подобное диаметрально противоположное разделение степени экспрессии - рецепторов у больных ПРС свидетельствует, во-первых, об активном участии этих компонентов врождённого иммунитета в патогенезе носовых полипов и, во-вторых, о совершенно разных функциональных свойствах ТЬИ-рецепторов в условиях хронического ТЬ-2-эозинофильного воспаления в слизистой оболочке носа. Наибольшей интенсивностью свечения отличался ГЬЯ-5 рецептор.

Значительный интерес представляли собой данные экспрессии PRR -рецепторов на лимфоцитах периферической крови больных ПРС. Несмотря на то, что лимфоциты являются основным действующим лицом адаптивного иммунитета, тем не менее, экспрессия рецепторов врождённого иммунитета на этих клетках является научным фактом. Нет оснований предполагать, что эта экспрессия остаётся функционально необоснованной. По-видимому, тесная кооперация клеточных структур врождённого и адаптивного иммунитета необходима для эффективного функционирования иммунной системы в целом. В наших исследованиях эти клетки экспрессировали все TLR 1-10 и Nod-2-рецепторы, однако, интенсивность экспрессии была намного ниже по сравнению с моноцитами и гранулоцитами, приближаясь в некоторых случаях к фоновой. Единственный рецептор, который был достаточно активно экспрессирован на лимфоцитах - это TLR-5 -рецептор. Интенсивность экспрессии TLR -5-рецептора на лимфоцитах была достоверно выше по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Также достоверное усиление экспрессии было зарегистрировано в отношении TLR -3. Заслуживает внимания достоверное снижение процента TLR-6 позитивных лимфоцитов в группе больных по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Т. е. между лимфоцитами, экспрессирующими эти рецепторы существуют реципрокные взаимоотношения.

Аналогичный подход был использован нами при изучении зависимости экспрессии TLR - и Nod-2 рецепторов в зависимости от эозинофилии в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов. Группа больных ПРС с уровнем эозинофилов в периферической крови до 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR - 3, 5 и 9 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах и уменьшением уровня TLR -7 позитивных моноцитов и лимфоцитов; группа больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR - 4 рецептора на гранулоцитах и лимфоцитах и угнетением экспресии TLR -10 рецептора на гранулоцитах. Фиброзно-отёчный тип носовых полипов сопровождался стимуляцией TLR -5 позитивных гранулоцитов и лимфоцитов и угнетением экспрессии TLR -7 и TLR -10 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС; отёчный тип полипов - достоверным увеличением уровня TLR -3 позитивных моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов в ткани носовых полипов и угнетением экспрессии TLR -5 рецептора на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС.

Оценка состояния системного и местного врождённого иммунитета при ПРС сопряжена с вопросом взаимосвязей между показателями того или иного хомпартмента иммунной системы. Изучение этих взаимосвязей позволяет конкретизировать

механизмы расстройств врождённой иммунной системы и связать эти механизмы с нарушением экспрессии РГЖ на конкретных клетках воспалительного инфильтрата в носовых полипах и на клетках периферической крови. В табл. 3 представлены результаты корреляционного анализа экспрессии ТЫ1 -1-10 рецепторов на моноцитах периферической крови и ОАВ-позитивными клетками в ткани носовых полипов.

Таблица 3

Корреляционная взаимосвязь между экспрессией IX К 1-10 рецепторов на моноцитах периферической крови больных ПРС и абсолютным количеством 'П К 1-10 -позитивных клеток в ткани носовых полипов.

Рецепторы г Р

Т1.К 1 0,675 р>0,05

ТЬЯ 2 0,391 р=0,225

тъяз 0,149 р=0,594

ТЫ* 4 -0,869 р=0,007

ТЬЯ5 -0,2 р>0,05

ТЬЯб 0,425 р>0,05

ТЬК 7 0,830 р=0,028

ПЯ8 0,8 р>0,05

Т1Л9 0,523 р=0,047

ТЬЯ 10 -0,443 р>0,05

Примечание: г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена; статистически достоверные значения г выделены жирным шрифтом.

Из таблицы видно, что достоверная сильная прямая корреляционная взаимосвязь определялась между ТЬЯ-7 - позитивными моноцитами периферической крови и Т1Л1-7-позитивными клетками в составе воспалительного инфильтрата в носовых полипах (г =0,830, р=0,028). Достоверная средняя прямая корреляционная взаимосвязь определялась между ТЬК-9-1Юзитивны\ш моноцитами и аналогичными клетками в ткани (г =0,523, р=0,047). Имея в виду, что количество ТЬГ<-7 позитивных моноцитов достоверно снижено в периферической крови больных ПРС, можно предположить аналогичное снижение ТЬК-позитивных клеток в составе воспалительного инфильтрата. Противоположная картина наблюдается по отношению к ТЪЯ -9-позитивным моноцитам и клеткам воспалительного инфильтрата. В этом случае отмечается увеличение, хотя не достоверное, уровня ТЬК -9-позитивных клеток в периферической крови, соответственно можно предположить, что аналогичное увеличите ожидает эти клетки и в ткани носовых полипов.

В табл. 4 представлены аналогичные данные, но по отношению к гранулоцитам периферической крови больных ПРС. Из всех исследованных показателей достоверная

сильная положительная корреляционная взаимосвязь была выявлена у Т1,Я -1-позитивных клеток (г =0,971, р<0,02) и у ТЪЛ -7- позитивш>1х клеток (г =0,884, р=0,012), в то время как у ТЬЯ - 4 -позитивных клеток определялась достоверная отрицательная средняя корреляционная взаимосвязь (г =-0,681, р=0,05). На основании того, что Т/.К -7-позитивные гранулоциты достоверно снижались в группе больных ПРС, а также на основании характера корреляционной взаимосвязи можно заключить, что снижение этих клеток затрагивает не только периферическую кровь, но и воспалительный инфильтрат в носовых полипах. Интерпретация же взаимосвязей ТЫ1 -1-позитивных гранулоцитов носит противоположный характер, а именно -сопряжённое увеличение этих клеток и в периферической крови, и в ткани носовых полипов. Очевидно, что активированные ТЬК -1 и ИЛ1 -7-позитивные гранулоциты из кровотока заносятся в ткань носовых полипов в разных количественных отношениях, обеспечивая участие механизмов врождённого иммунитета в патогенезе ПРС.

Таблица 4

Корреляционная взаимосвязь между экспрессией ТЬЯ 1-10 рецепторов на гранулоцитах периферической крови больных ПРС и абсолютным количеством ТЬЯ- 1-10-позитивных клеток в ткани носовых полипов.

Рецепторы г Р

Т1ЛП 0,971 р<0,02

Т1Л12 0,311 р=0,273

Ш13 -0,158 р=0,573

Т1Л*4 -0,681 р=0,05

Т1Л15 0,071 р-0,843

ТТЛ 6 0,4 р>0,05

Т1Л7 0,884 р=0,012

Т1Л8 0,257 р>0,05

ТТЛ 9 -0,108 р=0,739

Т1Л 10 0,577 р=0,13

Примечание: г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена; статистически достоверные значения г выделены жирным шрифтом.

Корреляционные взаимосвязи между ПЛ-позитивными лимфоцитами периферической крови и 'ГЪЯ -позитивными клетками в составе воспалительного инфильтрата в носовых полипах выглядели следующим образом. Достоверная положительная сильная взаимосвязь определялась между ТЬЯ — 4 -позитивными клетками (г =1,000, р=0,000), достоверная положительная средняя взаимосвязь определялась между Т1 ,Т<-2-почитивными клетками (г =0,659, р=0,009) и ПЛ-З -позитивными клетками (г =0,653, р=0,01).

Проведена оценка клинической информативности изученных нами показателей на примере модуляции экспрессии ТЬ[<-5 и ТСЖ-7 рецепторов при ПРС на клетках периферической крови. Речь идёт о том. что на основании достоверных изменений экспрессии этих рецепторов и патофизиологических следствий этих изменений можно говорить о нарушениях конкретных механизмов врождённого иммунитета при ПРС и, самое главное, представить обоснованные предложения по модуляции (иммуиомодуляции) экспрессии этих рецепторов, в т.ч. и медикаментозными средствами, с лечебной целью. Выбор именно этих рецепторов был обусловлен тем, что их экспрессия характеризовалась диаметрально противоположными изменениями, в первом случае в сторону повышения, во втором - в сторону снижения.

2500 2000 1500 1000 500 0

ТЫ1-5

486

2357

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

То11-5

3383*

314'

Л"

J

Рис. 3

Диаграмма уровня экспрессии ТЫ1 -5 рецептора на клетках периферической крови в контрольной группе.

Рис.4

Диаграмма уровня экспрессии 1X11-5 рецептора на клетках периферической крови у больных ПРС.

На рис.3 представлена диаграмма интенсивности экспрессии ТЬЯ-5 рецептора на клетках периферической крови в контрольной группе. Эта диаграмма является той условной нормой, на которую мы ориентируемся при интерпретации данных. На рис. 4 представлена аналогичная диаграмма, но только по отношению к общей группе больных ПРС. Видно, что все показатели экспрессии ТЬЯ -5 рецептора на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови достоверно превышают контрольные (р<0,05).

Если обратиться к поведению другого рецептора - ТЫ1 -7, представленного на рис. 6, то видно, что все аналогичные показатели у больных ПРС достоверно снижены по сравнению с контрольной группой, рис.5, (р<0,05)

ТоН-7 ТоН-7

Рис. 5

Рис. 6

Диаграмма уровня экспрессии ТЬЯ -7 рецептора на клетках периферической крови в контрольной группе.

Диаграмма уровня экспрессии ТЬЯ -7 рецептора на клетках периферической крови у больных ПРС.

Таким образом, анализ экспрессии конкретных видов РЯК рецепторов на клетках периферической крови больных ПРС, а также изучение этих показателей во взаимосвязи с особенностями клинического состояния пациентов позволяет получить дополнительную информацию о механизмах нарушения врождённого иммунитета. Аналогичный подход вполне оправдан и в отношении иммуногистохимических параметров. Эта информация очень важна при составлении схем системной и/или топической иммунотролной терапии больных ПРС.

Выводы:

1.Комплексное общеклиническое исследование в соответствии с

дополнительными методами обследования позволило выделить группу больных с хроническим неспецифическим полипозным риносинуситом. Наиболее информативными в постановке диагноза явились эндоскопическое исследование полости носа, а также КТ носа и околоносовых пазух, которые определили объем оперативного вмешательства у пациентов с полипозным риносинуситом.У 20,6% данной группы пациентов отмечалось умеренное повышение уровня ^Е с преимущественной сенсибилизацией к бытовым и эпидермальным аллергенам,в меньшей степени к пыльцевым аллергенам.

2.Дополнительные методы обследования при полипозном риносинусите (ольфактометрия, исследование транспортной функции, передняя активная

риноманометрия, акустическая рииоманометрия) коррелируют со степенью распространенности полипоза и являются информативными в оценке результатов хирургического лечения.

3. Воспалительный инфильтрат при полипозпом риносинусите характеризуется наличием активированных клеток, экспрессирующих рецепторы врождённого иммунитета - с TLR-1 по TLR -10. Наибольшей клеточной плотностью отличались TLR-5, TLR-6, TLR-7 и TLR-10 позитивные клетки.

4. На моноцитах периферической крови больных ПРС определяется достоверное увеличение экспрессии в отношении TLR - 3,4,5 рецепторов и достоверное угнетение экспрессии TLR -7 рецептора;

На гранулоцитах - достоверное увеличение TLR - 4,5,9 и угнетение экспрессии TLR -7 и TLR -10 рецепторов;

На лимфоцитах- достоверная стимуляция экспрессии была зарегистрирована по отношению к TLR - 3 и TLR - 5 рецепторам , а достоверное угнетение экспрессии - по отношению к TLR -6 и TLR -7 .

5. Группа больных полипозным риносинуситом с уровнем эозинофилов в периферической крови до 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR - 3, 5 и 9 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах и уменьшением уровня TLR -7 позитивных моноцитов и лимфоцитов; группа больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR - 4 рецептора на гранулоцитах и лимфоцитах и угнетением экспресии TLR -10 рецептора на гранулоцитах. Фиброзно-отечный тип носовых полипов сопровождался стимуляцией TLR -5 позитивных гранулоцитов и лимфоцитов и угнетением экспрессии TLR -7 и TLR -10 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС; отёчный тип полипов — достоверным увеличением уровня TLR -3 позитивных моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов в ткани носовых полипов и угнетением экспрессии TLR -5 рецептора на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС.

6. Изучение корреляционных взаимосвязей между TLR -1-10 позитивными клетками в системной циркуляции и в ткани носовых полипов показало наличие сильной положительной достоверной взаимосвязи между TLR -1 и TLR-7 позитивными клетками и сильной отрицательной достоверной взаимосвязи между TLR - 4 позитивными клетками.

Практические рекомендации

1.Ha современном этапе развития клинической иммунологии комплексное изучение иммунного статуса больных полипозным риносинуситом должно включать и оценку состояния врождённого иммунитета.

2. При изучении врождённого иммунитета в клинической практике необходимо проводить одновременную оценку и системного, и местного врождённого иммунитета методами иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии.

3. Практическая значимость изучения состояния врождённого иммунитета при полипозном риносинусите состоит в том, что открывается перспектива применения средств системной и/или топической иммунотропной терапии, направленной на модуляцию экспрессии TLR -1-10 и Nod-2 рецепторов и соответствующего влияния на течение и рецидивирование полипозного риносинусита.

Список работ, опубликованных в журналах ВАК:

1. Саидов М. 3., Давудов X. Ш., Давудова Б. X. и др. Экспрессия То11-подобных рецепторов в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом // Иммунология. - 2009. - N 5. - С. 272-278.

2. Давудова Б.Х., Саидов М. 3., Дайхес Н. А. и др. Изменения показателей врождённого иммунитета в зависимости от эозинофилии в периферической крови при полипозных риносинуситах //Российская оториноларингология. - 2009,- N5,- С. 27-35.

3. Давудова Б. X., Саидов М. 3., Дайхес Н. А. и др. Зависимость экспрессии Toll -подобных рецепторов от патоморфологии носовых полипов при полипозном риносинусите // Вестник оториноларингологии. - 2010,- N3. - С. 32-36.

4. Саидов М. 3., Давудова Б. X., Климова С. В. и др. Оценка корреляционных взаимосвязей между CD-позитивными клетками и экспрессией Toll -подобных рецепторов при полипозном риносинусите // Иммунология. - 2010. - N 1. - С. 28-34.

5. Саидов М.З., Давудова Б. X., Пинегин Б. В. и др. Клиническая значимость взаимосвязей показателей системного и местного адаптивного и врождённого иммунитета на примере полипозного риносинусита. // Иммунология. - 2010. - N 2. -С. 101-107.

6. Саидов М. 3., Давудова Б. X., Магомедова К. М. Современные представления об иммунопатогенезе полипозного риносинусита // Иммунология,- 2010.- N 5. - С. 261269.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

7. Давудова Б. X., Саидов М. 3., Дайхес Н. А. и др. Взаимосвязь эозииофплии периферической крови и показателей врожденного иммунитета при полипозных риносинуситах // Актуальное в оториноларингологии: материалы конференции (Москва, 2009 г). - М., 2009. - С. 91-92.

8. Давудова Б. X., Саидов М. 3., Дайхес Н. А. и др. Экспрессия TLR - рецепторов в зависимости от патоморфологии носовых полипов при полипозном риносинусите. // Высокие медицинские технологии: тез. докл. (Москва, 2009 г.). М., 2009. - С. 103 -104. 9..Davudova В. Kh. Study of the relationship between eosinophilia and the expression of Toll-like receptors on the peripheral blood cells and nasal polypous tissue in polypous rhinosinusitis. //Folia Otorhinolaryngol. Pathol. Respir. - 2010.-V 16. - № 2 .- C. 68 - 70.

Список сокращений

ПРС - полипозньш риносинусит

БА - бронхиальная астма

ЛПС - липополисахарид

мРНК - матричная РНК

ДК - дендритная клетка

АПК - антигенпрезентпрующие клетки

АГ - антиген

AT - антитело

ИГХ - иммуногистохимия

МАТ - моноклоналыше антитела

PRR - паттерн-распознающие рецепторы, рецепторы врождённого иммунитета TLR1-10 - (TOLL- подобные рецепторы врождённого иммунитета) с соответствующим порядковым номером

Nod-1, 2 - внутриклеточные рецепторы врождённого иммунитета

CD - кластер дифференцировки, обозначающий принадлежность клетки к

определённой клеточной популяции

DAB- диаминобензидин

ТНФ-а - тумор-некротический фактор - альфа

ИФ-у - интерферон - гамма

ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 - интерлейкины -1,-2, -4, -5 Г.-э. - гематоксилин-эозин

п/з - поле зрения ув.-увеличение

Подписано в печать 01.02.2011 г. Заказ № 99. Тираж 100 экз. Объем 1,5 пл. г. Москва, ул. Маршала Бирюзова, д. 1

Актуальность проблемы

Проблема полипозного риносинусита (ПРС) не теряет актуальности до настоящего времени. Многочисленные исследования не привели к принципиальным изменениям во взглядах на этиологию и патогенез этого заболевания. На сегодняшний день ни один из применяемых методов терапии, включая топическую стероидную терапию, не позволяет контролировать симптомы, рецидивы и течение ПРС [14,21,24,28,29,46].

Все методы лечения дают высокий процент ближайших рецидивов носовых полипов (от 20 до 60 %) [28,29,38,46,173]. Значительные нарушения дыхательной функции, развитие у 50-60% больных ПРС бронхиальной астмы существенно ухудшает качество жизни пациентов и обуславливает социальный аспект этой проблемы [14,22,32,46]. Тесная анатомо-физиологическая взаимосвязь носовой полости с бронхиальным деревом, единые (известные на сегодняшний день) патогенетические механизмы продуктивного воспаления и отёка слизистой оболочки, активация иммунопатологических процессов, этиологическая однотипность и генетические маркёры при бронхиальной астме (БА), астматической триаде, синдроме Картагенера, муковисцидозе и при ПРС позволяют найти черты сходства ПРС с системными иммунопатологическими процессами [1,31,32,52„62,66,82,98,166]. Именно эти данные позволили ведущим специалистам в этой области рассматривать ПРС как «астму носа» и применять при лечении ПРС стандарты, разработанные в отношении БА.

Несмотря на большое количество работ по клиническому аспекту этой проблемы [25,26,32,39,51,55,68,94,98], этиологии и эпидемиологии ПРС [22,32,46,51,56], патоморфологическому изучению ПРС [10,11,53,61,78,157], применению различных методов лечения, прежде всего хирургических [5,19,21,24,28,38,49], формулированию новых концепций патогенеза носовых полипов [10,34,41,51,70,106,152] существенного прогресса в решении этой проблемы не наблюдается.

Участники регулярно проводимых Международных консенсусных конференций по полипозному риносинуситу (последняя - European Position on Rhinosinusitis and Nasal Polips, 2008) до сих пор не могут прийти к единому мнению об этиологии, патогенезе и обоснованных стандартах лечения и ведения подобной группы пациентов.

Тем не менее, в соответствии с решениями Международных консенсусных конференций, эта форма воспалительного процесса представляется как хроническое продуктивное Th-2-зависимое эозинофильное воспаление, приводящее к ремоделированию слизистой оболочки носа, её отёку с последующим пролапсом слизистой оболочки и формированием носовых полипов [103,108,119,141,142,155].

Воспаление и отёк при ПРС, прогрессирующий рост носовых полипов, формирование двустороннего полипозного процесса в носу и околоносовых пазухах имеет уникальные особенности, связанные в первую очередь с нарушением местного и системного иммунного гомеостаза [1,13,15,103,107,121,149,156]. Уникальность этого патологического процесса состоит в том, что интерпретация местного эозинофильного продуктивного воспаления связывается со всеми достижения фундаментальной иммунологии и, прежде всего с изменениями адаптивного иммунитета.

Это заключение подтверждается результатами многочисленных работ, в соответствии с которыми у больных ПРС наблюдаются существенные изменения основных показателей системного и местного адаптивного иммунитета. Речь идёт, в частности, о колебаниях количественного уровня популяций и субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+ CD4+ CD8+ и др.), B-лимфоцитов, клеток макрофагально-моноцитарного ряда, уровня сывороточных иммуноголобулинов IgG, IgA, IgM и т.д. [13,15,91,155].

Однако, в связи с последними данными о роли врождённого (innate) иммунитета в индукции АГ-специфического, приобретенного (adaptive) иммунного ответа, интерпретация иммунопатогенеза ПРС претерпела существенные изменения. Речь идёт о том, что, в соответствии с современными представлениями, врождённый иммунитет является достаточно специализированным отделом иммунной системы, имеющим эволюционно закреплённый и генетически детерминированный рецепторный аппарат, специфическое взаимодействие которого с консервативными компонентами внешней оболочки микроорганизмов, приводит к мощной активации механизмов адаптивного иммунитета [72,74,109,133,135,136]. Рецепторы врождённого иммунитета (паттерн-распознающие рецепторы, или PRR-рецепторы), представлены, в частности, Toll 1-10-подобными и Nod 1,2 -рецепторами. Эти белки принимают активное участие в индукции антиген (АГ) - специфического (адаптивного) иммунного ответа. Современные концепции иммунитета отводят PRR-рецепторам фундаментальную роль в регуляции иммунного гомеостаза в целом [2,72,73,74,76,134,135,168]. По отношению к ПРС показано усиление экспрессии м-РНК TLR -2 и TLR -4-рецепторов и др. по сравнению с группой сравнения [102,122,128,142]. На эпителии носовых полипов отмечена экспрессия TLR -2, 3 и 4 рецептора, сопровождающаяся усилением выработки хемокинов, ростовых факторов и ИЛ-8 [128,174]. Дендритные клетки (С0208-позитивные), которые являются важнейшим компонентом врождённого иммунитета и локализуются в слизистой оболочке носа, при ПРС интенсивно экспрессировали TLR -2, TLR -4 и CD 14, что является свидетельством активации этого типа клеток. [156]. Укажем также, что в клинической практике достаточно подробно изучены все десять То11-подобных рецепторов у человека. Эти и другие результаты исследований подтверждают активное участие механизмов врождённого иммунитета в патогенезе ПРС [137,142,151,183].

С учётом того, что имеются достаточные основания отнести ПРС к системным иммунозависимым заболеваниям, очевидно, что изучение состояния врождённого иммунитета при ПРС существенно уточнит механизмы иммунопатогенеза ПРС.

Таким образом, значение указанных иммунных процессов в патогенезе ПРС несомненно. Не менее важно и то, что изучение врождённого иммунитета при ПРС позволит предложить новые лечебно-профилактические мероприятия этим больным. Однако клинико-иммунологических работ по изучению изменений показателей врождённого иммунитета при ПРС, основанных на современных информативных и высокоспецифичных методах научных исследований, мы не встретили.

Цель исследования:

На основании данных комплексного клинико-инструментального и лабораторных методов исследования изучить особенности течения полипозного риносинусита и дать оценку патогенетической значимости некоторых показателей системного и местного врожденного иммунитета у данной категории больных.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное клинико-инструментальное и лабораторные исследования у больных полипозным риносинуситом и оценить особенности клинического течения заболевания.

2.Определить значимость исследования различных функций носа в оценке степени тяжести заболевания и качества хирургического вмешательства у больных полипозным риносинуситом.

3. Провести иммуногистохимические исследования экспрессии Т1Л 1-10 и Иос1-2 рецепторов на клетках воспалительного инфильтрата в операционном материале носовых полипов больных полипозным риносинуситом.

4.Изучить экспрессию TLR 1-10 и Nod -2 -рецепторов на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах больных полипозным риносинуситом методом проточной лазерной цитофлуориметрии.

5.Оценить изменения показателей врождённого иммунитета в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов. б.Изучить корреляционную взаимосвязь экспрессии TLR 1-10 и Nod-2 -рецепторов на клетках периферической крови и на клетках воспалительного инфильтрата носовых полипов.

Научная новизна:

1.В работе впервые представлены данные экспрессии TLR 1-10 Nod-2 - рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови больных ПРС.

2. Впервые представлены данные иммуногистохимического изучения наличия и клеточной плотности TLR 1-10-позитивных клеток в составе воспалительного инфильтрата ткани носовых полипов.

3.Полученные результаты проанализированы с точки зрения уровня эозинофилов в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов, дана оценка клинической значимости этой информации.

4.Впервые получены данные наличия и/или отсутствия прямой сильной и достоверной корреляционной взаимосвязи между уровнем TLR 1-10-позитивных моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов периферической крови и TLR 1-10 - позитивными клетками в ткани носовых полипов как в общей группе обследованных больных, так и в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови и патоморфологического типа носовых полипов.

5.Полученные данные позволили оценить патогенетическое значение нарушений механизмов врождённого иммунитета при ПРС. Интерпретация полученных данных проведена с учётом самых последних данных в области клинической иммунологии заболеваний JIOP-органов, что позволило рекомендовать новые подходы к лечению ПРС, а также обосновать дальнейшие перспективные исследования в этой области.

Практическая значимость:

Практическая значимость полученных результатов состоит в том, что на основании новых данных об иммунопатогенезе ПРС открываются новые возможности модуляции активности системы врождённого иммунитета при ПРС. Это касается как местного, так и системного врождённого иммунитета. С учётом отсутствия в настоящее время специфических методов лечения ПРС, подобное направление в системной и/или местной иммунотропной терапии ПРС, несомненно, актуально и перспективно.

На основании анализа полученных данных оценена информативность показателей врождённого иммунитета в клинической практике. Рекомендуется при комплексной оценке системы иммунитета больных с патологией ЛОР-органов, в т. ч. и при ПРС, обязательно включать изучение местного и системного врождённого иммунитета методами иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии.

Результаты настоящей работы, полученные на основании новых методологических подходов к изучению проблемы ПРС, отражают фундаментальные механизмы иммунопатогенеза этого заболевания, а также перспективные способы модуляции экспрессии рецепторов врождённого иммунитета.

Личное участие автора в получении результатов исследования

Обследование больных, заполнение медицинской документации, ведение индивидуальных карт обследованных пациентов проведены лично автором. Диагностические исследования, операции полипотомии носа и послеоперационное наблюдение также проведены автором, либо при её активном участии. Автором освоены методы иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии и она принимала активное участие в их проведении. Анализ полученных данных, статистическая обработка результатов, оформление публикаций и диссертации проведены лично автором.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Иммунопатогенез полипозного риносинусита тесно связан с нарушениями местного и системного врождённого иммунитета.

2.Воспалительный инфильтрат при ПРС характеризуется наличием активированных клеток, экспрессирующих рецепторы врождённого иммунитета - с TLR -1 по TLR -10. Наибольшей клеточной плотностью отличались TLR-5, TLR-6, TLR-7 и TLR-10 позитивные клетки.

3. Клетки периферической крови больных ПРС экспрессируют PRR рецепторы с разной интенсивностью. В гранулоцитарной популяции достоверно увеличивается экспрессия TLR -4,5,9 рецепторов и угнетается экспрессия TLR -7 и TLR -10 рецепторов. В моноцитарной популяции достоверно увеличивается экспрессия TLR -3,4,5 и угнетается экспрессия TLR -7 рецептора. В лимфоцитарнойой популяции - усиление экспрессии TLR -3 и 5 рецепторов и угнетение — TLR -6 и 7 рецепторов.

4.Уровень эозинофилов в периферической крови больных ПРС, а также патоморфологический тип носовых полипов сопровождается достоверными изменениями интенсивности экспрессии спектра PRR рецепторов. Это касается, в частности, TLR -3, 4, 5 и 9 рецепторов.

5. На основании наличия сильных, достоверных, положительных корреляционных взаимосвязей у больных ПРС можно заключить, что в ткани носовых полипов при количестве эозинофилов в периферической крови свыше 150 кл/мкл и отёчном типе носовых полипов увеличивается уровень TLR -3 позитивных клеток; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов увеличивается уровень TLR -1 и TLR -9 позитивных клеток; при количестве эозинофилов до 150 кл/мкл увеличивается уровень TLR -2 позитивных клеток. Все клетки гематогенного происхождения.

6. Применение системных и/или топических средств модуляции экспрессии TLR -1-10 и Nod-2 рецепторов (рецепторов врождённого иммунитета) открывает новые перспективы в отношении иммунотропной терапии при полипозном риносинусите.

Апробация работы

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на:

XXVI Международной конференции молодых оториноларингологов(Санкт-Петербург, Дом Ученых,26-27мая 2010г.);

- The 44th Congress of the Polish Society of Otorhinolaryngologists, Head and Neck Surgeons(BapinaBa 9-12 июня 2010г.)

Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции ФГУ «НКЦ оториноларингологии ФМБА России» 15 сентября 201 Огода.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 6 в рецензируемых журналах, входящих в бюллетень ВАК.

Внедрение результатов исследования в практику и учебный процесс:

Итоговые материалы диссертации используются при комплексной оценке иммунной системы больных ПРС в ЛОР-отделении 67 клинической больницы г. Москвы и ринологического отделения Республиканской клинической больницы г. Махачкалы. Полученные результаты клинико-иммунологических исследований используются при чтении лекций, проведении семинаров и практических занятий на кафедрах JIOP- болезней и патофизиологии, а также курсе клинической иммунологии со студентами и клиническими ординаторами Дагестанской государственной медицинской академии. Материалы диссертации используются при составлении учебных методических пособий, а также практических рекомендаций для ЛОР - врачей.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками, 30 таблицами и 8 диаграммами. Список литературы включает 184 источника, из них 80 отечественных и 104 иностранных.

128 Выводы

1 .Комплексное общеклиническое исследование в соответствии с дополнительными методами обследования позволило выделить группу больных с хроническим неспецифическим полипозным риносинуситом. Наиболее информативными в постановке диагноза явились эндоскопическое исследование полости носа, а также КТ носа и околоносовых пазух, которые определили объем оперативного вмешательства у пациентов с полипозным риносинуситом. У 20,6% данной группы пациентов отмечалось умеренное повышение уровня IgE с преимущественной сенсибилизацией к бытовым и эпидермальным аллергенам, в меньшей степени к пыльцевым аллергенам.

2.Дополнительные методы обследования при полипозном риносинусите (ольфактометрия, исследование транспортной функции, передняя активная риноманометрия, акустическая риноманометрия) коррелируют со степенью распространенности полипоза и являются информативными в оценке результатов хирургического лечения.

3.Воспалительный инфильтрат при полипозном риносинусите характеризуется наличием активированных клеток, экспрессирующих рецепторы врождённого иммунитета - с TLR-1 по TLR-10. Наибольшей клеточной плотностью отличались TLR-5, TLR-6, TLR-7 и TLR-10 позитивные клетки.

4.На моноцитах периферической крови больных ПРС определяется достоверное увеличение экспрессии в отношении TLR-3,4,5 рецепторов и достоверное угнетение экспрессии TLR-7 рецептора;

На гранулоцитах - достоверное увеличение TLR-4,5,9 и угнетение экспрессии TLR-7 и TLR-10 рецепторов;

На лимфоцитах - достоверная стимуляция экспрессии была зарегистрирована по отношению к TLR-3 и TLR- 5 рецепторам, а достоверное угнетение экспрессии - по отношению к TLR -6 и TLR -7 .

5. Группа больных полипозным риносинуситом с уровнем эозинофилов в периферической крови до 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR-3, 5 и 9 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах и уменьшением уровня TLR-7 позитивных моноцитов и лимфоцитов; группа больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл характеризовалась стимуляцией TLR-4 рецептора на гранулоцитах и лимфоцитах и угнетением экспресии TLR-10 рецептора на гранулоцитах; фиброзно-отёчный тип носовых полипов сопровождался стимуляцией TLR-5 позитивных гранулоцитов и лимфоцитов и угнетением экспрессии TLR-7 и TLR-10 рецепторов на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС; отёчный тип полипов — достоверным увеличением уровня TLR -3 позитивных моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов в ткани носовых полипов и угнетением экспрессии TLR-5 рецептора на моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах больных ПРС.

6. Изучение корреляционных взаимосвязей между TLR-1-10 позитивными клетками в системной циркуляции и в ткани носовых полипов показало наличие сильной положительной достоверной взаимосвязи между TLR-1 и TLR-7 позитивными клетками и сильной отрицательной достоверной взаимосвязи между TLR-4 позитивными клетками.

Практические рекомендации

1 .На современном этапе развития клинической иммунологии комплексное изучение иммунного статуса больных полипозным риносинуситом должно включать и оценку состояния врождённого иммунитета.

2. При изучении врождённого иммунитета в клинической практике необходимо проводить одновременную оценку и системного, и местного врождённого иммунитета методами иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии.

3. Практическая значимость изучения состояния врождённого иммунитета при полипозном риносинусите состоит в том, что открывается перспектива применения средств системной и/или топической иммунотропной терапии, направленной на модуляцию экспрессии ТЬЯ-1-10 и N0(1-2 рецепторов и соответствующего влияния на течение и рецидивирование полипозного риносинусита.