Автореферат и диссертация по медицине (14.01.03) на тему:Состояние и взаимосвязи показателей системного и местного адаптивного иммунитета при полипозном риносинусите.

На правах рукописи

Л1?

Магомедов;! Камила Магомедовна

Состояние и взаимосвязи показателей системного и местного адаптивного иммунитета при полипозном риносинусите

14.01.03 - болезни уха, горла и носа

14.03.09 - клиническая иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

4850335

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 ИЮН 2011

Москва-2011

4850335

Работа выполнена в федеральном государственном учреждении «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России» и государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия».

Научные руководители:

доктор медицинских наук Отвагин Игорь Викторович,

доктор медицинских наук профессор Саидов Марат Зиявдинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Карпова Елена Петровна доктор медицинских наук, профессор Гущин Игорь Сергеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Защита состоится «21» июня 2011 года в /часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.059.01 при ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России» по адресу: 123182 г. Москва, Волоколамское шоссе 30/6

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России» по адресу: 123182 г. Москва, Волоколамское шоссе 30/6.

Автореферат разослан

2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук:

Список сокращений

ПРС - полипозный риносинусит

БА - бронхиальная астма

ИДС - иммунодефицитное состояние

ЛПС - липополисахарид

мРНК - матричная РНК

ДК - дендритная клетка

Эф - эозинофилы

Нф - нейтрофилы

Мф - макрофаги

АГ - антиген

AT - антитело

ИГХ - иммуногистохимия

МАТ - моноклональные антитела

CD - кластер дифференцировки, обозначающий принадлежность клетки к определённой

клеточной популяции

DAB- диаминобензидин

ТНФ-а - тумор-некротический фактор-альфа

ИФ-у - интерферон-гамма

ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 - интерлейкины -1,-2, -4, -5 г.-э. - гематоксилин-эозин п/з - поле зрения ув. - увеличение

IgG, IgGl, 2, 3,4 - иммуноглобулин G и его субклассы igM - иммуноглобулин М

IgA, IgAl, 2 - иммуноглобулин А и его субклассы FITS - флуоресцеин-5-изотиоцианат РЕ - фикоэритрин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Изучение состояния адаптивной иммунной системы при полипозных риносинуситах (ПРС) не теряет актуальности до настоящего времени, поскольку постоянно меняющиеся представления о фундаментальных процессах иммунного воспаления неизбежно сказываются на текущих взглядах о патогенезе ПРС. Этиология и патогенез ПРС остаются неясными. Многочисленные работы в этом направлении не изменили ситуацию. Тем не менее, взгляды на патогенез ПРС в последнее время подверглись существенным изменениям, связанными в первую очередь с передовыми достижениями в области клинической иммунологии заболеваний JlOP-органов.

Несмотря на очевидные результаты в изучении патогенеза и лечения ПРС, частота и тяжесть клинических проявлений ПРС не снижаются. Так, по данным Г.М. Портенко (2002) ПРС встречается от 1,3 до 4% случаев от общего количества обследованных групп населения. Применение новых средств лечения, включая кортикостероидные препараты, существенно не снижает частоту рецидивов носовых полипов. Несомненно, что все проявления респираторной аллергии при ПРС носят системный характер (Л.Б. Секретарша, 2005; J. Staikniene et al., 2008). Так, частота ПРС при аспириновой бронхиальной астме (БА) колебалась от 36 до 61% (А.Г. Волков с соавт., 2007). С учётом единых патогенетических механизмов развития иммунного воспаления слизистой оболочки, развития отека и нарушения функций внешнего дыхания при БА и при ПРС, очевидно, что это лишь разные проявления одного и того же патологического процесса на различных участках дыхательного тракта. Именно поэтому в соответствии с решениями международных консенсусных конференций ПРС образно определяют как «астму носа», применяя при этом все термины современной иммунологии, относящиеся к иммунопатогенезу этого процесса. Кроме этого, подобный подход обосновывает формирование лечебных стандартов при ПРС, принципиально не отличающихся от таковых при лечении БА (Р. Младина с соавт., 2005; J. Goserpath et al., 2006).

В соответствии с результатами работы IV Международной консенсусной конференции по ПРС (European Position on Rhinosinusitis and Nasal Polips, 2006) и последующих конференций аналогичного формата, ПРС определяется как хроническое продуктивное Th-2-зависимое эозинофильное воспаление, приводящее к ремоделированию слизистой оболочки носа, её отёку с последующим пролапсом слизистой оболочки и формированием носовых полипов (M.J. Ramanathan et al., 2008;

Y. Korono et al., 2006; W. Mann et a!., 2006). Акцент на Th-2-зависимый характер воспалительного процесса указывает, во-первых, на ведущую роль изменений со стороны системного и местного иммунитета больных ПРС, во-вторых, на превалирование продукции спектра Th-2-зависимых провоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и др.), обуславливающих преимущественно эозинофильный и IgE-зависимый характер хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке носа и, в-третьих, на заметную роль функциональной активности CD4+Th-2 субпопуляции Т-лимфоцитов в имыуиопгстогеиезе ПРС.

Наиболее активными «триггерами» хронического воспаления в слизистой оболочке носа являются суперантигены St. Aureus, а также риновирусная и грибковая инфекции, специфические свойства которых обуславливают важнейшую особенность воспаления при ПРС, а именно: преобладание эозинофилов в составе воспалительного инфильтрата.

Как указывалось, формирование носовых полипов является следствием хронического Th-2-зависимого эозинофильного воспаления, приводящего к ремоделированию слизистой оболочки носа (M.J. Ramanathan et al., 2008). Такой тип воспалительного процесса закономерно приводит, во-первых, к гиперпродукции провоспалительных цитокинов (ТНФ-а, ИЛ-1, ИЛ-5, ИЛ-8. ИЛ-13), эозинофильных факторов воспаления (ESP, МВР), факторов роста (TGF-P), факторов ангио- и неоангиогенеза, хемокинов (RANTES, Eotaxin), адгезионных молекул (1САМ-1, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) и, во-вторых, к активации клеток, прежде всего, иммунной системы, in situ и активному участию этих клеток в формировании воспаления в слизистой оболочке носа. Показано участие в этих процессах активированных Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, С08+-клеток), естественных киллеров (ЕК), активированных эозинофилов (CD34+-wieTKH), В-лимфоцитов (С020+кпеток), плазматических клеток, тучных клеток, несущих lgE-рецептор и др. (R. Pawankar et al., 2007; S. Morinaka, 2000). Концентрация ключевого цитокина, ответственного за активацию и кумуляцию эозинофилов в очаге воспаления, а именно - ИЛ-5 и рецептора к ИЛ-5, у больных ПРС была в 1200 раз (!) выше по сравнению с контролем (P. Gevaert et al., 2006). Представленные данные иммунопатогенеза носовых полипов подчёркивают многогранность этого патологического процесса.

Очевидно, что дальнейшие исследования иммунопатогенеза ПРС, и, прежде всего, системы адаптивного иммунитета, с применением современных, высокоспецифичных методов иммунологических исследований будут иметь не только научную, но и практическую ценность.

Цель исследования:

Провести клинико-иммунологическое изучение системного и местного адаптивного иммунитета у больных с полипозным риносинуситом и дать оценку корреляционных взаимосвязей полученных показателей для определения основных направлений медикаментозной терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить анамнестические и клинические особенности больных полипозным риносинуситом.

2. Проанализировать сопутствующие заболевания у больных с ПРС в зависимости от уровня эозинофилов в периферичекой крови.

3. Изучить наличие и количественное содержание СО-позитивных клеток в составе воспалительного инфильтрата носовых полипов и оценить состояние системного клеточного и гуморального иммунитета при полипозном риносинусите.

4. Проанализировать изменения иммунофенотипа клеток воспалительного инфильтрата в носовых полипах и показателей системного клеточного и гуморального иммунитета в зависимости от наличия или отсутствия эозинофилии в периферической крови, частоты рецидивов заболевания, а также патоморфологии носовых полипов.

5. Оценить патогенетическую значимость достоверных корреляционных взаимосвязей между СО-позитивными клетками в периферической крови и в воспалительном инфильтрате носовых полипов в зависимости от патоморфологии носовых полипов, рецидивов заболевания и эозинофилии в периферической крови.

6. На основании клинико-иммунологического анализа полученных результатов дать рекомендации по основным направлениям медикаментозной терапии.

Научная новизна

Впервые показано, что на фоне продуктивного преимущественно эозинофильного воспаления клеточный инфильтрат в носовых полипах включает в себя все основные компоненты адаптивного иммунитета - СОЗ+, С04+, С08+ и С020+-клетки, а также естественные киллеры (С056+), макрофаги (С068+) и дендритные клетки (С035+),

Впервые выявлено, что изменения со стороны системного адаптивного иммунитета носят комплексный характер, в частности, достоверное снижение С04+ и С020+-лимфоцитов в периферической крови больных ПРС можно интерпретировать как состояние вторичного транзиторного иммунодефицита.

Впервые установлено, что у больных полипозным риносинуситом с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл определяется достоверное снижение CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов, а у больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл подобный дефицит адаптивного иммунитета отсутствует.

Впервые показано, что рецидивирование полипозного риносинусита также сопровождается достоверным угнетением содержания CD4+ и С08+-лимфоцитов, однако безрецидивное течение ПРС ассоциировано со стимуляцией экспрессии С068-маркёра на моноцитах и гранулоцитах периферической крови.

Впервые выявлена связь патоморфологического типа носовых полипов с изменениями адаптивного иммунитета, а именно: отёчный тип связан с угнетением уровня CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов как в периферической крови, так и в ткани носовых полипов, наряду со стимуляцией интенсивности экспрессии С068-маркёра на моноцитах и гранулоцитах и lgG-позитивных клеток в периферической крови; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов такие изменения не определяются.

Впервые определена достоверная сильная положительная корреляционная взаимосвязь по CD8+, С020+-лимфоцитам и по С068+-клеткам, а также отрицательная сильная корреляционная взаимосвязь по CD3+, СР8+-лимфоцитам и СОб8+-клеткам in situ и в системной циркуляции, что необходимо учитывать при назначении системной и/или топической иммунотропной терапии.

Практическая значимость

На основании результатов, полученных в настоящей работе, можно утверждать, что патогенез полипозного риносинусита связан с комплексными изменениями адаптивного иммунитета: базисные показатели адаптивного иммунитета, такие как уровень Т- и В-лимфоцитов, некоторые Ig-продуцирующие клетки снижены, ассоциация ПРС со вторичным, транзиторным, иммунодефицитным состоянием вполне обоснована. На этом основании рекомендуется при обследовании больных ПРС в оценку иммунного статуса включать методы иммуногистохимии и проточной цитометрии с целью изучения основных параметров адаптивной иммунной системы как в системной циркуляции, так и в ткани носовых полипов. В первом случае объектом исследования являются клетки периферической крови, во втором - операционный, либо биопсийный материал.

Анализ полученных данных позволяет обосновать применение системных или топических иммунотропных средств в комплексном лечении больных ПРС. При этом учитываются такие факторы как снижение, либо повышение уровня основных параметров системного или местного адаптивного иммунитета. Кроме этого учитывается

необходимость одновременного применения других средств лечения, в частности, противовоспалительной терапии, которая обладает в т.ч. и иммунодепрессивным эффектом (кортикостероиды и др.).

Личное участие автора в получении результатов исследования

Отбор, обследование, наблюдение, лечение, заполнение медицинской документации больных ПРС, включённых в работу, проведено лично автором. Все операции полипотомии проведены с участием автора. Автор освоила методы иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии, все исследования с применением этих методов проведены при активном участии автора. Анализ и обобщение полученного материала, статистическая обработка, формирование баз данных первичного материала, публикации по полученным данным также проведены автором работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Критерии отбора больных с ПРС для проведения дополнительных иммунологических исследований.

2. Состав клеточного воспалительного инфильтрата в носовых полипах.

3. Изменения адаптивного иммунитета у больных ПРС в группах:

- с эозинофилией до- и свыше 150 кл/мкл;

- с рецидивированием и без рецидивирования ПРС;

- с различной морфологичекой структурой носовых полипов.

4. Рекомендации по лечению больных ПРС в зависимости от выявленных изменений адаптивного иммунитета.

Внедрение результатов исследования в практику и учебный процесс

Клинико-экспериментальные результаты, полученные в настоящей работе, являются основой при составлении плана обследования адаптивной иммунной системы больных ПРС, поступающих стационар, и эти подходы используются специалистами JIOP-отделения ГКБ №67 г. Москвы, а также сотрудниками ринологического отделения и отделения болезней JIOP-органов Республиканской клинической больницы г. Махачкалы. Данные комплексного обследования больных ПРС используются при чтении лекций, проведении семинарских и практических занятий по заболеваниям ЛОР-органов с курсантами факультета повышения квалификации на базе ГКБ №67 г. Москвы и Даггосмедакадемии. Кроме этого, итоговые материалы работы используются в учебном

процессе на кафедре патофизиологии и на курсе клинической иммунологии Даггосмедакадемии.

Апробация работы

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- XXVI Международной конференции молодых оториноларингологов (Санкт-Петербург, Дом Ученых, 26-27мая 2010 г.);

- The 44й Congress of the Polish Society of Otorhinolaryngologists, Head and Neck Surgeons (Варшава 9-12 июня 2010 г.)

- Ill Международный съезд оториноларингологов Узбекистана, Ташкент 8-9 октября 2010 г.

Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции ФГУ «НКЦ оториноларингологии ФМБА России» 28 октября 2010 г. Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 в рекомендуемых журналах, входящих в бюллетень ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 30 таблицами. Список литературы включает 202 источника, из них 77 отечественных и 125 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследования

В соответствии с целью и задачами работы были обследованы тематические больные на базе ЛОР-отделения ГКБ №67 г. Москвы, а также на базе ринологического отделения и отделения болезней ЛОР-органов Республиканской клинической больницы г. Махачкалы. Всего обследовано 38 пациентов. После проведения всех этапов клинического и лабораторно-инструментальных исследований всем больным был поставлен диагноз хронического полипозного риносинусита или полипозного гаймороэтмоидита с рецидивами или впервые выявленный. Возраст больных колебался от 18 до 70 лет, из них мужчин было 23, женщин - 15.

Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. Для проведения исследований было получено одобрение местных

этических комитетов. При обследовании больных особое внимание уделялось изучению анамнеза заболевания. Все больные заполняли анкеты, где подробно отвечали на вопросы по следующим пунктам: начало и длительность течения заболевания, наличие или отсутствия и количество рецидивов, наличие сведений о проводившихся ранее внутриносовых операции, объем и вид хирургических вмешательств, о проводившемся консервативном лечении, длительность ремиссии, наличие и частота гнойных воспалений, частота приема антибиотиков и с какого возраста, наличие аллергии сезонной, круглогодичной, аллергии на лекарственные препараты, наличие сопутствующих заболеваний, в том числе хронических заболеваний, частоты заболеваемости респираторными инфекциями и т. д. После лабораторно-инструментального обследования (передняя и задняя риноскопия, эндоскопическое исследование полости носа, рентгенография и компьютерная томография околоносовых пазух по показаниям, бактериологическое исследование отделяемого) больным было проведено первым этапом хирургическое лечение: полипотомия носа, эндоскопическая гаймороэтмоидотомия или полисинусотомия. Операционный материал в обязательном порядке направлялся на патоморфологическое и иммуногистохимическое исследования, а так же проводилось цитофлуориметрическое исследование периферической крови. От пациентов было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании и операцию, которое было внесено в историю болезни. Контрольную группу составили 18 здоровых добровольцев в возрасте от 27 до 54 лет.

Всем больным были проведены общепринятые лабораторно-инструментальные исследования, включая стандартную патоморфологию, результаты которых были введены в анализ полученного материала.

Иммуногистохимические исследования операционного материала были проведены как на криосрезах, так и на парафинизированных срезах. С этой целью использовались МАТ к CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD35, CD56, СОб8-маркёрам и поликлональные антитела к человеческому IgA, IgG и IgM. Применялись антитела компании Dako. Для визуализации результатов иммуногистохимических исследований использовалась тест-система EnVision+Dual Link System-HRP, (DAB), Dako. Методика иммуногистохимических исследований осуществлялась в строгом соответствии с рекомендациями компании Dako.

Наиболее демонстративные препараты сканировались в световом микроскопе «Leica DMLB» со встроенной видеокамерой по программе «Leica QWin Colour (GB) for Image Analysis». Видеоизображения переносились на флеш-карту и воспроизводились в тексте работы. Все препараты были подвергнуты морфометрии. Морфометрические

показатели определяли путем подсчета количества CD-позитивных клеток в нескольких полях зрения при увеличении х400 с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типичные для данного препарата поля зрения.

Цитофлуориметрические исследования клеток периферической крови больных ПРС проведены на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России», в отделе клинической иммунологии (зав. -проф. Б.В. Пинегин).

Использовались МАТ к CD3+, CD4+, CD8+ и CD20 фирмы «Сорбент», ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» и F(ab)2 фрагменты бараньих AT к иммуноглобулину мыши, меченных FITS. Определение CD14+, С068-позитивных клеток проводилось с использованием мышиных МАТ, меченных FITS (Dako), CD56-позитивных клеток - с использованием мышиных МАТ, меченных РЕ (Dako). Уровень IgG-, IgA- и IgM-позитивных клеток в периферической крови определялся с использованием поликлональных кроличьих антител, меченных FITS (Dako). В качестве изотопического контроля при цитометрии использовали lgG-фракцию от неиммунизированных мышей.

Проточную лазерную цитометрию проводили на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США), с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой клеточной взвеси выводили на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме «dot-plot». Анализ интенсивности флюоресценции и процента флюоресцирующих клеток проводили в зелёной (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой областях (РЕ) FL2 (585 нм). Клетки анализировались в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/с. Результат выражался в абсолютном количестве или в процентах флуоресцирующих клеток, либо в виде интенсивности флуоресценции, представленной в условных единицах флуоресценции (УЕФ). Данные обрабатывались с помощью программы «Cell Quest».

Статистическая обработка полученных результатов

Описательная статистика включала в себя выведение медианы (Me) и 25;75-процентилей для каждой из исследуемых выборок. При сравнении двух групп использовался Т-критерий Манна-Уитни. При множественных сравнениях - критерии Крускала-Уолеса и Данна. Корреляционную взаимосвязь между изученными параметрами определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г).

Значения р<0,05 рассматривались как статистически значимые.

Патогенетически значимые зависимости выводились на основании наличия сильных (г>0,7 и более), достоверных (р<0,05) и положительных корреляционных

взаимосвязей. В работе использовались компьютерные программы Microsoft Office Excel и «Биостат 4.03» (С. Гланц, Медико-биологическая статистика, «Практика», Москва, 1999).

Основные результаты исследования и их обсуждение Под наблюдением находились 38 больных с полипозным риносинуситом. Среди обследованных больных преобладали мужчины по сравнению с женщинами, в возрастном аспекте заболевание встречалось преимущественно от 36 до 55 лет. По клиническому течению полипозный этмоидит наблюдался у 7 больных, гаймороэтмоидит - 26 и полисинусит - 5. Все больные с ПРС распределялись в зависимости от частоты рецидивов и уровня эозинофилов в периферической крови. Уровень 150 кл/мкл был взят нами как физиологическая норма. Тщательный анализ анамнестических и клинических данных дал следующие результаты. Группа больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл характеризовалась наличием в анамнезе частых заболеваний вирусной или бактериальной этиологии, длительным и частым приемом антибиотиков, течение ПРС часто осложнялось гнойным воспалением. При лабораторно-инсгрументальном обследовании выявлена сенсибилизация больных преимущественно к бактериальной и грибковой флоре, к бытовым и эпидермальным аллергенам. Группа больных с уровнем эозинофилов более 150 кл/мкл, в анамнезе у которых часто преобладали аллергические заболевания, была выявлена высокая сенсибилизация к пыльцевым и луговым аллергенам, к стафилококкам, уровень Ig Е составил 172.4±2.2 кЕ/л.

Определение частоты рецидивов в этих группах дал интересные результаты, представленные в таблице 1.

Таблица 1

Зависимость рецидивирования ПРС от уровня эозинофилов в периферической крови

Число пациентов Процент пациентов с рецидивами ПРС

Уровень эозинофилов до 150 кл/мкл 18 30%

Уровень эозинофилов выше 150 кл/мкл 20 81,6%

Как видно из таблицы 1, рецидивы преимущественно (81,6%) встречались в группе с уровнем эозинофилов более 150 кл/мкл, что являлось важным аспектом для дальнейшей тактики лечения.

При эндоскопической картине полипы в полости носа визуализировались как округлые образования, блестящие, гладкие, подвижные, существенно уменьшающие просвет полости носа, при контакте с зондом не кровоточили, исходили из среднего носового хода, структуры остиомеатального комплекса в основном были полипозно изменены, отделяемое слизисто-водянистого, вязкого или слизисто-гнойного характера.

При рентгенологическом исследовании определялись полиморфные изменения. Характерным было затемнения пятнистой структуры, неправильных очертаний. Часто затемнения накладывались друг на друга, определяя суммацию рентгенологической картины.

По показаниям некоторым больным (неоднократно оперируемым, с длительным течением заболевания и с тяжелым течением процесса) была проведена компьютерная томография во фронтальной, коронарной и аксиальной проекциях. На серии томограмм околоносовых пазух при полипозном риносинусите визуализировалась следующая картина. В разном объеме и степени распространенности верхнечелюстные, лобные, клиновидные и клетки решетчатого лабиринта, а так же полость носа вплоть до хоан были заполнены мягкотканым субстратом, на фоне которого структуры полости носа не всегда могли быть дифференцированы.

Выбор оперативного лечения определялся в зависимости от степени поражения полипозным процессом. Это была полипотомия носа, эндоскопическая гаймороэтмоидотомия или полисинусотомия. Послеоперационный материал направлялся для патоморфологического исследования, в результате которого выявлялись отечные или фиброзно-отечные полипы. Зависимость частоты рецидивирования в этих группах была следующая.

Таблица 2

Зависимость рецидивирования ПРС от патоморфологии носовых полипов

Число пациентов Процент пациентов с рецидивами ПРС

Фиброзно-отёчный полип 12 42,7%

Отёчный тип 26 57,6%

Иммуногистохимические исследования клеток воспалительного инфильтрата показали активное участие всех выше обозначенных СО-позитивных клеток в патогенезе ПРС. Наибольшей активностью отличались Т-лимфоциты (СОЗ+, С04+, СР8+) и СЭ35+-клстки, относящихся к классу ДК. Топография позитивных клеток, в целом, была неоднозначной. ОАВ-позитивные клетки располагались диффузно, с тенденцией к

субэпителиальной и периваскулярной локализации, их клеточная плотность варьировала. В качестве иллюстрации на рисунках 1 и 2 представлена типичная картина локализации СОЗ+ и С035+-клеток в составе воспалительного инфильтрата при ПРС. Отметим, что однозначная интерпретация полученных ИГХ-препаратов основывалась на высокой специфичности МАТ компании Оако.

Данные морфометрического подсчёта СО-позитивных клеток в общей группе больных ПРС представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, наибольшая клеточная плотность приходилась на СБЗ+-клетки, наименьшая - на С068+-клетки, т.е. лимфоцитарный компонент воспалительного инфильтрата был преобладающим. Кроме этого, С035+-клетки также имели достаточно выраженную клеточную плотность т зйи.

Рис. 1 Рис. 2

СБ-З позитивные клетки СО-35 позитивные клетки

в носовых полипах, ув. х400 в носовых полипах, ув. хЮО

Эти данные являются основополагающими при выборе средств топического медикаментозного воздействия при ПРС, поскольку основные клетки-мишенями для этого - Т-лимфоциты и дендритные клетки, являющиеся одновременно источником гиперпродукции вышеупомянутых провоспалительных цитокинов, хемокинов и | адгезионных молекул.

Таблица 3

Иммунофенотнп клеток воспалительного инфильтрата в носовых полипах, иммуногистохимические данные, Ме (25;75процентили)

СО-маркёры Носовые полипы п=38 Контрольная группа п=4

СБ 3+ 34 (27;43) 4-18

СБ 4+ 18 (12;27) 2-5

СБ 8+ 19(12;21) 5-8

СБ 20+ 13 (8;16) 0-4

СБ 35+ 17 (11;26) 0-5

СБ 56+ 11 (7; 12) 0-7

СБ 68+ 6 (4;9) 0-3

Примечание: СБ+ клетки воспалительного инфильтрата в носовых полипах представлены в виде абсолютного количества БАВ-позитивных клеток в п/з при ув. х400;

в контроле представлен диапазон количества БАВ-позитивных клеток в п/з при ув. х400; О - отсутствие БАВ-позитивных клеток.

В таблице 4 представлены данные по уровню клеток адаптивного иммунитета в периферической крови общей группы больных ПРС, а также интенсивность флюоресценции СБ68+-клеток в моноцитарном, гранулоцитарном и лимфоцитарном окнах.

Таблица 4

Показатели клеточного адаптивного иммунитета больных ПРС, данные проточной цитофлуориметрии, Ме (25;75процентили)

СО-маркёры Больные ПРС п=38 Контрольная группа п=15

СБ 3, абс. 1516 (924,2019) 1533 (1407;1701)

СБ 4, абс. 734 (470;1042)* 924 (756;1008)

СБ 8, абс. 795 (389;1061) 833 (693;882)

СБ 14, % 80 (73;83) 80 (78;86)

СБ 14, с 248 (204;364) 236 (193;300)

СИ 56, % 24 (20;41) 26 (19;28)

СБ 56, с 151 (130;216) 146 (130;174)

СБ 68, моноциты, с 350 (254;475)* 279 (248;324)

СБ 68,гранулоциты, с 208 (150;323) 171 (131;218)

СБ 68, лимфоциты, с 61 (48;95) 48 (39;60)

Примечание: абс. - абсолютное количество позитивных клеток в 1 мкл;

с - средняя интенсивность флюоресценции (условные единицы флуоресценции);

* р<0,05 по сравнению с контрольной группой (критерий Манна-Уитни).

Видно, что максимальное количество CD-позитивных клеток приходится на общую популяцию Т-лимфоцитов (СОЗ+-клстки), минимальное - на процент С05б+-клеток, что в целом соответствует количественным взаимоотношениям изученных клеток и ИГХ-исследованиям операционного материала от этих же больных.

Достоверная разница при сравнении с контрольной группой была определена в отношении С04+-клеток и CD68+-mohouhtob, причем в первом случае регистрировалось достоверное снижение (р<0,05), а во втором - достоверное повышение (р<0,05) изученных показателей. Кроме этого, тенденция к снижению уровня CD-позитивных клеток затрагивает все виды этих клеток, за исключением CD68+. Если рассматривать эти изменения во взаимосвязи с показателями местного адаптивного иммунитета, то очевидно, что одновременно у больных ПРС существует два типа изменений в системе адаптивного иммунитета - это активное участие CD-позитивных клеток в формировании воспалительного инфильтрата в носовых полипах и снижение количества этих клеток в системной циркуляции. Напротив, усиление интенсивности свечения С068+-клеток, являющееся признаком повышенной аффинности рецептора на клетках макрофагально-моноцитарного ряда к МАТ к С068-марк6ру в периферической крови, сопровождается незначительной клеточной плотностью этих клеток в ткани носовых полипов, что подтверждается достоверной обратной сильной корреляционной связью между этими показателями (г = -0,782, р<0,05). Кроме этого достоверная обратная средняя корреляционная взаимосвязь определялась по отношению к С020+-лимфоцитам (г = -0,462, р<0,05).

Представленные показатели местного и системного адаптивного иммунитета и их взаимосвязи были изучены нами с точки зрения наиболее важных в клиническом отношении факторов, а именно: наличия или отсутствия эозинофилии в периферической крови больных (граница эозинофилии - 150 кл/мкл), рецидивирующего или безрецидивного течения ПРС и патоморфологического типа носовых полипов (отёчные, либо фиброзно-отечные). Из всех перечисленных факторов остановимся на рецидивирующем и безрецидивном течении ПРС. До настоящего времени научные основы рецидивов носовых полипов в достаточной степени не разработаны.

Из обследованных 38 пациентов рецидивирующий полипоз встречался у 20, что составило 52% от общей группы. Частота рецидивов по данным анамнеза варьировала от 1-2 до 6-7. У пациентов с длительностью заболевания свыше 5 лет рецидивы встречались в 100% случаев, от I до 5 лет - в 57% случаев и с длительностью заболевания до 1 года рецидивы не встречались вообще. Интересно, что в группе больных с уровнем

эозинофилов свыше 150 кл/мкл частота рецидивов была в три раза выше по сравнению с группой больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл (81,6% против 30%). Что же касается патоморфологии носовых полипов, то различия были незначительны, у больных с отёчным типом определялась тенденция к увеличению частоты рецидивов.

Таблица 5

Мммунофенотип клеток воспалительного инфильтрата в носовых полипах в зависимости от рецидивов, иммуногистохимические данные, Ме (25;75процентили)

CD-маркёры Больные с рецидивами n = 20 Больные без рецидивов n=18 Контрольная группа n=4

CD 3 27 (23;40) 37 (32;43) 4-18

CD 4 19(12-25) 18(13:29) 2-5

CD 8 13 (11;20) 20 (17;24) 5-8

CD 20 12 (7; 16) 13(8:14) <M

CD 35 23 (16;30) 13 (I0;18) 0-5

CD 56 12 (9;16) 9(7;11) 0-7

CD 68 6(4;7) 6(3:9) 0-3

Примечание: СО+ клетки воспалительного инфильтрата в носовых полипах представлены в виде абсолютного количества ОАВ-позитивных клеток в п/з при ув. х400;

в контроле представлен диапазон количества ОАВ-позитивных клеток в п/з при ув. х400; 0 - отсутствие ОАВ-позитивных клеток.

В таблице 5 представлены результаты ИГХ-исследований плотности СО-позитивных клеток в носовых полипах в зависимости от рецидивов. Видно, что статистически значимых различий между группами больных с рецидивами носовых полипов или без них не определялось ни по одному параметру. Очевидно, что воспалительный процесс при ПРС сопровождается интенсивной инфильтрацией ткани носовых полипов СО-позитивными клетками вне зависимости от рецидивов носовых полипов.

Однако, если обратиться к данным проточной цитофлуориметрии, представленным в таблице 6, то видно, что в группе больных с рецидивами регистрировалось достоверное уменьшение уровня абсолютного количества С04+ и С08+-клеток по сравнению с контрольной группой здоровых доноров (р<0,05). В то же время в группе больных без рецидивов отмечалась достоверная стимуляция флуоресценции С068+моноцитов и С068+гранулоцитов периферической крови (р<0,05)

Таблица 6

Показатели клеточного адаптивного иммунитета больных ПРС в зависимости от рецидивов полипов, данные проточной цитофлуориметрии, Ме (25;75процентили)

СО-маркёры Больные с рецидивами п = 20 Больные без рецидивов п=18 Контрольная группа п=15

СБ 3, абс. 1353 (939;1963) 1516 (900;1959) 1533 (1407; 1701)

СО 4, абс. 602 (399; 1021)* 840 (645;944) 924 (756; 1008)

СО 8, абс. 713 (503,962)* 795 (297; 1124) 833 (693;882)

СО 14, % 77 (72;81) 80 (76;85) 80 (78;86)

СО 14, с 235 (219;314) 273 (160;392) 236 (193;300)

СО 56, % 31 (22;38) 24 (16;44) 26 (19;28)

СО 56, с 154 (131 ;172) 151 (130;242) 146 (130;174)

СО 68, моноциты, с 301 (265;442) 419 (252;466)* 279 (248;324)

СО 68,гранулоциты с 197 (119;241) 245 (167;362)* 171 (131;218)

СО 68, лимфоциты, с 51 (46;78) 86 (49;104) 48 (39;60)

Примечание: абс. - абсолютное количество позитивных клеток в 1 мкл;

с - средняя интенсивность флюоресценции (условные единицы флюоресценции);

*р<0,05 по сравнению с контрольной группой (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).

Таким образом, рецидивирование носовых полипов сопровождается дефицитом клеток адаптивного клеточного иммунитета, выполняющих фундаментальные функции в индукции антиген(АГ)-специфического иммунного ответа, а именно: Т-хелперов (СЭ4+клеток) и Т-цитотоксических клеток (С08+клеток). Течение же ПРС без рецидивов связано со стимуляцией С068+моноцитов и С068+гранулоцитов, поскольку усиление интенсивности флюоресценции является отражением функциональной активации этих клеток. Отметим, что этот маркёр свойственен клеткам макрофагально-моноцитарного ряда, однако и гранулоциты являются позитивными по этому маркёру. Экспрессия указанного маркёра на гранулоцитах приблизительно в два раза меньше по сравнению с моноцитами. Очевидно, что факт связи дефицита по С04+ и С08+-клеткам в группе больных с рецидивами носовых полипов является отражением известного взгляда на генез ПРС как заболевания, ассоциированного со вторичным иммунодефицитом, что одновременно означает перспективность обсуждения вопроса о применении системных иммунотропных препаратов при лечении ПРС, особенно в группе больных с рецидивами носовых полипов.

Изучение взаимосвязей между показателями системного и местного адаптивного иммунитета показало, что в группе больных с рецидивами полипов достоверная отрицательная сильная корреляционная взаимосвязь определялась только по отношению к СЭ68+-клеткам (г= -0,871, р<0,05). В группе больных без рецидивов носовых полипов достоверная положительная средняя корреляционная взаимосвязь определялась в отношении СОВ+ (г=0,646, р<0,05) и С068+-клегок (г=0,704, р<0,05), причём в последнем случае эта взаимосвязь сопровождалась достоверным увеличением уровня этих клеток в крови по сравнению с контрольной группой (таблица 6). Иными словами, имеется сопряжённое одновременное увеличение уровня и функциональной активности СР68+-клеток и в периферической циркуляции, и в воспалительном инфильтрате носовых полипов в группе больных ПРС без рецидивов.

Практическая значимость полученных результатов состоит также и в том, что по поведению конкретного показателя адаптивного иммунитета можно определять назначение конкретных медикаментозных средств. В качестве примера были выбраны наиболее информативные СЭ4+ и СЭ20+- лимфоциты. При анализе поведения этих клеток в зависимости от рецидивов ПРС картина выглядит следующим образом.

СО-4

о ♦.........................................-................?...................................

Больные ПРС с Больные ПРС без рецидивами рецидивов

□ носовые полипы □ кон июль

Рис. 3. Плотность СБ4+клеток в носовых полипах в зависимости от рецидивов, ИГХ-данные.

На рисунке 3 представлены ИГХ данные по С04+-клеткам в зависимости от рецидивов ПРС. Из диаграммы видно, что процесс рецидивирования не оказывает влияния на количественный уровень С04+- клеток в воспалительном инфильтрате в носовых полипах. И в том, и в другом случаях плотность этих клеток была практически равной.

СЭ-4

юоо

500

о

бо:»

Больные ПРС с рецидивами

840 024

Больные ПРС без рецидивов

□ больные ПРС □ контрольная I рупиа

Рис. 4. Абсолютное количество С04+-клеток в периферической крови больных ПРС в зависимости от рецидивов, цитофлуориметрические данные, * р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Однако, если посмотреть уровень этих клеток в периферической крови, то, как видно на рисунке 4, достоверное снижение С04+-клеток (р<0,05) фиксируется в группе больных ПРС с рецидивами носовых полипов. Очевидно, что процесс рецидивирования носовых полипов сопряжён с дефицитом С04+-клеток, являющихся, наряду с другими функциями, главным продуцентом иммунорегуляторных цитокинов.

С0-20

20 10

0

Больные ПРС с рецидивами

Вольные ПРС Оел рсцидиьои

□ носовые полипы □ контроль

Рис. 5. Плотность СЭ20+клеток в носовых полипах в зависимости от рецидивов, ИГХ-данные.

Что же касается гуморального адаптивного иммунитета, то уровень С020+-клеток в ткани носовых полипах представлен на рисунке 5. Видно, что и в этом случае рецидивирование носовых полипов не сказывается на плотности СР20+-клеток в составе воспалительного инфильтрата. Уровень этих клеток был практически идентичным в обеих группах больных.

CD-20

149" 147

150 100 50 0

Больные ПРС с рецидии<-ти

Больные ПРС По j рецидииои

□ больные ПРС О конгролымн группа

Рис. 6. Абсолютное количество С020+-клеток в периферической крови больных ПРС в зависимости от рецидивов, цитофлуориметрические данные, * р<0,05 по сравнению с контрольной группой, ** р<0,05 при сравнении групп между собой.

Цитофлуориметрические данные представили иную картину. Из рисунка 6 видно, что достоверное снижение этих клеток наблюдается в группе больных ПРС с рецидивами носовых полипов, как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой больных без рецидивов носовых полипов. Таким образом, дефицит предшественников клеток - продуцентов антител в первой группе больных ПРС очевиден.

Расхождение результатов ИГХ-исследований и цитофлуориметрических замеров уровней CD4+ и С020+-клеток в группе больных ПРС с рецидивами носовых полипов отражают отсутствие прямо пропорциональных изменений количества патогенетически «заинтересованных» иммунокомпетентных клеток в периферической циркуляции и in situ. Очевидно, что эти факты отражают такое состояние адаптивного иммунитета при ПРС, связанное с процессом рецидивирования носовых полипов, которое имеет черты сходства со вторичными транзиторными ИДС.

В своих рекомендациях по определению основных направлений медикаментозной терапии мы основывались на результатах клинико-анамнестического, лабораторно-инструментального, иммуногистохими-ческого и цитофлуориметрического исследований в обеих группах (с уровнем эозинофилов до и более 150 кл/мкл). Учитывая полученные показатели в группе с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл понижение уровня основных клеток адаптивного иммунитета - CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, что говорит о наличии вторичного иммунодефицита обосновано назначение системных и по показаниям местных иммуномодуляторов (Деринат, ИРС-19 и т.д.), стимулирующих В и Т-лимфоциты, при необходимости антибиотикотерапию с возможным длительным курсом. Во второй группе с уровнем эозинофилов более 150 кл/мкл, где наблюдается

противоположная картина, активность основных клеток адаптивного иммунитета повышена, что, вероятно, вызывает усиление соответствующего воздействия эозинофильных факторов на основные популяции Т-лимфоцитов. Это подтверждается достоверным увеличением уровня CD3 и СЭ20-клеток (р<0,05) и тенденцией к повышению остальных клеток. Данные результаты дают основание к назначению курса стероидной терапии.

Таким образом, изменения конкретных показателей адаптивного иммунитета при ПРС свидетельствуют об очевидной не только научной, но и практической значимости оценки системного и местного иммунного статуса в клинической практике. Необходимо отметить, что лечение ПРС является комплексным и индивидуальным у каждого больного с учетом выявленных у него особенностей местного и системного адаптивного иммунитета.

Выводы

¡.Анализ клинико-анамнестических особенностей течения ПРС позволил выработать критерии отбора больных для проведения дополнительных исследований и разделить их на группы с целью выработки индивидуальной тактики лечения с учетом этиопатогенетических факторов.

2. В группе больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл наблюдались повторные заболевания респираторными инфекциями, осложненные обострением хронических заболеваний верхних дыхательных путей и сопровождающиеся с частым и периодически длительным приемом антибиотиков. В группе больных с уровнем эозинофилов более 150 кл/мкл преобладали аллергические заболевания. Рецидивы ПРС преимущественно встречались второй группе.

3. Воспалительный клеточный инфильтрат в носовых полипах включает в себя все основные компоненты адаптивного иммунитета - CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-клетки, а также естественные киллеры (CD56+), макрофаги (CD68+) и дендритные клетки(С035+); максимальная клеточная плотность приходится на Т-лимфоциты и С035+-клетки.

В общей группе больных ПРС определяется достоверное снижение CD4+ и CD20+-лимфоцитов в периферической крови (что можно интерпретировать как состояни вторичного транзиторного дефицита адаптивного иммунитета), а также одновременно увеличение уровня CD68+-mohouhtob и IgA-позитивных клеток.

4. У больных ПРС с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл определяется достоверно снижение уровня CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов; у больных с эозинофилие свыше 150 кл/мкл подобный дефицит адаптивного иммунитета отсутствует.

ПРС с рецидивирующим течением встречается у пациентов с длительностью заболевания свыше 5 лет и сопровождается эозинофилией в периферической крови, а также достоверным угнетением содержания CD4+ и С08+-лимфоцитов, в то время как у больных без рецидивов носовых полипов определяется стимуляция экспрессии CD68-маркёра на моноцитах и гранулоцитах периферической крови.

Отёчный тип носовых полипов сопровождается угнетением содержания основных компонентов адаптивного иммунитета - CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов как в периферической крови, так и в ткани носовых полипов, наряду со стимуляцией интенсивности экспрессии CD68- маркёра на моноцитах и гранулоцитах и IgG-позитивных клеток в периферической крови; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов такие изменения не определяются.

5. Достоверная сильная положительная корреляционная взаимосвязь между показателями системного и местного адаптивного иммунитета у больных полипозным риносинуситом определялась по С020+-лимфоцитам у больных с эозинофилией до 150 кл/мкл, а также по С08+-лимфоцитам и по С068+-клеткам у больных без рецидивов носовых полипов, в то время как отрицательная сильная корреляционная взаимосвязь была характерна для С068+-клеток у больных с рецидивами носовых полипов и для CD3+ и С08+-лимфоцитов у больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл, что необходимо учитывать при назначении системной и/или топической иммунотропной терапии. 6. Рекомендованы основные направления в выборе тактики медикаментозной терапии: группе больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл обосновано применение иммуномодуляторов (полиоксидоний, ликопид, иммуномакс и др.), антибиотикотерапия, местно в послеоперационном периоде - топические кортикостероиды или иммуномодуляторы в зависимости от показателей. В группе с уровнем эозинофилов более 150 кл/мкл рекомендовано назначение глюкокортикостероидов: местно топических и системных.

Практические рекомендации

1. Результаты настоящего исследования позволяют рекомендовать обязательное включение оценки состояния системного и местного адаптивного иммунитета при комплексном обследовании и лечении больных полипозным риносинуситом.

2. При обследовании состояния адаптивного иммунитета больных полипозным риносинуситом рекомендуется использование методов иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии, а из показателей адаптивного иммунитета - уровень Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, С08+-клеток), В-лимфоцитов (С020+-клеток) и IgG, IgA и IgM-позитивных клеток.

3. Угнетение состояния системного адаптивного иммунитета является основанием для применения системных иммуностимулирующих средств, аналогичные изменения в ткани носовых полипов являются основанием для применения топических иммуностимулирующих средств (ИРС-19, деринат и т.д.). Напротив, стимуляция уровня основных клеток адаптивного иммунитета в системной циркуляции и in situ позволяет обосновать выбор преимущественно противовоспалительных средств терапии, нежели иммунотропных, такие как топические кортикостероиды (Назонекс, Назавапь, Фликсоназе, Аванис и т.д.), системные кортикостероиды (дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон и т.д.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Особенности состояния и взаимосвязи показателей системного и местного адаптивного иммунитета при полипозном риносинусите (Саидов М.З., Давудов Х.Ш., Магомедова K.M. и др.) // Иммунология , 2009, №6. - С. 365-370.

2. Взаимосвязь состояния системного и местного адаптивного иммунитета с рецидивами при полипозном риносинусите (Саидов М.З., Давудов Х.Ш., Магомедова K.M. и др.) // Российская оториноларингология, 2009, №6(43). - С. 60-66.

3. Влияние эозинофилии на показатели системного и местного адаптивного иммунитета при полипозном риносинусите (Саидов М.З..Давудов Х.Ш., Магомедова K.M. и др.) // Вестник оториноларингологии, 2009, №3. - С. 27-30.

4. Современные представления об иммунопатогенезе полипозного риносинусита (Саидов М.З., Давудова Б.Х., Магомедова K.M.) // Иммунология, 2010, №5. - С. 261-269.

Подписано в печать: 20.05.2011 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Актуальность проблемы.

Изучение состояния адаптивной иммунной системы при полипозных риносинуситах (ПРС) не теряет актуальности до настоящего времени, поскольку постоянно меняющиеся представления о фундаментальных процессах иммунного воспаления неизбежно сказываются на текущих взглядах о патогенезе ПРС. Этиология и патогенез ПРС остаются неясными. Многочисленные работы в этом направлении не изменили ситуацию. Тем не менее, представления о патогенезе ПРС в последнее время подверглись существенным изменениям, связанными в первую очередь с передовыми достижениями в области клинической иммунологии заболеваний JIOP-органов. Во всех теоретических взглядах на генез полипоза носа и околоносовых пазух (ОНП) участию иммунной системы, особенно состоянию иммунитета слизистой оболочки полости носа (СОПН), отводится ведущая роль. Это касается инфекционной [46], аллергической [14], патоморфологической [9,75] многофакторной [53,55] и других теорий, оценки роли мукоцилиарного клиренса [30,31, 118] и т.д.

Несмотря на очевидные результаты в изучении патогенеза и лечения ПРС, частота и тяжесть клинических проявлений ПРС не снижаются. Так по данным Портенко Г.М. [46] ПРС встречается от 1,3 до 4% случаев от общего количества обследованных групп населения. Применение новых средств лечения, включая кортикостероидные препараты, существенно не снижает частоту рецидивов ПРС. Несомненно, что все проявления респираторной аллергии при полипозе носа носят системный характер [14,32,62,110,116,180].

В соответствии с результатами работы IV Международной консенсусной конференции по ПРС (European Position on Rhinosinusitis and Nasal Polips, 2006) и последующих конференций аналогичного формата, ПРС определяется как хроническое продуктивное Th-2-зависимое эозинофильное воспаление, приводящее к ремоделированию слизистой оболочки носа, её отёку с последующим пролапсом слизистой оболочки и формированием носовых полипов [109,126,141,159,165]. Акцент на Независимый характер воспалительного процесса указывает, во-первых, на ведущую роль изменений со стороны системного и местного иммунитета больных ПРС, во-вторых, на превалирование продукции спектра Независимых провоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и др.), обуславливающих преимущественно эозинофильный и IgE-зависимый характер хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке носа и, в-третьих, на заметную роль функциональной активности CD4+Th-2 субпопуляции Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе ПРС.

Таким образом, формирование носовых полипов является следствием хронического Th-2-зависимого эозинофильного воспаления, приводящего к ремоделированию слизистой оболочки носа [126]. Такой тип воспалительного процесса закономерно приводит, во-первых, к гиперпродукции провоспалительных цитокинов (ТНФ-а, ИЛ-1, ИЛ-5, ИЛ-8. ИЛ-13), эозинофильных факторов воспаления (ESP, МВР), факторов роста (TGF-P), факторов ангио- и неоангиогенеза, хемокинов (RANTES, Eotaxin), адгезионных молекул (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) [158,166] и, во-вторых, к активации клеток, прежде всего иммунной системы, in situ и активному участию этих клеток в формировании воспаления в слизистой оболочке носа. Показано участие в этих процессах активированных Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CDS+клеток), естественных киллеров (ЕК), активированных эозинофилов (СБ34+клетки), В-лимфоцитов (СВ20+клеток), плазматических клеток, тучных клеток, несущих IgE-рецептор и др. [130,159,160]. Концентрация ключевого цитокина, ответственного за активацию и кумуляцию эозинофилов в очаге воспаления, а именно — ИЛ-5 и рецептора к ИЛ-5, у больных ПРС в 1200 раз выше нормы [109]. Представленные данные иммунопатогенеза носовых полипов подчёркивают многогранность этого патологического процесса. Также необходимо отметить важную роль врождённого иммунитета в патогенезе ПРС. Речь идёт о модуляции экспрессии рецепторов врождённого иммунитета (Т1Л1-рецепторов, Ж,Б1-рецепторов, ЩЛ^-рецепторов) при ПРС. Изменение экспрессии рецепторов врождённого иммунитета непосредственно сказывается на специфичности и функциональном статусе адаптивного иммунитета организма. Это направление научных исследований отражено в самых последних работах [60,73,142].

Необходимость дальнейшего исследования иммунопатогенеза ПРС, и, прежде всего, системы адаптивного иммунитета, с применением современных, высоко специфичных методов иммунологических исследований явилось побудительным моментом для проведения данного исследования.

В настоящей работе исследованы в том числе и СО- фенотипы естественных киллеров, фолликулярных дендритных клеток, а также макрофагов. Хотя эти клетки, в соответствии с современными представлениями, относятся к системе врожденного иммунитета, тесная функциональная связь активности этих клеток с эффекторными механизмами адаптивного иммунитета очевидна. Именно поэтому в работе включен материал по С068+, С035+ клеткам, объединенным с СБ-фенотипом Т- и В-лимфоцитов.

Цель исследования:

Провести клинико-иммунологическое изучение системного и местного адаптивного иммунитета у больных с полипозным рино синуситом и дать оценку корреляционных взаимосвязей полученных показателей для определения основных направлений медикаментозной терапии.

Задачи исследования: 1.Изучить анамнестические и клинические особенности больных полипозным рино синуситом.

2. Проанализировать сопутствующие заболевания у больных ПРС в зависимости от уровня эозинофилов в периферической крови.

3. Изучить наличие и количественное содержание СБЗ+, СБ4+, СБ8+, С014+, С020+, С035+, СЭ56+, СБ68+ - позитивных клеток в составе воспалительного инфильтрата в носовых полипах и оценить состояние системного клеточного и гуморального иммунитета при полипозном риносинусите.

4. Проанализировать изменения иммунофенотипа клеток воспалительного инфильтрата в носовых полипах и показателей системного клеточного и гуморального иммунитета в зависимости от наличия или отсутствия эозинофилии в периферической крови, частоты рецидивов и патоморфологии носовых полипов.

5. Оценить патогенетическую значимость достоверных корреляционных взаимосвязей между СБЗ+, СЪ4+, С08+, СБ14+, С020+, СБ35+, С056+, СБ68+ -позитивными клетками в периферической крови и в воспалительном инфильтрате носовых полипов в зависимости от патоморфологии носовых полипов, рецидивов заболевания и эозинофилии в периферической крови.

6. На основе клинико-иммунологического анализа полученных результатов дать рекомендации по основным направлениям медикаментозной терапии.

Научная новизна.

Впервые показано, что на фоне продуктивного преимущественно эозинофильного воспаления клеточный инфильтрат в носовых полипах включает в себя все основные компоненты адаптивного иммунитета - СБЗ-ь, С04+, СБ8+ и С020+-клетки, а также естественные киллеры (СВ56+), макрофаги (СБ68+) и дендритные клетки (ТЮ35+).

Впервые выявлено, что изменения со стороны системного адаптивного иммунитета носят комплексный характер, в частности, достоверное снижение С04+ и С020+лимфоцитов в периферической крови больных ПРС можно интерпретировать как состояние вторичного транзиторного иммунодефицита.

Впервые установлено, что у больных ПРС с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл определяется достоверное снижение уровня CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов, а больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл подобный дефицит адаптивного иммунитета отсутствует.

Впервые показано, что рецидивирование полипозного риносинусита также сопровождается достоверным угнетением содержания CD4+ и CD8+-лимфоцитов, безрецидивное течение ПРС ассоциировано со стимуляцией экспрессии CD68- маркёра на моноцитах и гранулоцитах периферической крови.

Впервые выявлена связь патоморфологического типа носовых полипов с изменениями адаптивного иммунитета, а именно: отёчный тип связан с угнетением уровня CD3+, CD4+, CD8+ и СБ20+-лимфоцитов как в периферической крови, так и в ткани носовых полипов, наряду со стимуляцией интенсивности экспрессии CD68- маркёра на моноцитах и гранулоцитах и IgG-позитивных клеток в периферической крови; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов такие изменения не определяются.

Впервые определена достоверная сильная положительная корреляционная взаимосвязь по CD8+, С020+-лимфоцитам и по CD68+-клеткам, а так же отрицательная сильная корреляционная взаимосвязь по CD3+, CDS+лимфоцитам и С068+-клеткам местно и в системной циркуляции, что необходимо учитывать при назначении системной и/или топической иммунотропной терапии.

Практическая значимость.

На основании результатов, полученных в настоящей работе, можно утверждать, что патогенез полипозного риносинусита связан с комплексными изменениями адаптивного иммунитета: базисные показатели адаптивного иммунитета, такие как уровень Т- и В-лимфоцитов, некоторые Igпродуцирующие клетки снижены, ассоциация ПРС со вторичным, транзиторным, иммунодефицитным состоянием вполне обоснована. На этом основании рекомендуется при обследовании больных ПРС в оценку иммунного статуса включать методы иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии с целью изучения основных параметров адаптивной иммунной системы как в системной циркуляции, так и в ткани носовых полипов для прогноза рецидивного течения.

Обосновано применение системных или топических иммуностимулирующих средств в комплексном лечении больных ПРС. При этом учитываются такие факторы как снижение, либо повышение уровня основных параметров системного или местного адаптивного иммунитета. Кроме этого, учитывается необходимость одновременного применения других средств лечения, в частности, противовоспалительной терапии, которая обладает в т. ч. и иммунодепрессивным эффектом (корти ко стероиды и др.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Критерии отбора больных с ПРС для проведения дополнительных иммунологических исследований.

2. Состав клеточного воспалительного инфильтрата в носовых полипах.

3. Изменения адаптивного иммунитета у больных ПРС в группах:

- с уровнем эозинофилов до - и свыше 150 кл/мкл;

- с рецидивированием и без рецидивирования ПРС;

- с различной морфологической структурой носовых полипов.

4. Рекомендации по лечению больных ПРС в зависимости от выявленных изменений адаптивного иммунитета.

Апробация работы.

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на:

XXVI Международной конференции молодых оториноларингологов (Санкт-Петербург,Дом Ученых,26-27мая 2010г.);

- The 44th Congress of the Polish Society of Otorhinolaryngologists, Head and Neck Surgeons (Варшава 9-12 июня 2010г.);

- Ill Международный съезд оториноларингологов Узбекистана (Ташкент 8-9 октября 2010 г.).

Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции ФГУ «НКЦ оториноларингологии ФМБА России» 28 октября 2010года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 работы в рекомендуемых журналах, входящих в бюллетень ВАК.

Внедрение результатов исследования в практику и учебный процесс.

Клинико-экспериментальные результаты, полученные в настоящей работе, являются основой при составлении плана обследования и ведения больных ПРС, поступающих в стационар, и эти подходы используются специалистами ЛОР отделения ГКБ №67 г. Москвы, а также сотрудниками ринологического отделения и отделения болезней ЛОР-органов Республиканской клинической больницы г. Махачкалы. Данные комплексного обследования больных ПРС используются при чтении лекций, проведении семинарских и практических занятий по заболеваниям ЛОР органов с курсантами факультета повышения квалификации на базе ГКБ№67 г. Москвы и Даггосмедакадемии.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 158 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 29 таблицами. Список литературы включает 202 источника, из них 77 отечественных и 125 иностранных.

Выводы

1. Анализ клинико-иммунологических особенностей течения ПРС позволил выработать критерии отбора больных для проведения дополнительных исследований и разделить их на группы с целью выработки индивидуальной тактики лечения с учетом этиопатогенетичеких факторов.

2. В группе больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл наблюдались повторные заболевания респираторными инфекциями, осложненные обострением хронических заболеваний верхних дыхательных путей и сопровождающиеся с частым и периодически длительным приемом антибиотиков. В группе больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл преобладали аллергические заболевания. Рецидивы преимущественно встречались во второй группе.

3. Воспалительный клеточный инфильтрат в носовых полипах включает в себя все основные компоненты адаптивного иммунитета — CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+-ioieTKH, а также естественные киллеры (CD56+), макрофаги (CD68+) и дендритные клетки(С035+); максимальная клеточная плотность приходится на Т-лимфоциты и СБ35+-клетки. В общей группе больных ПРС определяется достоверное снижение CD4+ и С020+-лимфоцитов в периферической крови, (что можно интерпретировать как состояние вторичного транзиторного дефицита адаптивного иммунитета) а также одновременное увеличение уровня СБ68+-моноцитов и IgA-позитивных клеток.

4.У больных ПРС с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл определяется достоверное снижение уровня CD3+, CD4+, CD8+ и С020+-лимфоцитов; у больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл подобный дефицит адаптивного иммунитета отсутствует. ПРС с рецидивирующим течением встречается у пациентов с длительностью заболевания свыше 5 лет и сопровождается эозинофилией в периферической крови, а так же достоверным угнетением содержания CD4+ и СВ8+-лимфоцитов, в то время как у больных без рецидивов носовых полипов определяется стимуляция экспрессии CD68+маркера на моноцитах и гранулоцитах периферической крови. Отёчный тип носовых полипов сопровождается угнетением содержания основных компонентов адаптивного иммунитета - CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+-лимфоцитов как в периферической крови, так и в ткани носовых полипов, наряду со стимуляцией интенсивности экспрессии CD68- маркёра на моноцитах и гранулоцитах и IgG-позитивных клеток в периферической крови; при фиброзно-отёчном типе носовых полипов такие изменения не определяются.

5. Достоверная сильная положительная корреляционная взаимосвязь между показателями системного и местного адаптивного иммунитета у больных полипозным риносинуситом определялась по СЭ20+-лимфоцитам у больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл, а также по С08+-лимфоцитам и по СБ68+-клеткам у больных без рецидивов носовых полипов, в то время как отрицательная сильная корреляционная взаимосвязь была характерна для СБ68+-клеток у больных с рецидивами носовых полипов и для CD3+ и CD8+-лимфоцитов у больных с уровнем эозинофилов свыше 150 кл/мкл, что необходимо учитывать при назначении системной и/или топической иммунотропной терапии.

6. Обоснованы основные направления в выборе тактики медикаментозной терапии больных полипозным риносинуситом. Определив баланс и соотношение CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, т.е. клеток адаптивного иммунитета, по иммуногистохимическим данным и результатам цитофлуориметрического исследования периферической крови у конкретного пациента можно обосновать назначение топической и системной иммунотропной и /или противовоспалительной терапии. В частности, в случаях превалирования активированных CD- позитивных клеток с сопутствующей гиперпродукции провоспалительных медиаторов обосновано применение кортикостероидов как местных, так и системных, а в случаях ингибиции уровня этих клеток в составе воспалительного инфильтрата и в периферической крови обосновано применение препаратов, стимулирующих экспрессию этих рецепторов, т.е. иммуномодуляторов.

Практические рекомендации

1 .Результаты настоящего исследования позволяют рекомендовать обязательное включение оценки состояния системного и местного адаптивного иммунитета при комплексном обследовании и лечении больных полипозным риносинуситом.

2. При обследовании состояния адаптивного иммунитета больных полипозным риносинуситом рекомендуется использование методов иммуногистохимии и проточной цитофлуориметрии, а из показателей адаптивного иммунитета - уровень Т-лимфоцитов (СБЗ+, СБ4+, СВ8+-клеток), В-лимфоцитов (С020+-клеток) и ^А и ^М-позитивных клеток.

3. Угнетение состояния системного адаптивного иммунитета является основанием для применения системных иммуностимулирующих средств (иммуномакс, полиоксидоний и т.д.), аналогичные изменения в ткани носовых полипов являются основанием для применения топических иммуностимулирующих средств (деринат, ИРС-19 и т.д.). Напротив, стимуляция уровня основных клеток адаптивного иммунитета в системной циркуляции и местно позволяет обосновать выбор преимущественно противовоспалительных средств терапии, нежели иммуномодуляторов, таких как топические кортикостероиды (назонекс, назаваль, фликсоназе и т.д.), системные кортикостероиды (дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон и т.д.).