Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Сорбционно-хроматографическая очистка ДНК-азы и цитохрома С в технологии получения фармацевтической композиции

На правах рукописи

САЛЬНИКОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ДНК-АЗЫ И ЦИТОХРОМА С В ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ

14.04.01 - Технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 7 ИЮЛ 2014

'"ГТГиЮПОЙ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2014

005550521

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Глазова Наталья Владимировна

Официальные оппоненты: Степанова Элеонора Федоровна

Пожарицкая Ольга Николаевна

кандидат химических наук, доцент кафедры биотехнологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-

фармацевтическая академия»

Минздрава России

доктор фармацевтических наук, профессор кафедры технологии лекарств Пятигорского медико-фармацевтического института филиала ГБОУ ВПО

«Волгоградский государственный медицинский университет»

Минздрава России кандидат фармацевтических наук, заместитель генерального директора по новым технологиям ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации»

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «23» сентября 2014 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14) и на сайте организации (https://siles.google.eom/a/pharminnotech.com/dissovet).-Автореферат разослан «¿^>> с^с-сР'^^г 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

Орлов А,С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить продукты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом. Гидролитические ферменты имеют ряд особенностей, выгодно отличающих их от другого вида сырья: высокая эффективность в микроколичествах, высокая специфичность, быстрое достижение желаемого результата, возможность создания на их основе продукта с заданными свойствами. Однако, расширение номенклатуры новых лекарственных форм, включающих ферменты, затруднено в виду их высокой лабильности, а также инактивации ферментов за счет взаимодействия с компонентами лекарственных форм. Все это не позволяет выдерживать срок хранения готового продукта (2-3 года). Современные достижения позволяют использовать такие носители, которые могут не только устранить негативное воздействие сопутствующих компонентов, но и стабилизировать сами ферменты.

Потребность в ферментных препаратах определяет необходимость совершенствования технологии их выделения с целью получения высокоочищенных ферментов. В настоящее время при получении высокоочищенных ферментных препаратов значительную роль играют сорбционные методы, которые, однако, недостаточно широко используются в промышленности. Особенности физико-химических свойств белковых макромолекул, а именно: большая молекулярная масса, лабильность молекулы, с одной стороны, и многокомпонентность растворов, содержащих помимо целевых компонентов большое количество примесных соединений различной природы, с другой стороны, свидетельствуют о том, что выделение и очистка ферментов представляет определенные трудности.

Наиболее эффективной является гибкая технологическая схема, где на одном и том же оборудовании можно получать несколько препаратов в зависимости от потребности рынка. Задачей работы является разработка сорбционно-хроматографического метода выделения и очистки панкреатической ДНК-азы и цитохрома С на одном хроматографическом носителе.

Целью работы явилась разработка эффективной гибкой схемы выделения и очистки ДНК-азы и цитохрома С, которая позволит оптимизировать существующую технологию, увеличить выход и чистоту целевого продукта, а также создать новую фармацевтическую композицию для профилактики герпетических высыпаний.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить равновесные, термодинамические и кинетические закономерности сорбции цитохрома С и ДНК-азы на различных хроматографических носителях (ионогенных и неиногенных), на основании чего выбрать оптимальный сорбент для препаративной хроматографии.

2. Теоретически обосновать условия разделения компонентов смеси, на примере смеси цитохрома С и ДНК-азы; оптимизировать хроматографический процесс по скорости подвижной фазы.

3. Подобрать селективные параметры выделения и очистки ферментов с целью разработки гибкой технологической схемы для имеющихся производственных мощностей.

4. Разработать состав и технологию производства изделия медицинского назначения на основе ДНК-азы и носителя, которая может использоваться для лечения заболеваний, вызванных вирусами герпеса.

5. Разработать методики качественного и количественного анализа изделия медицинского назначения с целью стандартизации.

6. Разработать нормативную документацию на изделие медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп» -проект ТУ и лабораторный регламент.

7. Изучить стабильность ДНК-азы в полученном изделии для обоснования сроков годности.

Научная новизна. Впервые созданы и изучены комплексы ДНК-азы с липосомами и гликосферами, позволяющие получить на их основе новые лекарственные средства, обеспечивающие стабильность ДНК-азы в течении срока годности.

Впервые разработана и оптимизирована гибкая схема выделения и очистки ферментов, имеющих различные физико-химические свойства, с использованием одной и той же хроматографической системы.

Теоретически обоснованы условия разделения компонентов смеси, на примере смеси цитохрома С и ДНК-азы; оптимизирован хроматографический процесс по скорости подвижной фазы.

Практическая значимость. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований:

• Разработаны состав и технология производства изделия медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также для профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп»;

• Разработан лабораторный регламент на производство салфеток медицинских «Герпестоп»;

• Составлены технические условия (ТУ 9393-021-01899876-2009) на салфетки медицинские для обработки воспалённых участков кожи, слизистой, а

также для профилактики герпетических высыпаний "Герпестоп» для ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика», данный вид продукции внедрен в производство и реализуется на территории РФ (Акт о внедрении от 17.04.2014 г.);

• Предложен эффективный масштабируемый способ очистки ДНК-азы и цитохрома С, исключающий недостатки известной схемы очистки фермента и позволяющий увеличить выход целевого продукта, сократить время технологического цикла процесса получения фермента и повысить удельную активность препарата (номер заявки на патент 2013144910). Предложенный способ апробирован в цехе ферментных препаратов ООО «Самсон-Мед» (Акт о внедрении от 10.02.2014 г.);

• Результаты выполненной работы используются в учебном процессе СПХФА при изучении дисциплины «Химия и технология выделения и очистки биологически активных веществ» (Акт о внедрении от 18.03.2014 г.)

Апробация работы

Основные результаты исследований были доложены на научно-практической конференции «Фармация из века в век» (СПб, 2008), IV международной научно-практической конференции «Наука: теория и практика» (Прага, 2008), III международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни» (Белгород, 2008), XV Международный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи, входящие в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК РФ и подана 1 заявка на патент.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальное доказательство эффективности модели оптимизации хроматографического разделения в двухкомпонентной системе по скорости подвижной фазы при разделении цитохрома С и ДНК-азы.

2. Показана возможность выделения и очистки различных ферментов (ДНК-азы и цитохрома С) с использованием гибкой технологической схемы.

3. Результаты исследований по обоснованию состава и технологии получения изделия медицинского назначения.

4. Результаты изучения стабильности изделия салфеток медицинских «Герпестоп» для обоснования срока годности.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 144 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 147 страницах, содержит 12 таблиц, 33 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы, изложены цели и задачи исследования, показано научное и практическое значение диссертации.

Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрены особенности сорбционных методов при выделении и очистки белков, а также виды полимерных сорбентов и носителей для выделения биологически активных веществ. Заключительная часть посвящена современным методам модификации биологически активных веществ с использованием носителей, а также перспективам создания новых готовых лекарственных форм на их основе.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Объектами исследования в работе являлись ферменты цитохром С и дезоксирибонуклеазы производства ООО «Самсон-Мед» (г. Санкт-Петербург).

В качестве сорбентов для исследования были выбраны отечественные макропористый сульфокатионит на основе стирола и дивинилбензола (КУ-23), а также сорбенты РигоНге гнеионогенный АР-500 и сульфокатионит С-160 на основе сверхсшитого полистирола.

В качестве носителей для иммобилизации использовались липосомы и гликосферы фирмы «ЗтпБе», которая предоставляет их в виде суспензии в полярных растворителях (вода/гликоли). В качестве антисептика в работе использовался раствор хлоргексидина биглюконата 20%, выпускаемый ЗАО «Московская Фармацевтическая фабрика» (г. Москва).

В работе для определения концентрации белка были использованы модифицированный метод Лоури и метод с биуретовым реактивом (связывание с Кумасси синим). Активность ДНК-азы определяли методом Кунитца, в основе которого лежит спектрофотометрическое определение продуктов гидролиза ДНК при длине волны 260 нм, образующихся при воздействии фермента на субстрат. Определение концентрации цитохрома С основано на его свойстве изменять окраску при переходе железа гема из окисленной формы в востановленную.

Глава 3. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции ферментов на различных хроматографических носителях

С целью выбора оптимальных условий очистки ферментов в статических условиях были изучены рН-зависимости емкости сорбции ДНК-азы и цитохрома С из модельного раствора на ряде сорбентов. Был проведен термодинамический анализ сорбции, для чего был изучен изотермический процесс сорбции в области значений рН, близких к рН производственных экстрактов поджелудочной железы крупного рогатого скота для ДНК-азы (рН=1,8+2,0) и сердец для цитохрома С (рН=4,0) при различных температурах.

По полученным данным был построен график зависимости 1£Ки=Г(Ы), из которого определяли термодинамическую константу сорбции (К) как площадь под графиком зависимости 1§Ки=А^). Определение термодинамических функций взаимодействия ферментов с выбранными сорбентами проводили по методу Боннера-Аргерзингера.

Результаты расчета представлены в таблицах 1 и 2, из которых видно, что термодинамическая константа сорбции возрастает с увеличением температуры, энтальпийный фактор не изменяется, а изменение энергии Гиббса происходит за счет увеличения энтропийного фактора. Это свидетельствует о преобладании гидрофобных взаимодействий в системе, что является важным фактором при выборе элюента, так как в данном случае недостаточно только сдвига рН, а требуется введение компонента, разрушающего гидрофобные взаимодействия.

Таблица 1.

Термодинамические функции сорбции ДНК-азы на различных ___сорбентах ___

Сорбент Т,К Кс1, мл/г ДН, кДж/моль ДО, кДж/моль ТДБ, кДж/моль

278 8,13 -29,6 146,6

С-160 298 140 117,0 -38,1 155,1

318 318 -41,1 158,2

278 5,06 -15,8 105,2

КУ-23 298 85 89,4 -19,7 109,1

318 179 -34,3 123,7

Таблица 2.

Термодинамические функции сорбции цитохрома С на различных ____сорбентах__

Сорбент Т.К Кс1, мл/г ДН, кДж/моль Дв, кДж/моль ТДБ, кДж/моль

278 28 -29,4 104,4

С-160 298 166 75 -35,4 110,4

318 522 -40,0 115,1

278 106 -32,4 91,1

КУ-23 298 426 58,6 -37,7 96,3

318 730 -41,9 100,6

При анализе кинетических характеристик наиболее важным является поиск модели кинетики сорбции, которая адекватно описывала бы экспериментальные данные. При этом правильности выбора модели соответствует условие независимости рассчитанных коэффициентов от зернения сорбента.

Для расчета коэффициента диффузии была использована модель «оболочка-ядро». Как видно из таблицы 3, значения эффективных

коэффициентов диффузии, в пределах ошибки эксперимента не зависящие от радиуса зерна сорбента, что свидетельствует о правомерности использования данной модели для описания кинетики сорбции ферментов сорбентами С-160 и КУ-23. Это позволяет использовать именно эту модель для расчёта коэффициента диффузии в кинетико-динамическом анализе.

Таблица 3.

Коэффициенты диффузии ДНК-азы и цитохрома С, рассчитанные по _ модели «оболочка-ядро»_

Радиус зерна сорбента, мкм Коэффициент диффузии, £>эф, м"Ус

ДНК-аза Цитохгюм С

Катионит С-160

100-250 8,0М0"и 2,9-10""

250-500 7,92- 10"и 3,0-10'"

500-1000 7,99-10"'3 2,95- 10'"

Сульфокатионит КУ-23

100-250 0,9-10'и 3,0-0""

250-500 0,9-10"м 3,1-0""

500-1000 0,9-10'и 3,0-0""

Глава 4. Исследование динамических процессов сорбции и десорбции 4.1. Теоретический анализ условий оптимизации. Изучение влияния скорости подвижной фазы на процесс сорбции ферментов из многокомпонентной смеси

Эффективность динамического процесса сорбции связана с подбором таких условий, которые обеспечивают максимальное разделение целевых и примесных компонентов. Одним из параметров, определяющих эффективность работы хроматографической колонки, является критерий регулярности X, предложенный в теории неравновесной динамики сорбции, который объединяет равновесные, кинетические и гидродинамические параметры сорбции:

2 = 12.(1

где е - порозность слоя сорбента;

Кд- коэффициент распределения; £>эф - коэффициент диффузии, м2/с;

- рабочая скорость протекания раствора, м/с; 4, - средний диаметр зерна сорбента, м; Но - высота слоя сорбента, м.

Для достижения максимального разделения веществ на колонке необходимо подобрать оптимальные условия проведения динамического процесса: скорость пропускания раствора через колонку, высоту насыпного

слоя сорбента и диаметр колонки. Анализ величин, входящих в уравнение для ^ показывает, что в заданных условиях (при постоянных габаритах колонки Б, Н; параметрах сорбции К<|, и диаметре частиц сорбента с1ч) единственным параметром, сильно влияющим на величину X, является скорость проведения процесса, которая в экспериментальных условиях может различаться на несколько порядков. Соответственно, возможно изменения режима от нерегулярного (Х,«0,35) до регулярного, близкого к равновесному (^»0,35), который считается наиболее благоприятным для хроматографического процесса. Однако, при сорбции медленно диффундирующих веществ, таких как белки и ферменты, трудно добиться регулярности режима, и желательно провести эффективное разделение в неравновесных условиях. В связи с этим, нами был проведен теоретический анализ, позволяющий прогнозировать оптимальную скорость сорбционного процесса в нерегулярном режиме, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода.

Используя ранее полученную зависимость относительно удерживаемого объема V от X для внутридиффузионной кинетики сорбции, а также зависимость для критериального параметра X, была получена зависимость, улавливающая взаимосвязь между величиной разности удерживаемых объемов и равновесно-кинетическими параметрами сорбции:

= кь-Ж-къ-Щх

Ыр

с ^ Н

где в = 17,2 ■ -—— • У0 • — - постоянная величина для заданной колонки;

го ¿г

Кс11,Кс12 - коэффициенты распределения для 1-ого и 2-ого компонентов;

£>1, О. - коэффициенты диффузии для 1-ого и 2-ого компонентов, м2/с.

Таким образом, для определенной сорбционной системы при заданных условиях (параметры колонки У0, Н0 и диаметр частиц сорбента ёч) эффективность распределения будет определяться соотношениями кинетических 02) и равновесных параметров для пары

разделяемых компонентов, то есть выражением (К^- — • П2)-

Соответственно, в зависимости от соотношения между этими параметрами, функция Д) будет иметь различный вид. На рисунке 1.

сор

представлена теоретическая зависимость разности удерживаемых объемов (АУ) 2) от приведенной скорости со, которая определяется как: со = —

где - скорость сорбции компонентов в равновесных условиях.

1.2 -

Рисунок 1. Зависимость разности удерживаемых объемов от приведенной скорости при различных соотношениях между равновесно-кинетическими параметрами:

1}1 « 1; £Ь < 1; < 1; 2) Е < 1; «1 > 1; < 1;

' ог каг ка1-ог

В данном исследовании было получено экспериментальное подтверждение теоретических кривой 3 (рисунок 1) в результате изучения процесса сорбции ДНК-азы и цитохрома С на сульфокатионите КУ-23 и С-160.

С этой целью были рассчитаны соотношения между равновесными (Кс11,Кс!2) и кинетическими (Бъ 02) параметрами сорбции ферментов. Было показано, что при сорбции цитохрома С и ДНК-азы на сульфокатионите КУ-23 и С-160 выполняются неравенства, соответствующие кривой 3 (рисунок 1).

То есть, в данном случае возможно разделение компонентов при переходном режиме. Экспериментальные выходные кривые сорбции ДНК-азы и цитохрома С на КУ-23 и С-160 представлены на рисунках 2 и 3 соответственно.

Из полученных выходных кривых находили значения удерживаемых объемов У|, разность удерживаемых объемов ДУ и рассчитывали критериальный параметр (таблица 4).

Рисунок 2. Выходные кривые сорбции ДНК-азы и цитохрома С из модельного двухкомпонентного раствора на С-160 при различных скоростях пропускания раствора: а) 0,56-1 (Г5 м/с; б) 3,4-1 (Г5 м/с; в) 5,61 а5 м/с.

Рисунок 3. Выходные кривые сорбции ДНК-азы и цитохрома С из модельного двухкомпонентного раствора на сульфокатионите КУ-23 при различных скоростях пропускания раствора: а) 0,56" 10-5 м/с; б) 3,4-10-5 м/с; в) 5,6-10-5 м/с.

Таблица 4.

Значения критерия регулярности и удерживаемых объемов при различных скоростях пропускания раствора через хроматографическую колонку

Фермент WrO^e-iO'^M/c W2=3,4-10":,M/C W3=5,6-10"5m/C

Vi, см3 X Vi, cms X Vi, см3 X

Сорбция на С-160

Цитохром С 0,2 3,93 0,5 0,65 0,3 0,39

ДНК-аза 0,4 1,28 1,45 0,21 0,65 0,13

Разность удерживаемых объемов ДК см3 0,2 0,95 0,35

Сорбция на сульфокатионите КУ-23

Цитохром С 0,2 10,1 0,5 1,67 0,3 1,01

ДНК-аза 0,4 0,26 1,6 0,04 0,7 0,03

Разность удерживаемых объемов AV, см3 0,2 1,1 0,4

В соответствии с полученными экспериментальными данными была построена зависимость ДУ].2=^и), которая имеет вид кривой с максимумом (рисунок 4), что соответствует теоретической кривой 3 (рисунок 1). За величину (оец принимали значение скорости при режиме, близкому к равновесному.

Анализ рассчитанных параметров, а также подтвержденные теоретические зависимости показывают, что для данной двухкомпонентной системы при переходе от нерегулярного режима к регулярному существует оптимальная область скоростей, при которой возможно достигнуть максимального разделения ферментов. Следует отметить, что предлагаемый подход достаточно универсален и не ограничивается конкретным механизмом сорбции, поэтому может быть реализован для случаев ионообменной, гидрофобной, распределительной и других видов хроматографии с участием как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ. С практической точки зрения, процесс сорбционного разделения ДНК-азы и цитохрома С может использоваться для очистки ДНК-азы от менее высокомолекулярных примесей, а цитохрома С от более высоко молекулярных примесей.

Таким образом, скорость подвижной фазы является важным фактором, влияющим на эффективность динамического процесса сорбции. Варьированием данного параметра можно добиваться как максимального разделения компонентов, так и изменения их выхода из хроматографической колонки.

о 1

со

Рисунок 4. Зависимость величины разности удерживаемых объемов от приведенной скорости в процессе сорбции ДНК-азы и цитохрома С на С-160 (1) и сульфокатионите КУ-

23 (2).

4.2. Изучение сорбции и десорбции цитохрома С в динамических условиях на сульфокатионитах КУ-23 и С-160

С целью определения оптимальных условий десорбции цитохрома С было изучено влияние рН десорбирующей системы, ее состава и скорости подачи элюента на обострение границ зон при десорбции. Было показано, что наиболее эффективным элюентом для десорбции цитохрома С с сульфокатионита КУ-23 является 0,5 М раствор (Ш^БС^ в аммиаке рН=10,0 (рисунок 5). Сульфат-ион добавлялся в раствор для создания необходимой ионной силы, для того чтобы легче вытеснить цитохром С из активных центров сорбента, поскольку сульфат-ион является двухзарядным, а цитохром С при

рН=р1= 10,04 имеет нулевой суммарный заряд. В результате проведенных опытов были подобранны оптимальные условия проведения сорбции и десорбции цитохрома С из модельного раствора на макропористом сульфокатионите КУ-23, которые были использованы и для сульфокатионита С-160.

Был проведен опыт с использованием заводского экстракта цитохрома С при подобранных оптимальных условиях, который показал, что выход по целевому продукту составляет 77%, а степень концентрирования цитохрома С --1,3.

Рисунок 5. Выходные кривые десорбции цитохрома С с сульфокатионита КУ-23 различными элюентами: 1 - цитратно-фосфатный буферный раствор с рН=9,5, \¥дес=2,75x1 ОТ4 м/с;

2 - буферный раствор КС1 и ЫаОН с рН=10,2, 1Гдес=2,2x1 (Т4 м/с;

3-0,1 Мраствор (ЫН4):504 в аммиаке рН=10,0, !Удес=3,67x1 (Г4 м/с;

4-2 Мраствор ШЯ4)2804 в аммиакерН=10,0, Шес=1,5х]С/4 м/с.

4.3. Изучение сорбции и десорбции ДНК-азы в динамических условиях на сульфокатионитах КУ-23 и С-160

Экспериментальные данные по изучению равновесных и кинетических характеристик сорбции ДНК-азы сорбентами КУ-23 и С-160 позволяют делать предположение об их взаимозаменяемости при использовании в технологии выделения и очистки ДНК-азы. Для выбора сорбента, который будет использован в гибкой схеме производства ферментов, был проведён кинетико-динамический анализ сорбции ДНК-азы.

Предварительный эксперимент по изучению рН - оптимума сорбции ДНК-азы на сульфокатионите С-160 показал, что процесс десорбции наступает в сильно-щелочной области рН и может быть затруднен гидрофобностью сорбента. Поэтому в ходе эксперимента заменялись условия десорбции и

менялись элюенты, в качестве которых были выбраны: аммиачный буферный раствор с рН = 10,3; аммиачный буферный раствор рН = 10,3 + 0,5 М (МН4)28С>4; аммиачный буферный раствор рН = 10,3 + 50% ацетон.

Выходная кривая полного цикла сорбции-промывки сорбента-десорбции приведена на рисунке 6., из которого видно, что при десорбции аммиачным буфером с рН= 10,3 процесс десорбции затруднен, выход ДНК-азы составил 10%. Такая плохая десорбция с С-160, по всей вероятности, обусловлена большой гидрофобной поверхностью сорбента и образованием дополнительных, помимо ион-ионных, гидрофобных связей белка с матрицей носителя, которые прочно удерживают фермент на колонке. При добавлении в элюент 0,5 М (№[4)2804, происходит незначительное увеличение выхода ДНК-азы. Это обусловлено тем, что балластные белки при данной ионной силе задерживаются на колонке. Таким образом, ввиду большой гидрофобной поверхности сорбента, существенно затрудняется процесс десорбции. В дальнейших экспериментах, основываясь на том, что основные связи гидрофобны, в элюент был добавлен ацетон, который их разрушает. Как видно из рисунка 6, при введении в элюент 50% ацетона выход фермента значительно повышается и приближается к 100%. Однако, несмотря на высокий выход по десорбции и большую емкость по сорбции по сравнению с КУ-23, дальнейшее практическое применение катионита С-160 затруднено ввиду неудобства практического использования органического растворителя в заводских условиях, потери активности и разрушения нативной структуры ДНК-азы органическим растворителем. Поэтому в дальнейшем для разработки гибкой технологической схемы как наиболее оптимальный был выбран сульфокатионит КУ-23.

-*-рН-10.3 5<М ацетон -*-рН=10.3 <- 1п (МИЕЯМ \VVii

Рисунок б. Выходная кривая сорбции - промывки - десорбции ДНК-азы из модельного раствора при различных условиях на С-160

При работе с экстрактом для выделения ДНК-азы методом дробной элюции мы использовали отечественный макропористый сорбент КУ-23, который применяется в настоящее время на производстве, где проводится десорбция 4-х панкреатический ферментов одновременно, при этом выход ДНК-азы составляет 50%. Задачей работы является разработка метода градиентной элюции, которая бы позволила выделять ДНК-азу отдельно от других ферментов, ввиду их различных свойств. Процесс десорбции на сорбенте КУ-23 проводили аммиачным буфером в градиенте рН от 8,0 до 9,5, полученные данные представлены в таблице 5, из которой видно, что подобранный элюент рН=9,0; 0,025 М (МН4)2504, позволяет увеличить выход целевого продукта (ДНК-азы) на 36% по сравнению с использованием заводского элюента.

Подбор элюента для десо Таблица 5. рбции ДНК-азы на КУ-23

Элюент Концентрирование (по белку) Пик Выход ДНК-азы, %

рН=8,0 нет размыт 45%

рН=8,5 нет размыт 50%

рН=8,8 нет не размыт 60%

рН=9,0 19% не размыт 96%

рН=9,5 35% не размыт, но появляется второй пик 99%

рН=9,0; 0,025 М (Ш^С^ 26% самый четкий пик 98%

рН=9,5; 0,025 М (Ш4)2804 22% обострение пика 98%

рН=9,8; 0,05 М (ЫНО^СЬ (заводской элюент) нет размыт 61 %

На основании полученных данных по подбору условий десорбции был проведен эксперимент с использованием экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота в динамических условиях (рисунок б).

VI, мл

Рисунок 6. Выходная кривая сорбции - промывки - десорбции ДНК-азы 1 - по белку, 2 по активности из экстракта при оптимальных условиях на КУ-23.

4.4. Разработка гибкой технологической схемы выделения и очистки цитохрома С и ДНК-азы на сульфокатионите КУ-23

В предыдущих главах показана возможность применения гибкой технологической схемы в производстве с целью получения на одном оборудовании с использованием сорбента КУ-23 ферментов: цитохрома С и ДНК-аза. Технологическая схема гибкой технологии получения субстанции дезоксирибонуклеазы и субстанции цитохрома С представлены на рисунке 7. Технологических процесс начинается с водной экстракции целевого продукта из соответствующего сырья. Отделение жмыха проводят на центрифуге, затем на сепараторе проводят обезжиривание и осветление. Полученный экстракт охлаждают и подают на ионообменные колонны, заполненные КУ-23. Сорбцию и десорбция целевого продукта ведут при оптимальных условиях. Полученный элюат передают на концентрирование и очистку от балластных примесей на ульрафильтрационной мембране с различными мембранными модулями в зависимости от размера целевого продукта. Затем концентрат подвергают диафильтрации, где происходит удаление солей, и передают на стадию розлива и сублимационной сушки.

Приготовленный раствор подвергают предварительной и стерилизующей фильтрации, разливают в стерильные кассеты, которые затем загружают в сублимационную установку. После окончания процесса сублимации лиофилизированный порошок под ламинаром в боксе фасуют с предварительно подготовленную первичную упаковку. Продукцию маркируют и предъявляют на приемочные испытания. Упакованную серию продукции хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 20 °С.

ВР.1.1.

ВР.1.2.

ВР.2.1.

ВР.2.2.

ВР.2.3.

ВР.2.4.

ВР.2.5.

ВР.3.1.

ВР.3.2.

ВР.3.3.

ТП.4.1.

ТП.4.2.

ТП.4.3.

ТП.4.4.

ТП.5.1.

ТП.5.2.

ТП.6.1.

ТП.6.2.

ТП.6.3.

ТП.6.4.

Подготовка воды очищенной

Подготовка воды для инъекций_

I

Приготовление антисептиков и дезрастворов

Подготовка

производственных

помещений

Подготовка оборудования

Подготовка персонала

Подготовка технологической одежды и материалов

Подготовка воздуха для технологических помещений

Получение очищенного пара

Приготовление растворов

Приготовление экстракционной смеси

Измельчение, экстракция, центрифугирование

Сорбция на КУ-23

Элгоция выделяемого фермента_

Концентрирование и очистка от балластных примесей на ультрафильтрационной мембране__

Диафильтрация

Подготовка первичной упаковки

УМ07.1.

УМО 7.2.

Стерилизующая фильтрация

Розлив

Замораживание и сублимационная сушка

Фасовка субстанции в первичную упаковку

Маркировка

| УМО 7.3. [ Упаковка в ящики, отгрузка [4-

ТП.4. К,, К,

ТП.5.

КГ,К„

ВР.1. к« кх, кмб Подготовка воды

г

ВР.2. Кг, Кх. Км6 Санитарная произв обработка эдства

ТП.6.

км5

ВР.З. Кх, КМб Вспомогательные работы

■

Получение элюата

Отходы

Потери

Получение обессоленного раствора фермента

—»1 Отходы |

Получение субстанции

УМО.7. Кт; К„ Кыл

Потери

Фасовка, маркировка, упаковка и отгрузка продукции на склад

15

Отходы

Потери

^^Готовый продукт^^

Рисунок 7. Технологическая схема гибкой технологии получения субстанции дезоксирибонуклеазы и субстанции цитохрома С 17

Глава 5. Модификация панкреатической ДНК-азы с целью создания новых лекарственных средств

ДНК-аза является самым лабильным из группы ферментов, получаемых из поджелудочной желез и может терять активность как при создании готовой формы, так при её хранении. Поэтому, для создания новых стабильных лекарственных форм необходимо создать комплекс фермента с липосомами или гликосферами. Новая лекарственная форма разрабатывалась на основе влажной салфетки для обработки кожи и мелких травм «Антисепт-б», выпускаемая ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика».

Предварительно было изучено влияние антисептика (хлоргексидина биглюконата), липосом и гликосфер на активность ДНК-азы. Экспериментальные данные представлены на рисунке 8, из которого видно, что ни один из компонентов не оказывает ингибирующего влияния на общую активность ДНК-азы в растворе. Интересным является тот факт, что в присутствии некоторых компонентов (хлоргексидин, липосомы) происходит активация фермента. В связи с тем, что липосомы и гликосферы представляют собой глобулы с гидрофильными наружной и внутренней частями, фермент может быть присоединен как к наружной части носителя, так и заходить внутрь частицы. Липосомы менее стабильны, более рыхлые по структуре, благодаря чему упрощается доступность субстрата для ДНК-азы, происходит активация. Для комплекса ДНК-азы с гликосферами, у которых ядро состоит из плотно сшитого декстрана, проникновение такого высокомолекулярного субстрата как ДНК внутрь частицы затруднено вследствие более жестких связей в плотной сердцевине частицы. С учетом экспериментальных данных, представленных на рисунке 8 были подобраны оптимальные соотношения ДНК-аза:носитель, которые рекомендовались для создания готовой формы.

10 20 30 40 50 60 70 80

С иосятсля, •/• С 1итис(1ттяка,

"^влияние Липосом -й-аяплнне гоикосфер -»-активность ДНК-аэи а.иинпе янтнсептпка

Рисунок 8. Влияние антисептика, липосом и гликосфер на активность ДНК-азы.

Для расчета количества ДНК-азы, связанной в комплекс с носителем, применили метод кинетики диффузии через пористые мембраны, который позволяет рассчитать количество фермента свободного и связанного в комплекс. Экспериментально для ДНК-азы была выбрана мембрана с

18

диаметром пор 0,22 мкм, которая задерживает комплекс фермента с липосомами или гликосферами, но остается проницаемой для несвязанного фермента.

з <М5 В

ё

о,и -

0.1

0,05 0

0 5 10 И <0 23 50

ДНК-»1Ы -9-ДНК-ал и приели ими птклфгр

- ЛИК-МП в ирпсуктииии шииким

Рисунка 9. Кинетика диффузии ДНК-азы в присутствии липосом и гликосфер.

Как видно из рисунка 9, количество свободной ДНК-азы уменьшилось (преобладает ДНК-аза связанная), то есть произошло уменьшение угла наклона кривой к оси X, что и говорит о явном связывании фермента с носителями. Причем, чем меньше угол наклона кривой, тем больше происходит связывание в комплекс.

Пользуясь полученными данными, а также, зная проницаемость мембраны, были рассчитаны концентрации связанного в комплекс и свободного фермента. Концентрации ДНК-азы свободной и связанной с гликосферами составили Ссво6=0,62 мг/мл, Ссвяз=1,38 мг/мл. При взаимодействии ДНК-азы с липосомами получили следующие значения: Ссвоб=0,21 мг/мл, Ссвяз=1,79 мг/мл. То есть, процент связывания ДНК-азы с липосомами составил 90 %, с гликосферами 70%.

Зная общую активность ДНК-азы в растворе, для сравнения связывания различными носителями удобно пользоваться такой величиной, как удельная активность, которая показывает, сколько единиц активности фермента приходится на один грамм носителя. Этот показатель составляет 7560 ЕА/г и 18360 ЕА/г гликосфер и липосом, соответственно.

При изготовлении готовой лекарственной формы важна стабильность терапевтических свойств в течение установленного срока годности. Поэтому был поставлен эксперимент на стабильность ДНК-азы в полученных комплексах в водном и физиологическом растворах при комнатной температуре. По результатам опыта был сделан вывод, что данный комплекс с гликосферами обладает пролонгированным действием, а также стабилизирует ДНК-азу в водном растворе. Показано, что ферментативная активность ДНК-азы сохраняется на уровне 50% в течение 2 месяцев. Это объясняется тем, что высокая ионная сила - 5% раствор хлорида натрия - способствует разрушению гликосфер и высвобождению ранее связанного фермента, происходит реакция ферментативного гидролиза ДНК. Длительное сохранение 50% активности

ДНК-азы в растворе дает возможность предположить, что и в лекарственном средстве стабильность будет аналогична. Было показано, что ДНК-аза в комплексе с гликосферами сохраняет свою стабильность в растворе, поэтому в дальнейшем мы продолжили эксперименты в практическом направлении и использовали комплексы с ДНК-азы с гликосферами для создания новой фармацевтичкой композиции - влажных салфеток.

Технологическая схема получения салфеток медицинских представлена на рисунке 10. Предварительно готовят раствор с концентрацией ДНК-азы 2 мг/мл, содержанием хлоргексидинабиглюконата 0,05% и оптимальным содержанием гликосфер - 30% и переносят в емкость для пропитывающего раствора. Процесс производства осуществляется на автоматической линии для производства влажных салфеток из нетканного материала и включает следующие технологические операции: разрезание и складывание крепированной бумаги для увлажняющей салфетки, завертывание в этикетку основы, увлажнение дозатором из- емкости для пропитывающего раствора, герметическая упаковка и маркировка готовой продукции. Для количественного определения белка и ферментативной активности в салфетках медицинских была разработана модифицированная методика.

Результаты экспериментов по определению ферментативной активности ДНК-азы в готовой форме за период 2 года показали, что в активность фермента ДНК-азы сохраняется в течении срока годности на уровне не менее 500 ЕА/упакова.

ВР.2.1. Подготовка производственных помещений

ВР.2.2. Подготовка персонала и технологической одежды

ВР.2.3. Подготовка оборудования

ВР.3.1. Прием и распределение сырья

ВР.3.2. Взвешивание сырья

ВР.1. Кт, Кх, Кмб Подготовка воды очищенной

ВР.2. Кт, Кх, Кмб 1г Санитарная подготовка производства

ВР.З. Кт Подготов' 'а сырья

ТП.4. Кт, Кх,

Приготовление раствора «ДНК-аза + гликосферы + Хлоргексидин»

г;

Потери

Отходы

УМО.5. Кт, Кх, К Упаковка и маркировка готовой продукции Потери

(^Готовая продукция

Рисунок 10. Технологическая схема пртШийстки салфеток медицинских «Герпестоп»

По результатам полученных данных совместно с ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика» был разработан лабораторный регламент и ТУ 9393-021-01899876-2009 на салфетки медицинские для обработки воспалённых участков кожи, слизистой, а также для профилактики герпетических высыпаний "Герпестоп». На основании этих документов было получено регистрационное удостоверение на данный вид продукции.

Таблица 7.

Показатели качества изделия медицинского назначения «Салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а

Наименование показателя Метод определения Значение параметра

Описание Визуальный В соответствии с НД

рН ГФ XII, потенциометр ический От 3,0 до 5,0

влага Гравиметрический Не менее 2 г/ед. продукции

Микробиологическая чистота ГФХН В соответствии с НД

Количественное определение белка Спектрофотометрический 0,4 мг/ед. продукции

Определение ферментативной активности Биохимический Не менее 500 ЕА на ед. продукции

Упаковка Визуальный Салфетки должны быть упакованы в индивидуальную упаковку из материала трехслойного композитного на основе алюминиевой фольги типа «Сопаль»

Маркировка Визуальный В соответствии с НД

Хранение В защищенном от света месте при температуре не выше 20°С

Срок годности - Должен быть не менее 2 лет

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучены равновесные, термодинамические и кинетические закономерности сорбции цитохрома С и ДНК-азы на различных хроматографических носителях, на основании чего были выбраны макропористые сульфокатиониты КУ-23 и С-160 для препаративной хроматографии.

Предложена теоретическая модель, позволяющая в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами сорбции прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки. Получено экспериментальное подтверждение модели при разделении ДНК-азы и цитохрома С.

Показана возможность дробной десорбции ДНК-азы из заводского экстракта при использовании подобранных условий (оптимального элюента с параметрами рН = 9,0 + 0,025 М (Ш4)2804). Анализ элюата по активности и белку позволяют говорить о возможности отдельного выделения ДНК-азы при использовании дробной элюции. Разработана и оптимизирована гибкая схема выделения и очиЬтки ферментов ДНК-азы и цитохрома С, которые имеют различные физико-химические свойства, при использовании одной и той же хроматографической системы. Подана заявка на патент, в котором описана данная схема (номер заявки 2013144910).

Разработан состав и технология производства новой фармацевтической композиции - изделие медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также для профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп». Для анализа активности ДНК-азы и количественного определения белка в готовой форме разработан модифицированный метод, который заключается в предварительном разрушении комплекса нанообъект -фермент.

Разработано и зарегистрировано изделие медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также для профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп» по ТУ 9393-021-01899876-2009, внедрено на производстве на ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика». Исследована стабильность ДНК-азы в составе салфеток медицинских «Герпестоп» в течение 2,5 лет. Показано, что активность фермента ДНК-азы в сочетании с гликосферами и антисептиком не уменьшается в период наблюдения за изделием медицинского назначения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Новикова, С. А. Изучение сорбции панкреатической ДНК-азы на сорбентах нового поколения/ С.А. Новикова, Ю.А. Иванкина, Н.В. Глазова // Объединенный научный журнал. - Москва, 2008. - №3. - С.64-67.

2. Глазова, Н.В. Сорбционная очистка и модификация панкреатической ДНК-азы/ Н.В. Глазова, С.А. Новикова, B.C. Котовчихина // Фармация из века в век: сборник научных трудов. Часть IV. Биохимические, микробиологические, биотехнологические исследования. - Санкт-Петербург, 2008. - С.25-27.

3. Новикова, С.А. Использование наноматериалов для иммобилизации гидролитических ферментов, получаемых из животного сырья / С.А. Новикова, Н.В. Глазова, B.JI. Багирова, В.Н. Иванов // Сборник материалов XV Международного Конгресса «Человек и лекарство» (Тезисы докладов) -Москва.:2008. - С.85.

4. Новикова, С.А. Исследование взаимодействий сверхсшитых макропористых сорбентов с панкреатической дезоксирибонуклеазой/ С.А. Новикова, Н.В. Глазова // Материалы IV международной научно-практической конференции «Наука: теория и практика» - Прага, 2008. - С.5-8.

5. Новикова, С.А. Исследование взаимодействий сверхсшитых макропористых сорбентов и наноносителей с панкреатической дезоксирибонуклеазой/ С.А. Новикова, Н.В. Глазова // Конференция «Сорбенты как фактор качества жизни» - Белгород, 2008. - С.275-278.

6. Новикова, С.А. Использование наноматериалов для иммобилизации гидролитических ферментов/ С.А. Новикова, Н.В. Глазова, A.M. Макогонов // Медицинская иммунология. - Санкт-Петербург, 2009. - том 11.- №4-5 - С 484485.

7. Новикова, С.А. Кинетика сорбции цитохрома С на макропористых сульфокатионитах/ С.А. Новикова, Н.В. Глазова // Естественные и технические науки - Москва, 2008. - №6(38) - С. 130-132.

8. Новикова, С.А. Оптимизация процесса сорбции ДНК-азы и Цитохрома С из их смеси / С.А. Новикова, Н.В. Глазова // Сорбционные и хроматографические процессы - Воронеж, 2011. - том 11. - выпуск 6. -С.820-827.

9. Серкова, А.Н. Технологии лекарственных субстанций синтетического и природного происхождения / Н.В. Глазова, А.Н. Серкова, С.А. Сальникова // Сборник научных трудов международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения» - Санкт-Петербург, 2012. - С. 30-33.

10. Способ получения ферментов из группы гидролаз и оксидаз, лактоферрина и альбумина/ Н.В. Глазова [и др.]. - № 2013144910; заявл 07.10.2013.

На правах рукописи

Сальникова Светлана Александровна

СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ДНК-АЗЫ И ЦИТОХРОМА С В ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ

14.04.01 — технология получения лекарств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать А. В. Пономаревой

Подписано к печати 25.06.2014. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Гарнитура «Тайме». Печать ризограф. Печ. л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 1260

«Изд-во СПХФА». Санкт-Петербург, уд. Проф. Попова, 14