Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Сухой очищенный экстракт из листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni), получение и стандартизация

На правахрукописи

Фёдоров Сергей Владимирович

Сухой очищенный экстракт из листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni), получение и стандартизация.

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии (МГАТХТ) имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

Доктор технических наук,

профессор Кедик Станислав Анатольевич

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Дементьева Наталья Николаевна

Доктор химических наук,

профессор Юркевич Александр Морисович

Ведущая организация: ГУП Центр по химии лекарственных средств

(ЦХЛС-ВНИХФИ)

Защита состоится «10» мая 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216 пМосква, ул. Грина,7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216 г.Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

К.С.-Х.Н.

^ирлрбл^ м- в- Кирцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время одной из актуальных и первоочередных проблем отечественного здравоохранения является профилактика и лечение таких широко распространённых и трудно излечимых заболеваний, как диабет и гипогликемия. В связи с этим особое внимание уделяется поиску новых низкокалорийных, эффективных и безвредных заменителей сахара. Повышенный спрос на низко калорийные напитки и продукты питания, а также высокая стоимость таких традиционных синтетических сахарозаменителей, как сахарин, ацесульфам, аспартам и цикломат стимулируют этот поиск.

Среди наиболее перспективных и эффективных современных природных подсластителей внимание привлекают сладкие дитерпеновые гликозиды, накапливающиеся в надземной части растения Дота геЬаиеШта ВеПош (в дальнейшем - стевия) в достаточно большом количестве - до 20% в пересчете на сухой вес и обладающие ярко выраженным сладким вкусом, в 250 — 300 раз превышающим сладость сахарозы. Стевия - многолетнее травянистое растение, принадлежащее к роду Stevia (посконник) семейства СошровНае, состоящее из единого или разветвлённого стебля высотой 60 - 80 см с крестообразно расположенными эллиптическими листьями и небольшими белыми цветками, собранными в пышное соцветие. Стевия произрастает в субтропических климатических условиях со среднесуточной температурой 23 °С на песчаных почвах. Родиной стевии является северная часть Парагвая, а на сегодняшний день она культивируется в промышленных масштабах в Бразилии, Израиле, США, Канаде, Вьетнаме, Корее, Китае и Японии. В одной только Японии на нужды пищевой промышленности ежегодно тратится около 1700 тонн листьев стевии.

Сухие экстракты стевии, фигурирующие на мировом рынке под названиями «81еук«т», «81е\тх», и «МагитШоп 50», используются либо индивидуально, либо в композициях с другими средствами для подслащивания напитков и других продуктов питания.

Во многих странах мира - в первую очередь, в Японии, а также Бразилии, Корее, США, Парагвае, Лаосе, Китае, Индонезии, Таиланде и других - подсластители на основе экстракта стевии используются в широком спектре продуктов питания: винах, безалкогольных напитках, плодово - ягодных сиропах, кондитерских изделиях, при производстве зубной пасты, жевательных резинок и косметических продуктов. Стевиозид, основной дитерпеновый гликозид стевии, нетоксичен, низко калориен, устойчив при температурной обработке (до 120°С) и в широком ди;

условии применения в частных технологиях производства алкогольных и безалкогольных напитков, молочных продуктов, хлебобулочных и кондитерских изделий, а также майонезов, соусов и консервов, стевиозид наилучшим образом подходит для использования в процессах смешивания в слабокислых средах, в процессах высокотемпературной обработки и может быть внесён в рецептуру на любой стадии.

В последние годы в различных странах проводятся интенсивные исследования терапевтического действия дитерпеновых гликозидов стевии при таких распространённых заболеваниях, как гипогликемия и диабет. Обнаружены также и другие лечебные свойства, так, экстракт стевии согласно последним данным проявляет контрацептивную и антивирусную активности.

Растущий интерес к продуктам переработки стевии и появление продуктов питания и пищевых добавок на основе стевиозида на российском рынке обусловливают необходимость разработки эффективных методик контроля их качества с использованием современных методов анализа. В связи с неординарными органолептическими свойствами и биологической активностью дитерпеновых гликозидов стевии требуется углублённое изучение физико - химических и биологических свойств данных соединений, а также совершенствование методов их выделения из растительного сырья.

Цельработы.

Разработка универсальных и высокочувствительных методов стандартизации сухого очищенного экстракта стевии, оценка биологической активности, в частности антивирусной и бактерицидной, полученного стандартизированного сухого экстракта стевии и совершенствование выделения суммарной фракции сладких дитерпеновых гликозидов (сухого очищенного экстракта) из листьев стевии.

Научная новизна. Предложен вариант технологии выделения суммарной фракции дитерпеновых гликозидов (сухого очищенного экстракта) из листьев Stevia rebaudiana Bertoni (Mediplantex, Вьетнам).

Создана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье, сухом очищенном экстракте стевии и продуктах питания.

Разработана универсальная методика количественного определения стевиозида в растительном сырье, сухом очищенном экстракте стевии и продуктах питания методом ВЭЖХ. Улучшены условия хроматографического разделения, а также разработан новый способ экстракции растительного сырья и последующей очистки экстракта с использованием метода твердофазной экстракции.

Проведена оценка биологической активности (антивирусной и бактериальной) сухого очищенного экстракта стевии. Испытания проводились с вирусом болезни Тешена,

вирусом инфекционного ринотрахеита, с человеческим короновирусом в культуре клеток и возбудителем сибирской язвы на жидких и твёрдых питательных средах.

Практическая значимость.

В результате проведения физико-химических и технологических работ определены показатели для стандартизации и сертификации сухих листьев стевии, а также получено санитарно-эпидемиологическое заключение Минздрава РФ №77.99.02.916.Д.002428.04.03 на использование измельчённых листьев стевии в пищевой промышленности.

Предложенная схема лабораторного получения сухого очищенного экстракта из листьев Sterna rebaucdana Bertoni с высоким содержанием стевиозида может быть использована в качестве базового подхода для создания технологии получения сухого очищенного экстракта стевии и её дальнейшего использования в пищевой и фармацевтической промышленности.

Результаты проведённых физико - химических и технологических исследований сухого очищенного экстракта стевии были использованы при разработке ТУ, технологической инструкции, рецептуры биологически активной добавки, а также при подготовке полного комплекта документации для регистрации в МЗ РФ на основе сухого очищенного экстракта стевии биологически активной добавки (Б АД) в капсулах и таблетках

Результаты проведенного комплекса аналитических, физико-химических и технологических работ были использованы при разработке проекта фармакопейной статьи предприятия (ФСП) ООО "Научно - исследовательский и учебно - методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии".

На модельных системах изучена биологическая активность (антивирусное и бактерицидное действие) полученного сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

Разработанные универсальные методики качественного и количественного определения стевиозида в растительном сырье, сухом очищенном экстракте стевии и продуктах питания с использованием методов ТСХ и ВЭЖХ, соответственно могут быть использованы официальными контролирующими организациями, а также отделами контроля качества пищевых и фармацевтических предприятий.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы опубликованы в материалах VI Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания» (Россия, Сочи, 2002г.) и VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Россия, Санкт-Петербург, 2003г.)

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных

работ.

На защиту выносятся следующие положения.

результаты подбора оптимальных условий получения сухого очищенного экстракта из сухих листьев Stevia rebaudiana Bertoni;

- методика ТСХ для препаративного выделения индивидуального стевиозида из сухого очищенного экстракта стевии;

- методика качественного определения стевиозида в растительном сырье, сухом очищенном экстракте стевии и продуктах питания методом ТСХ;

результаты разработки методики количественного определения стевиозида в растительном сырье, сухом очищенном экстракте стевии и продуктах питания методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием;

данные по антивирусному и антибактериальному действиям полученного сухого очищенного экстракта стевии;

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит_

таблиц и_рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы,_глав

экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, приложений. Список цитированной литературы включает источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты, материалы и методы исследования.

Объектами исследований служили: сухой очищенный экстракт стевии, полученный посредством экстракции листьев Stevia rebaudiana Bertoni (Mediplantex, Вьетнам), последующей очистки экстракта и кристаллизации из метанола; индивидуальный стевиозид, выделенный из сухого очищенного экстракта стевии методом препаративной ТСХ.

Для экстракции веществ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марок «х.ч.» и «осч.».

Спектры поглощения в УФ-области снимали на спектрофотометре модели HP 8452 А (США), ИК - спектр - на приборе Pharmalyzer Digilab FTS 2000 (США), спектры ПМР и ЯМР 13С - на приборе «Bruker WP-200» (Германия).

Качественное определение стевиозида, а также его препаративное выделение из сухого очищенного экстракта стевии осуществляли методом ТСХ на пластинах «Fertigplatten Kieselgel 60» (Merck).

Количественное определение стевиозида осуществляли методом ВЭЖХ со спетрофотометрическим детектированием на приборе «Стайер» («Аквилон», Россия)

Подготовку образца перед вводом в хроматографическую систему осуществляли на установке для твердофазной экстракции «Vacuum Manifold» (Phenomenex, США)

Концентрирование извлечений, отгонку растворителей проводили с помощью ротационного испарителя «ИР-1М2» (г.Клин, Россия).

Дня определения общих физико - химических показателей использовали: поляриметр «Polomat А» (Германия), прибор для определения температуры плавления (г.Клин, Россия), прибор для определения потери в массе при высушивании (Россия).

Основные результаты исследования

1. Получение сухого очищенного экстракта из листьев сгевии.

Все сладкие дитерпеновые гликозиды сгевии являются производными кауреновой кислоты, гидроксилированное производное которой, известное под названием стевиол, является предшественником в биосинтезе сладких дитерпеновых гликозидов. Структурное разнообразие дитерпеновых гликозидов обусловлено молекулами моно-, ди- и трисахаридов, связанными со стевиолом по 13 и 19 положениям (рис.1). Из девяти известных сладких дитерпеновых гликозидов (см. табл.1) наиболее изучен стевиозид. Это химически - и термостабильное вещество с коэффициентом сладости около 300, применяющееся в пищевой индустрии ряда стран. Оно нетоксично и низкокалорийно.

Q—R2

Таблица i.

Дитерпеновые гликозиды стевии.

Название Ri R2

Стевиозид Glc Glc2-'Glc

Сгевяолбиозид Н Glc2 - 'Glc

Ребаудиозид А Glc GIC3 2 - 'Glc L

Ребаудиозид В Н Glc3 2 - 'Glc 4c

Ребаудиозид С Glc Glc3 2 - 'Rha 4ic

Ребаудиозид D г Glc2-'Glc G1C32-'G1C 4k

Ребаудиозид £ Glc2 - 'Glc Glc2 - 'Glc

Ребаудиозид F Glc Gjlc3 2 - 'Xyl 'Glc

Дулкозид А Glc Glc2-'Rha

Примечание(Лс-глюкоза, Xyl-ксилоза, Юш-рамноза,

Выделение сухого очищенного экстракта стевии проводили из высушенных листьев стевии, приобретённой у фирмы Mediplantex (Ханой, Вьетнам) в соответствии со схемой, приведённой на рисунке 2. Высушенные измельчённые листья стевии экстрагировали 80% этанолом. Спиртовой экстракт упаривали досуха, растворяли в воде и

обезжиривали этанацетатом Сумму дитерпеновых гликозидов извлекали из обезжиренного водного экстракта бутанолом и перекристаллизовывали из метанола. Всего было получено 5 лабораторных серий сухого очищенного экстракта общим количеством 10,9 г из 250 г растительного сырья (табл 2)

Таблица 2.

Результаты получения сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

Серия , Вес сырья, г. а-» Анализ стевиозида в сырье (ВЭЖХ), %* Вес сухого экстракта, г Анализ стевиозида в -сумм Экстракте (ВЭЖХ)',%

ь 50 4,04 2,5 68,2

2. 50 4,04 2,1 67,3

3. ' 50 4,04 1,5 71,3

4. 50 4,04 2,9 65,6

5- 50 4,04 1.9 71,8

Итого 250 10,9

Методом ВЭЖХ было установлено, что содержание стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии составляет 66 - 72% На типичной хроматограмме, приведенной на рисунке 12, помимо пика стевиозида присутствуют еще два пика, соответствующих соединениям, принадлежащим к классу дитерпеновых гликозидов, предположительно ребаудиозидам А и С, которым свойственно более сильное удерживание на данном сорбенте (литературные данные) Подлинность стевиозида была установлена методом 13С - ЯМР, который также подтвердил наличие в смеси ещё двух соединений гликозидной природы УФ - спектр 0,01% раствора в метаноле сухого очищенного экстракта стевии обладал ярко - выраженным максимумом при 206 нм и плечом при 224 -240 нм (см рис. 3), что соответствует литературным данным по поглощению дитерпеновых гликозидов. Снятый в таблетках КВг ИК - спектр (см рис 4) содержал полосы поглощения при 3390, 2930,1730, 1620, 1080 см1, хорошо согласующиеся с литературными данными Также были получены следующие числовые показатели, удельное вращение [а] Б 5% раствора в воде составило (- 32 - 34)°, а температура плавления - 199 - 204 °С.

Рис. 2. Схема получения сухого очищенного экстракта из листьев стевии. Э А - этилацетат.

' I ' ■ ' I ■ ' ■ I ■ ■ ■ I 1 ■ ■ I ■ 1 1 I

200 220 240 280 '*'дуе19П0ч(пп

Рис. 3. УФ - спектр сухого очищенного экстракта стевии.

Ряс. 4. ИК - спектр сухого очищенного экстракта стевии.

2. Разработка методики ТСХ для качественного определения стевиозида и его препаративного выделения из сухого очищенного экстракта стевии.

Для качественного определения стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте стевии был использован метод ТСХ, как наиболее распространенный метод, отличающийся хорошей чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью. При разработке методики ТСХ было использовано 4 вида систем: хлороформ-метанол-вода (10:5:1), хлороформ-метанол-вода (30:10.1), хлороформ-метанол-вода (30:20:1), бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1). Для обнаружения использовали различные реагенты: 2 % раствор ванилина в метаноле ортофосфорная кислота (1:1), 50 % раствор серной кислоты, анисовый альдегид - серная кислота - ледяная уксусная кислота (0,5:1:50). Значения М для стевиозида в различных системах элюирования приведены в таблице 3. Наилучшие результаты были получены при использовании системы хлороформ-

метанол-вода (10:5:1) и 50 % раствора серной кислоты в качестве проявителя. Пятна на хроматограммах испытуемых образцов оценивали в сравнении со стандартным образцом стевиозида (рис.5). Чувствительность методики определения - 0,5 мкг стевиозида.

Таблица 3.

ХроматограФическая подвижность стевиозида в различных системах растворителей.

Элюнрующая система. Значение Кг для стевиозида

Хлороформ-метанол-вода (10:5:1) 0,37

Хлороформ-метанол-вода (30:10:1) 0,12

Хлороформ-метанол-вода (30:20:1) 0,43

Бутанол-уксусн &я кислота-вода (4:1:1) 0,47

О

О

О

О

О

о О

О

• • •

О о

о о

о о о

о п п

1 2 3

Рис. 5. ТСХ стевиозида в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (10:5:1), пластина «Fertigplatten Kieselgel 60» (Merck).

1 - Экстракт листьев стевии

2 - Сухой очищенный экстракт стевии

3 - Стандартный образец 95 % стевиозида (Вьетнам)

Разработанный метод ТСХ был использован для препаративного выделения индивидуального стевиозида из сухого очищенного экстракта стевии с целью его дальнейшего использования в качестве рабочего образна. 85% чистота выделенного стевиозида была подтверждена методом ВЭЖХ. Подлинность была подтверждена методом

10

"С - ЯМР, а также методом ПМР. При снятии спектра ПМР в качестве эталонного соединения использовали триметилсилан (ТМС). Дублет в - области 6,0 м.д. и два неразрешённых дублета в области 5.6 м.д. (рис. 6) относятся к аномерным протонам в глюкозных остатках при положениях 19 и 13 стевиозида, соответственно, что согласуется с литературными данными. На основании полученного спектра можно сделать вывод о присутствии в стевиозиде примеси стевиолбиозида, дитерпенового гликозида со свободной карбоксильной группой, причём его содержание находится в пределах 15 - 20%. В связи с неинформативностью спектра ПМР и технически сложной процедурой снятия было решено в дальнейшем использовать метод ЯМР 13С для подтверждения подлинности стевиозида. Отнесение химических сдвигов сигналов в спектре ЯМР 13 С проведено относительно внутреннего стандарта (ТМС) на основании литературных данных. Для сравнения, в таблице 4 наряду со значениями химических сдвигов сигналов атомов углерода исследуемого стевиозида приведены значения, взятые из литературы.

14' ' ' 1.1 ' ' <« ' 5.« 5 6 5.4 ' 5.1 ' 5.0 " ' '' 4 4 '«'-

(И"Л>

Рис. 6. Спектр ПМР очищенного стевиозида в дейтеропиридине.

Таблица4,

Сравнение экспериментально полученных значений химических сдвигов сигналов атомов углерода стевиозида с литературными данными.

Номер Химический ■ Химический Номер Химический Химический

«тома сдвиг сдвиг. атома сдвиг сдвиг,

углерода • литературное углерода литературное

* значение значение

1 40,6 40,7 18 28,1 28,2

2 19,2 19,2 19 176,7 177,0

3 38,2 38,1 20 15,4 15,4

4 43,8 43,9 СЗ-1 95,5 95,6

5 57,2 57.3 СЗ-2 73,8 73,8

б 22,0 22,0 СЗ-З 78,9 79,0

7 41,5 41,5 вЗ-4 70,9 70,8

8 42,4 42,5 63-5 78,8 79,0

9 53,8 53,8 вЗ-б 62,0 61,9

10 39,7 39,7 ем 97,6 97,7

11 20,4 20,6 С1-2 84,3 84,3

12 36,5 36,6 78,1 77,9

13 85,8 85,9 в1-4. 71,5 71,3

14 44,3 44,3 в1-5 78,0 77,9

15 47,5 47,5 Ы-6 62,6 62,5

16 154,2 154,3 С2-1 106,4 106,5

17 104,4 104,5

Представленные выше значения химических сдвигов атомов углерода исследуемого стевиозида хорошо согласуются с литературными данными, что подтверждает его подлинность Незначительные отличия связаны как с погрешностью

измерений, так и с тем, что литературные значения были получены на приборе с другой рабочей частотой Наряду с основными сигналами в спектре присутствуют сигналы атомов углерода стевиолбиозида Содержание этого соединения составляет не более 15 % УФ -спектр выделенного индивидуального стевиозида (рис 7) показал наличие максимума поглощения при 206 нм и отсутствие плеча в области 224 - 240 нм, характерного для спектра суммы дитерпеновых гликозидов Снятый в таблетках КВг ИК - спектр (рис 8) содержал полосы поглощения при 3390, 2930, 1730, 1080 см'1, хорошо согласующиеся с литературными данными. Также были получены следующие числовые показатели удельное вращение [а]Б 5% раствора в воде составило -31,5°, а температура плавления -198,5-199,5 °С

05 А

3 < 0.4

• о с « £ 03 \

S • * 02 01 0 IX

1 1 ' 1 1 1 200 220 ' 1 ' 2« г т ■■,—1—1 200 ' 1 ' .......-т Wavelengti (гш

Рис. 7. Спектр поглощения выделенного индивидуального стевиозида.

Рис 8 ИК-спектр выделенного индивидуального стевиозида.

3. Разработка универсальной методики количественного определения

стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте стевии.

В рамках данной работы нами были исследованы и оптимизированы три стадии количественного анализа стевиозида в растительном сырье: экстракция стевиозида из листьев Stevia rebaudiana, очистка экстракта и хроматографическое разделение с помощью обращённо - фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии на аминопропилсиликагеле. Нами показано, что разработанный метод может с успехом применяться для количественного определения стевиозида в сухом очищенном экстракте, а также в продуктах питания, содержащих листья стевии.

3.1. Подбор условий хроматографического разделения стевиозида.

При подборе хроматографических условий анализа использовали рабочий стандартный образец стевиозида 95% чистоты, приобретённый во Вьетнаме. ВЭЖХ выполнялась на хроматографической системе «Стайер» (ЗАО «НПКФ Аквилон», Россия) состоящей из двух насосов Марафон серии II, динамического смесителя, инжектора Rheodyne 7725i с объемом петли 10 мкл и спектрофотометрического детектора с фиксированной длиной волны детектирования UVV-104. Управление, сбор и обработка хроматографической информации осуществлялись с помощью программно-аппаратного комплекса «Мультихром 2.0» («Амперсэнд», Россия). После варьирования профиля градиента подвижной фазы и типа разделительной колонки (Si, C18, NH2) были выбраны оптимальные условия хроматографирования: разделение проводили на колонке Luna NH2 (250 х 4,6 мм, 5 \i) (Phenomenex, США) с установленной в линию перед аналитической колонкой предколонкой в

универсальном держателе предколонок. Для обеспечения постоянной температуры разделительной колонки использовался термостат колонок ThermaSphere (Phenomenex, США). В качестве подвижной фазы была использована смесь деионизированная вода -ацетонитрил в градиенте концентраций. Применённая нами форма градиента (табл. 5) не только позволяла разделить пики стевиозида и других гликозидов дитерпенового ряда, но и регенерировать колонку перед следующим анализом в ходе смывки примесей, обладающих сильным удерживанием и способных постепенно ухудшать разделительную способность сорбента. Время удерживания стевиозида составляло 11 + 0,5 мин. Типичная хроматограмма рабочего стандартного образца стевиозида представлена на рис. 9.

Таблица 5.

Форма линейного градиента подвижной фазы.

3.2.

Выбор длины волны детектирования.

Для выбора длины волны детектирования были сняты УФ - спектры в метаноле индивидуального стевиозида, выделенного при помощи препаративной ТСХ (рис.7) и сухого очищенного экстракта, полученного из листьев стевии (рис.3). Оба спектра имеют максимум поглощения при длине волны Хп^тО.Об нм с удельным коэффициентом поглощения ( Е"4/!,;,, ~57,3). Так как предел пропускания ацетонитрила, являвшегося одним

являвшегося одним из компонентов подвижной фазы, лежит в области 210 нм, (было решено в качестве аналитической длины волны детектирования использовать 215 нм.

3.3. Построение градуировочнон кривой. Определение предела детектирования стевиозида.

Для количественного определения стевиозида в пробах нами был применён метод абсолютной градуировки. Была построена калибровочная кривая зависимости фактора отклика детектора от концентрации стевиозида по четырём точкам (рис.10). Отклик детектора линеен в диапазоне концентрации стевиозида 0,2 - 1 мг/мл. Коэффициент парной корреляции R = 0,9997. Нижний предел обнаружения стевиозида составлял 1 мкг, что соответствует концентрации 0,1 мг/мл стевиозида в пробе.

1.25

* 1/

■JL

2 >

Плита»

5 10 15 2(1 25 30 35 П+02

Рис. 10. Калибровочная зависимость площади пика от концентрации раствора стевиозида (единицы измерения концентрации - мг/мл, площади - мВ/мин)

3.4. Отработка условий экстракции стевиозида из растительного сырья и последующей очистки экстракта.

Нами были исследованы и оптимизированы две стадии анализа растительного сырья: экстракция стевиозида из листьев Бита геЬаисВапа и очистка экстракта перед хроматографическим разделением. В качестве экстрагентов для выделения дитерпеновых гликозидов чаще всего использовались органические растворители, такие как метанол, этанол, диэтиловый эфир и ацстонитрил. Однако, использование этих растворителей не только экономически невыгодно, но и нецелесообразно с химической точки зрения, так как в экстракт переходит большое количество органических веществ, прежде всего пигментов, препятствующих дальнейшему анализу. Экстракция водой позволяет максимально снизить содержание сопутствующих примесей и упростить дальнейшую очистку экстракта. В целях оптимизации экстракции стевиозида мы исследовали влияние на степень извлечения таких параметров, как степень измельчения сырья, соотношение сырьё - экстрагент, температура

экстрагента, количество последовательных экстракций и их продолжительность (таблица 6). Наибольшее извлечение стевиозида из растительного сырья обеспечивала трёхкратная экстракция 20 мл кипящей воды в течение 30 минут. Также экспериментально установлено, что максимальное извлечение стевиозида из растительного сырья обеспечивает фракция частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм.

Таблица 6.

Зависимость извлечения стевиозида (%) из листьев Stevia rebaudiana от параметров

экстракции.

Число экстракций - Температура воды, "С Объём воды, мл., Время экстракции, мин.

1 2 3 20 50 100 10 20 30 10 30 60

2,5% 3,6% 3,9% 2,3% 3,1 % 3,8 % 3,4% 3,8% 3,8% 3,1% 3,9% 3,8%

Целью дальнейшей подготовки пробы являлась очистка первичного экстракта. На данной стадии использовали вакуумный манифолд на 12 позиций и картриджи для твердофазной экстракции Strata NH2 (500мг/3 мл) (Phenomenex, США). Мы использовали несколько типов картриджей для твердофазной экстракции, в частности, С13 и NH2. Так как С18 картриджи обеспечивали коэффициент извлечения стевиозида не более 54%, для очистки экстракта был применён метод неудерживающей твердофазной экстракции с использованием NH2 картриджей. Преимуществом данного метода является простота (проба пропускается через картридж с сорбентом, неудерживающим целевые вещества, но сорбирующим примеси) и эффективность (коэффициент извлечения стевиозида с картриджа составлял не менее 95 % для различных образцов сырья; СКО <2,1% для п = 5). Типичная хроматограмма очищенного водного экстракта листьев стевии приведена на рис. 11. Разработанный метод твердофазной экстракции может с успехом применяться для количественного определения стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии (рис.12), а также в продуктах питания, содержащих листья стевии (рис. 13).

ал—1—I—«—I—I—I—I—I—I—I—I—г—I—I—I—I—I—I—I—I—I 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 мин

Рис. П. Типичная хроматограмма очищенного водного экстракта листьев стевии. 1 - стевиозид.

100-

Рис.12. Типичная хроматограмма сухого очищенного экстракта стевии. 1 стевиозид, 2 и 3 - примеси дитерпеновых гликозидов.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 мин

Рис.13. Хромагсярамма экстракта травяного чая, содержащего листья стевии. 1 стевиозид, 2 и 3 - примеси дитерпеновых гликозидов.

3.5. Метрологические характеристики методик анализа.

Метрологические характеристики методики количественного анализа стевиозида в растительном сырье рассчитывались из результатов анализа высушенных до постоянной массы листьев стевии (Мейр1аПех, Вьетнам). В 10 независимых повторностях одного образца относительная ошибка единичного определения составила ± 2,83 % (табл. 7).

Таблица 7.

Метрологические характеристики методики количественного анализа стевиозида в листьях стевии (МеДр1аПех. Вьетнам).

Метрологические характеристики методики количественного анализа стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии рассчитывались из результатов анализа 10 независимых повторностей суммарной фракции дитерпеновых гликозидов третьей серии, причём относительная ошибка единичного определения составила + 4,85 % (табл.8).

Таблица 8.

Метрологические характеристики методики количественного анализа стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии.

4. Контроль качества и стандартизация сухого очищенного экстракта стевии.

Разработке методов анализа предшествовало изучение физико-химических свойств дитерпеновых гликозидов и стевиозида в частности в необходимом объёме.

Изучение свойств сухого очищенного экстракта стевии проводилось на образцах пяти серий.

Изучены ИК-спектры сухого очищенного экстракта стевии в таблетках бромида калия, при сопоставлении которых со спектром индивидуального стевиозида установлено, что сухой очищенный экстракт стевии имеет аналогичные с индивидуальным стевиозидом спектры.

Данными 'Н-ЯМР- и 13С-ЯМР-спектроскопии подтверждено соответствие основного компонента фракции стевиозиду.

Изучение спектров поглощения в УФ области сухого очищенного экстракта стевии проводилось с целью выбора оптимальных условий и характеристик, позволяющих установить подлинность. Спектр 0,01% раствора сухого очищенного экстракта стевии в метаноле имеет один ярко выраженный максимум при длине волны 206 + 2 нм и плечо в районе 224 - 240 нм. При сопоставлении спектров со спектрами индивидуального стевиозида установлено, что стевиозид имеет аналогичные спектры с сухим очищенным экстрактом за исключением плеча в районе 224 - 240 нм. Изученные спектры в области от 190 до 300 нм специфичны и информативны. Для установления подлинности стевиозида предложено использовать спектр поглощения 0,01% раствора сухого очищенного экстракта из листьев стевии в метаноле.

Нами определён и выведен удельный показатель поглощения (E^Vic) для сухого очищенного экстракта стевии при длине волны 206 нм. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9.

Удельный показатель поглощения Е14/^ сухого очищенного экстракта

стевии.

Серия E1%/im (п*=5)

1 59,1

2 57,2

3 55,6

4 59,0

5 55,6

Среднее значение 57,3

Важным показателем подлинности сухого очищенного экстракта стевии является содержание в нём стевиозида. Для качественного определения стевиозида была раразработана методика ТСХ. Для этих целей использовалась система растворителей хлороформ-метанол-вода в соотношении (10 5 1), пластинки «Fertigplatten Kieselgel 60» (Merck). Обнаружение проводили визуально при дневном свете после обработки пластинок 50 % раствором серной кислоты Пятна были окрашены в чёрный цвет. Хроматографированию подвергали 50 мкг сухого очищенного экстракта стевии Чувствительность методики определения - 0,5 мкг стевиозида. Характерной зоной являлось пятно с Rf 0,37, соответствующее стевиозиду. Разработанный метод ТСХ был включён в раздел "Подлинность" проекта ФСП ООО "Научно - исследовательский и учебно -методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии", а также в ТУ на биологически активную добавку к пище -БАД "Стевия" (таблетки, капсулы)

Для количественной оценки содержания стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии разработана методика с использованием метода ВЭЖХ Время удерживания стевиозида составляет 11 + 0,5 мин (рис 12) Обнаружен ряд пиков примесных компонентов Наиболее интенсивны пики примесных компонентов с временами удерживания около 13,8 мин и 16,7 мин., соответствующие, согласно литературным данным, дитерпеновым гдикозидам ребаудиозиду А и ребаудиозиду С, соответственно С учётом данных, полученных для образцов пяти лабораторных серий, содержание стевиозида в сухом очищенном экстракте стевии предложено нормировать не менее 65%. Разработанный ВЭЖХ метод вошёл в раздел 'Количественное определение" проекта ФСП ООО "Научно -исследовательский и учебно - методический Центр фармацевтических технологий" на

субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии", а также в ТУ на биологически активную добавку к пище - БАД "Стевия" (таблетки, капсулы).

Установлены нормы для общих физико - химических показателей качества сухого очищенного экстракта стевии: растворимость, температура плавления (199 - 204 °С), потеря в массе при высушивании (не более 7%), удельное вращение [а]Б 5% раствора в воде (- 32 -34)°. Результаты вошли в проект ФСП ООО "Научно - исследовательский и учебно -методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии".

5. Исследование антивирусного в антибактериального действия сухого очищенного экстракта стевии.

Для оценки биологической активности сухого очищенного экстракта, полученного пами из листьев стевии, были проведены испытания антивирусного и антибактериального действия совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии. Испытания проводили с вирусом болезни Тешена (РНК -содержащий вирус), вирусом инфекционного ринотрахеита (ИРТ, ДНК - содержащий вирус), а также в отношения человеческого короновируса, выделенного в ГУ НИИ гриппа РАМН от ребёнка в марте 2003 года в городе Санкт-Петербург, в культуре клеток и возбудителем сибирской язвы на жидких и твёрдых питательных средах.

В результате проведённых исследований установлено, что сухой очищенный экстракт, полученный из листьев стевии, в дозе 2000 мкг/мл ингибирует репродукцию вируса болезни Тешена иа 0,5 ^ ТЦД50 (тканевых цитопатических доз), ИРТ - на 0,25 ^ '11II150 и короновируса-на 0,33ТЦД50

Сухой очищенный экстракт стевии в дозе 4000мкг/мл инактивирует вирусы болезни Тешена на 0,75 ^ ТЦД50 , ИРТ - на 0,5 ^ ТЦД50 и короновирус - на 0,66 ^ ТЦД50.

Сухой очищенный экстракт стевии в концентрации 1,25% обладает бактериостатическим действием, а в концентрации 2,5% - бактерицидной активностью на возбудителя сибирской язвы в споровой форме при посевной концентрации 106 спор/мл.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Оптимизированы условия лабораторного выделения сухого очищенного

экстракта из листьев 81г\1а гвЬаыШапа Вейот (МеШркйсх, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 72%.

2. Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье, экстрактах и продуктах переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.

3. Разработал метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Оптимизированы условия подготовки образца с использованием метода твердофазной экстракции. Коэффициент извлечепия стевиозида с картриджа для твердофазпой экстракции составлял не менее 95%, а средне квадратичное отклонение метода составляло <2,1% (для п=5). Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.

4. Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК-спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие физико - химические показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Stevia теЬаиМапа Вейоп!

5. В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, полученный из листьев Stevia геЬаиМапа ВегЪот, обладает слабым вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также слабым бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.

6. Результаты проведённых физико - химических исследований были использованы при разработке технологической документации - проекта ФСП ООО "Научно - исследовательский и учебно - методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии" и ТУ на биологически активную добавку к пище - БДД "Стевия" (таблетки, капсулы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кедик СА, Януль НД., Фёдоров СВ. Сладкие дитерпеновые гликозиды стевии // Питание и здоровье. Биологически активные добавки, 2002, №8, с.42-44.

2. Федоров С.В, Кедик С А., Лнуль Н. А. Разработка метода выделения сладких дитерпеновых гдикозидов стевии и анализ полученных экстрактов // Материалы VI Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания», Сочи, 2002, с 266.

3. Кедик С. А., Фёдоров С. В., Прохорова Л.В, Смирнова Е.В., Шелестова В.В., Антонова Н.П., Панов А.В. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // VII Международный съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2003 г., Ш раздел, с. 352-357.

4. Кедик СА, Федоров С.В, Януль Н А. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сорбционные и хроматографические процессы, 2003, т.З, №6, с.648-653.

5. Кедик С. А., Федоров С. В., Януль НА., Прохорова Л.В., Смирнова Е.В., Панов

А.В. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методами ВЭЖХ и ТСХ // Химико - фармацевтический журнал, 2003, т 37, №10, с. 19-22.

Принято к исполнению 31/03/2004 Исполнено 31/03/2004

Заказ № 108 Тираж: 150 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

4 • *

t*? _ , A.

В настоящее время одной из актуальных и первоочередных проблем отечественного здравоохранения является профилактика и лечение таких широко распространённых и трудно излечимых заболеваний, как диабет и гипогликемия. В связи с этим особое внимание уделяется поиску новых низкокалорийных, интенсивных и безвредных заменителей сахара. Повышенный спрос на низко калорийные напитки и продукты питания, а также высокая стоимость таких традиционных синтетических сахарозаменителей, как сахарин, ацесульфам, аспартам и цикломат стимулируют этот поиск [ 1 - 6 ].

Среди наиболее перспективных и эффективных современных природных подсластителей внимание привлекают сладкие дитерпеновые гликозиды, накапливающиеся в надземной части растения £Уеу/а геЬаисИапа Вейош (в дальнейшем -стевия) в достаточно большом количестве - до 20% в пересчёте на сухой вес и обладающие ярко выраженным сладким вкусом, в 250 - 300 раз превышающим сладость сахарозы. Стевия произрастает в основном в северной части Парагвая, а на сегодняшний день культивируется в промышленных масштабах в Бразилии, Израиле, Вьетнаме, Корее, Китае и Японии. В одной только Японии на нужды пищевой промышленности ежегодно тратится около 1700 тонн листьев стевии [ 7 ].

Экстракты стевии, фигурирующие на мировом рынке под названиями (^еуюэт», «81еу1х», и «МагитШоп 50», используются либо индивидуально, либо в композициях с другими средствами для подслащивания напитков и других продуктов питания [ 8 ].

Во многих странах мира - в первую очередь, в Японии, а также Бразилии, Корее, США, Парагвае, Лаосе, Китае, Индонезии, Таиланде и других - стевиозид, основной дитерпеновый гликозид стевии, используется как подсластитель в широком спектре продуктов питания: винах, безалкогольных напитках, плодово - ягодных сиропах, кондитерских изделиях, при производстве зубной пасты, жевательных резинок и косметических продуктов. Стевиозид нетоксичен, низко калориен, устойчив при температурной обработке (до 120°С) и в широком диапазоне значений рН (2 - 10) [9-13]. При условии применения в частных технологиях производства алкогольных и безалкогольных напитков, молочных продуктов, хлебобулочных и кондитерских изделий, а также майонезов, соусов и консервов, стевиозид наилучшим образом подходит для использования в процессах смешивания в слабокислых средах, в процессах высокотемпературной обработки и может быть внесён в рецептуру на любой стадии [ 9 -13].

В последние годы в различных странах проводятся интенсивные исследования терапевтического действия стевиозида при таких распространённых заболеваниях, как гипогликемия и диабет. Обнаружены также и другие лечебные свойства, так, экстракт стевии согласно последним данным проявляет контрацептивную и антивирусную активности [ 1,14 ].

Растущий интерес к продуктам переработки стевии и появление продуктов питания и пищевых добавок на основе стевиозида на российском рынке обуславливают необходимость разработки эффективных методик контроля их качества с использованием современных методов анализа. В связи с неординарными органолептическими свойствами и биологической активностью дитерпеновых гликозидов стевии требуется углублённое изучение физико - химических и биологических свойств данных соединений, а также совершенствование методов их выделения из растительного сырья.

Поэтому представляло интерес:

Разработать и оптимизировать универсальные и высокочувствительные методы стандартизации сухого очищенного экстракта стевии;

Совершенствовать способ выделения сухого очищенного экстракта из листьев стевии;

Оценить биологическую активность, в частности антивирусную и бактерицидную, полученного стандартизированного сухого очищенного экстракта стевии;

С этой целью в настоящей работе оптимизированы условия лабораторного получения сухого очищенного экстракта из листьев геЬаисИапа ВеЛот

МесИр1атех, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 80%.

Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.

Разработан метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Улучшены условия хроматографического разделения, а также разработан новый способ экстракции растительного сырья и последующей очистки экстракта с использованием метода твердофазной экстракции. Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.

Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта из листьев стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК - спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие физико - химические показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Лег/а геЬаисИапа ВегЮш.

В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, выделенный из листьев геЬаисИапа ВеЛош, обладает вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.

II. Обзор литературы. и

V. Общие выводы

1. Оптимизированы условия лабораторного выделения сухого очищенного экстракта из листьев геЬаисИапа Вейош ( МесНр1ап1ех, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 72%.

2. Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.

3. Разработан метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Оптимизированы условия подготовки образца с использованием метода твердофазной экстракции. Коэффициент извлечения стевиозида с картриджа для твердофазной экстракции составлял не менее 95%, а средне квадратичное отклонение метода составляло < 2,1% (для п=5). Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.

4. Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК-спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие числовые показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Лта геЬаисИапа ВеЛош.

5. В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, выделенный из листьев Stevia геЬаисИапа Вейот, обладает слабым вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также слабым бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.

6. Результаты проведённых физико - химических исследований были использованы при разработке технологической документации - проекта ФСП ООО "Научно - исследовательский и учебно - методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии" и ТУ на биологически активную добавку к пище - БАД "Стевия".