Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез, исследование и применение адсорбентов аффинного типа биомедицинского и фармацевтического назначения

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ О ^ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

' I;"] рс^ЯЗАНСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. акад. И. П. Павлова

На правах рукописи УДК 543.544 :(615.1+ 616.000.57)

КУЗНЕЦОВ Петр Васильевич

СИНТЕЗ, ИССЛЕДОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ АДСОРБЕНТОВ АФФИННОГО ТИПА БИОМЕДИЦИНСКОГО И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия )3.00.04. — биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук в форме научного доклада

Рязань — 1994

Работа выполнена на кафедре биохимии Красноярском государственного медицинского института и на кафедре фармацевтической химии Кемеровского государственного меди цинского института.

"Научные, консультанты: доктор медицинских наук, академик РАН Е. А. Строев,-доктор.фармацевтических на ук, профессор А. А. Цуркан.

О <¡1 и ц и а л ь н и е оппоненты: доктор фарманевтичес ких наук, профессор Ю. Е. Орлов, доктор фармацевтически наук, профессор А. Н. Щавлинский, доктор химических наук профессор Г. А. Чалый.

В еду щ а я о р г а н из а и и я: Пермский фармацентиче ский институт.

3; та диссертации состоится г

Совета (Д 084.67.02) при Рязанском государственном меди цинском университете им. акад. И. П. Павлова (г. Рязань ул. Высоковольтная, д. 9).

С диссертационной работой можно ознакомиться в науч ной библиотеке университета.

Диссертация (доклад) разослана ....../£¿^^..1994 г

в.

часов на заседании Специализированного Ученогг

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Е. А. РЯЗАНОВА

О Б 4 а л X А Р А К Т й Р II С Ч ; К * ? .•. .

¡¡о:чч л.п;■■ •,.

(ПОЮ зир-.жоо ■ оч --и!, . : ..... ■

!5оте и фар»ашш в качестве ;щеор:>от»тои -гдя иНгипю:........г тг

фии (АФл) биополимеров (Н1), рдч? ^зкологичео.-си -л?: ••■■:. (ФАВ), в то»1 числе растительмкх биологически зкти '-.гг.ос-;к (рЕЛВ), лекаретштшх средств (лО, полв»«ерт!Х лекар.ггвечнц:-: . средств, б том числе V! и»»"оОилизоеанных фер"С*"гов, г»»««- и ¡дг.'З-р.осорбе«тов, пили»»врных реагентов и биосенсеров. Исследования в области синтеза и применения ПСН интенсивно проводятся -сак за рубежом (США, Япония, ФРГ, А«глия, Израиль и пр.), тик и в странах СНГ, в том числе и а Россия. В нашей стране по даиний прооле-*»е успешно работает Н.А.Плате, А.Е.Васильев, З.А.Д&зат'ков, 1'.В.Лисичкин, Б.А.Кляищ!жий, их сотрудчшки и киллегм.

' Стратегический путь сознания ПСН обязательно к:лкч<зет поч-5ор и активашм соотвегетаугуцей поли»'вр"ой »псриты с ".с.и»"£Г"лзй ее химической ••откфясацией определен^!" лига".лом {ск:и кфичеокой молекулой) по заданному фу»кциоиаль«о-«у тзттачеккго. Среди известных методов активации (более 15) сохраняет слою -дгсгжуэ актуальность метод эпоксиактивашш (НЭА), приводя':;::;*: к получения ьь-сокостабиль*»ых ПСН, спосооных к длитель»эку фу"К'пю1П!роБа"'л:о. Большой интерес в последние годы вызывают так\-:е ппразидозктик::-роваммые ПСН, исследованием которых активно г»п*ир*ались -Б.А. щицкий и сотр. (1985-89 гг.). Однако использсзп< зах гиаразияосодер-каздх ПСН, исследование их пр! "ии и фармации изучены яв»о недостаточно. 3 итог. ллдоп ..и!?ор.>" была сделала попытка системного исследована;-. этой проблс*: с и:---пользование»' как мягких, так и полужестких (стером, тойопгл) типов матриц.

С другой стороны, в последние годы резко условились клдееи-фисациотгые ра««ки классического »-етода А5Х, г.лтор-.к уде «е :"0-щали все известные его варианты и "оцифакацк;:, игнорируя те-- еа~ «№» новейшие перспективы метода, применительно :-: ксзле-ош'пш "изкслюлекуляриых веществ (ШВ) (З.Даваяков и лр., 1969), а особенности - ЯС, фитопрепаратов (ФП). Поэтотп- предо??, алллопь крайне актуальным и и»терес"ьр' проверить гипотез;/ апторя (П.В.Кузенов, 1986) о выделении среди А5Х »ивой области исследовакиг -т.н.неклассической АФХ (НАОХ). Безусловно, развитие и системное изучение возможностей НАФХ при»'енитель«и к вк^ичайгсу арсе»-!л;

П'О , [

рБАВ, ЛС ча rj"OQO синтеза «ошх видгз адсорбе"тои афф>,пя па (ААФТ) является новейши>» перспективам яаправлечием ф; Естественно исследовать при синтезе ААШ и другие метод! вации »«атрид - беизохиноиовый (БХА), триазиновый (ТЗА).

Цель и задачи исследования. Целью работы является го длительно функционирующих ААЗ?Г для применения НАФХ в фар . таюке использование оригинальных »катодов выделения некотс - хгАЛу/л/'-фертсен'гов, стероидевязывающих о'елков (ССБ).

В задачи исследования входило

- предложить новые системные подходы к "единой класс* »»етода АФХ, стратегии синтеза азоадсорбентов (АЗС);

- изучить неизвестный путь иммобилизации глюкокортив до в «а гкдразидосодержащих АЖГ и на ос«ове ориги"аль«ых предложить способы ввделе«ия и очистки некоторых НАДО/Н/-тов (глутатио«ре,пукгазы - ГР, изодатратдегицроге^азы - ИВ латдегидрогетзы - МДГ), ССБ;

- изучить возможность при»'ене«ия реактива Инмгаиа-Дин фу«кщо«альио'* фармацевтическом анализе лекарственных сре ко»«плексообразующего полимера как индикатора метода »ерку

- обосновать возможность использования 0С"0в«ых при« классической АФХ (емкость адсорбента, длина вставки и др. ласти НАФХ, изучить применение некоторых типов высокостаб; ААФТ для выделеиия, очистки и анализа ЛС, рБАВ, ФП, на их разработать способы анализа ряда ФП.

Научная «овизяа.. I. Впервые для выделения и очистки 1 завися»ферментов разработан синтез НАД<Б-гидразидооксип] фарозы (НАДФ-ГАОШ). На ее основе создан способ вьщеления очищенного ферментного препарата.

2. Впервые разработан и изучен новый путь синтеза ст< содержащих ккШ на основе гидразидоносителей для исследовг

3. Впервые разработан синтез АЗС с фенолы»ы«'и, полифс •«и и алкалоидошдобными лиганда>.<и для исследований в облас

4. Впервые проверено изучение влияния структурных осс тей (тип матрицы, структура вставки и др.), синтезированнь "а специфику выделения, очистки некоторых типов ВП, ЛС, pl В процессе исследования си"тезирова"0 и изучено более ста ААФТ.

5. Впервые предложены новые способы разделения, выдел очистки ос"об«ых классов рБАВ - алкалоидов, флаваиоидов, к wob и др. "а полученных ААФТ.

6. Впервые, "а ос«ове изученных, AAST показала возчож»

группового разделения различных классов рЕАВ в комбинировать ¡х ifi.

7. Впервые использован систе«<пый почхоп тля создания едино;: классификации вариантов жидкостной колоночной АФХ, изучена стратегия синтеза АХ.

Практическая ценность и реализация результатов

В биомедицинских исследованиях.. I. Для эффективного выделения и очистки ГР и других КАДО/Н/-зависит'ых ферментов из печени крыс предложено заменить импортный адсорбент 2,5-АД$-сефарозу легко синтезируемой НАД5 - ГАОПС. Данный способ позволяет получать в значительных количествах (граммы) эти ферменты в условиях лаборатории .

2. Полученные нами стероидимиобшшзоштше ААФТ (СИ-ААФГ) позволяют провести замену труд«одоступах коммерческих аналоге -при исследованиях ССБ, стероидных рецепторов. Новый стратегический путь синтеза СИ-ААФТ защищен авторски»* свидетельством » 1592985 (СССР).

Разработанные авторов« способы синтеза AAST одого типа используются в работе кафедры фармацевтической химии, ЦНШ1 Кемеровского медицинского института, а способы шделет,ия и очистки - БП ; лабораториях Института..биофизики СО РАШ (г.Красноярск), Инс?;п;--та биоорганической химии (Беларусь, г.Минск \ Института биохимии (Беларусь, г.Гродно).

В фармацевтических исследованиях. I. Для фар-'апептичееко?.: функционального экспресс-анализа ЛС, содеряшщх первичные аминогруппы (алифатические, ароматические, гичра;>пд«гие^, авторо»« ложен реактив Инмаиа-Диптзиса (2, 4, б - Три?гитробензплсульфон;:? натрия), что позволило с успехом использовать его в условиях аптечного анализа лекарстветп?ых фор».!, дефектуры.

2. В фармацевтическом анализе галогенид-ионов »<етодом »чзрку-риметрии автором предложен в качестве полимерного индикатора »те-горазового действия комплексообразущий пояи»-ер на основе иммобилизованных производных витаиина В^ (а.с.Р I381942).

3. Для исследований в области НА<М авторо" разработан способ получения полимерных ААФТ с имчобилизованмы»*и фенольныуи, полифе-нольными лигандами (а.с. № I481985). На его основе разработаны способы выделения и очистки азотсодержащих алкалоидов, флавонои-дов (а.с. № 1700463), кумаринов (а.с. № 1770097), танина (а.с.

Разраоотатме спосоои разделения, выделения и очистки "ых классов пЕдВ используются "а кафедре фармацевтической КГМИ, в лабораториях кафедр фармакогнозии и биохимии Санкт бургского х№»ико-фар»<ацевтическоро института, в Харьковско но-исследовагельском институте химии и технологии лекарств средст н (Украина, г.Харько в).

Настоящая п,иссептацион"гя работа выполнена б ра**ках Г — - програ^ы "ФАРМАЦИЯ" - № 10.06.02, "Фармацевтичес отология и'биофарчация" (раздел Ш, п.29), № госрегистрации 01.9.30003597. " - ' .......

Апробация работы. Результаты работы доложеныла Всесо симпозиум« по физике и химии белков и пептидов (Баку, 1980 Всесоюзных конференциях: по физико-химической биологии (То 1982),. по перспективам использования биоспецифической хро>< фии (Вильнюс, 1982); на Всесоюзных конференциях: "Новые ле вениые препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Т 1989), "Проблещи стандартизации и контроля качества лекаре средств" (Москва, 1991); "а республиканских конференциях и дах: по пути повышения эффективности фармацевтической наук ков, 1986), У Всероссийском съезде фармацевтов (Ярославль, по резерва*» совершенствования лекарственного обеспечения Р (Владимир, 1991), по реализации научных достижений практич фармации (Харьков, 1991), по актуальным вопроса»» фармацевт «ауки и практики (Курск, 1991); на зональных и региональны ференциях и совещаниях: по профилактике, диагностике и леч заболеваний человека (Кемерово, 1987, 1988), по применению ченных методов аналитической химии на предприятиях Кузбасс »■•ерово, 1988), по опыту развития новаторава, изобретательс (Кемерово, 1989), по актуальны»« проблемам фармации Кузбасс "ерово, 1989), по состоянию и перспективам развития фармац Сибири и «а Дальнем Востоке (Томск, 1991), по поиску, созд изучению новых лекарственных средств растительного и синте ксго происхождения (Томск, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 получено б авторских свидетельств.

На защиту выносятся:

- теоретическое обоснование предложенного систе»*ного включающего новый принцип классификации метода АФХ, вьщеле

j-ак Huuoro направления, г полые подходя к страт.зг ;и синтеза АЗС;

разработка списобоп синтеза гидразидосодержащих ЛЛФТ (с при немение»» МЭА, БХА и ТЗЛ), содержащих п качестве лигпндаи koJoo-менты, кортикистероиды, витамины, фенильные и полифенольнцц ЛС, рБАВ;

- результаты систе»»ного скрининга ААФТ как по параметрам: отр ктура адсорбента - хро«атогряфическая специфичность (при па лений, ьыде , очистке БП, рНАВ и др.), так п К'.- и 2) С ¿i ' исследования различннл классов рБАВ, включая обоснование ипт;:>»а-'ль«ых условий для создания эффективных способов их выделения и

очистки;

- методы фармацевтического анализа лекарстветгк,-. Форм па ocuo ве реактива Инмаыа-Динтзиса, а также полимерного индикатора и комбинированных ОН;

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ I; .

I. К ПРОЕМЕ НОВЫХ КЯАССИКЖАЦИОШЫХ ПЙШфШЗ МЕТОДА. А 0 X , СТРАТЕГИИ СИНТЕЗА АХ

Хороши известии, что стратегия синтеза классически*. аффич-«ых адсирбе«тив для метода АФХ в последние годы становится единой и широко используется в так называемых нетрадиционных вариантах АФХ, где исследуется разделение, выделение и очистка различных НМВ, прежде всего ЛС, рБАВ (П.В.Кузнецов, 1992). В этой связи автором предложе" для адсорбентов, содержащих в своей с тру ктуре систему: матрица - вставка - лиганд (СМШЬ, независимо от конкретного варианта MX,более общий и точный термин - ААФТ (П.В.Кузнецов, 1991).

Отмеченная авторим классификационная "неразбериха", уже воцарившаяся в методе классический А$Х, где игнорируются такие новые варианты метода, как рецептор»о-аффицчая хроматография, пэ-лифэнол-лигамдная хроматография, белок-лигачД"ая хроматография и ряд"" других, привела к появлению более десяти классификационных групп ААФТ, вплоть до шделения так называемых "экзотических" аффинных адсорбентов.

С другой стороны, идеи о выделении новых разновидностей А5Х-"обращенной" Ш (ОШ) и неклассической АФХ (П.В.Куэмегоз, 1992 позволили автору предложить новую концепции классификлтз»:, учитывающую применимость АФХ не только в области исследования Dil, но ; в области изучения НМВ, которая является методологически-■ стержнем любых частных методов А5Х. Предлокетгная концепция илластриру-

ется схемой № I.

кл А Ф л (тип лиганда не Н А $ X (как лигандн и<

зависит от его массы) зованы ЩВ)

ОБЛАСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ ВП ОБЛАСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ НЫЗ

О А Ф X (иммобилизован! олиго-, полимерньБ лига-

Схема "Т.—Единая.концепция использования методов А£Х в области жидкостной колоночной хроматографии (П.В.Кузнецов, 1992)

Аналогичная ситуация известна для полифенол-лигандно! матографии (ГЩХ), например, кверцетинсодержащий ААФТ испс вался не только в клА&Х (очистка эстрогечного рецептора), исследованиях автора в области НАФХ,(П.В.Кузнецов.и др., ] 1993), где новые оригинальные ААШТ с различны»™ фечольньля лифеноль«ьши лиганцами применяли для разделения, выделение стки основных классов рБАВ, таких как алкалоиды, флавонощ марины и др.

Предложенная концепция позволила углубить и расширить схематизацию наиболее перспективных методов активации тнер носителей,•например, МЭА (П.В.Кузнецов,, 1993),,где авторов лько приведены новейшие современные данные по синтезу и пр нию эпоксиактивированных носителей в области клАФХ, но и в показаны перспективы использования их в других вариантах м лярной жидкостной колоночной хроматографии (ШШ, в том чи варианте НАФХ, актишо развиваемом в работах автора.

Наконец, автором в одном из последних обзоров, посвящ стратегии синтеза АЗС (П.В.Кузнецов, 1993) впервые предлож стеяатизирова« и проанализирован новый подход к стратегии АХ, отсутствующий в новейших монографиях по ШН, согласно чу сегодня известны три стратегических цути синтеза АЗС: я пильный метод" (А®), "реверсный метод" (РШ) и "лиганд-вс ный метод" (ЛШ), в каждом из которых имеются частные и ко ные способы синтеза,также анализируемые автором (см.схему ,

А Ф М путь:

———-—-

Л В М путь: _.

где: X (Х-') - зона химически модифицируемой матриц

У (УО - модифицируемая функция вставки (или вставки с лигандом)

Л - иммобилизованный лиганд

Схема !f» 2. Основные стратегические пути синтеза АЗС (П.В.Кузнецов, 1993).

Разработанный впервые системный а"ализ стратегии синтеза АЗС, по мнению автора, позволяет проводить выбор четкого, направленного пути синтеза АХ в соответствии с особенностями областей молекулярной ККХ, в которых они будут использоваться в дальнейшем.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ГИДРАЗИДОСОДЕРДАЩЦХ ААФТ ДНЯ БИОМЕДЙЩШШГО ПРИМЕНЕНИЯ

Современное состояние методов синтеза гидразидосодержащих AMT и перспективы их применения в области метода MX частично рассмотрены автором в ряде обзоров (Б.А.Клящицкий, П.В.Кузнецов, 1984; П.В.Кузнецов, В.Я.Кононенко и др., 199I; П.В.Кузнецов, 1992, 1993). В них отражена не только чалоизученность этого направления в клАФХ, но и особо подчеркнуты перспективы синтеза этого вида ААФТ на основе МЭА, впервш разработа*того эстонскими исследователя*^ в 1979 году. Автору, разрабатыпа?:-щему далее это направление, удалось стабилизировать и частично модифицировать способы эпоксидирования мягких носителей (ага-роза, сефароза), распространить их на носители полужесткого типа (тойопал и др.). При этом в качестве зпоксиреагентов использовались не только наиболее перспективный метод Аксена и сотр. (1974), но и некоторые био(поли)эпоксиды, систематическое изучение которых пока только начинается.

2.1. Синтезt скрини»г и использование коферментсодерж.ащих ААФТ для получения высокоочищ^ных НАД£/Н/~ зависимых ферментов

Выделение и очистка методом клАФХ некоторых важнейши ■ - НАД5/Н/-зависимых ферментов (ЩЦГ, МДГ) цикла Кребса, а т одного из центральных, ферментов тиол-дисульфидного обмена достаточно актуальная, но и трудоемкая процедура. Принцип задача эта била решена уже в середине 70-х годов зарубежн следователями, но на основе бромцианактивированных типов из которых наиболее перспективной оказалась 2,5 - АДф-сеф которая стала важнейшим коммерческим сорбентом зарубежных ("Фармация", Швеция).

Однако, к «ачалу 80-х годов была показана и доказана деленная нестабильность этих бромцианактивированных типов особенно по связи матрица - вставка, а также наличие для желательной неснецифической сорбции других БП.

С другой стороны, кроме 2,5-АД£-сефарозы хорошие рез по очистке и получению НАД(ф)-зависимых ферментов показал разидосодержащие-коферментиммобилизованные ААФТ, впервые ченные достаточно простым способом Вильчеком и сотр. в 70 дах (т.н. "рибозилсвязанные",FC-ААФТ, Я.Туркова, 1980), и же на основе бромцианактивации.

Поэтому, появление в 1979 году способа Устава и сотр получения высокостабильных (особенно по связи матрица-вст эпоксигидразидосефароз позволило автору получить на их ос ряд новых ГС-ААФГ с иммобилизироваиным НАДф и изучить их нение для выделения и очистки ГР (П.В.Кузнецов, B.C.Бонда 1980).

В процессе их синтеза важнейшей стадией являлся спос эпэксиактийации агерозных носителей (сефароза 4,6В; агаро. по Аксену и сотр. с применением эпихлоргидрина. К сожалей: условиях классического способа Аксена качество эпоксигеля нестабильным (шло сильное "комкование"), в связи с чем ав' была проведена модификация способа: введение оргатмческог створителя-25% димегилсульфоксида и добавка поверхностно ; «ого вещества - бромида датилтриметилачмоттия и др. его aw

гов. Качество зпоксигеля сцеживалось разработать, автора»- экспрессной Ифе«олфгалеи"овой" пробой (ФФП) и било "а уровне сред-неэпоксиактивироваяных носителей (ЭАН) (до 20-40 мкчолеП :>нокси-групп/мл упакованного геля) (П.В.Кузнецов, рац.предложение КГМп № 900, 1981).

Разработаттый автором модифицирований способ давал в итоге высоковязкий, хорошо структурированный эпсксигель, который в дальнейшем модифицировали по способу Устава и сотр. путе» введения гидразидной вставки и далее лига«дами по схеме 3 с получе-

Модельный бромдаанактивиро ванный ААФТ (У) синтезировали аналогично. С целью более широкого скрининга НА^-содержащих ААФТ по парачетру "структура-сорбция" для выделения и очистки ГР был разработан синтез ряда оригинальных АЗС (У1-УШ по схене

С аналогичной целью синтезировали ААШ (Ж-Х1) и для коза-ле«тной хроматографии ГР - аналоги широко известной "ткопролил-сефарозы", получающиеся после активации меркаптогеля 5,5-дитл-обис-(2-"итробензойной кислотой) (реактив Эллнана,ДТКБ), а также ряд их производных "а основе цистачина, цистеика к глутатио-"а (П.В.Кузнецов, рац.предложение отраслевое, 1Г» 0-147сЗ, 1960). Синтез кШТ С1Х-Х1) проводили по схеме ¡Г» 5.

нием ГС-ААЖГ (1-1У).

о

Схема !,"> 3

№ 4.

<rO-tHrNT7 M

ù

Схема № E 2..

OH yCOOH

о 4Hr¿H -C-Hi" M U -R - S -S -(O)- KíO¿

- ____________________Ç0HH^HZ" COOH

- ; -СН-СН/ ; -'CH-tc^üü-NH-CH-CH/ ; (m сое и u; í>-¡)

¿'ООН

(Xi).

Емкость синтезированных МФТ < I-УП) по лиганду, опре. мая стандартными Сф-мегодами (Я.Туркова, 1980), варьирова 0,8 до 5 мкмолей/мл упакованного геля. Для группы ковален1 АШТ (УШ-XI) емкость по ДГНБ-зависимым группам составила i мкмолей лиганда/мл геля.

Скрининг полученных ААФТ по ГР проводили методом ЙКХ стандартных условиях: стеклянные колонки ("Фармация", Шве заполнеттые 4-5 мл геля адсорбента, фосфатный буфер с pH скорость элюирования 18-20 мл/час (перистальтический нас? topeipex", "ЛКБ", Швеция), объем фракций - 1,5-2,0 мл (ко тор типа 301 В "fWed", Польша). Элюентами служили: I мл раствора НАД$Н в фосфатном буфере ("пульс") или 0,5 M рас натрия хлорида в том же буфере для ААФГ типа I - УП. При с AMT типа УШ-XI элюентом служил I раствор дитиотреит ("£eWa"t . Броцзсс хроматографирования контролировал СФ-26 (СССР) или с помощью фотометра "VvLeoid, S» («дщ» ция). Регенерацию колонок проводили 2 M раствором натрия с последующей отмывкой их дистиллированной водой. Активно определяли известным методом Рэкера (1955). Концентрацию определяли модифицированным методом Лоури.

По данным скрининга,ААФТ типа УШ-XI практически не с вали ГР, хотя по белку выход составил до 1,5 мг/мл геля а бента, что говорит о наличии в элюатах неидентифицирован* SH-белков. AAST типа У1-УП (АХ) полностью связывали FF заносимого образца, но при элюоди наблюдался сравнительно высокий выход фермента (до 30%) и очистка лишь в 40 раз ( табл. I)., Для ААФТ типа 1-У удалось показать четкую зако* ность - эффективность очистки ГР зависит от длины вставк» адсорбенте. Оптимальной она■оказалась для НАД&-ГА0ПС. Ре: ты проведенного скрининга на этапе клАФХ приведены в таб;

Таблица I. Э($фекгии"ость работы АА$Т при очистке ГР "а этапе КЛЛФХ

Тип Адсорбента Элюент I 2 3

I. Аз о AMI (У1) I fi.i ради 2292 28 40

П. FC-ÄAütT

• х=2

а) (У) — и w - 1902 57 31

б) (I) - " — " — 1919 52 30

х=3 (П) — " — п — 2788 90 72

х=4 (Ш) — " м — II055 . 73 205

Ш. z'f 5-АД5-

сефароза

(контроль) _ Ч _ W __ 4525 85 120

Где: I - удельная активность ГР в «молях НАД5Н мин" на

I мг белка; 2 - процент выхода фермента; 3 - кратность очистки; х - число атомов углерода в структуре вставки; а) - бромдаанактивированный аналог, б) - зпоксиактиви-рованный аналог.

Таким образом, данные скрининга впервые показали возможное?: использования двух типов получе«*тых AAST, причем РС-ААФТ с х=8 (себацильный аналог) практически тте связывает ГР, что позволило рекомендовать для дальнейших исследований по получению НАД5-за-висимых ферментов высокой степени чистоты именно РС-АА2Т с х=4 (Ш) - т.н. ВД&-ГА01Ю. В отличие от классической 2,5-А,ЕЩ-сефаро-зы, а также от известных бромцианактивизированиых НАД(Ф)-адсорбентов, синтезированная автором НАД5-ГА0ПС высокостабильна, не имеет в своей структуре ио«огенных групп и сильно гидрофобных вставок, которые обычно уменьшают селективность адсорбентов (B.C.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин, 1987, 1988).

Разработанный в дальнейшем на основе НАДО-ГАОПС быстрый метод получения высокоочиценннх !1АД5/Н/-заБисдетых ферментов - (ГР ИЦДГ, МДГ) из печети крыс включал следующие стадии: I) получение первичного препарата (грубый супернатант печени), 2) фракционирование сульфатом аммония (от 40 до 80% насыщения в фосфатном

буфере с рН 6,9 - 7,0, центрифугировав') - 50 ООО X 30 м ализ), 3) клАФХ на НАДф-ГАОПС (колонка 1,6 X 20 си, скор протока до 60 мл/час, объем фракций 5-7 ил, элюция 2-3 ч раствора НАД5Н в фосфатном буфере с рН 6,9-7,0) и 4) хро графию на гидроксилапатите (колска 2,6 X 20 см, градиен шя 0,01 М фосфатным буфером с рН 6,86, скорость протока объем фракций 5 мл). Скорость разверстки градиента (2 су -последней стадии задавали при помощи смесителя "Свтлодт' ("ЛКБ", Швеция), остальное-оборудование описано ранее. Д электрофорез белковых образцов проводили известным метод и 5 А5 -форез.

Уже на стадии получения ферментного препарата метод< в нем, кроме ГР-активности, были идентифицированы допол«! - ИЦЦГ- и МДГ-активности, что в целом соответствовало тр< ковым зонам «а диск-электрофорезе. После дополнительной : тографии на гидроксилапатите (см.рис.1) получены практич< могенные ЫДГ и ИЦЦГ, а также ГР высокой степени чистоты ( рис.2 и таблицу 2).

Высокая стабильность адсорбента НАД&-ГА011С подтвержу использованием хроматографической колонки с этим ААФТ дл> в течение 2 лет (около 20 циклов хроматографии без сниже* ктивных и адсорбционных свойств). Предложенный способ очк НАД$/Н/-завиеичых ферментов позволяет эффективно заменить мерческий ААФГ - 2,5-АЦВ-сефарозу (Швеция) оригинальные с ственным адсорбентом, более стабильным и относительно лег тезируемым (В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Ме^евикин, 198

0,2

ои

-гЪ

275

м

0,5

0,25

4-

Ь >16 24 за ч.

Рис.1. Хроматография на гидроксилапатите. Стрелкой ооозначен момент подключения градиента фосфатного буфера. I - кофермент ШШШ, 2 -неиденгифииированный белок, 3 - ИЦЦГ, 4 -

хо

iras?»

sa

а

б

H

к,»,,

О п..,.. ________,

л.. ДП — Vjjlt: л г vo t „ ^

препаратов на разных стадиях очистки ферментов, а - диск-электрофорез образца после хроматографии «а НШ-ГАОПС; б-г - SAS -фороз МДГ, ИЦЦГ и ГР соответственно после хроматографии на гидроксилапатите.

Таблица 2. Итоговые параметры очистки НАД5/Н/-зависимых ферментов из печени крыс

Стадии ГР щдг ; мдг

очистки I 2 I ; 2 ; I ' 2

Грубый супернатант ——Нрракциотарова- ние сульфатом аммония -5»- клА&Х—а* -»-хроматография та 32 1742 1 > 31 I 1035: 1,9, 74 .........1._____________| ... I.........

Где: I -выход фермента, %; 2 - фактор очистки.

Кроме того, по мнению автора, получений ферментный препарат высокой степени очистки, с достаточно стабильны" качественным составом, мог бы использоваться для диагностики и исследования некоторых патологических процессов (глаукомы, ожоговых поражений глаз и др.).

2.2, Синтез, скрининг и применение СИ-ААФТ ...для выделения и очистки ССБ

Среди важнейших проблем рецептологии исследование стероид-рецепт ориых белков (или ССБ) занижает одно из ведущих ««ест, а их выделение и очистка до сих пор не потеряли своей актуальности, в особенности с применением клАФХ. Анализ систематизированных литературных даншх по синтезу ААФТ с ¡¡"мобилизованными сте-рои.цчычи гормонами (П.В.Кузнецов и др., 1991) показал, что за

г

в

рубежом эта задача принципиально решена з конце 70-х-сере1 80-х годов, но способы получения этого типа ААФТ весьма ки, требуют ряда дефицитны* реагентов.

Те»« не менее, как и предполагалось, пути стгтеза СИ-/ основе гидразидонисителей достаточно просты»и и эффективнь соба«и - через высокоактивные аль-производные стероидов -чески не изучены.

С другой стороны, работа-ш Б.А..Ютя'циц^'ого ИиЗтр»(Х984 были показаны перспективы использования ряда гидразидосоде носителей на различных видах матриц (агароза, тойопал, сфе др.) для иммобилизации аль-содержащих лигаидов (производны птомицина и др.) с получением АкШ, эффактивныл в очистке крови, некоторых липопротеидов и т.д.

Весьма привлекательным в синтезе СИ-ААФТ на основе ги доадсорбентов представляется факт варьирования их химическ структуры в широком диапазоне (типы и полярность вставок, фильно-гадрофобные свойства матриц и т.д.), что позволяло конечную итоге провести классическое изучение их свойств в влении "структура кШ1 - сорбдаонкый эффект" и сделать важ выводы о специфике применения такого типа СИ-ААФТ.

Наконец, в рдде последних обзорных работ по синтезу э: активированных ААФТ (П.В.Кузнецов, 1993) уоедительно доказ преимущество эпоксиадсорбентов, получаемых по метода Аксен др. (1974), перед их аналогами на основе реагента Сандберг та (диглицидиловый эфир 1,4-бутакдуо/ч?,!, так как ААФТ на ос последних показали ощутимую неспецифическую сорбцию белков тому в дальнейшей работе автор использовал носители, актив; ванны« только по метода Аксена и др.

2.2.1. Синтез СИ-ААФТ на основе некоторых типов гидразидоадсорбентов

В основу разработанного автором оОщего стратегическоп синтеза СИ-ААФТ положена реакция окислен ж боковой цепи ко] стероидов (как 17-окси-, так и 17-деэоксипроизводных) ацетг меди (П) до 20-кето~21 -альдегида по способу Льюбарта-Мэтти! (1961) и используемая в химии стероидов для фотометрически анализа ил в биологических объектах и в дальнейшем широко I пользуемая в анализе стероидных лекарственных препаратов. I

нейшей особентюсг? о этой реакции являете.г лйразоваиие гшразопов в очень мягких условиях (без нагревания), что позволяло эффективно иммобилизовать 21-альпроизво,Д";;е стероиды "а гидразидоап-сорбенты по метопу шиффовнх оснований (А.А.Лурье, 1978) при pH 3-5, без выделения промежуточного 21-альпроизводного.

Для синтеза гидразидоадсорбентов использовали эпоксиагаро-зу и эпокситойопал, полученные по модифицированного' авторов методу Аксена и др., и с о дерущие IG-23 vnM ;»покси-.групп на i ил уосителя, которые известны».* способом переводили в гидразидоад-• сорбенты (В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин, 1987). В качестве вставок использовали дигидразиды*янтарной, глутаровой, адипимовой и яблочной кислот.

Другие типы гидразидоносителей получали по методу Клящицко-го и сотр. (1986) гидразинолизом сложноэфирнцх групп у модифицированных матриц по схеме № 6:

Н, n - . , , ,, Схема ,Y> 6

I*

о о

гидразидокарбонил-агароза (сфепсн) . >0 H.N-NH, о

^-с-о-сн2-сн2-он-—i-^-e"

чми-мнг

гидразадосферон

Все промежуточные гидрази,доносители давали положительную реакцию Инмана-Динтзиса (1969) - вишиево-красиый цвет геля и не имели максимумов поглощения в интервале длин волн'220-360 нч. Интересно отметить, что гидразидоносители метола Клящцкого и сотр. практически не имели вставок (гидразидосферон) или имели ее лишь в два атома (гидразидокарбонилсодеряащие носители).

Общий синтез кортикостероидгидразидо(эпокси)-адсорбентов протекал по схеме № 7:

,-,и Схема },' 7

[ о j -он

ghR-NH-NH, ,

--"ff-R-NH-N-OH"St^ ^

где — С- гидразидосферой (.<П);-0-С'с5 гидразид

0 бонилагароза £ХШ

О

_ С~0 {СН^-О-С- - гвдразидокарооиилсфероя (Х1У);

он о о /С

-О-СКД-СК-СИ^Н-ИК-СЧРЬ)- С- - гидразидоэпокси-агароза (ХУ), Т(

1 СГ ' опал

— — »'аднл /I/, сукци^ия /2/, глутарил /3/, адкпоил

= - гидрокортизон (а), дексаметазон (о), преднизол( вещество Райхштайна (г), 16-четил вещество Рай> штайна (д).

Полученные СИ-ААФТ СХП-ХУ1) в УФ-спектрах имели два иг *<а поглощения; один - при 240 им, связанный с еноновой (дие вой) системой кратных связей гормонов, другой - в области < 310 им, соответствовал "илидековому" хромофору. Емкость СИ-по и*шобилизоваттому лиганду находилась в диапазоне 0,8 - 2 мл упакованного объема геля. Типичные УФ-спектры ситезироЕ них адсорбентов: ХУ-2(г) и ХУ-1(г) приведены на рис.3. Инге но, что блокировка избыточных 1'идразидных групп СИ-ААФТ рас ром формальдегида, проводимая в специальных случаях, не вли на их УФ-спекгры, а реакция Инчана-Динтзиса блокированных С ААФТ в течение 20-30 минут была отрицательной.

Для иммобилизации окислен»тих стероидов (г) и (д)испол

вали гидразидоадеорбенты, полученные та основе изоииазида. '.

синтеза СИ-АА&Т типа Ш1 приведен на схеме № 8:

+ /~. п о Схена № 8

^-о^гед-сНг-юУс" + __

он ^ чмн-нн^ н'

1-.-.-----.—,—,-,-Анм.

220 2.60 зоо . 340

Рис. 3. Типовые УФ-спектры (глицерин) СИ-ААФТ: I - ХУ - 2(г) и 2 - ХУ - I (г);

УФ-спектры адсорбентов ХУП также имели максимумы поглощения при 240 и 340-360 «»», которые отсутствовали у промежуточного изокиазидсодеркащегося адсорбента. Последний имел максимум около 270 чти (ароматический хромофор), который повторялся и п УФ-спёктрах СИ-ААфТ типа ХУП.

Из других оригинальных ААФТ с нестероидшми лигандами, изученных при скрининге выделенных ССБ, отметим синтезы дифе-галагарозы (ХУШ), мисклеронагарозы (XIX) - аналоги известной .фенилсефарозы, гели типа "сефатода" (ХХ-ХХР, содержащие и«-"0-ошгазованяые аналоги витает (схема № 9).

Схема К- 9

^-О-СНГу-7 •+ н^-ын-с-сн -».^-0-Сй2-СН-СИг-МИ-ЫН-С-С«

6 ^ 6н гхуил ° Ф

9 сн3

н^и-нн-с-с-о-ф-сс.

IX л) о и1з

0 О ОН б

^. СИЗ

он 0 (^5)

—^ (хх-ххО

Лигачды для ААФТ (ХУШ и XIX) получали гидрази«олизо" соответствующих этиловых эфиров спазмолитика и «исклерона обычным способом. Полученные гидразидопроизводные дают с реактивом И"-мана-Динтзиса сильноположительну» реакцию (темно-красное окрашивание) .

Все синтезированные СИ-ААФТ (ХП-ХУШ, а также гели (ХУШ, XIX) - бесцветные, хорошо фильтрующие воду носители и только гели типа "сефаггола" (ХХ-ХХ1) - оранжево-красного цвета (рН 6-7),с

концентрацией лигавда не менее 3-4 мкмолей/>»л геля. Сефато.-

XXI имеет ь УФ-спектре поглощения максимума при 260-285 «« >а матический хромофор) и 480-490 им (аа о группа). Комплексообраз гание геля с ионами ртут:; (П) приводит к батохрс--ному сдвигу второго максимума поглощения до 550 «м и изменению окраски до красновато-фиолетовой (реакция Алиева на азопиридокси^св ый фр мент). При восстановлении геля дитионитом натрия в растворе г рокарбоната окраска геля исчезает, и он после промывки раство

2 М натрия хлорида и дистиллированной водой легко дает реакда Инмана-Динтзиса на свободные первичные ароматические аминогру (оранжево-красное окрашивание).

Специфической реакцией на "сефатол" - медь (Ш-хелатный комплекс (красно-бурый гель) можно считать генерирование моле лярного йода при пропускании через колонку с гелем раствора к лия йодида (в фильтрате синее окрашивание с крахмалом).

Обнаруженные специфические реакции "сефатола" с ионами т. желых металлов позволяют рекомендовать его для металлхелатной хроматографии БП, а также для ковалентной хроматографии тиола) тивных пептидов, белков, так как после расщепления дисульфвдн< связи сефатола меркапгореагентами его активные тиогруппы легк< детектируются реактивом Эллмана.

Таким образом, важнейшие особенности структуры синтезированных СЯ-AAST - наличие в положении C£j лиганда ферментостаб! ной метилиденовой связи - позволяют., в принципе, выделять ССБ сильнокислых растворов после специального, селективного восстг новления илидеиовой связи, либо после ее кислотного гидролиза элгаировагь белково-гормональный комплекс в условиях ковалентнс аффинной хроматографии (П.В.Кузнецов, 1993). Специально подче^ кнем, что дкганды на основе производного вещества Райхштайна а СИ-ААФТ нами применены впервые.

2.2.2. Скрининг полученных СИ-AAST по ССВ плазмы крови человека для изучения феномена "структура-сорбционный эффект"

Скрининг СЙ-ААЙЕ по ССБ плазш крови проводили в условиях т.". "бэтч-процесса": встряхивали 50 мл белкового экстракта с

3 мл геля адсорбента на холоду (ледяная баня) в течение 2 часо Затем несвязанный белок отмывали на пористом фильтре Шогта (фо фатнкй буфер с pH 7,4) до нулевых значений оптической плотност

при длине волны 280 им (СФ-26, СССР) и гель адсорбента упакслава-ли в хроматографическуо колонку. Элюцию сороировашюго белка проводили 8 М раствором мочизины, собирая фракции пи 3 мл. Объединенные белковые фракции диализировали против дистиллирова?той воды 24 часа на холоду, концентрировали растворон ПЭГ-40 ООО и анализировали (определение белка по Бредфорду, электрофорез по Ломали, определение молекулярной массы и При необходимости применяли биоспецифическую элюцию 5 X I0~w Ы раствором вещества Раи-хтай"а. В контрольной группе использовались немодифицироваттые гормонами адсорбенты-носители - гидразидозпокси-агароэа, тойопал.

Полученные данные показали, что максимальная емкость по белку наблюдалась для агароэных СИ-ААФТ с иммобилизован-там веществом Райхштай"а и его 16- оС-метильтшм аналогов? (лиганды - /Г/ и /Д/) независимо от точкой структуры использоватых гидразидшх вставок и составляла около 30-80 »»кг белка на I мл упаковаштого геля адсорбента. Близкие результаты найдены для агароэных адсорбентов с иммобилизованным гидрокортизоном, в то время как пред-тшзолоновый и дексаметазоновый аналоги показали емкость по белку значительно нике (около 20 мхг/мл геля).

Однако, замена агарозкой матрицл на тойопаловую (другие фрагменты СИ-ААШТ-вставки и лиганды не менялись) приводит к резкому, почти десятикратному уменьшению общей емкости по белку, а емкость по белку немодифидарованного гормоном адсорбента составила около 4 мг/мл упакованного геля.

Сфероновые аффиотые адсорбеуггы, как немодифивдрованный, так и его преднизолоновый аналог, оказались в изученигых условиях "бэтч-процесса" супервысокоемкими - около 700 мкг белка/мл геля адсорбента (адсорбент без гормонального лигачда) и около 900 мкг/мл (преднизоложэвый аналог), что, безусловно, определяется высокой емкостью по белку самого гкдразиносферона.

Как следует из полученных экспериментальных данных, ацсор-бенты на основе тойопала, по-видимому, следует рекомендовать к использованию на самых последних стадиях тонкой очистки ССБ, в то время как сфероновые СИ-ААФТ, по нашему "негаю, целесообразно применять лишь на самых первых этапах очистки, при наработке "грубого дула" ССБ с дальнейшим его разделением.

Таким образом, полученные результаты позволяют расположить изученные СИ-АА&Г в следующий ряд по уменьшению сорбции белка

(в зависимости от типа матрицы):

сфероновый тип (Х1У) гидразидоэпокси-агарозный ти! — гидразино-агарозк&Л тип СХИ1) > тойопадохй тип СХУ1).

Интересно отметить,, что для наиболее оптимальных агар< типов адсорбентов емкость по белку зависела как от введени; вставок, так и от введения лиганда гормона. Так, для немод! рованных. лигандом аАФТ (XI) и его аналога с иммобилизовать ществом Райхштайна (ХИ - г) .емкости по белку оказались 40 1 мкг/мл геля соответственно. -

Более детальный'анализ влияния тонкой структуры агаро; СИ-ААФТ на качественную сорбцию белков плазмы крови провод) по данным электрофореза в ПААГ. Как показывают данные табл! каждый конкретный СИ-ААФТ имеет свой особый белковый спект; сорбированных ССБ, что еще раз демонстрирует уникальность ; аффинной системы синтезированных СИ-ААФТ в целом. Тем не м( для большинства адсорбентов характерны три основных зоны п( пептидов: зона 78-60 кДа (альбумин-транскортиновая зона), :

59-51 кДа (тра«скортин) и зона 40-48 кДа (секссчероидсвязыв! глобулин), наличие белков,в которых удачно коррелирует с и: стными литературными данными Хюбнера и др. (1987): основтгьи (транскортин и сексстероидсвязывающий глобулин), имеют средм« лекулярные массы в зоне от 40 до 70 кДа.

Неизвестным фактом (см.таблицу 3) оказался феномен со] так называемых "гидразидозависимых белковых фракций" (диапг

60-78 кДа), которые после специальной обработки СИ-АА&Т (б. ровка избытка гидразидогрупп формальдегидом) фактически ис но наблюдались четко выраженные белки в зоне искомых ССБ -50 кДа.

Таблица 3. Влияние изменений структуры СИ-ААФТ на сорбцию белков плазмы крови +

» п/п Наз вамие адсорбента Тип адсорбента Длина вставки Полипептидные зоныГкДг в ПААГ 4

40-50 50-60 60-80

I 2 3 4 Г"' 5 6 7

I. Вещество Райхштай- на-гидра- зидокар- бонил-ага- роза Ж С1 - 51,54,59 -

'4.

Вещество Райх-щтайна-гидра- . зицосукшкил-зпоксиагароза 1 ХУ

Вещество Райх-г) штайна-гидра- |

злцоддлпоилзпс ■■

ксиагароза , ХУ

16-с^-мегил-вецество Райх-штайна-гидра- \ зидоглутаршг- ! эпокси-агаро- I за | ХУ

I

Вещество Райх-штай«а-гидра-зидомалил-эпокси-агаро-за

6.

7.

Гидразидокар-бонил-агароза

Гидразидима-

лил-зпокси-

агароза

45,48

45 , 52г55

40,48

60,67

70

72

! ХУ С4-0Н < 40-42,45 51,55,60 ¡68,75,87,

100

59 67,78

60 68,78

ХШ

ХУ

С4-0Н

2

3

5

/ + / - в режиме бетч-процасса; /-/ - зона высокой

интенсивности; /---/ - минорная белковая зона.

Правда, остается неясным вопрос, являются ли полипептиды зоны 55-68 кДа типичной альбуминовой фракцией или это какая-то новая, специфическая "гидразидзависимая фракция альбумина"?

Анализ других изменений белкового пула показал, что практи чески идентичный спектр имели СИ-ААФГ с и'-мибилизоватгным вещ-зст вом Райхштайна, его 16- о(, -метильным аналогом и дексаметазоном, в то время как у гидрокортизо«содержацего аналога отсутствовал полипептид 55 кДа, а у преднизолонивого аналога - полипептиды 60 и 68 кДа. Эти результаты еще раз подтвердили факт высокой специфичности всей аффинной систе»и у синтезированных СИ-ААФТ.

Несмотря на то, что удлинение вставки в ААФТ - от С^ до С^ (см.табл.3) весьма слабо влияет на спектр сорбируемого бел-

нового лула, некоторая ее "гидрофилизадая" - наличие СН -груг в гидразидомалилькой вставке (си. № 5 в таил. 3) увеличивает чественный состав выделяемого белкового пула, хотя при атом лосы в зонах 40-50 кДа и 65 - 90 кДа становятся минорными. F роматиграфия белкового пула, накопленного на адсорбенте № 5 табл.3), «а контрольном адсорбенте гидразидоэпоксиагарозе (с №7 в табл.З) показала, что полипептиды зоны 55-58 кДа полно вышли в свободном"объеме, .в то время как белки зоны 75-78 kJi полностью сорбировались на контрольном адсорбенте. Это подте дило факт связывания лигандон именно белков зоны 55-58 кДа.

Интересно, что из рехроматографируеного белкового пула же не сорбировался полипаптид с молекулярной массой.68 кДа, тирый методом 0ухтерло«и был ранее идентифицирован (с исполь ванием антисыворотки против альбумина человека) как альбумин который содержался в белковых фракциях большинства изученных как содержащих лигачды стероидной природы, так и не содержащ их. Этот факт указывает на первичние связывание этого полипе да обоими типами адсорбентов именно в нативном состоянии,, в время как после ряда воздействий на него (высаливание, конце' рирование и др.) феномен сорбции исчез, что свидетельствует высокой лабильности его нативной структуры.

Среди других белков, обнаруженных в полипептидном пуле . № 5 методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони идентифицированы кроме альбумина также альфа(два) - макрогло! лин и иммуноглобулины гамма-класса. Методом радиоиммунологич! кого анализа в нем идентифицирован и транскортин. Его "аличи( подтверждено и специальными хроматографическими процедурами ■ биоспецифической злюцией раствором стероида (вещество Райхпт на, концентрация 5 X 10~® И) суммы сорбируемых белков, а таю, хроматографирование плаз»«ы крови с добавкой свободного вецес Райхштайна в той же концентрации. В последнем случае из дубл? полос "а электрофореграмме в зоне транскортина исчезает верх» полоса, по-видимому, полипептида, ответственного за связывану лигандом.

Для специального исследования силы связывания выделенньп методом А5Х белков использовали метод аффинного электрофорезе котором в качестве промежуточного геля применяли а^арозу с сус дированмычмв ней глюкокортикоидами (см.рис,4), Оказалось, чте иболее слабо взаимодействуют с ввделе«нымя ССБ вещество Райхп

на (б) и его 1б~метильное производное (n), п то время как гидрокортизон практически полностью спязыпаег исследуемые ССВ (г), а дексамэтазон (е) и преднизолон (д) связывают их частично по сра-

Эти результаты аффинного электрофореза, впервые примененные для изучения ССБ, доказали значительные преимущества использования в качестве лигандов именно вещества Райхштайна к его 16- оС -метального аналога в синтезах глюкокортикоидсодержащал. ААФТ, тач как практически полная десорбция ССБ с этого типа AAST достигалась применением раствора 8 М мочевины в качестве относительно специфического элюента.

Таким образом, результаты проведеншх исследований показали перспективность использования нового типа СИ-ААФТ на ранних стадиях вцделения и очистки ССБ (в том числе и транскортина), а также ^подтвердили известные данные Хюбнера и др. (1987) о значительной гетерогенности этого типа полипептидов плазмы крови, которые по мере их очистки способны существенно изменять свои нативные свойства. Вдавленная автором среди полипептидов зоны 55-68 кДа так называемая "гидразидозависимая фракция альбумина" впервые показала зависимость выделения и очистки белков от статуса неблоки-рованных нейтральных гидразидных групп поверхности ААФТ, которые до наших исследований считались формально химически нейтральными, не влияющими на феномен выделения и очистки белков (П.В.Кузнецов и др., 1992).

3. ПРИМЕНЕНИЕ 2,4,6 - ТВШИТРОБЕнЗОЛСУДШНАТА (РЕАКТИВ ИШАНА-ДИНТЗИСА) В ®АШЩВТИЧЕСКйЧ АНАЛИЗЕ

Известно, что важное место в функциональном фармацевтическом анализе (ФФА) занимают нитрофенилсодержащие реагенты, широко ис-

пользуете для идентификации аиитопроизводнчх, пиридинового кла, 3-кетостероидов, сердечных гликозидов, производных ада тана (ррчктивы Цинке, Татье, Раймонда, Keane, Ванага и др.)

Большой интерес для ФФА представляет и малоизученная р ция Инчана-Дингтзиса (р.И-Д), впервые введенная авторами в I как одна из важнейших качественных проб в структурно»' анали - аффинных адсорбентов и позволяющая эффективно идентифициров "а поверхности гелей, причем с дифференциацией, алифатическ ароматическую аминогруппы и гидразидную функцию - желто-ора вое, красно-оранжевое и темно-красное окрашивание соответст В р.И-Д реагентом является 2,4,6-тринитробекзолсульфона? н в насыщенно*» растворе натрия тетраборага (pH 9,2).

Однако, применение р.И-Д в фармацевтических исследоран для лекарственных веществ с незамещеи-ной аминогруппой (прои гае п-аминобензойной кислоты, сульфаниламиды, аминокислоты, нопроизводные адвмантана, гидразиды карбоновых кислот и др. для ряда экстемпоральных лекарственных форт' на их основе в ступной нам литературе нами не обнаружено.

В наших исследованиях мы использовали 1% раствор реакт И-Д: 0,5 г 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (фирма »Svgim. растворяли в мерной колбе на 50 мл в 2-3 мл дистиллированно ды, раствор осторожно (по каплям) нейтрализовали 0,5-1 М ра ром гидроксвда натрия до рй 5-6 и доводили до метки свежепр товленчым насыщенным раствором буры (pti 9,2). Реактив храни посуде нейтрального стекла «а холоду, Он-годен для употребл-в течение 18-20 дней.

Для исследований применяли фармакопейные образцы ряда . ственных веществ (ГФ X), лекарственные формы на их основе.

Реакции идентификации лекарственных средств с реактива проводили в фарфоровых чашках капельным способом.

, В качестве примера приводим фрагмент исследования (П.В нецов, Р.Н.ГорН, 1989) лекарственных средств с незамещенной группой (с»', табл. 4).

Таблица 4. Качественный анализ лекарственных

средств с незамещенной аминогруппой с примечание»' челктини И-Д

Тип неза- Лекарствен- Анализиру- Методика Время Ре-

мещенной ные вещества, е'^й ин- проведемия реак- зуль-

амино- лекарствен- гредиент реакции ции тат

группы ная форма

2 3 4 5 б

■ Алифатическая

Ароматическая

Аминокалро-новая кислота

Метионин Цистеин Раствор глутами-ИОВОЙ кислоты 1%

Ами«окапро-новая кислота

Метионин

Цистеин

Глута-.'И-

новая

кислота

Метионин ОДг Ыетиомин Глюкоза 0,1 г

Новокаин

Новокаин

Сульфашл-натрий Стрептоцид Норсульфазол

Раствор новикайна 0,25%, 0,Ь%, 5%

Сульфацил-

натрий

Сттзептоцид

Норсульфа-

фазол

Новокаин

К нескольким кристалликам вещества прибавляют I каплю реактива

То же

К 2 капля*' раствора прибавляют I каплю реактива

К 0,01 г порошка прибавляют I'каплю реактива

К нескольким кристаллам гещества прибавляют I каплю реак тива

То ке

II

К 2 каплям раствора прибавляют I каплю реактива

Сразу Келто-оранжевое икра-шива-ние

т + +

то же то же

I мин.

Сразу -"-

-"- Оранже-во-краС' чое окр,

шиваиие

+ + +

То же То же 15 сек. - " -

i мин. - " -

7-8 >'И". 5 мин.

Сразу

ч

I 2

3

4

5

Раствор Натрия л-катрия амииоса-п-амино- лишлат салишлата 5%

Гидра- -Изониазид. зидная

Изониазид

К 2 каплям раствора прибавляют I каплю реактива

К нескользким кристаллам вещества.--прибавляют I каплю реактива

5 сек. 1

Сразу Т к о и

Примечание. Результаты анализа: + + + резко положительн

Нам пе известно специальных исследований механизма р.И чо ш литературным данным (Я.Туркива, 1980) протекает прямо* нитрофеиилировамие незамещенных аминогрупп на аффинадх геля:

Ъ * ^Мк^Уг;

По-видимому, аналогично реагируют с р. И-Д и исследовал нами лекарственные средства, причем возникновение спевдфичес окрашивания, возможно, связано с образованием п-хиноидчой ст туры продукта реакции.

Таким образом, р. И-Д может быть рекомендовала как в Ш карстветых веществ, так и в экспресс-анализе лекарств вмест традиционной унифицированной пробы - реакции азосочетания на вичную ароматическую аминогруппу, особенно при проведении ка венных реакций ча чистые вещества (дефектура}. Безусловно, ч р. И-Д достаточно высокоспецифична в анализе гидразидов (изо ■зил) и может оыть рекомендована непосредственно для введения (фармакопейные статьи и др.К

Благодаря простите выполнения, зкспресснисти, универсал: ти р.И-Д заслуживает дальнейшего специального изучения при 81 зе многокомпонентных лекарственных, форм.

4. НС СЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ ¡3 )АДСОРБЕНТОВ ДЯЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

лорошо известно, что сре,;И первых типов АА<2Г, сии тезированных для применения в области клАФХ, важное место занимали АХ, легко получаемые по классической реакции азосочетания (РАС), Они широко использовались в клАФХ для выделения и очистки самых разнообразных классов БП-белков, ферментов и др. (Я.Туркова, 1980; Б.А.Клящицкий, П.В.Кузнецов, 1984).

Системный анализ путей синтеза АЗС с выделением лишь трех • основных стратегических направлений, проведенный автором недавно (П.В.Кузнецов, 1993), позволил ему сделать вывод о преимущественном использовании в синтезах АЗС именно "а«ииофенильиого метода", который и применялся в данной работе для получения ряда оригинальных АХ, использованных в качестве ААФТ в выделении и очистке НАЛФ/Н/ -зависимых ферментов, ССБ (адсорбенты У1-УП, "сефатол" ХХ-ХХ1).

Изучение особенностей структуры и химического поведет« адсорбентов ХХ-ХХ1 (способность к комплексообразованию с рядом тяжелых металлов - йога ртути (П), меди (П) и др.) позволило предложить его пиридитолмадй аналог следующей структуры:

в качестве полимерного индикатора в меркуриметрии при определении галогенид-ионов (бромид-ион). Чувствительность "сефатола" -гофидитолаэобензгидразидоэпоксисефарозы (XXI) к иону ртути (П) -0,1 - 1,7 мкг/мл близка к таковой для дифенилкарбазона (0,1-1,0 мкг/мл), меркуриона (0,44 мкг/мл), азокрасителя теофиллидича (0,178 мкг/мл).

Титрование проводили в нейтральной или слабокислой среде стандартным раствором ртути (П) нитрата до перехода красно-оранжевой окраски в фиолетовую в точке эквивалентности. Относительная ошибка титрования бромидов - 1,28/5 при использовании б качестве индикатора "сефатола" (при использовании чифенилкарбазона и меркуриока она составляет 2,6 и 2,455 соответственно).

Преимущество полимерного индикатора "сефатола" состояло в »«ногократном применении его для титрования: после фильтрования он выдерживал не менее 5 циклов регенерации (П.В.Кузнецов, И.Б.Ва-

вилихина, 1987).

Уникальными свойствами полимерного кислотно-основного катора обладал АХ с я-^'обилиаоваитгьм на эминоарилсфероне < 2-(п-оксифенил) этанолом-лекарственчый препарат "тирозол"-( оец любезно предоставлен проф. Е.А.Красновы».», Сибирская ме;. екая академия, г.Томск). Наблюдался переход окраски геля и» тора от оранжево-желтой(&кислой, нейтральных средах) до че{ зеленой в щелочной среде (pH 8,5-9,0). Применение многокра7 ввиду высокой стабильности матрицы (П.В.Кузнецов, 1993).

4.1. Синтез, скрининг и использование АЗС для выделения и очистки азотсодержащи алкалоидов, витаминов и их аналогов

Как уже отмечалось ранее, одна из разновидностей клАФХ впервые разработанная к внедренная в исследование БП японск следователем Т.Ватанабе (70-е годы), довольно успешно приме лась для выделения и очистки лишь некоторых типов белков (ф протеины и др.), а для исследования углеводов, пуриновых ал ияов и других ШВ оказалась неэффективной. В своих пионбрск работах Т.Ватанабе не использовал АЗС. Последние на основе ; фенольных и полифенольных лигандов (морин, кверцетин, ализа; элаготанин и др.), включая и иммобилизованный 8-оксихинолин не менее успешно применяют позднее как для сорбции солей ypi др.тяжелых металлов, так и для разделения некоторых классов нических веществ - производные анилина, ароматические кисло' др.ШВ. В рамках предложенной нами концепции "клАНО", в вар! НАФХ, ШШ отчетливо трансформируется в "краситель-лигандну» матогра$ию" (КрЛХ) и, безусловно, имеет отличные перспектива вития (П.В.Кузнецов, 1992;.

В этий связи значительный теоретический и практический рес представляли изучение .высокостабильных полимерных АЭС д; разделения, выделения и очистки разных типов рБАВ, ЛС метод1. ЖХ.

Синтез АЗС приводили с учетом важнейших стратегических, цкпов получения аффинных адсорбентов, которые предполагали е рование всех компонентов СМВИ. Так, в качестве ЭАН наш испо зовались эпоксиативированные агароза (сефароза /А/, тойопал (Япония, HW -50-65), модифицированный сферой (аминосферон,А

1000, ЧССР /А НС/). В качестве реагентэв эпоксидироваикя примегя-ли эпихлоргидрин (метод Аксена), а такта некоторые бис(поли)-эпоксиды (диглицидиловнй оЛир ;>тиле*»гликоля /ДГЭЭ/, полиэпоксид (П.В.Кузнецов, 1993) "эпон-812" /ПЭ/). В качестве гидразидных вставок использовали п-нитробензгидразид и гидразид £. - .л/ (п-нитробеизоил)а»<инокапроновой кислоты (ГНБАК, получен от Б.А.Клящицкого, г.Москва). После »/мобилизации вставок нитроге-ли восстанавливали по методу Кзмпбвла до аминопроизводных (дити— рнит натрия), которые вводили в РАС с фенольными, полифенольны-ми лигандами в условиях,описанных нами ранее (В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.Б.Мекевикин, 1987). В качестве лигачдов использовали: фенолы - резорцин (РЦ), гексилрезорцшг (гРЦ), 8-оксихи-нолин (8-ОХ), тетрациклин (ТРЦ); производные бензо-1,4-пирана (кверцетин - КВЦ, морин - ИРН, рутин - ЕГН, катехин - КХ, апи-генин - АПГ, троксевазин - ТБЗ); дубильные вещества (танин - ТН, экстракты дуоа - ЭД, бадана - ЭБД, акаши - ЭА и др.).

Синтез ААФТ типа ХЗШ(а) с фенольными и полифенольт^-и ли-гаида«и (®Л, ГШ) проводили по схеме № 10:

^т-снгое ' о Схе"а * 10

ОН" ^О7 ^ (рЦ 9,2)

о и

—^^-о-снгсн-сн^н-мн-с^оуноо '' г 2 о

<сипРЛ,ПФЛ>

9Н но __ ^о --

о

Аналогично синтезированы АЗС типа ХХП(б), в которых в качестве вставки использовался ГНБАК.

В этих же условиях синтезированы АХ типа ХХЫ на основе AMC с тем же спектро« иммобилизованных лигандов. Ооцая структура AA3ST этого типа представлена ниже:

>0 ___

С О - снг-с,н2- ö - си2- CHJ N -М

ААФТ типа ХХ1У (аналог иомосб»«енных смол) синтезирован по схеме № II с использованием моногидразида- -Л/-(п-карбоксифснил)-

а^ида "г.юновой кислоты (МГМК) (любезно представлен сотру и Санкт-Петербургского личико-фармацевтического института В.; ченюко",':

Схема №11

й-о СНгч—7 ■«■ Н,й-ад-С-ад1-С-КН-(5>-СООН НАС. !>-;Р_буры _

^ " « ^ («ц.ЛО^С)

О С

—-г. о-ск-см-сн-ин-м-с -с.нг-с-ын-^>-соон

ОН С: О

С целью исследования влияния полярности вставки на со[ и разделение азотсодержащих лекарственных средств (АЛС) по не № 12 получены модельные АЗС типа ХХУ, в которых использс носители, эпоксидировантгые ПЭ и ДГЭЭ.

Схема № 12 о

?!-он ^-^^г/о ^-сн-с^-о^-а-енг^

он-зо-зб^с ¿н * ^ (РИ 9,2)

ел -(.[Ю^аА

г-.и пи (\ т и

. , .»У

I [И (НаА

-СИг-МН -«Н-С-^/^-НО^ -он А о« О

3

мсГ но«.

он ОН л "

Наконен, в условиях, разработатогых нами ранее для симт АХ на основе БХА-носителей (А и Т) (И.В.Федоров, П.В.Кузне 1989) были синтезированы АЗС типа ХШ по схеме № 13:

Схе»<а № 13

о с _ 0

о о (рН б.г.) Ъ о

ОН -

а. [из

2, Наноси ее ' 0 X о —, он

Аналогичный АШ 13.. -типа (ШП), получен;' й по этой охе»о (любезно предоставлен аспирантом кафедры фармацевтической хн-'Нн КГМИ В.З.Шкаргндой) бил такке включен •• ооци;; скрининг МО.

Емкость всех синтезированных ААФТ, кро^е сфероновых аналогов (тип ПШ), имеющих емкость по лиганду около 35-50 мкмолей "а I мл упакованного геля, составила не менее 3-5 мкмолей ФЛ, ПФЛ/ на I мл упакованного адсорбента.

Хромат«графический скрининг ряда АДС (пуринокые алкалоиды, их некоторые синтетические аналоги, тропановые алкалоиды, алкало-■иды экстракта культуры тканей рауэольфии змеиной, тубокурарин, хинин; ряд синтетических МС - антипирит?, амидопирин, новокаин, тиамин) проводили методом ЖКХ низкого давления (ЖХ нд): скорость хроматографирования 30-35 мл/час, объем фракций 2-3 мл, детектирование при длине волны 270 ни, объем ААФТ в колонке (15 X 0,5 с«» 2-5 мл. В качестве элое«та применяли 2 М раствор натрия хлорида, иногда 50% водный этанол, сбор элюата проводили па коллекторе фракций "Диафрак"-002 (СССР). Концентрацию АЛС в элюатах определяли спектрофотометрически методом калибровочных графиков. Перед . хроматографированием колонку с ААФТ промывали 2-3 "Л 0,1 М раствора соляной кислоты, с последующей отмывкой ее дистиллированной водой до нейтральной рН.

При необходимости использозали стандарты индольтгых алкалоидов (аймалин, серпентин и др.), а также сухой экстракт суммы алкалоидов культуры тканей (образцу сухой ткани раувольфии змеиной, любезно предоставленные сотрудниками Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института Т.А.Астаховой и Л.А.Николаевой). Качественный экспресс-контроль за ай»алином проводили реактивом: 5% хлорное железо в 35% хлорной кислоте (розово-красное окрашивание на фильтровальной бумаге). Образцы технического заводского аймалина получены на предприятии "Здоровье" (г.Харьков, Украина).

Результаты проведенного хроматографического скрининга показали: I. Пуриновые алкалоиды, их соли, ряд синтетических производных, а также антипирин з изученных условиях (рН 7,0), на всех типах адсорбентов (ХХП - ХХУП) не адсорбировались. Только высокоемкие сфероновые ААф! показали их удовлетворительное разделение, мо не сорбцию (см. рис. 5).

2. Факт следовой сорбции основных "тестовых АЛС" (амидопирин, тиамин и хинин) - в интервале 0,25 - 1,2 мг АЛС/»л упакованного

обье»«а геля адсорбента, сопоставимый с сорбвдсй на немодифи ванныл носителях (агароза - 0,56 и тойопал - 0,85 ««г/мл гел зафиксирован для ААФТ типа ХХШ (сфороиовые аналоги), ХХ1У ( обменный аналог), ХХУ1 (БХА-аналоги) и ХХУП (ТЗА-аналог). А гичную сорбшю (до 0,85 "гЛ«л) показали АЛС на бис(поли)эпо дириванмых аналогах типа ХХУ.

3. Только на ААФТ типа ХХП, эпиксидированных по методу на, получена сорбция~исследованных АЛС (кро»«е пуриновнх алк дов, антипирина) в интервале 2-12 иг АЛС/мл геля -адсирбента правило, сорбшя АЛС на этих типах ААФТ сочеталась с удовле тельным разделение»' (см., например, рис. 6).

4. В цело»» по увеличению силы Сирбции АЛС исследовании следует расположить в следующий ряд:

типы ХХ1У - ХХУП — тип ХЖ < тип ХХП(а) <тип ХХП(б

Переход от феноль«ых к полифенольным лигандам практиче не меняет общий феномен сорбции, но наблюдается значительно ление сорбции для АЗС типа ХХП(б), имеющих вставку ГНБАК, о ющуюся на печтаметиленивый фрагмент, как показано в таблице

Таблица 5. Емкость иснивных модельных АЛС на ААФТ типа ХХП (а,б) (мг/мл упакованного геля адсорбен

носителя | КВ%* К^ | Р% КВ^ ¡щ* Щ щ ^ ' — - . . _ | , _ , __ _

Сорбируе- ; мое АЛС

А»«идопи-рин

Агароза

Тойопал

0,55 0,64 ; 0,5 0,8 0,5

; I 2,6 3,5

Хинина ! 4,2 4,5 I 4,3 4,9 3,2

г/хл , I 11,9 9,7

РЦ

; CфeJ 1,5 0 3,7 1,2

* - КВ^ - ААФТ типа ХХП(а); КВЦ2 - ААФТ типа ХХП(б).

По-видимому, сорбция АЛС на изученных ААФТ сильно завис от их хинной "молекулярной" структуры (сорбция "двупентрово! хинина в несколько раз выше сорбции амидопирина - моницикла ним сильиоосновным атомом азота). Наконец, агарозчые гели щ Сирбции АЛС работают, как правило, не хуже их тойопаловых

Г'.-м (си. таол. 5i, а вкупе имеют значительно лучш_'г сорбцию, чв" сфероновие АХ (тип ХХЫ), хотя последние имели е»«кость п 3-5 раз большу» (по лигячду). Этот фет,омон иолиоогья согласуете;! с известными литературными данны»ти об уменьшении сорбции ЛС на ААФТ с повышенным содержанием лиганда (П.В.Кузнецов, 1992).

5. В целом приоритетными лимандами для исследуе»^*. ААФГ (АЗС типа ХХП (а), (б), ¿ийопаловые матрицы) следует считать КХ- ,

ЭД- и ЗЕД- лига«ди, и итчас/и КВЦ-лигачд.

6. Услож"ение структуры феиолытоги ли1'анда, введение дополнительного основного атома азота, приводящие к изменению тонкой структуры лиганда, например, для ТРЦ-тойопала, тип ХХП (а), фактически снижает сорбцию до уровня сфероиовых аналогоЕЗ.

7. Элюцию с AAST типа ХХП (а,б) сорбированных AJ1C проводят, как правило, ступенчаты«' градиентом солевых растворов (0,01 -0,05 - 2 М) натрия хлорида, раз веденными кислотами (0,1 " HCl), в том числе и органическими (борная кислота и др.).

Таким ооразом, »wo сделать общий вывод, что ралделитель«ые и сорбционные процессы при хроматографии некоторых типов АЛС на исследуемых ААФТ (типа АЗС) весьма чувствительны к параметра»« всей "аффинной системы" - к типу матрицы, структуре вставки и лиганда (П.В.Кузнецов, 1992, 1993). Причем, повышение гидрофиль-ности вставки (АМН типа ХХУ, эпоксиактивироватгые ДГЭЭ и струк-турноблизкие к AMT типа ХХП(б) по общей "протяженности" вставки, но более гидрофильные), как ш парадоксально, приводит к резкому падению сорбции АЛС, хотя в классической АФХ сорбция БП, как правило, усиливается (П.В.Кузнецов, 1992).

Рис.5. Хроматографический профиль разделения п\'р'1"обь;к алкалоидов (I - кофеин-бензоат натрия; 2*- теобромин; 3 - теофиллин: 4 - амидопирин; 5 - антипирин) на ААФТ типа Кл - сф (-) и МШ - сф

(---). Объем геля - 5 мл, объем фракций - 2 мл,

элюент - 3 мл 2М раствора натрия хлорида.

270

х

• — q>¡>.

0,6 -

ОДт

0,05 М

на гс

4

А

•I)

2^5

О 15 го ■ 60 75 90 (ОЬ"

Рис. б. Хроматографический профиль разделения «а ААЖ типа КХ-агароза сум^ы алкалоидов культуры тканей (раувольйии змеиной). Нанесено 5,246 нг (21,5 «л раствора) оСразца, подвижная фаза -вода дистиллированная, элюшя - ступенчатый градиент - 0,05——1,0 М раствор хлорида "атри? детектирование спектрофотометрическое (при-245 и 280 объем фракции - 2 мл. Аймалин идентифицирован в первом пике, вониленииовая фракция - 2,3 пики.

Факт отсутствия сорбции пуринавых алкалоидов на та«ин-1: люлозе, впервые отмеченный Т.Ватанабе и повторившийся в наше работе, позволяет считать важны" не только особенности струк ААФТ, которая должна быть, по-видимому, минимально ионогенно "адсорбенте Ватанабе" имелись достаточно основные третич^е азота Еставки, как и у ТРЦ-т аналога, где они входили уже в < ктуру лиганда), иметь при этом важный гидрофобный фрагмент ( вка типа ГНБАК), приводящий к минимальной экранированности л! да "поле*«" матрицы, но и иметь высокую основность хроматогра< емых АЛС, которая должна быть не ниже уровня третичного алифг ческого атома азота (новокаин, индольные алкалоиды) или пирш бого третичного атома азота (хинин и дй).

В заключение отметим частичную очистку технического заве ского препарата "Аймалин" на ААФГ типа КХ-агароза, где удалое получить за один этап хроматографирования бесцветный элюат, с держащий аймалин (П.В.Кузнецов, С.С.Барсегян, О.В.Супгелова,

4.2. Скрининг и npi'-'е.ненис АЗС для. раздел^' м,

Д. Jlï

GPM? ростах

Хорошо известно, что сегодня основная масса исследований по разделению, выделешы и очистке фпавоноидсв (ФЛ) и их производных проводится метод он ЖКХ ira полиамиде, полисахаридах носителях, реже используются кремнеземные носители (Э.Хефтман, 1986). Часто носители в высокоэффективной ЖКХ (ВЭМХ) при выделении ФЛ модифицируются по кре»-незе»-ной поверхности различными эйирами целлюлозы (ацетатные, трифенилкарбаматные производные) или их полимерными аналогами.

Однако, при этом возникают сложности с наработкой ФЛ в количестве 10-100 мг (полупрепаратиЕный вариант ЖКХ), концентрированием их из разбавленных водных растворов, с определением следовых количеств в сложных, природных сесях рБАВ.

На основе си"тезировр.тшх нами ранее АХ, с ::ель;о упрочения разделения ФЛ и их производных автором разработан способ разделения сесей ФД из 2-4% водно-спиртовых растворов методом ¡ХКХчд с детектирование»» в УФ-области (длина волны 360 im, C5-2Ô, СССР), где в качестве адсорбентов применяют производные бензо-I,4-пи-рон/хро»'ан/агарозы, конкретно КХ-, MFH- агарозы (тип ХХП (a)j, лучшие из отскрининговантгых ААФТ с такими лигандами, как РЦ-, КВЦ-, АЛГ-, РГН7 ТВЗ-{П.В.Кузнецов, И.В.Федоров, авт.свидет. № 1700463, 1991; П.В.Кузнецов и др., 1991). В качестве злюеита применяли 10-505? водно-органические растворы, а идентификацию ФЛ в пиковых фракциях проводили УФ-спектрофотометрически (полное совладение с Уф-спектрами стандартных образцов, описанными в литературе). Скорость хроматографирования - 15-25 »»л/час, объем фракций - 3 мл (коллектор фракций "Диафрак -001", СССР), объем геля AAST - 1-2 мл, стеклянная хронатографическая колонка фирмы "Фармация" (Швешя) - 1x15 см. Точность предложенного способа -12%, чувствительность-в пределах 0,05 - 0,07 ><г ФЛ в пробе (рутин, кверцетин).

В качестве объектов исследования применяли модолыгые смеси ФЛ, содержащих гликозиды (рутин, наршесин, гербацетиновке гл«ко-зиды) и их аглико»ш (иорин, кверцетич, гербацетин) и некоторые полусинтетические ffllj например, оксиэтилированиые производные рутина (препарат "Венорутон", Болгария), изокперцетии и др.

Результаты по разделе"^-) модельных с««есей - гллгозид: кок «а изучемных ААФТ показали, что независимо от типа ис; зуе«ой ><атри;л (А или Т) происходит четкое групповое разде. изученных (БЛ: гликозиды входят в свободном объеме (при под ных фазах - вода дистиллированная, 5-20$ водные раствори о1 ла), а агликоны наиболее полно злшруются 50-70% водным pat ~ром этанола (П.В.Кузнецов, И.В.Федоров, I99I5. Типовая xpoi rpu'^'^a разделения этого вида представлена рис. 7.

501% ЕМ

I 2

1 4 б е <х ~ "ТР' Рис. 7. Хвоматографический профиль разделения на Кл-А (объем геля - I мл) смеси ФЛ: I -нарписсин (3-0-рутинозид-3~метил-кверце-тина), Z - морин. Объем фракций - 3 мл, скорость хроматографирования - 18 мл/чае элюент - 5 «л 50% водного этанола.-

При использовании 3-5-кратного избытка этой смеси Ш и блюдается феномен концентрирования агликоиового компонента рина (появляются светло-желтого цвета фракции).

Успешной оказалась попытка разделить структурноблизкие козиды кверцетина - рутин (3-0-ругинозид, биозид) и изоквер трин (3-0-глюкозид, мотозид), используя в качестве подвтсно зы дистиллированную воду или 18-20% водный этанол, а в каче ААФТ - МРН-содерхащие гели тойопалового типа, как эпоксиакт пованлыо (ХХП-а), так и бензохиионактивироваиные (тип ХХУ1) повая хрочатогва"ма разделешя смеси пот- и биозида ФЛ при на рис. 8:

о/

ЗОо

л *

0,2

0,4

(б)

А г

\

(а)

V/

ж

9Р,

8 tt Й J'2,1 гь so 34- 33 42. АО Рис. 8. Хроматографический профиль дазделе»кя на МНР-Т рутина-I, изокверцетина-2, Объем геля - 4 мл, объем фракций - 3 мл, скорость хроматограйиро-ва«ия 18-20 »л/час. Вариант (а) - подвижная фаза - вода дистиллированная, (б) - 20% водный этанол.

Применение MST сферонивого типа - МРН-сф (тип ХХШ, высокоемкий) для разделения данной смеси показало тенденцию к суцест-венной сорбции компонентов.

В этой связи представлялось интервент» провести изучение сорбционной емкости синтезированных ккШ по наиболее сорбируемым типам ФЛ - агликомам (кверцетин и морин) в зависимости от типа матрицы (кроме сфероновой, где отмечены сильные сорбциииные процессы) , варианта химической модификации (см.таблицу б).

Таилица 6. Емкость AMT агарозного и тойопалового типа по модельным агликонам ФЛ,(эпокси-

AASTJ

Тип матрицы А Т

Тип ААФТ не модиф. ААФТ не модиф. 1 ААФТ

Е м к и с т ь по ФЛ (мг ■Л» л геля адсорбента )

кверцетим морин 0,02 0,2-0,6 0,08 1 0,2-0,8 - 1-3 2-6

Предварительная оценка емкости бечзохимочактивировантгых ААСТ по сорбции агликонов ФЯ - не менее 10 нг/мл геля - нуждается в специальном изучении.

Аналогичная сорбция, агликонов ФЛ из »«одельних растворс гликозинов (рутин, изоквернетрич и др.) наблюдается после < гич«ого гидролиза последдих (0,4 М HCl, 10-20 минут). Это г ляет предложить новые подходы для идентификации структуры е кона в очищенных препаратах гликозидов ФЛ. Важно, что нали! растворе для гидролиза 18-20% спирта не изменяло результате сорбции агликонов.

В процессе исследования не обнаружено значительного в; строения ААФТ - типа активации, тонкой структуры лиганда не мен разделения и выделения ФЛ в изученных условиях, когда г ной фазой являлись дистиллированная вода, 18-20^ водный эта В изученных условиях на ААФТ легко отделяются 3-0-,8-0-глив от соответствующих агликонов. Обнаружено эффективное раздел «оно- и биозидов, увеличение емкости по агликонам "а синтез ванных ААФТ агарозного и тойопалового типа. Последний феном позволяет рекомендовать их в качестве эффективного оригинал способа при изучении структуры гликоэидое ФЛ через их аглик после проведения кислотного гидролиза.

Таким образом, автором впервые разработаны новые, дост но экспрессные стратегические подходы к хроматографическому следованию процессов разделения, выделения, структурного ан ФЛ и их производных на оригинальпък типах полимерных АШ1.

Исследования по применению полученных ААФТ в химии ФЛ должаются - они внедрены в научные программы кафедры фармак зии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института

4.3. Скрининг и применение АЗС для разделения, выдел и анализа кумаринов, их аналогов е. некоторых ти

В настоящее время известно лишь ограниченное количеств со специфическими, как правило биополимерными лигачда«и (ор коид, сыворото*г"кй альбумин человека и др.), которые исполь; ся только для разделения оптических изомеров некоторых прои: иых'кумари«а в русле ОАФХ. При этом применяют различные вар; техники ЖХ, в тон числе и B3JXX (В.В.Шкаренда, П.В.Кузнецов 1993).

С другой стороны исследование хроматографического разд( и выделения производных кумарина в области НАФХ с использов; АЗС, синтезированных с учетом MHJl-системы (П.В.Кузнецов, 19":

¿y

позволяет существетс ■.асширить возможности >-е 'одов фармацевтического и фитохи»ического анализа.

Синтез ААФТ, использопя'п'Мл долее в хро-'атографическом скрининге ряда оксику»аринов ÍOKM) - кумарин (I), 4 - метилумбеллифе-рон (П), скополетии (111), оскулетин (1У), гер"иарим (У), эскулин (УI) и др., их аналогов, с антикоагулянтным действие" - варфарин (X), синкунар (XI), фепромарон (XII), дикумарол (ХШ), неодикума-рин (Х1У) и т.д., проредили как описано ранее (см.раздел 4.1 автореферата) на основе эгсоксиактивираванных по методу Аксена ara-розы и тойопала. В качестве вставок применяли известные п-штро-фенилсодержащие гидразиды, иногда - п-нитроанилин, на которые (после восстановления концевой п-нитрогруппы) по реакции азосоче-тания иммобилизовали ряд лигандов фенольной (РЦ, г-РЦ, эстрадиол -ЗСТ) и полифенольной природы (производные бензо-1,4-пирана- КВЦ, КХ, МРН, АПГ и др.), дубильные вещества - 1Н, ЭД, ЭА, брусники -ЭБ . Аналогично иммобилизовали эти же лиганды "а аминосфероне (ЧССР) (П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, 1991).

Кроме ОКМ, подвергнутых хроматографическому скринингу в виде ряда модельных смесей, исследовались также отдельные очищеттые фракции кумаринеодержацих ФП - экстракт красавки густой (ЭКГ), настойка полыни (НП), азотсодержащий лекарственный препарат кар-бокрачен (ХУП), ряд Ш, содержащих фурокумаримм(ФКМ) - ам"ифурин (AI®), пастинацин (ПТН) и псоберан (ПБ) (таблетки, спиртовые р-ры).

В качестве подвиж"ЫХ фаз (Ш) при хроматографировании применяли: дистиллированную воду (тип А), 2 М раствор натрия хлорида (тип Б), 4 М раствор мочевины (тип В), 10%-"Ый раствор этанола (об/об) тип Г), растворы уксусной или соляной кислот с рН 3,5 (или натрий цитратный буфер с той же рН - тип Д). Для элюции ФКМтри необходимости использовали 50-60% водный этанол.

Для хроматографического скрининга ОКИ, ФКМ и их производных применяли режим ЖХнд, позволяющий сочетать скорости аналитического варианта (скорость потока 66-150 мл/час) с возможностью »<ик-рополупрепаративного разделения и наработки чистых компонентов смесей (в мг количествах). Для анализа 0,1-1,0 мг количеств исследуемых веществ оказались удобны'.™ стеклянные хроматографические колонки (15x0,5 см, "Фармация", Швеция), заполненные 2-5 мл упакованного геля адсорбента. Сбор фракций (по 2-3 мл) вели перистальтическим насосом "Юнипан", тип 304 (Польша) на коллекторе фракций иДиафракп002" (СССР). Детектирование проводили спектрофотомет-

рически при длине волны 250 или 275 км (СФ-26, СССР), инодщ при длине волны' 320 н»».

Идентификацию выделенных ОКМ, ФКМ, контроль полноты ра: лечия проводили по УФ-спектрам (в то« числе с ионизирующими бавками), а также методом ТСХ со свидетелями (В.П.Георгиев« - 1975).

Все исслелуемые препараты и используемые реагенты cooti ствовали требования»» ГФ X или и»«ели'квалификацию ЧДА.

Первичный скрининг ААФТ на основе агарозы показал их пс ■ную неспособность к разделению даже простейших 2-3 компонент модельных смесей ОКМ и ФКМ и поэтому в дальнейшем они не исс до вались, хотя ранее при изучении АЛС, Ш и юс аналогов, они были вполне конкурентоспособными с тойопаловыми производными другой стороны классический адсорбент для разделения рБАВ пс фенольного типа - полиамид, эффективный в области препаратиЕ ККХ, сильно удерживал изучаемые ОКМ и их аналоги, то есть он лея фактически непригодным для работы в исследуемо»« режиме ( литическом и микрополупрепаративном).

Близкий аналитический потенциал имели немодифицированны гели сферой и тойопал К W - 75, на которых ОКМ элюировалис достаточно быстро, причем при хроматографировании в Гй> типа (вода дистиллированная) пики были широкие, сильно перекрываю еся. Несколько лучшие результаты показало использование Ш т Г (10$ водный-этанол).

Селективность разделения ОКМ, разрешающая способность н ^модифицированном тойолале Н W -40/50/65 в ПФ типа А зн тельно увеличивается, особенно с удлинение" хроматографическ колонки. Поэтому матриш Т- Н VV - 50 использовались как ос ва для синтеза соответствующих ААФТ.

В процессе скрининга полученных ААФГ по модельным снеся ОКМ было выявлено их неоднозначное поведение: так влияние АА< с лигандами ЭД, ЗА, РГН, ЗБ на разделение с-еси - убеллифер зскулетин: 4-оксикумарт (смесь -б) малоэффективно и разделе близко к профилю на немодифицированныл Т-гелях, хотя они, Kai другие типы AAäJT хорошо разделяют с»*есь (в): 4-оксикумарич:к1 тотоксол:мармезин. В итоге, после проведения скрининга и КХ-АПГ-, ЗСТ-содержащих ААФТ, предпочтение было отдано ААФТ тип;

КХ-тойопал (КХ-т), показавшего хорояее разделение ОШ практически во всех типах М (см. рис. 9 и 10).

Влияние структуры вставки (удл„ 'е»яе "а пемтаметиленовый фрагмент- (-(СН^)^-), ААФТ типа ХХ(и> не привело к существенному улучшению разделения, в отличие от полученного положительного эффекта (усиление сорбции) при НАФХ алкалоидов.

Как и ожидалось, азотсодержащий ОКМ-карбокрамен (ХУЛ) легко сорбируется на Ш типа А на всех исследоватптых ААФТ (в том числа и агарозного типа), легко элюируясь при изменении ионного фона (2 М раствор натрия хлорида).

Интересной оказалась адсорбция дикумарола (Ж) на ААФТ даже в ПФ типа А (дистиллированная вода), которую можно объяснить его сильными липофнльн№!И свойствами - существование»/ в конфор-мации, стабилизированной внутримолекулярной водородгой связью (ВС), см. рис. II:

\

-4—-:--------4---1----V, м л

О 5Ъ

Рис. 9. Хроматографический профиль раз-

деления на КХ-т (объем геля -

2 >»л) ОМ - нитрофарнна (2) и неодикумарина (I); объем фракции - 3 мл, скорость хромагогра<$иро~ вания - 1,1 - 1,3 мл/час, ПФ -дистиллированная вода.

Рис. 10. Хроматографический профиль разделения ■ КХ-т (объем геля - 5 ил) ОШ-эскулина кумарина (2), эскулетина (3) и метилуб лиферона (4); объем фракции - 2,5 мл, рость хроматографирования - 0,3 мл в и; ту, Ш-дистиллированная вода.

р-н

Рис. II. Конформация дикумарола (XI), стаоилизи] ванная внутримолекулярной ВС.

Аналогичные эффекты хроматографического поведения ана; дикумарола (синкумар, варфарин, фепромарон - X - ХП) впервг найденные нами, также могут быть объяснены образованием спе фичмых конформеров (см. рис. 12), стабилизированных внутри» лекулкрчой ВС: р^

ОН , р О

и

£ - - СНг-СЧ-Нз

(.XI

-оПС4

- ед.гС~С2Н.,-

схи)

Рис. 12. Конформации 3-замещенных 4-оксикумаринг стабилизированные внутримолекулярной ВС

Впервые отмене ""ые эффекты из-'снетш ;эл;л1роэания иео-дикуартга (Х1У) при пнецении и поцтгсяче фат.* ио»«оп щухвд летних металлов (С i^, Mg^ и др.) по чаше- j ••нш.пгн обьясилюуся образование" стабильных комформашй, создающих подобие "гсраум-кле-тки", способной включать в себя ионы металлов.

Хроматографический анализ эфирного экстракта ЭКГ на КХ-т (объе" 2 мл) показал наличие скополетина (01) в зоне фракции 2025 *<л, а также ряд некдентифипированных соединений кумариповой природы (минорные компоненты). Аналогично из кислого гидролизата НП выделено около десяти соединений кумариновой природы (в той же зоне элюата), изучение которых планируется далее, а также ряд неидентифипированных *<инор«ых компонентов (И.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, 1991).

Изучение ФКМ в ФП типа АМФ, ПТН и ПВ на полученных АА5Г показало, чти: I - агарозные ААФТ, «©модифицированный тойопаловые носители (в ?ом числе и промежуточный п-аминогель ААФТ) либо вообще не разделяли ФКМ (мемоД1ф1шрован«зя агароза), либо давали сильно перекрывающиеся пики;

2 - высокоемкий РЦ - сферой показал значительное удерживание ФКМ, которое следует считать сорбглей (удерживаемый объем более 150 »л;;

3 - среди тойопаловых ААФТ лучшую степень разделения ФКМ показали негликозилироваины« по 3-GH группе лиганды: РЦ- , АПГ- и КХ~ так как ААФТ типа РТН-т практически не разделял ФКМ в исследуемых ФП;

4 - применение модельного АПГ-т с измененной структурой вставки (увеличение ее на -(СН^)^ - фрагмент) улучшило разделение по пику третьего компонента (бергаптена, 5 - метоксипсо-рален; при анализе ФКМ в препарате А® (см.рис. 13);

5 - разделение ФКМ всех изученных препаратов (АМФ, iTIH и ПВ) на АА®Г с Негликозилировачнггми лигандами (АПГ-, РЦ- и др.) приходило с применением в качестве подписной фазы - дистиллированной воды (ПФ- типа А), а выделение неидентифишровашшх "и-норных примесей достигалось элюшей 60$ водным-этанолом (П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, 1991) (с»*, рис. 13).

-f.o

Ö.5

40 48

26 34

(тхгпАРдтЛМФ)

.M*. Cf>p.

Рис. 13. Профиль хро««атографического разделения <2 препарата на АДГ - т/мод./J-ксачтотоксю 2-изош"Пинеллитг, 3-бергаптен, 4-неиден1 йицированные минорные примеси. 0,25 «г i пробе, объем геля - 2 т, скорость хро»ч графирования 54-66 мл/час, объем фракии5 3 >«.

Таки»» образом, хромагографкроваше ОКМ и ЗШ в попвиз; фазе типа А (вода дистиллированная) на изучетшх ААФТ свя: наличием в молекуле поляр1ГЫх ОН- или СН30 - груш, т.е., t ше липофилъность ОКМ, тем сильнее он удерживается (см,рис. аналогично ведут себя и ffiOl, давая следующий ряд в порядке ■ления их связывания с МФТ:

ксантотоксин «^псоралем ^изопимгшиеллин & сфоидин "\6epi

•^ичператорин

Факт необычно сильного удерживания императорина (8- i пильного производ«ого псоралема), приводящий к злюши его 60% воц«ым этанолом (он выделяется в пике 4 - см. рис. 13! объясняется дополнительной фиксацией молекулы на поверхнос AAST, как за счет повышенной гидрофобности радикала, так i счет структурного стерического эффекта ("рогатый" радикал! (П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, 1991).

Полученные интересные результаты по исследованию про!1 ных кумарина на синтезированных ААФТ позволяют в цальиейше стагочно глубоко и детально изучать их в области варианта

4.4. Скрининг и применение АЗС для выделетая и очист} бильных веществ

Высокая медицинская значимость дубильных веществ (ДВ) то»' числе и новых танинов, обладающих противовирусной, прс

аллергической, ачтигиалура;г ой и др. видами активм^ти стимулирует исследования по разделению, гзыцелеит: и очистке ДВ, гче, как правило, применяется многократная Гс.г.—фальтра!р1я на сефа-дексах, особенно на сефадексе 2Н-20, x;>n>n.'or;;;vV!'- на раллич-ттых типах силикагелей, тойопаловых носителях.

Нами впервые показана возможность выделения ДВ из коры дуба на ААФТ типа РЦ-т в условиях ШХнд (объем адсорбента - 2 мл, подвижная фаза - вода дистиллированная - от"ывка до стабильного нулевого фона, элюшя - 5 мл 50% водного ацетона) с Уф-детекцией выделяющихся фракций при длине волны 280 нн (CS-26, СССР) (В.В.Шкаренда, П.В.Кузнецов, 1989). Наиденная сорбциоттнан емкость РД-т по конденсированным ДВ коры .дуба - 40,74 мг/м.л упакованного геля адсорбента (для ^модифицированного носителя - той-опал HW- 50/55 - 26,78 мг/мл).

По данным ТСХ ("силуфол-UN/-254" ЧССР> в системе - зтллапс-тат: муравьиная кислота: вода, 10:2:3 - на хро*«атограммс наклоне одно пятно красяо-коричневого цвета с R-f - 0,2 - 0,22. ЯК-спектр сухого остатка совпадает с литературными данными (А.Блажей, Л.Шу-тый, 1977). Интересно отметить, что первичное осаждение суммарных ДВ в датой работе проводили "желатинэво-апотоновым" списо- "" бом. Полученный препарат ДВ из киры ,дуба использовали как лига"д для синтеза соответствующих AAST (П.В.Кузнецов и сотр., 1991).

В дальнейшей нами с целью повышения выхода целевого продукта разработан способ очистки от низкомолекулярных примесей (галловая кислота и др.) фармакопейного танина с получетгием препарата высокой степени чистоты (в зо1,е R -f = 0-0,2, по дандач ТСХ, найдены три основных пятна; система - бетгзол¡метанол:.чедяттая уксусная кислота, 45:8:15, пластины "силуфол"), с выходом 9555. (П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, авторское свидетельство ff« I73476I, 1992).

В'разработанном способе очистки применяли ККХнд на КХ-г (катехин-азобензгидразидо-оксипропил-тойопал), объем геля ААФТ I мл упакованного объема (стеклянная хроматографическая колонка-15x1 см); скорость хроматографирования - 40-45 мл/час, элюция сорбированного препарата - 50% водным раствором ацетона. Ь отличие от известных способов очистки танина с получением препарата такой же степени чистоты (П.А.Явич и сотр., 1962) с выходом >ге более I5-2¿$, где комбинируются ионообметгее способы с экстракцией и применяется подкисление (5% HCl), предложений нами способ

и^еет фактически одну хро«атографическую стадию очистки в вар! анте НАФХ, а время технологического цикла сокращается до 6-8 < сов. Аналогичной высокой емкостью по танину (около 56 мгЛ*л г< ля адсорбента обладает и МЕР типа ЭД-т (П.В.Кузне-: и др., 1991). *

Продолжая изучение разделения, выделения и очистки ДВ дом НАФХ; нами проведен первичный скрининг, наряду с немодифш рованньР'и «осителяни - тойопало*« Н W 65 (Япония), сефадексом <£ Н-20 (Швеция), ряда ААФТ, как классических (лизин-сефароза, Швеция, голубая агароза, СССР), так ААФТ с "алкалоидоподобны>'1 лигандами - 8-ОХ, -ТРД - тойопалов НУ/ 65 (Е.М.Антипенко, П.В.Кузнепов, 1993). Наряду с ними подвергнуты детальному скр! нингу РЦ-т, гРЦ-т, ЭД-т и ЭБД-т - ААФТ с фенольчы»»и, полифено; ними лигандами. В условиях хроматографического скрининга, описанного ранее, после отмывки водой дистиллированной основных I месей танина (галловая кислота) использовали градиентную злющ-20%, 30% и 40% растворами водного этанола, а элюдаю "полимернс фракции" танина проводили 50% водны«' ацетоном - типовая хрома! грамма приведена на рис. 14.

В целом все подвергнутые скринингу ААФТ расположились в следующий ряд в порядке ухудшения разделения танина:

ТРЦ-т> 8-ОХ-т > ЭВД-т ЭД-т > РЦ-т> гРЦ-т

Как и ожидалось, сочетание кислых и основных свойств в структуре "алкалоидоподобных иммобилизованных лигандов в ААФТ типа ТРД-т, 8-0Х-т улучшило разделение танина по сравнению с ААФТ, имеющими иммобилизованные полифенольные и фенольные лига ды.

Несмотря на то, что разделительная способность "одифициро ванных ААФТ (ТРД-т, 8-ОХ-т) по танину улучшилась незначительно по сравнении с немодифицированной матрицей, наблюдалось четкое увеличение емкости этих ААФТ - см.таблицу 7, что позволяет счи тать исследования ДВ на ААФТ интересными и перспективными для известных типов ДВ (гицролизуемые, конденсированные) из других растительных объектов (корневище лапчатки, кора дуба и др.), с целью создания стандартных образцов этих ключевых типов ДВ.

Таблица 7. Емкпстше характеристики исгл'Г'уе- :• : АЛй' по танину

АИ5Т Немоцифицированмне Модифинирошигоь-е А АФТ

тойопал H 1V-65 1 сефадекс j ЛН-20 лизин- сефароза ТРЦ-т

Емкость адсорбентов по танину, мг/мд 32-35 1 j 12-15 Í - Ь : 35 - 3t3

l^sc сб)

_______М" сур.

400 120

Ríe. 14. Хроматографический профиль разделения та"И'»а «а тойопале HW-65(ai. ТРЦ-т (б). Элюенты -20% этанол (I), 30$.- (П) и 4% - (Ш), 50% вод«ый раствор ацетона (IV). Объем геля - I мл упаков.геля, объем фракции - 3 мл, скорость хро»«атографирова"ия~- 45 мл/час. Пик Г- иле" тифицирован, как галловая кислота. Нанесено -10 иг (10 мл 0,1/0 раствора) танина.

В заключение отметим, что нами плер?>--з показано нвлотте необратимой сорбции Д5 (танина) на классических аЭДишплс адсор.'он-тах-желатин-сефароза, лизин-сефароза, голубая агароза - по неизученному механизму. Наконец, впервые обнаружешгнй феномен элпцнп части танина градиентом 20-40% водного этанола позволит в дальнейшем детально изучить качество этих, по-видимому "олиго-'ерных" фракций.

4.5. Определение тканина (витамин..ВдД. и л&х

»а о^"оие ААФТ_

Известно, что комбинированный фитопрепарат "Зек; содержит сложный комплекс рБАВ настойки каштана конского 1 Ьшъ курросах^паиг ), вахнейпм»га действующими вещества»« рой явлпттг.ч:--ку«*ат,нмг>пу.е гликозиды (эскулии, фраке;;*' и д; тритерпеноше сапонины - зецин'и, возможно,-флавоноидн. К добавлен дополнительно синтетический лекарственный препарг тамин В| (тиамин). По требованиям К 42-277-82 в анализе I рата определяют лишь сапонины (качественно, реакцией с 505 ной кислотой - красно-бурое окрашивание) и тиамин (количес но, по классической тиохромной пробе). Точный состав оста; компонентов изучен недостаточно (куиариновые гликозиды, ф; нокдные принеси) ввиду их малого содержания в препарате.

Представлялось весьма интереса», зная основные особе поведения, важнейаих групп рБАВ на исследуемых ААФТ, и в чс ти уникальность элюши АЛС (в том числе и тиамина) слабыми ворами солей,

разработать'простой, эффективный хромато-спе фотометрический способ количественного определения тиамина препарате "эскузак™. Другие известные методы анализа тиами гравиметрия (на основе пикриновой, кремневольфрамовой кисл различные флюоресцентные »«етоды, ЖКХ на конообменниках (П. нецов, В.В.Шкаренда, 1992).

Предварительно нами проведен анализ модельной смеси, кой по составу к изучаемому препарату, и содержащей КМ - э лин, эскулетин, АЛС-тиамин и агликон фЛ-кверцетин. Разделе' этой смеси проводили в условиях ЖКХнд (скорость хроматогра вания - 60-70 \ад/час, объем фракций - 2,5 мл, объем геля -или КХ-т - 0,5-3 мл, детекция ультрафиолетовая - при 275 н; (или 240 нм при определении тиамина), подвижная фаза - воде тиллированная, элюент - 65% водный этанол. В аналогичных у< ях хроматографировали и пробу - 1-1,5 мл препарата (см.рис.

Как и ожидалось, на основании полученных ранее резуль1; по хроматографированию основных групп рБАВ на- синтезирован* АЗС (П..В.Кузнецов, 1392; 1993) элшрование компонентов "эс* на" проходило в порядке увеличения их липофильны свойств:

/

cano«\*wu, гликоэиач кумарино? у охсикумарииы> флавокслды (агликони)

0/1 M Ne'i.'l!

100

V, мл

wT/TiV —

Рис. 15. Хроматографический профиль разделения рЬАВ препарата "зскузан" тга ААФТ типа КХ-т: I - сапониновая фракция, 2 - кумариновая фракция (скополетин, умоеллиферон и др.), 3 - тиамин, 4 - флавоноиды.

Интересно отметить, что на агарозио« аналоге КХ-а также наблюдается отчетливая сорбция тиамина (емкость его по тиа-иг? 2,8 мг/мл упакованного геля несколько зыпе, чем на КХ-т аналоге, для которого она равна 1,7 мг/мл), слабее сорбция Ш, а разаеле-ние сапонинов и КМ вообще отсутствует. Поэтому для количественного анализа тиамина хромато-спектрофотометрическич способом использовали адсорбент КХ-а, на котором селективно элюировали тиамин 0,4 M раствором натрия хлорида, с последующим количественным определением. Относительная ошибка метода - - 3,05% (П.В.Кузнецов, В.В.Шкареняа, 1992). Результаты определения - см.таблицу 8.

Таблица 8. Определение тиамдта в препарате "эскузан" на адсорбенте КХ-а

Xi X | X i - X (XL - X)4 S ^ j s

0,1840 0,1750 0,1840 0,1800 0,1810 i3,2.I0~3 !5,8-I0~3 0,I808i 3,2-10~3 | 5,0-I0~3 ¡2,0-Ю-4 i 1,024-3,364'10"^ 1,0242,500-10"° 4,000-I0~8 1,979'I0~û 4,447•IG~3

St= 1,985-Ю-3; 5,519-Ю-3; oL = 0,1808± 5,19-Ю"3; £$ти.= - 3,05$.

Тики?» ооразом, применение полученных ААФТ весьма эфф« но как в качественно»*, так и в количественном анализе коме ватных ФП типа "эскузан".

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДУ ГО РЕЗУЛЬТАТАМ РАБОТЫ

1. Предложен новый системный подход для создания ед№ классификации Жал в области исследований методом А$Х как I так и низкомолекулярмых ФАВ (принцип "кл- А Н О П.В.Куз цов, 1992). па основании этого подхода выделена новая обла изучения ВДВ, в том числе ЛС, рЕАВ и других низкомолекуляр соединений с применением ААФТ различного типа - Н А $ X .

2. Впервые систематизированы важнейшие пути синтеза А что способствовало определению практической значимости это группы ЮН в области биохимии и фармации.

3. Разработаны и изучены новые пути синтеза эпоксишги ванных гидразидосодержащих ААфТ с иммобилизованит^и коферм ми, глюкокортикостероидами. Полученные оригинальные ААФТ. и дованы для выделения и очистки некоторых НАД&/Н/-зависимых ментов (ИЦЦР, ГР и др.), ССБ; „на основе разработанных АА5Г ложены новые способы очистки этих БП, которые выделены в г генном и высокоочищенном виде.

4. Некоторые гиды исследуемых АА$Г-НАД$-ГАОПС, агароз) гнаразидоадсороенты с иммобилизованным веществом Райхштайн; его 1б-альфа-метильным аналогом рекомендованы как замените; ряда классических импортных адсорбентов, таких как 2,5-АДй-роза и др.

5. В процессе изучения особенностей строения и сорбцис свойств СЙ-ААЖГ для оценки связывания их лигандами белков (С впервые использован метод аффинного электрофореза.

6. Изучено применение реактиваМнмана-Дичтзиса (2,4,6-нитробекзолсульфоната) для идентификации ряда лекарственны? ществ с первичной незамещенной а*<иногруппой - анестетиков, нокисдот, сульфаниламидов и других ЛС, а также лвкарственнь фор«' на их основе в условиях аптечного экспресс-анализа. Ре мендовано внедрить р. и-Д для качественного анализа в НТД.

7. Изучено и обосновано применение в качестве полимерм азоиндикатора "сефатола" - пиридитол-азафенилгидразидо-эпок сефароэы - в количественном меркуриметрическо» определении

"кд-ио"ов.

0. Синтезирован ряд новых: оригиналыгых АА®Г, относящихся к типу АЗС, на основе метопов МЭА, БХА, ТЗА с исппгьзо нашем в качестве вставок п-*датробе«зоилированшх гидразидов, фенольных и полифенольных, а также "алкалоидоподобных" лигандов, хроматогра-фические свойства которых исследованы в ооласги НАФХ.

9. На основе полученных ААФГ методом ШХмд изучены условия разделения, выделения и очистки смесей ЯС, рБАВ различных, классов и групп - алкалоидов, витаминов и других азотсодержащих ЛС, флавоноидов, кумаринов и их аналогов, дубильных веществ.

10. Исследованы нсмодифишрованные носители, используемые

в синтезе ААФТ (агароза, тойопал и др.). В некоторых случаях при изучении алкалоидов, кумаринов и их аналогов предложены гипотезы механизмов удерживания рБАВ на ААФТ.

•II. В процессе хроматографического скрининга синтезированных АЗС отобраны наиболее эффективные типы ААФТ, на основе которых разработаны новые спосооы фармацевтического и фитохимическо-го исследования этих рБАВ, защищенные авторскими свидетельствами СССР.

12. Разработан способ выделения и очистки азотсодержащих алкалоидов на ААФТ с иммобилизованными производными ¿'-пирона или хромона.

13. Разработан способ разделегая агликонов флав.еноидов от их гликозидов, моттозидов - от биозидов, в том числе - частично оксиэтилированных (для препарата "Ве^орутон").

14. Разработан способ очистки фармакопейного танина от низке молекуляртлх фенольных примесей, что позволило предложить полученный препарат в качестве стандартного ооразца в различных областях науки и практики.

15. Предложены хромато-спектрофотометрические методы анализа действующих компонентов кумаринсодержащих фитопрепаратов "Ам-мифурин", "Псоберан" и др., препарата комбинированного типа "Эс-кузан". Дня последнего препарата применение ААФТ позволило эф-фективт?о разделить и выделить азотсодержащий препарат тиамин от сапонинов, кумаринов и флавоноидов. Данные методы рекомендуются для аналогичных по составу препаратов как альтернативные известным фармакопейным методам анализа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

!

I. П. В .Кузнецов, В.С.Бондарь. Новые НАД£Н-содертсащие t те адсорбет/ты .для очистки дисульфидредукгазных ферменте Тез. докл. У Всесоюзного симпозиума по физике и химии белке пептидов. Баку, 1980. - С.82.

---------2. П.В.Кузнецов. Метод получения З-карбокси-4-нитрофея

тиоглутатион-сксипроггнл-сйфарсзы. /Рацпредложение МЗ FCiCF № 0-1478.1980. ------

3. В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, Л.С.Колестншико. Биоспс ческая адсорбция дисульфидредуктаз цитозоля печени крыс на АДЬ-сефаризе и КАДФ/Н/-содержащих аффинных адсорбентах. /В Регуляторные эффекты и обме™ моноаминов и вдклонуклеотидов. Красноярск, I9GI. - С.71-75.

4. П.В.Кузнецов, В.С.Бондарь, Л.А.Лихачева. Скрининг s ных адсорбентов цля Еиделения некоторых дисульфидре.дуктазт ферментов. /Тез.докл. Всесоюзной кон$. "Аффинная хроматогра Вильнюс, 1982. - С.73-74.

5. Экс.пресс-метод выделения глутатионредуктазы с испол вамием аф$имного адсорбента. /В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, Л. хачева, Л.С.Колесниченко 1J Тез.докл. Всесоюзной конф. пАф$ хроматография". Вильнюс, 1982. - С.74-75.

6. В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин. Получение татионредуктазы из печени крыс методом аффинной хроматограф ее некоторые свойства./Труды Iii Всесоюзной межунивер. конф. физико-химической биологии. - Часть I. - Тбилиси, 1982. - С 63.

7. Простой способ получения глутатионредуктазы с высок активность» из печени крыс. /В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.Е жевикин, Л.А.Лихачева, Л.С.Колесниченко // В сб.г Еиологиче роль и обмз" "оноаншюв и циклонуклеотидов. Красноярск, 198 С.8-12.

8. Б.А.Клящиший, П.В.Кузнецов. Аффинные адсорбенты на ве носителей, активированных эпоксидными соединениями. / Ус химии. - 1984. - Т.53, вып.10., - С.1740-1764.

9. В.С.Бондарь. П.В.Кузнецов, В.В.Межевикин. Получение НАДБ-зависимых дегидрогеназ аффинной хроматографией «а ново НАДф-содераащем адсорбенте. Дез.докл. У Всесоюзного си««поз по инженерной энзимологии.- Часть I. - Кобулети, 1985. - С.

10. Повис аспекты применения аф^гчих абсорбентов г. обл? •

ти фармации. /П.В.Кузнецов, И.Б.Ваьшшхииа, С.С.Барсегктг, 0.А.Доний //Те >. ",окл. 1У В :е00шч')''0 съезда фзр'-ацзвто!?. К"зань, . ■ С.362.

11. II.В.Кузнецов. Реакция Инмана-Динтзиса в фармацевтической функционально^ анализе. Дез.докл. респуб.маучн.коиф. "Оптимизация лекарственного обеспечения и пути повышения аффективное -ти фармацевтической науки". Харьков, 1965. - С.144-145.

12. П.В.Кузнецов, И.Б.Вавилихина. Сефатол - полимерный индикатор для меркуриметрии. /Материалы У Всероссийского сье:з~а фармацевтов. Ярославль, 1957. - С.290-291.

13. П.В.Кузнецов. Способ эпоксиактивации синтетического носителя (тойопал, Япония) и применение фенолфталеиновой прооы для идентификации эпоксиактивированных носителей. /Тез . докл.ит/ч. -практич. кочф. "Профилактика , аиагностика дзчониз человека". Кедрова, 1987. - С.260-261.

14. В .С. Бондарь, П.В.Кузнецов, З.ВЛсчег.!?.;'?». Синто.':, ст;.:\-нинг и использование новых аффинных адсорбентов для получения НАДО/Н/-эависичых ферментов. /Препринт !,• 63 Б. Красноярск, 1937.- 35 С.

15. П.В.Кузнецов, О.А.Демин. К вопросу применения опоксиак-тивирова?пткх матриц для синтеза аффшпшх адсорбентов с и»«'обили-зованны«и гормонами. /Тез. докл.науч.-практич.конф. "Профилактика, диагностика и лечение заболеваний человека". Ке«ерово, 1938,-С.55-56.

16. В.С.Бондарь, П.В.Кузнецов, В.В.Меяевикии. Получение вы-сокоочищетпгых НАД5(Н)-зависимых ферментов ил печени крис с использованием НАД5-гидраэидоадипоилоксипропилсефаро»н. /Прикл. биохим. микроб. - 1988. - Т.ХХ1У, вкл.З. - С.361-357.

17. П.В.Кузнецов, С.С.Барсегян, И.Б.Вавилихина. 11оли»'ярные адсорбенты в исследовании азотсодержащих лекарственных средств. /Тез.докл.науч.-практич.совещания "Применение совре"ет»к< "О'годов аналитической химик на предприятиях Кузбасса". Кемероно, 1988. - С.92.

18. В.В.Шкареида, П.В.Кузнецов. Анализ лекарственных содержащих растительные биологические пктг. ;е г^-ест:.-! г.-- л ••.<•.: бентах аффитпгого типа. /Тез. докл. науч.нирактич. "¡Ь-.-менение ссвреметгных методов аналитической /.пхни на иречирпл':••• Кузбасса". Кемерово, 19П8. - С.91.

19. II.В .Кузнецов, Г.H.Горн. К Ejnpocy применения 2,4, нитробензолсульфоната в фармацевтическом анализе. /Фармаци! 198Э, - » I. - 0.78-75.

20. П.В.Кузнецов, И.В.Федоров, В.В.Шкаренда. Хроматог] на адсорбентах аффинного типа - перспективное направление i тохимии. Дез.докл. Всесоюзной конф. "Новые лекарственные i

-------------рать; lu .¿¡цемент. ^.uupi; h дальнего Востока". Томск, 1989. -

2. - С.89-90. "" ------------

21. П.В.Кузнецов. 0 перспективе исследования нетрадици вариантов аф$ик«ой хроматографии. /Тез.докл. обл. науч.-пра конф. "Актуальные проблемы фармации Кузбасса". Кемерово, 19 С.105-106.

22. И.В.Федоров. П.В.Кузнецов. Ит*мобилизация производи гидразидсв карбомовых кислот на п-бензохинон-активированных сителях./ Тез.докл.- обл. науч.-практич. конф. "Актуальные п мы фармации Кузбасса". Кемерово, 1989. - С.106-109.

23. В.В.Шкаренда, П.В.Кузнецов. Выделение дубильных ве! на полимерном адсорбенте аффинного типа. /Тез. докл. обл.- н; практич.конф. "Актуальные проблемы фармации Кузбасса". Кеме] 1989. - С.109—III.

24. О.А.Демин, П.В.Кузнецов, С.Ф.Зинчук. Скрининг аффи» адсорбентов для выделения стероидсвязыващих белков из мозге ткани крыс. Дез,.докл. обл. науч.-практич. конф. "Актуальные проблемы фармации Кузбасса". Кемерово, 1989. - C.III-II3.

25. Синтез аффинных адсорбентов с иммобилизованными сте ными горюнами (обзор). /П.В.Кузнецов, Б.Я.Кононенко, С.Ф.Зи О.А.Демин, В.В.Метавикин. // Препринт S 153 Б.Красноярск, IS 37 С.

26. П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, О.В.Суптелова. Синтез а бентов аффинного типа для полифенол-лигандной хроматографии логически активных Еецеств. /Тез.докл. науч.-практич. конф. стояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальне^ Востоке". Томск, 1991. - С.148-149.

27. П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда, И.В.Федоров. Кидкостная рополупрепаративная хроматография на адсорбентах аффинного ti перспективная область фармацевтических исследований. /Тез. дс науч.-практич. конф. "Резервы совершенствования лекарственног обеспечения населения РСФСР". Владимир, 1991. - С.40-41.

28. В.Б.икаренда, П.В.Кузнепоп. применение полимерных абсорбентов аффинного типа для очистки и выделения полифемолъних соединений. /Тез. докл. науч.-практич. коиф. "Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики? - Часть II. - Курск, 1991.-С.104-105.

29. В.В.Шкаренда, П.В.Кузнецов. Влияние параметров систем"! "матрица-вставка-лиганд" адсорбентов аффинного типа «ачро-'ато-графическое поведение оксику>«ари«ор . /Тез. докл. респуб. науч. конф. "Реализация научных достижений в практической фарма'.дт". 'Харьков, 1991. - С.177-178.

30. П.В.Кузнецов, И.В.Федоров. К проблеме исследования флавоноидов на адсорбентах аффитгттого типа. /Сб. науч. тр. "Синтез

и контроль качества лекарств". Рязань, 1991. - С.124-127.

31. К проблеме получения стандартных образцов дубильных веществ «а адсорбентах аффинного типа. /П.В.Кузнецов, В.В.Шкарен-да, Е.М.Антипенко, Е.А.Захарова. // Материалы Всесоюзной конф. "Проблемы стандартизации и контроля качества лекарствешгух средств". - Т.2, ч.2. - Москва, 1991. - С.36-37.

32. П.В.Кузнецов, В.В.Шкаренда. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ.

I. Определение фурокумаринов в фитопрепаратах. /Хим.-фарм. журн.~ 1991. - Т.25, № 4.- С.72-76.

33. П.В.Кузнецов, В.В.Шкареида. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. П. Новые подходы к разделению, выделению и очистке оксиКумаринов. /Химия природ, соедин. - 1991. - № 4. - С.475-481.

34. П.В.Кузнецов, В.В.Шкареида. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически актив"}« веществ. Ш. Определение тиамина и других компонентов в фитопрепарате гзскузан. /Хим.-фар», журн. - 1992. - Т.26, № 7-8. - С.104-105.

35. П.В.Кузнецов. Современные тенденции развития классических и нетрадиционных гариачггов аффинной хроматографии. (Обзор)./ Хим.-фар«, журн. - 1992. - Т.26, № 2. - С.78-84.

36. В.В.Шкареида, П.В.Кузнецов'. Современное состояние жидкостной колоночной хроматографии кумарипов. I. Характеристика методов, детектировала, хроматографическое попечение кучаримов. /Химия, природ, сое,д. - 1992, - у 6. - С.151-168.

37. выделение стерэлдсвязыЕг;.;1:(ИХ белков на новых аг, адсорбентах. /П.В.Кузнецов, О.А.Демин, В.Я.Кононенко, С. чук. //Укр. биохи". кур»г. - 1992, - № 3. - С.2С-28.

38. В.В.Ыкаренда, П.В.Кузнецов. Современное состоя?; костной колоночной хроматографии кумаринов. ¡1. Высокоэфф пая жидкостная хроматография производных кумарина. /Хими род.,соед. - 1993. - ¡> 2. - С.171-188.

39. П.Б.Кузнецов", С.С.Барсегян, О.В.Суптелоза. Поли адсорбенты аффинного типа в исследовавши физиологически , ных веществ. 1У. Азоадсорбенты для разделения и сорбции : держащих лекарственных средств. /Сб. науч. тр. Кемерово, С.121-130.

40. Б.В.Йкаренда, П.В.Кузнецов. Полимерные адсорбенг. финного типа в исследовании физиологически активных вес;е< У. К проблеме изучения механизмов взаимодействия кумарине адсорбентами. /Сб. науч. тр. Кемерово, 1993. - С.276-283.

41. Е.М". Антипенко, П.В.Кузнецов. Скрининг адсорбенго финного типа для разделения и очистки танина. /Сб. науч.-Кемерово, 1993. - С.3-7.

42. К исследованию нового способа синтеза аффинных а, бевдюв для выделения стероидевязывающих белков. /О.А.Демн П.В.Кузнецов, С.Ф.Зинчук, А.В.Махлев //Сб. науч. тр. Кеме; 1993. - С.60-68.

43. П.В.Кузнецов, Е.М.Антипенко. Бис(поли)эпоксидиро1 адсорбенты аффинного типа для неклассической аффинной хро( гр^фии биологически активных веществ. Дез. докл. науч. кс "Поиск, создание и изучение новых лекарственных средств ра тельного и синтетического происхождения"'. Еийск, 1993. - С

44. П.В.Кузнецов. Эпоксиактивированные адсорбенты в к костной хроматографии физиолошески активных веществ. (05з Хим.-фарм. кури. -1993. - Г.27, £ 6. - С.56-65.

45. П.В.Кузнецов. Современное состояние стратегии ситг азоадсорбемтов аффинного типа для исследования ф-лзиолошео активных вещестз (обзор),/Хим.-фарм.журн. - 1993. - Т.27, ! С.-36-45.

46. А.с.1381942 (СССР). Способ получения комплексообр;. щего полимера. /II.В.Кузнецов/.- 1987. .

бентов для выделения и очистки азотсицерлицил аио»™.,»», ,

П. В.Кузнецов, И.В.ВаЕилихичд, С.С.Варсегян, И.В.¿«лора;;, В.В.Шка-

речда/. - 1989.

48. А.с.1592985 (СССР). Способ получения сорбента для извлечения стероидевязывающих белков. /П.В.Кузнецов, О.А.Демнн, С.Ф.Зинчук). - 1990.

49. A.c. I7004G3 (СССР). Cuvuuu разделения $ла&оион;;с:<./ П.В.Кузнецов, Я.В.Федоров/. - 1991.

50. A.c. I73476I. Способ очистки танина. /¡Т.В.Кузиецоз, В.В.Шкаренда/. - 1992.

51. A.c. 1770897 (СССР.). Способ разделения и выделения ку-»аринов. /П.В.Кузнецов, Я.В.Ыкаренда/. - 1992.