Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Технология фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой

На правах рукописи

СЕРКОВА АНАСТАСИЯ НИКИТИЧНА

ТЕХНОЛОГИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ

14.04.01 - Технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

19 АПР 2015

005567871

Санкт-Петербург - 2015

005567871

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Глазова Наталья Владимировна Официальные оппоненты: Молохова Елена Игоревна

кандидат химических наук, доцент

Пожарицкая Ольга Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии

кандидат фармацевтических наук, ЗАО «Санкт-Петербургский

институт фармации», заместитель генерального директора по новым технологиям

Ведущая организация:

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «09» июня 2015 года в 17.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.088.01, созданного на базе ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д.14) и на сайте организации (https://sites.google.eom/a/pharminnotech.com/dissovet).

Автореферат разослан « » гиилги* 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

Орлов А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В диссертационной работе поставлена актуальная научная задача, состоящая в получении модифицированной формы пероксидазы из растительных источников сырья, которая может входить в состав фармацевтической композиции для наружного применения. Согласно «Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года», утвержденной Председателем Правительства Российской Федерации 24 апреля 2012 года приоритетными направлениями развития биотехнологий являются биофармацевтика, биомедицина и промышленная биотехнология, в частности наномедицина и производство ферментов.

Актуальность темы исследования. Важным аспектом фармацевтической промышленности в настоящее время является расширение спектра комплексных лекарственных форм, включающих ферменты.

Производство лекарственных форм ферментов из животного сырья ограничено недостатком их ассортимента и высокой стоимостью конечной продукции. Возможность использования ферментов из более дешёвого растительного сырья ограничена отсутствием производственной базы и покупкой дорогостоящих зарубежных аналогов. Кроме того, ряд ферментов из растительного сырья, пользующихся большим спросом, вообще не производится в России в промышленном масштабе. Один из таких ферментов пероксидаза (КФ 1.1.11.7).

Пероксидаза является основным реагентом в медицинских диагностических тест-системах, широко использующихся для выявления целого ряда вирусных, бактериальных и онкологических заболеваний. Этот фермент обладает так же лечебными свойствами, среди которых наиболее ярко выраженными и значимыми являются: антибактериальные, антиоксидантные и иммуномодулирующие. В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствуют биологически активные добавки и средства космецевтики с указанными свойствами, однако практически отсутствуют лекарственные препараты. Известны средства космецевтики производства КНР, обладающие антиоксидантными свойствами за счет присутствия пероксидазы алое вера (гели алое Lucklife и Fohow), биологически активная добавка (БАД) японского производства, являющаяся иммуномодулятором и антиоксидантом, содержащим растительную пероксидазу (пакеты с гелем Bio Rex), БАД в виде водно-спиртового раствора биоантиоксидантного комплекса из клеток биомассы женьшеня (Неовитин).

Анализ рынка показал, что в настоящее время на российском рынке отсутствуют лекарственные препараты с пероксидазой.

Известно, что нативные ферменты являются лабильными веществами, которые могут терять активность как при воздействии различных внешних факторов, так и при хранении. Проблема сохранения активности ферментов может решаться их направленной модификацией с применением различных методов иммобилизации - химических и физических. Физические методы являются более мягкими и не вызывают сильных изменений в структуре фермента. Модифицированные ферменты могут быть включены в различные лекарственные формы (капли, пасты, гели, крема, аэрозоли и др.).

В связи с этим актуальна разработка состава фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой как основы для геля.

Степень разработанности темы исследования Изучению структуры, свойств и области применения пероксидаз из растительного сырья посвящены работы отечественных и зарубежных ученых В.А. Андреевой, И.Г. Газаряна, В.В. Рогожина, K.G. Welinder, N.C. Veitch и др. Сорбционно - хроматографической очисткой ферментов из различного сырья и оптимизацией методов занимались Г.В. Самсонов, Г.Э. Елькин и Н.В. Глазова. Сорбенты для технологии выделения высокомолекулярных БАВ представлены в работах K.M. Салдадзе, Г.В. Самсонова, В.А. Даванкова и др. Анализ российского рынка показал отсутствие лекарственных форм на основе растительных пероксидаз. Технология выделения, очистки и модификации пероксидазы из корнеплодов редьки черной, а также технология геля на основе фармацевтической композиции с растительной пероксидазой предлагаются впервые. Все выше сказанное предопределило актуальность темы исследования, формулировку цели и последовательность решения задач.

Цель диссертационной работы - создание фармацевтической композиции, включающей модифицированную пероксидазу из растительного сырья.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Подбор условий экстрагирования пероксидазы из растительного сырья, исследование процесса сорбции фермента на различных сорбентах из растительных экстрактов. Выбор оптимального сорбента по данным изотерм сорбции;

2. Проведение хроматографической очистки пероксидаз из растительных экстрактов на макропористых сорбентах, подбор ультрафильтрационных модулей для концентрирования и обессоливания элюатов;

3. Разработка технологической схемы выделения и очистки пероксидазы из экстракта с получением лиофилизата;

4. Модификация пероксидазы и подбор состава фармацевтической композиции;

5. Разработка технологической схемы получения фармацевтической композиции в виде геля для наружного применения, включающей модифицированную растительную пероксидазу;

6. Исследование стабильности пероксидазы и гентамицина в составе геля, его биологической безвредности. Разработка проекта ФС на гель с пероксидазой.

Методы исследований. В работе использовали физико-химические (спектрофотометрия, динамическое рассеяние света, электронная микроскопия, хроматография) и биохимические методы. Обобщенный анализ полученных результатов основывался на математической статистике. Обработку данных проводили с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2003 и программы Mathcad. Оценку случайных погрешностей проводили методом математической статистики с использованием критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р= 0,95.

Научные результаты. На защиту выносятся следующие научные результаты:

1. Содержание активных и примесных белковых компонентов в экстрактах из корней хрена и корнеплодов редьки черной;

2. Оптимальный сорбент для хроматографической очистки и мембранный модуль для концентрирования пероксидаз из экстрактов;

3. Модификация пероксидазы с подбором оптимального носителя;

4. Разработка метода выделения и очистки пероксидазы из растительного сырья;

5. Технология геля, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция с модифицированной растительной пероксидазой.

Научная новизна. В ходе диссертации впервые:

1. Проведена сорбционная очистка пероксидаз из растительных экстрактов на макропористом сорбенте

2. Разработана технологическая схема выделения, очистки и модификации пероксидазы из корнеплодов редьки черной

3. Разработана фармацевтическая композиция на основе модифицированной пероксидазы из корнеплодов редьки черной в комплексе с антибиотиком из группы аминоглшсозидов

4. Получен гель, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция, включающая пероксидазу из корнеплодов редьки черной, гентамицин и р-циклодекстрины.

Достоверность и обоснованность научных результатов. Обеспечивается использованием методов исследований, соответствующих предмету, цели и задачам работы; аттестованных и поверенных приборов и оборудования; однородной и представительной выборкой результатов экспериментов, позволяющей судить о сходимости и воспроизводимости представленных данных; представлением и обсуждением результатов работы на конференциях различного уровня.

Практическая ценность работы.

В результате проведенных исследований:

1. Предложена схема выделения и очистки пероксидазы из корнеплодов редьки черной, которая сокращает продолжительность технологического процесса и увеличивает выход фермента в сравнении с известными технологиями

2. Подобран состав и получен опытный образец геля, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция, включающая модифицированную пероксидазу из корнеплодов редьки черной в комплексе с гентамицином

Реализация результатов работы.

1. Апробация предложенной сорбционной схемы выделения и очистки пероксидазы из корнеплодов редьки черной проведена на предприятии ООО «Самсон-Мед» (Санкт - Петербург, акт от 02 октября 2014 года)

2. Внедрение в учебный процесс ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России при подготовке специалистов по направлению 03.01.06 «Биотехнология» (акт от 18 июня 2013 года).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения», посвященной памяти выдающегося отечественного учёного в области технологии лекарств Юрия Карловича Сандера, состоявшейся на базе ГБОУ ВПО СПХФА в

г. Санкт-Петербург 03-04 февраля 2012 г.; на Конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу в рамках VII международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", который состоялся 20-22 марта 2012 г. в Москве, награждена дипломом и медалью; на городском семинаре Менделеевского общества «Хроматография, ионный обмен, альтернативные методы», проводимого на базе Химического факультета СПбГУ 09 апреля 2012 года; на мероприятии по программе «Участник молодёжного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») в мае 2012 года. Программа проводится Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. Серкова А.Н. является победителем программы «У.М.Н.И.К.»

2012 года. Номер Госконтракта: № 10483р/16906 от 08.06.12. Номер проекта 16906. Переведена на второй год 13 мая 2013 года; на финале XIV конкурса научно-исследовательских проектов под девизом «Молодые, дерзкие, перспективные», проходившего в рамках Международного инновационного форума в ОАО «Ленэкспо» в г. Санкт-Петербург 25 сентября 2012 г., награждена сертификатом; на XVIII Международном съезде «PHYTOPHARM 2014», состоявшемся на базе ГБОУ ВПО СПХФА в г. Санкт-Петербург 03-05 июля 2014 г. Серкова А.Н. является победителем конкурсного отбора на предоставление в

2013 году субсидий молодым ученым, молодым кандидатам наук вузов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга по теме «Модификация ферментов и конструирование наноструктур на их основе», размер субсидии составил 100 000 рублей.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научных исследований ГБОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Минздрава России. Номер государственной регистрации темы НИР «Разработка технологий производства, методов анализа, стандартизации и фармакологической оценки лекарственных растений, новых или модифицированных фармацевтических субстанций и препаратов» № 01201252028.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Исследования диссертационной работы соответствуют паспорту специальности 14.04.01 - технология получения лекарств, а именно: пункту 3 - «Разработка технологий получения субстанции и готовых лекарственных форм»; пункту 4 -«Исследования по изучению особенностей технологии получения готовых

лекарственных форм из различных видов субстанций, сырья и вспомогательных веществ».

Публикации и вклад автора в разработку работы. По теме диссертационной работы опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. Все результаты, составляющие содержание диссертации, получены автором самостоятельно.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех разделов, заключения, списка используемой литературы из 172 наименований и пяти приложений. Основное содержание диссертации включает 147 страниц текста, 51 рисунок и 20 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы исследований, сформулирована цель работы, поставлены задачи, решение которых позволяет достичь цели исследования; определены научная новизна и практическая значимость результатов работы.

В первой главе описаны структура, свойства и области применения растительных пероксидаз; методы выделения и очистки ферментов, в частности хроматографические методы и используемые сорбенты; современные подходы к созданию модифицированных форм ферментов. Приведен анализ существующих технологий получения пероксидазы из различного растительного сырья. Типовая технологическая схема получения пероксидазы из промышленного источника — корней хрена состоит из стадий измельчения, экстракции, ультрафильтрации, осаждения, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии, диализа и лиофилизации. Недостатками подобных технологий являются длительность процесса (от 3 до 11 суток), связанная с многостадийностью, низкий выход фермента (менее 3 г с 1 кг сырья).

Проведенный анализ литературных источников подтверждает актуальность проведения исследования по разработке технологии получения пероксидазы из альтернативного сырья в промышленных масштабах.

Во второй главе описаны объекты исследования и методики экспериментов. Объектами исследований являлись пероксидазы, полученные из корней хрена (Armoracia rusticana) и корнеплодов редьки черной (Raphanus sativus). Приведены реактивы; приборы; физико-химические, спектральные, хроматографические методы проведения исследований.

Концентрацию белка в растворе определяли с помощью реактива Фолина -Чиокальтеу по методике, в основу которой положен метод Лоури. Метод основан на восстановлении фенильной группы тирозина фосфомолибденовой кислотой реактива Фолина-Чиокальтеу с образованием окрашенного в голубой цвет соединения, определяемого на спектрофотометре при А.=750 нм и толщине кюветы 10 мм.

Метод определения активности пероксидазы основан на измерении количества окисленного в присутствии фермента пирогаллола в пурпурогаллин. При этом раствор приобретает более насыщенную пурпурную окраску. Пурпурогаллин имеет максимум поглощения при Х=420 нм. 1 единица активности пероксидазы по пирогаллолу соответствует такому количеству фермента, которое катализирует образование 1 мг пурпурогаллина из пирогаллола за 5 минут при I 20 °С и рН = 6,0.

Глава 3

Условия сорбционно-хроматографического выделения и очистки пероксидазы из экстрактов с последующим концентрированием полученных элюатов на

мембранных модулях

В результате исследований подобраны условия экстрагирования пероксидазы из предварительно измельченного высушенного растительного сырья 5% раствором СаС12 в соотношении 1:10 в течение 0,5 часа при постоянном перемешивании. Показано, что активность фермента в экстракте зависит от присутствия в среде ионов кальция. При отсутствии ионов кальция пероксидаза полностью инактивируется в течение нескольких минут, чего ранее не было указано в литературных источниках для корнеплодов редьки черной. Установлено, что минимальной концентрацией ионов кальция необходимой для проявления пероксидазной активности является 50 мг/мл, что учитывали при подборе экстрагента.

Как видно из представленных гельхроматограмм (рисунок 1) белковый состав экстрактов отличается в зависимости от вида сырья. Активная фракция пероксидазы на рисунке 1 (А) определяется в первых двух пиках по общему белку и полностью отсутствует в третьем пике. На рисунке 1 (Б) активная фракция пероксидазы совпадает с первым пиком по общему белку, во втором пике по белку активность не наблюдается. Удельная активность пероксидазы в экстрактах зависит от партии сырья и варьирует в пределах 0,07 - 0,1 ЕД на 1 мг белка.

Подбор оптимального сорбента для выделения и очистки пероксидазы из экстрактов проводили на основании рН оптимумов сорбции и расчетов коэффициентов распределения Кй по изотермам сорбции.

Емкость сорбции по активности пероксидазы снижается в области рН<5 и рН>7,5, что может быть обусловлено быстрой инактивацией фермента в этой области рН. Оптимальным для проявления активности пероксидазы является рН=6,0.

V III пш --

Ш lI'.lMlBiiBi ПМЛ I

Г Г™ 1 ■ Н ■ I lip I I

0,5

То,4 <1

^ 0,3

7 0,2

W

^0,1 CJ

0

Л / \

i i

jP I пик _ 11 1ШК.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Vi-VoAW

♦ по общему белку по активности

0 ОД 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

V¡-V0/Vra по общему белку — по активности

А Б

Рисунок 1 - Гельхроматограммы исходных Са2+ - содержащих экстрактов из корней хрена (А) и корнеплодов редьки черной (Б) с определением активности

пероксидазы

Изучение изотермического процесса сорбции пероксидазы проводили в статических условиях на различных сорбентах: макропористых етирол-дивинилбензольных ионогеном (КУ-23) и неионогенном (Полисорб - 1) сорбентах, сорбентах фирмы Purolite - сверхсшитые сульфакатиониты С160 и С150; сверхсшитом карбоксильном катионите С115 Е, отечественном макросетчатом карбоксильном катионите Биокарб, мезопористом катионите фирмы Purasorb АР-500, карбоксильных катионитах ДМЭГ, БДМ-18, БДМ-24. По изотермам сорбции при Ср£ШН = 7 мг/мл графически рассчитывали значения Kd для пероксидазы из корнеплодов редьки черной и корней хрена.

Наибольшими значениями обладали: карбоксильные катиониты БДМ-18 и ДМЭГ; макропористые сульфокатиониты Purolite С150 и КУ-23, из которых КУ-23 является одним из самых применяемых для сорбции белковых молекул;

молекулярный сорбент Полисорб - 1. На выбранных сорбентах подбирали оптимальные условия сорбции и элюции.

На всех сорбентах, кроме Purolite С150, сорбция идет с выходом фермента в пределах от 60 до 97 %. Однако десорбция с наибольшим выходом возможна лишь на КУ-23 (87%). Для разработки технологии выделения, очистки и модификации пероксидазы использовали сильный макропористый сульфокатионит КУ-23 (рисунок 2).

С/Сисх

(А/Ашд

сорбция

промывка

Рисунок 2 - Выходная

кривая сорбции-промывки-десорбции пероксидазы из экстракта корнеплодов редьки черной на КУ-23

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

1,2 1,4 1,6 (V,-Vo)/VKM

—♦— по общему белку —■- по активности пероксидазы

Гельхроматографический анализ элюата (рисунок 3) показал наличие одного активного пика при снижении количества примесных компонентов. Рассчитанная удельная активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной в элюате превосходит в 10 раз активность пероксидазы в исходном экстракте (для экстракта из корней хрена экспериментальные результаты близки по значениям).

С целью концентрирования пероксидазы в элюате из корнеплодов редьки черной выбрали метод ультрафильтрации с применением установки Vivaflow 200 фирмы «Sartorius Stedim Biotech». Подобрали мембранный модуль с отсекающей способностью (н.о.м.) 30 кДа. При его использовании концентрирование по общему белку происходит в 2,23 раза, по активности пероксидазы в 1,43 раза (таблица 1).

Для деминерализации концентрированного раствора использовали ультрафильтрационный модуль с отсекающей способностью 5 кДа с проведением последовательно ультрафильтрации и диафильтрации (остаточная концентрация соли не более 2%).

I

0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

А

В- \\

/ *

1 > V

\ д V V

Н \

Рисунок 3 -Гельхроматограмма элюата

после очистки экстракта корнеплодов редьки черной на КУ-23

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 —— по общему белку УгУо/Укол —■— по активности пероксидазы

Таблица 1 - Экспериментальные данные процесса ультрафильтрации элюата, содержащего пероксидазу, через мембрану с н.о.м. 30 кДа

Раствор V, с, Собщ.б.» Ц, Степень А, Аобщ.б.э Ч, Степень

мл мг/мл мг % конц. ЕД/мл ЕД % конц.

Исходный раствор 250 9,94 2485 - 1,58 395 -

Фильтрат 220 3,66 805,2 28,23 2,23 0,00 0,00 0,0 1,43

Концентрат 30 22,17 665,24 22,3 2,27 68,1 17,24

Результаты сравнительного анализа по изучению пероксидаз, выделенных из растительного сырья, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Физико-химические свойства пероксидаз, выделенных из корней хрена (п.х.) и корнеплодов редьки черной (п.р.ч.)

Свойство П.х. П.р.ч.

Молекулярная масса:

- исходный экстракт 42000 Да 48000 Да

- депигментированный 20000 Да 45000 Да

экстракт

Свойство П.х. П.р.ч.

- элюат 20000 Да 20000 Да

рН оптимум 6-6,5 6-7

Рабочий диапазон рН 5-8 5-8

Рабочий диапазон температур 20-60 иС 20-60 °С

Изоэлектрическая точка 8,9 8,7

Утах, (М*мин)"' 185185 172413

Кт,мМ 22,35 36,90

Исследования показали, что пероксидазы, выделенные из разных растительных источников, обладают близкими физико-химическими свойствами. Однако, как показали исследования, пероксидаза из корнеплодов редьки черной содержит меньше примесных компонентов, поэтому на ее основе разрабатывали состав геля.

Глава 4

Разработка фармацевтической композиции с модифицированной

пероксидазой

Известно, что нативные ферменты являются лабильными веществами, которые могут терять активность как при воздействии различных внешних факторов, так и при хранении. Проблема сохранения активности ферментов в готовой форме может решаться направленной модификацией фермента. Для этого применили Р-циклодекстрины (в России они официально зарегистрированы, разрешены к использованию в пищевой, косметологической и фармацевтической промышленности и признаны полностью безвредными).

Ценность пероксидазы, как лекарственного препарата, может возрастать, если использовать её в комплексе с другими биологически активными веществами, которые значительно расширяют её спектр действия, например, с антибиотиками. Для этого применили антибиотик из группы аминогликозидов гентамицин (оказывает бактерицидное действие, термостабилен, обладает широким спектром действия, применяют наружно при ожогах, ранах, язвах и т.п.).

Предварительно исследовали влияние каждого компонента на активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной (п.р.ч.). Исследования показали, что добавление Р-циклодекстринов к п.р.ч. незначительно снижает ее активность, а

добавление антибиотика увеличивает активность фермента в 1,2 раза. Добавление Р-циклодекстринов к комплексу антибиотик/п.р.ч. увеличивает активность пероксидазы в 1,4 раза. В дальнейшем, для создания фармацевтической композиции использовали тройной комплекс пероксидазы из корнеплодов редьки черной, гентамицина и р-циклодекстринов (в весовом соотношении 1:0,33:2). Разработан состав фармацевтической композиции и технология геля на ее основе.

Для подтверждения связывания гентамицина с ферментом и комплекса гентамицин/фермент с циклодекстрином использовали метод кинетики диффузии пероксидазы через пористую мембрану. Эксперименты проводили на специальных двухкамерных ячейках. Камеру №1 заполняли исследуемым раствором, камеру №2 - фосфатным буферным раствором с рН=6,0. Экспериментальные данные представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Кинетика диффузии пероксидазы в присутствии гентамицина и Р-циклодекстринов

0 20 40 60 80 ♦ пероксидаза ^ сек

—пероксидаза+гентамицнн

—* - пероксидаза+гентамицин+бета-ЦЦ

Как видно из данных, представленных на рисунке 4, кинетическая кривая антибиотик/фермент проходят ниже кинетической кривой раствора пероксидазы, что говорит" о возможном образовании комплекса. Кинетическая кривая комплекс/циклодекстрин проходит ниже кинетической кривой чистого раствора пероксидазы из корнеплодов редьки черной и ниже кинетической кривой антибиотик/фермент, что подтверждает наличие связывания фермента с антибиотиком и циклодекстрином. Методом кинетики диффузии через пористые мембраны рассчитан процент связывания пероксидазы с гентамицином (33 %) и пероксидазы с гентамицином и циклодекстринами (67 %).

При создании фармацевтической композиции подбирали оптимальные весовые соотношения фермент: компонент и изучали влияние эксципиентов на активность пероксидазы в составе геля. Выбранный состав фармацевтической композиции представлен в таблице 3. Получены опытные образцы (пять серий),

которые заложены на хранение. Технология геля заключается в отвешивании необходимых количеств пероксидазы, гентамицина, р-циклодекстринов, альгината натрия, метилпарабена, пропилпарабена и воды очищенной. Расчетное количество воды очищенной, альгината натрия, метилпарабена и пропилпарабена смешивают, нагревают до 80 °С и выдерживают при перемешивании в течение 6 часов, после чего охлаждают до 25 °С при перемешивании до получения однородного бесцветного геля. В полученный гель вносят расчетное количество комплекса пероксидазы, гентамицина и р-циклодекстринов и перемешивают в течение 2 часов. Технологическая схема представлена на рисунке 5.

Стабильность пероксидазы анализировали в пяти сериях геля, упакованного по 15 г в тубы алюминиевые с мембраной по ТУ 9467-004-32807885-2008; ТУ У 28.7-25463020-006-2003; ТУ У 28.7-32030717-001-2008 с внутренним лаковым покрытием, заложенных на хранение при комнатной температуре (допуски по объему ± 5%). При изучении стабильности оценивали внешний вид геля, рН извлечения, подлинность, количественное содержание пероксидазы, микробиологическую чистоту (таблица 4).

Таблица 3 - Состав фармацевтической композиции в виде геля на 100 г

Название вещества Кол-во в 100 г [г] Функция Спецификация

Активные вещества:

Пероксидаза из корнеплодов редьки черной 0,58 активное вещество

Гентамицин 0,20 активное вещество Еиг. РЬ, ВР

Вспомогательные вещества:

Р - циклодекстрины 1,16 носитель Бит. РЬ, ШР, ВР

Метилпарагидроксибензоат (нипагин) 0,15 консервант Еиг. РЬ, ВР, иБР/ЬЛ7

Альгинат натрия 7,0 геле-образователь Еиг. РЬ, иБР, ВР

Пропилпарагидроксибензоат (нипазол) 0,05 консервант Еиг. РЬ, ВР, иБР/№

Вода очищенная 90,86 растворитель ФС 42-2619-97

Таблица 4 - Спецификация показателей качества на гель с пероксидазой

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Однородный бесцветный гель

Подлинность

- пероксидаза Спектрофотометр ический Ультрафиолетовые спектры поглощения растворов препарата и рабочего стандартного образца (PCO) пероксидазы приготовленных для количественного определения, в области от 300 до 450 нм должны иметь максимум при одних и тех же длинах волн.

- нипапш ВЭЖХ Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, полученного при количественном определении, должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора стандартного образца нипапша (метил 4-гидроксибензоат).

- нипазол ВЭЖХ Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, полученного при количественном определении, должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора стандартного образца нипазола (пропил 4-гидрокси-бензоат)

- гентамицин ВЭЖХ Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, полученного при количественном определении, должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора стандартного образца гентамицина.

Плотность ГФ XII От 0,99 до 1,01 г/см3

pH водного извлечения ГФ XII, потенциометр ический От 5,0 до 7,0

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Размер частиц ГФ XI Не более 100 мкм

Микробиологическая чистота ГФХ11 Категория 2

Количественное определение - пероксидазы - гентамицин - нипагина - нипазола Спектрофотометр ический ВЭЖХ ВЭЖХ ВЭЖХ Содержание пероксидазы в 1 г должно быть от 155 до 170 ЕД Содержание гентамицина в 1 г должно быть от 3,45 до 3,75 мг Содержание нипагина в 1 г должно быть от 1,35 до 1,65 мг Содержание нипазола в 1 г должно быть от 0,45 до 0,55 мг

Масса содержимого упаковки ОСТ 64-492-85 Норма допустимых отклонений: для 1 упаковки по 15 г: ± 4 %; для 10 упаковок по 15 г:± 1,3 %.

Упаковка По 15 г в тубы алюминиевые с мембраной с внутренним лаковым покрытием. По одной тубе вместе с инструкцией по медицинскому применению помещают в пачку из картона для потребительской тары

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирование В соответствии с ГОСТ 17768-90

Хранение В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 °С

Срок годности 2 года

Результаты исследования показали, что в течение срока наблюдения (2,5 года) внешний вид геля не изменялся, активность пероксидазы находилась в диапазоне 157-170 ЕД/г препарата.

Изучено сохранение активности пероксидазы и гентамицина в тубах геля в течение двух с половиной лет, составлен проект ФС на гель с пероксидазой.

Исследования биологической безвредности позволяют отнести гель к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ. Полученные результаты могут служить основанием для проведения доклинических и клинических исследований специфической активности геля, разработки лабораторного и опытно-промышленного регламентов.

ВР.1.1 Получение воды ВР.1 Вспомогательны

очищенной Кх, Кц еработы

ВР.1.2

Подготовка оборудования

ВР.1.3 Подготовка

сырья

ТП.2.1

Экстрагирование

ТП.2.2 Центрифугирование

ТП.2.3 Депигментация

ТП.3.1 Сорбция, промывка

ТП.3.2 Десорбция, промывка

ТП.6.1 Приготовление

раствора фермента

ТП.6.2 Приготовление

раствора

антибиотика

ТП.6.3 Объединение

растворов

антибиотика и

фермента

ТП.6.4 Смешение раствора

антибиотика и

фермента с

порошком

циклодекстринов

Промывные воды

ОБО

Механические на

потери ЗБО

наст. ТП7.

ТП.2 Кт, Кх Получение денигментирован ного раствора

ТП.З Кт, к* Получение элюата

г

ТП.4 Кт, К, Получение концентрата

<

ТП.5 Кт, К» Ляофильная сушка

ТП.6 Кт, кх, Км Получение комплекса пероксидазы, гентамицина и ПД

Потери БАВ

на

ОБО

Жмых

ОБО

Отработанный на ^

СКН рег

Потери БАВ

ОБО

Отработанный на ,,

КУ-23 рег

Промывные на ^

воды ОБО.

Потери БАВ

на

Отработанный фильтрат

ОБО на

ОБО

Потери БАВ

в атм^

Потери БАВ

на

ОБО

Механические потери

на

Т5Б$

Кт, Кх, Км-технологический, химический, микробиологический контроль ОБО - разбавление, нейтрализация

Рисунок 5 - Технологическая схема производства геля с пероксидазой

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Подобраны условия экстрагирования (экстрагент — 5% раствор СаСЬ, время экстрагирования 0,5 часа), для выделения очищенной пероксидазы из экстракта подобраны оптимальный сорбент (макропористый сульфокатионит КУ-23) и мембранный модуль (ультрафильтрационный модуль с отсекающей способностью 30 кДа)

2. Предложена технология сорбционной очистки и концентрирования пероксидаз на макропористом сорбенте с использованием сорбционного и мембранного модулей. Состоит из стадий экстрагирования, депигментации на сорбенте СКН, сорбционно-хроматографической очистки на КУ-23, концентрирования и деминерализации на ультрафильтрационной мембране с отсекающей молекулярной массой 30 и 5 кДа, получения пероксидазы в виде лиофильно высушенной субстанции.

3. Проведен сравнительный анализ пероксидаз, выделенных сорбционно-хроматографическим методом из растительных экстрактов корней хрена и корнеплодов редьки черной: исследования показали, что пероксидазы обладают

близкими физико-химическими свойствами. Ввиду того, что субстанция пероксидазы из корней хрена содержит большее количество примесей и корни хрена значительно дороже, для дальнейших исследований выбрали субстанцию пероксидазы из корнеплодов редьки черной

4. Показана перспективность модификации пероксидазы редьки черной циклодекстринами: (ЦЦ): при весовом соотношении ЦЦ: фермент 2:1 и более наблюдается активирование пероксидазы

5. Разработана технология геля, активной составляющей которого является фармацевтическая композиция, включающая комплекс пероксидазы из корнеплодов редьки черной, гентамицина и р-циклодекстринов

6. Исследована стабильность пероксидазы и гентамицина в геле, разработан проект ФС на гель (приложение Г) и проведен анализ его биологической безвредности, который позволяет отнести гель к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (приложение Д)

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ в журналах перечня ВАК

1. Серкова, А.Н. Влияние ионов кальция при разработке сорбционно-хроматографического метода выделения пероксидазы из экстракта / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж: Воронежский государственный университет, кафедра аналитической химии, 2013. -Т.13, Вып. 3.-С. 377-384.

2. Серкова, А.Н. Выделение, изучение, модификация растительных пероксидаз / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Фармация. - М.: Изд-во «Русский врач», 2014. - 6. - С.18-21.

3. Серкова, А.Н. Наноструюуры, включающие пероксидазу редьки черной, антибиотики и циклодекстрины для создания различных фармацевтических композиций / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова, Н.В. Заинкова, Т.И. Муравьева, Н.Д. Бунятян // Фундаментальные исследования. - М.: Академия Естествознания, 2015. - № 2 (часть 3). - С. 518-522.

Публикации в других изданиях

1. Серкова, А.Н. Выделение пероксидазы из растительного сырья / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Научно-практическая конференция, посвященная 65-

летию факультета промышленной технологии лекарств: сборник научных трудов. - Часть I. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2010. - С. 158-162.

2. Серкова, А.Н. Использование наносистем в качестве перспективы создания новых лекарственных форм / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Сб. VII междунар. науч. - практич. конфер. Наука и технологии: шаг в будущее — 2011. — Praha, Publishing House «Education and Science» s.r.o., 2011. - V.3. - С. 29-35.

3. Серкова, A.H. Нанотехнологии в разработке ферментных препаратов / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова, В.Н. Иванов, Е.П. Яковлева, А.А. Шенгер // Нанотехнологии в фармации и медицине: Материалы международной научно-практической конференции (13-14 октября 2011 г., г. Харьков, Украина). - X., 2011.-С. 69-73.

4. Серкова, A.IL Получение лекарственных субстанций природного происхождения с использованием нанотехнологии / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова, С.А. Новикова // Международная научно-методическая конференция «Сандеровские чтения», посвящённая памяти выдающегося отечественного учёного в области технологии лекарств Юрия Карловича Сандера, 03-04 февраля 2012 года: сборник научных трудов. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2012.-С. 30-33.

5. Серкова, А.Н. Создание и изучение наноструктур, включающих пероксидазу редьки чёрной /А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Материалы международной науч.-практич. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 20-22 марта 2012 г., Москва. - М.:ЗАО «Экспо-био-химтехнологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2012. - С. 257-258.

6. Серкова, А.Н. Выделение, сорбционно-хроматографическая очистка и изучение свойств пероксидазы из редьки чёрной / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2012 г. Ч. III. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2012. - С.42-44.

7. Серкова, А.Н. Выделение, сорбционная очистка и изучение свойств пероксидазы из различного сырья. Каталог XV конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов «Молодые, дерзкие, перспективные» (Санкт-Петербург, 25 сентября 2012 г.) СПб.: Изд-во «Лема», 2012.-С. 186-187.

8. Серкова, А.Н. Выделение и изучение пероксидаз из различного сырья/ А.Н. Серкова, Н.В. Глазова// Сборник научных трудов по материалам Международной заочной научно-практической конференции «Наука и образование в жизни современного общества» 29 октября 2012 года. - Часть Тамбов: Изд-во ТРОО «Бизнес- Наука - Общество», 2012.- С. 127-128.

9. Серкова, А.Н. Применение гибкой схемы сорбционной технологии выделения и очистки ферментов из растительного и животного сырья для последующего создания биофармацевтических композиций / Н.В. Глазова, А.Н. Серкова, С.С. Декунов// Материалы международной науч. -практич. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 19-22 марта 2013 г., Москва. - М.:ЗАО «Экспо-био-химтехнологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013. - С. 267-268.

10. Серкова, А.Н. Модификация ферментов и конструирование наноструктур на их основе /А.Н. Серкова // Восемнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. - СПб., 2013.-С. 131-131.

11. Серкова, А.Н. Сорбционная очистка лактопероксидазы / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Достижения молодых ученых в развитии инновационных процессов в экономике, науке, образовании: Материалы V Международной научно-практической конференции [Текст] + [Электронный ресурс]. Под ред. О.М. Голембиовской - Брянск: БГТУ, 2013. - С. 95-97.

12. Способ получения ферментов из группы гидролаз и оксидаз, лактоферрина и альбумина / А.Н. Серкова [и др.]. - № 2013144910/10(069334); заявл. 07.10.2013.

13. Серкова, А.Н. Современные технологии конструирования фармацевтических композиций на основе ферментов и наноносителей / А.Н. Серкова, Н.В. Глазова // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», Санкт-Петербург, 20 ноября 2013 г. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2013. - С. 63-64.

14.Guerreiro, Antonio. Influence of Surface-Imprinted Nanoparticles on Trypsin Activity / Antönio Guerreiro, Alessandro Poma, Kai Karim, Ewa Moczko, Jessica Takarada, Isabel Perez de Vargas-Sansalvador, Nicholas Turner, Elena Piletska,

Cristiana Schmidt de MagaMes, Natalia Glazova, Anastasia Serkova, Aleksandra Omelianova and Sergey Piletsky // Advanced healthcare materials, Germany, 2014. - P. 11-15. -DOI: 10.1002/adhm.201300634.

15.Serkova, A.N. Development of gel with black radish peroxidase / A.N. Serkova, N.V. Glazova // Obzory po kliniceskoi farmacologii I lekarstvennoi terapii. The 18th international congress Phytopharm 2014, Saint-Petersburg, Russia, 3-5 July 2014. - SPb.: Publishing company "The Publishing LTD. N-L", 2014. - 12. - C. 58-58.

16. Serkova, A.N. The nanostructured medicines in the form of gel and cream including the peroxidase of the black radish / A.N. Serkova, N.V. Glazova // Archiv euromedica, Hannover, Deutschland, 2014, vol.4, num.2. - P 86-87.

На правах рукописи

Серкова Анастасия Никитична

ТЕХНОЛОГИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ

14.04.01 —Технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать А. В. Пономаревой

Подписано к печати

02.04.2015.

Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Гарнитура «Тайме». Печать ризограф. Печ. л.1,5. Тираж 120 экз. Заказ 1365

«Изд-во СПХФА». Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14