Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование тетраэтилтиурамдисульфида

На правах рукописи

I

ТЕРСКИХ АНАСТАСИЯ ПЕТРОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРАЭТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДА (АНТАБУСА)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

гьштг

Курск-2011

005009544

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Шорманов Владимир Камбулатович Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Новиков Олег Олегович доктор фармацевтических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная

фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Зашита состоится « ^.а/^гг_2012 г. в /3^ часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « /¿I » _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тетраэтилтиурамдисульфид (антабус, тетурам) в настоящее время входит в состав многих противоалкогольных препаратов и является одним из наиболее действенных лекарственных средств для лечения хронического алкоголизма.

Есть сведения, что основной метаболит тетраэтилтиурамдисульфида -диэтилдитиокарбамат - способен стимулировать активность иммунной системы. Соли дитиокарбаминовых кислот обладают радиопротекторной активностью.

Наряду с применением в медицине тетраэтилтиурамдисульфид широко применяется в аналитической практике в качестве реагента на ионы металлов.

Рассматриваемое соединение применяют также как хелатообразователь при отравлении тетракарбонилом никеля.

Тетраэтилтиурамдисульфид и некоторые близкие к нему структуры находят широкое применение в качестве пестицидов.

Тетраэтилтиурамдисульфид токсичен для теплокровных организмов. 1^50 для крыс при пероральном введении составляет 500 мг/кг.

Описаны многочисленные случаи отравления людей данным соединением с летальным исходом. Смерть взрослого человека может наступить от 30 г тетраэтилтиурамдисульфида, а при концентрации алкоголя в крови более 0,13 % - от 1 г вещества.

Широкое применение рассматриваемого вещества, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления, обуславливают необходимость изучения данного вещества в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости данного соединения в биологическом материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования тетраэтилтиурамдисульфида является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования тетраэтилтиурамдисульфида.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров тетраэтилтиурамдисульфида.

2. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

3. Исследовать особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

4. Изучить распределение тетраэтилтиурамдисульфида в органах и биожидкостях теплокровных животных.

5. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в биологическом материале.

Научная новизна исследований. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения тетраэтилтиурамдисульфида в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида методами ТСХ и хроматоспектрофотометрии.

Исследованы особенности поглощения веществом электромагнитного излучения в УФ-части спектра, закономерности изолирования агентами различной химической природы. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Впервые для изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента этилацетата. На основе применения в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки в тонких слоях или колонках нормальнофазового сорбента разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого вещества в ткани органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно изменённого биоматериала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (крысы) исследованы особенности распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных при его самостоятельном введении и при введении вместе с этанолом.

Определены сроки сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом материале (печень, кровь).

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида.

Внедрение результатов работы:

- методика изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из ткани печени, одноэтапного ТСХ-разделения и количественного определения методом спектрофотометрии (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 01.09.2009 г.,

кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко с 16.02.2009 г. и кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 15.12.2010 г.);

- методика определения тетраэтилтиурамдисульфида в биологических жидкостях (кровь, моча) одноэтапного ТСХ-разделения и количественного определения методом спектрофотометрии (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 01.09.2009 г. и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко с 16.02.2009 г. и кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 15.12.2010 г.).

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 0120.0801917.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2008), на II Международном научном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), на IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010), на IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано тринадцать научных работ, 4 из которых - в журналах списка ВАК, а 2 публикации являются патентами РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общей схемы исследования, общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 168 страницах машинописного текста, содержат 10 рисунков, 27 таблиц. Список цитируемой литературы включает 169 источника, из которых 64 - на иностранных языках.

Первая глава (обзор литературы) включает в себя известные данные о тетраэтилтиурамдисульфиде как объекте химико-токсикологического исследования.

Вторая глава посвящена вопросам идентификации объекта исследования хроматографическими и спектральными методами.

В третьей главе приводятся экспериментальные данные по вопросам количественного определения анализируемого вещества.

Четвёртая глава включает в себя результаты изучения особенностей выделения и очистки объекта исследования хроматографическими методами.

В пятой главе рассмотрены вопросы определения тетраэтилтиурамдисульфида после его изолирования из биологического материала оптимальным изолирующим агентом.

В шестой главе приведены данные, полученные в результате изучения особенностей распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных и сохраняемости в биологическом материале (печень, кровь).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографической активности тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях и колонках сорбентов;

особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемым веществом в УФ-области спектра;

- методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;

- результаты исследования очистки тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях и колонках сорбентов;

- методика изолирования объекта исследования из биологического материала (печени, крови, мочи) и очистки от соэкстрактивных веществ;

особенности распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных животных;

- сохраняемость тетраэтилтиурамдисульфида в тканях трупных органов и в биологических жидкостях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован тетраэтилтиурамдисульфид (антабус, тетурам) (в дальнейшем - ТЭТД); стандарт ФСП - 42-0550630805; содержание основного вещества не менее 99,9%).

Применены методы ТСХ, адсорбционной колоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК- спектрофотометрии.

Методики изолирования, очистки, идентификации и количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследована хроматографическая подвижность ТЭТД в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращённофазовых сорбентов с использованием подвижных фаз различной полярности.

Для характеристики подвижности анализируемого соединения рассчитаны, в частности, значения абсолютной (Rf) и относительной (Rs) (по отношению к Rf тетраметилтиурамдисульфида (в дальнейшем - ТМТД)) хроматографической подвижности и условного удерживания в тонком слое

сорбента (В = Щг).для метода ТСХ, а также значения времени и объёма удерживания (УД относительного (по отношению к удерживанию ТМТД) удерживания, коэффициента ёмкости (к), числа теоретических тарелок (N¡1 для ВЭЖХ.

Как свидетельствуют данные таблиц 1 и 2, наиболее оптимальные условия хроматографирования ТЭТД в тонких слоях гидроксилированного сорбента достигаются при использовании ряда элюентов малой и средней полярности, включающих гексан, диоксан и пропанол-2 в объёмных соотношениях 8:3:0,4 и 8:3:0,8 и 15:5:1. Наиболее целесообразно применение в качестве подвижной фазы системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1). Для варианта обращённофазовой ТСХ наиболее оптимальной подвижной фазой явилась система растворителей ацетонитрил-вода (5:5).

Таблица 1

Параметры хроматографирования ТЭТД в присутствии внутреннего стандарта (ТМТД) в тонких слоях нормальнофазового сорбента с

использованием оптимальных подвижных )аз

Компоненты подвижных фаз Объёмные соотношения компонентов ТЭТД ТМТД

В н5 Яг

Гексан-диоксан 6:4 0,86 1,16 1,24 0,69

7:3 0,75 1,33 1,58 0,48

Гексан-пропанол-2 8:2 0.81 1,23 1,33 0,63

2:8 0,85 1,18 1,16 0,72

Этилацетат-гексан 7,8:3,2 0,91 1,10 1,02 0,89

6,2:5,4 0,89 1,12 1,01 0,88

8,3:2,6 0,88 1Д4 1,09 0,80

Гексан-диоксан-ацетон 7:3:0,8 0,88 1,14 1,18 0,75

Гексан-диоксан-пропанол-2 8:2:0,4 0,85 1,18 1,22 0,70

8:2:0,6 0,86 1,16 1.22 0,70

8:2:0,8 0,87 1,15 1,22 0,72

8:3:0,4 0,81 1,23 1,10 0,73

8:3:0,6 0,85 1,18 1,09 0,78

8:3:0,8 0.91 1,10 1,09 0,84

8:4:0,2 0,87 1,15 1,17 0,75

8:4:0,4 0,85 1,18 1,22 0,70

8:4:0,6 0,84 1Д9 1,25 0,67

8:4:0,8 0,81 1,23 1,30 0,63

8:5:0,2 0,90 1,11 1,11 0,81

15:5:1 0,87 1,15 1,39 0,63

Гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон 8:2:0,4:0,4 0,84 1,19 1,29 0,65

8:3:0,8:0,8 0,81 1,23 1,24 0,65

Таблица 2

Параметры хроматографировапия ТЭТД в присутствии внутреннего стандарта (ТМТД) в топких слоях обращеннофазового сорбента с использованием оптимальных подвижных фаз_

Компоненты подвижных фаз Объёмные соотношения компонентов ТЭТД тмгд

Кг В к, Иг

Диоксан-вода 6:4 0,30 3,33 0,59 0,51

7:3 0,36 2,78 0,71 0,51

8:2 0,53 1,89 0,78 0,68

Диоксан-буфер с рН 1,68 5:5 0,12 8,33 0,3 0,40

Ацетонитрил-вода 5:5 0,22 4,55 0,46 0,48

ДМФА-вода 5:5 0,13 7,69 0,26 0,5

Этанол-вода 5:5 0,21 4,76 0,39 0,54

Подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 15:5:1 (по объёму), явилась такэе оптимальной для определения объекта исследования методами хроматографии низкого давления в колонках силикагеля Ь 40/100 ц и ВЭЖХ (таблица 3).

Таблица 3

Основные параметры хроматографировапия ТЭТД и ряда близких по структуре соединений методом нормальнофазовой ВЭЖХ в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) __

Хроматографиру- Относительное к' N I ВЭЖХ

емые вещества удерживание (по отношению к ТМТД)

Карбофуран 3,46 346 0,834 1,21 1731 1,22

ТМТД 4,15 415 1 1,33 1547 1,80

ТЭТД 4,42 442 1,065 1,98 2413 3,28

Банкол 6,36 636 1,533 3,04 2257

Результаты изучения особенностей хроматографической подвижности рассматриваемых соединений указывают на возможность их идентификации методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум при идентификации ТЭТД методом ТСХ в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями составляет 0,10,2 мкг. Открываемый минимум рассматриваемого соединения методом нормальнофазовой ВЭЖХ составляет 0,005 мкг в хроматографируемой пробе.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемого соединения в УФ-области спектра при использовании в качестве растворяющих сред ацетонитрила, 1,4-диоксана, хлороформа, этанола и этилацетата. Рассчитаны отдельные оптические характеристики электронных спектров ТЭТД в данных средах.

На основе изучения особенностей поглощения УФ-излучения ТЭТД в среде этилацетата, хлороформа и ацетонитрила, при длинах волн 284, 282 или 280 им (для каждого растворителя соответственно) были построены градуировочные графики зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества в дпнных растворителях для дальнейшего их использования при количественном определении ТЭТД.

При рассмотрении ИК-спектра ТЭТД отмечено присутствие в нём ряда характеристических полос, соответствующих определённым видам колебаний участков молекулы рассматриваемого вещества (таблица 4). В высокочастотной части ИК-спектра (область 2868-2972 см"1) ТЭТД присутствуют полосы, соответствующие валентным асимметрическим и симметрическим колебаниям С-Н связи в метальных и метиленовых группах. Полоса с максимумом в области 1375 см"1 предположительно может соответствовать симметричным деформационным колебаниям С-Н в метальной группе.

Асимметрическим деформационным колебаниям С-Н связей в СН3-группе соответствует полоса с максимумом при 1456 см"1.

В интервале частот 1072-1092 см"1 располагаются максимумы полос, обусловленных валентными колебаниями -C=S связи.

В ИК-спектре имеются полосы, которые могут быть отнесены к колебаниям S-S-связи, деформационным колебаниям N-C=S и колебаниям с участием связи -C=S.

Таблица 4

Характеристика ИК-спектра ТЭТД_

Максимумы характеристических полос, см"1 Отнесение колебаний Максимумы характеристических полос, см"1 Отнесение колебаний

2972 Валентные асимметрические -СН3 1375 Симметрические деформационные -СНз?

2930 Валентные асимметрические -СН2- 1092 1072 Валентные -С=Б

2868 Валентные симметрические -СНз 1292 1273 Колебания ?

1497 Деформационные >М-С=8? 586 556 Колебания с участием связи-С=8?

1456 Асимметрические деформационные -СНз

Показана возможность идентификации ТЭТД но электронным (УФ-) и ИК-спектрам.

Для определения условий очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения методов колоночной и тонкослойной хроматографии.

В частности, изучены особенности хроматографической активности ТЭТД в макроколонках, заполненных сорбентом с гидроксилированной поверхностью, в качестве которого рассмотрен силикагель Ь 40/100 ц. В качестве подвижной фазы рассмотрена система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1).

Установлено, что в стандартных условиях при использовании в качестве подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) ТЭТД присутствует с девятой по шестнадцатую (18-32 мл) включительно фракциях элюата (объём каждой фракции - 2 мл).

Основываясь на полученных ранее данных, для определения условий очистки рассматриваемого вещества в тонком слое нормальнофазового сорбента была выбрана система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1), а в качестве элюента для извлечения вещества с пластины -ацетонитрил. Концентрация вещества при моделировании методов очистки составляла 0,001 г/мл.

Изучена зависимость степени изолирования ТЭТД из биоматериала изолирующими агентами различной природы.

В процессе исследования изучали особенности извлечения ТЭТД из биологического материала (ткани печени без признаков гнилостного изменения и соединительнотканного перерождения, взятой от трупа человека) изолирующими агентами различной химической природы: карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота), спиртами (пропанол-2), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями (1,4-диоксан), алканами (гексан), галагеналканами (хлороформ), аренами (толуол), простыми и сложными эфирами (этилацетат, диэтиловый эфир), нитрилами (ацетонитрил).

Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Зависимость изолирования ТЭТД от природы изолирующего агента

Изолирующий агент Степень извлечения, % Изолирующий агент Степень извлечения, %

Этилацетат 98,36±2,69 Толуол 62,64±3,38

Хлороформ 89,26±4,25 Эфир 45,28±4,53

Гексан 23,13±3,16 Пропанол-2 25,69±9,1

Ацетонитрил 43,09±5,62 Ледяная уксусная кислота 10,28±6,32

1,4-Диоксан 26,65±3,41

Для обнаружения и предварительной идентификации ТЭТД, выделенного из биологического материала, использована возможность применения хроматографии в тонких слоях нормальнофазового сорбента, количественное содержание ТЭТД определяли методом УФ-спектрофотометрии по поглощению в ацетонитриле с использованием уравнения градуировочного графика.

Сравнение результатов изолирования ТЭТД (при содержании его в биологическом объекте 0,1%) указанными изолирующими жидкостями показывает, что максимальные значения степени извлечения достигаются при использовании в качестве изолирующего агента этилацетата.

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого соединения этилацетатом от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Исследования показали, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемого вещества из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза.

При изучении зависимости степени извлечения ТЭТД от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что достаточно полное извлечения анализируемого соединения из ткани печени достигаются уже при настаивании в течение 45 минут.

Установлено, что увеличение содержания ТЭТД в модельных смесях (печень) в интервале концентраций (1,0-15,0 мг) при постоянной массе биологического материала (5,0 г) сопровождалось лишь незначительным изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 3,0 %.

Для изолирования ТЭТД из биологической жидкости (крови) также была изучена зависимость степени извлечения данного вещества от природы изолирующих агентов.

Количественная оценка результатов определения представлена в таблице 6.

Таблица 6

Зависимость изолирования ТЭТД из крови от природы изолирующего агента

Изолирующий Внесено ТЭТД, мг в 5 г крови Найдено ТЭТД, %

агент

1 2 3

Ацетон 0,5

2,0 -

5,0 17,60±3,65

Толуол 0,5 7,85±1,98

2,0 6422±2,43

5,0 47,65±2ДЗ

1 2 3

Этилацетат 0,5 13,86±1,23

2,0 29,86±2,09

5,0 30,18±1,98

Хлороформ 0,5 21,83±2Д1

2,0 66,79±2,07

5,0 53,17±1,97

На основании проведенных исследований можно предложить использовать для крови в качестве изолирующего агента этилацетат при не менее, чем двукратном настаивании с двукратным объемом изолирующего агента.

С целью нарушения устойчивости связи ТЭТД со специфическими для крови эндогенными биологическими веществами и повышения степени извлечения ТЭТД этилацетатом из крови, рассматривали возможность введения в биологические пробы фермента пепсина, а также натрия фторида в различных количествах.

Результаты степени извлечения ТЭТД из крови при использовании пепсина представлены в таблице 7.

Таблица 7

Зависимость степени изолирования ТЭТД из крови с гемоконсерваптом «Фаглюцид» от количества добавленного пепсина

Масса пепсина, мг Внесено ТЭТД, мг в 5 г крови Найдено ТЭТД, %

5 0,5 25,14±1,13

2,0 26,65±1,34

5,0 23,63±1,27

10 0,5 26,42±1,23

2,0 23,44±1,45

5,0 22,48±1,39

15 0,5 36,42±1,02

2,0 43,35±1,89

5,0 44,05±1,87

Как свидетельствуют полученные данные, внесение в искусственную смесь анализируемого вещества с кровью (5 г) навески пепсина массой 15 мг позволяет увеличить степень извлечения ТЭТД из крови до 44,05 %.

Результаты степени извлечения ТЭТД из крови при использовании натрия фторида представлены в таблице 8.

Таблица 8

Зависимость степени изолирования ТЭТД из крови с гемоконсервантом «Фаглюцид» от количества добавленного натрия фторида

Масса навески натрия фторида, г Внесено ТЭТД, мг в 5 г крови Найдено ТЭТД, %

0,5 0,5 73,85±2,67

2,0 93,44±2,43

5,0 95,55±2,13

1,0 0,5 13,85±2,22

2,0 48,16±2,07

5,0 44,95±1,98

2,0 0,5 3,85±1,23

2,0 16,70±1,67

5,0 16,57±1,79

Как показывают получившиеся результаты, добавление натрия фторида в количестве 0,5 г позволяет добиться высокой степени извлечения ТЭТД из крови до 95,55 % при содержании анализируемого вещества в количестве 5,0 мг в 5 г биожидкости.

Разработанные методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методами колоночной и тонкослойной хроматографии (таблица 9).

Таблица 9

Оптическая плотность растворов остатков, полученных после очистки контрольных извлечений из ткани печени различными методами

Вид очистки Элюент при определении Количество биологической ткани, соэкстрактивныс вещества из которого после очистки присутствуют в 1 мл фотометрируемого раствора, г Длина волны, им Оптическая плотность растворов остатков

Колоночная хроматография гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) 1,0 276 0,011

ацетонитрил 1,0 280 0,013

Тонкослойная хроматография ацетонитрил 1,0 280 0,009

На основе предварительных исследований разработаны методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупного органа (печени), крови и моче на основе изолирования этилацетатом и последующей очистки извлекаемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

Количественная оценка результатов определения представлена в таблице 10.

Таблица 10

Результаты количественного определения анализируемого соединения в биологическом материале с применением очистки методами ТСХ и колоночной хроматографии

Биологический объект Внесено ТЭТД, мг Найдено ТЭТД, %

Очистка методом колоночной хроматографии Очистка методом ТСХ

Определение методом спектрофото-метрии Определение методом вэжх Определение методом спектрофото-метрии

Ткань печени 0,5 76,64± 7,19 76,48±7,45 76,83±7,07

2,0 90,89±5,04 90,69±5,25 91,01±5,12

5,0 91,26±4,89 90,97±5,06 91,44±4,84

Моча 0,5 91,26±2,41 91,03±2,67 91,96±2,49

2,0 93,07+2,18 92,82±2,37 93,60±2,22

5,0 94,30±2,06 94,12±2,35 94,44±2,06

Кровь 0,5 75,18±2,96 74,98±3,03 76,35±2,94

2,0 92,98±3,83 92,89±4,11 93,42±3,02

5,0 95,17±3,38 94,бб±2,87 95,53±2,65

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании ТЭТД в количестве от 0,5 до 5,0 мг в 5,0 г биоматериала разработанные методики, включающие очистку методом колоночной хроматографии, позволяют определить в ткани печени 90,97 % исследуемого вещества, в крови - 95,17 %, в моче - 94,12 %. Аналогичные результаты получены при использовании для очистки метода тонкослойной хроматографии.

Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Изучены особенности распределения ТЭТД в организме теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении данного вещества самостоятельно или вместе с 40 % этанолом. В каждом случае 25 животных объединялись в 5 опытных групп по 5 особей в каждой. Самостоятельно отравляющее вещество вводили двумя способами. Согласно первому способу ТЭТД вводили 250 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 10% суспензии

на основе 1% раствора крахмала (так как рассматриваемое соединение практически не растворимо в воде) трижды с интервалом в три часа. Согласно второму - ТЭТД вводили в количестве 500 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 20 % суспензии в 1 % крахмальном растворе через каждые 12 часов в течение 3 суток.

При изучении распределения ТЭТД на фоне введения этанола исследуемое вещество вводили в количестве 500 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 10% суспензии на основе 1% раствора крахмала однократно. Через 1 час затравленным ТЭТД животным внутрижелудочно вводили 3 мл 40% этанола. В течение 15-20 минут животные погибали от «тетурам-этаноловой» реакции.

После гибели животных их трупы вскрывали, одинаковые органы, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них ТЭТД. Параллельно исследовали органы животных двух контрольных групп (по 5 особей каждая), которым вводили в желудок 1 % раствор крахмала, не содержащий анализируемое вещество по схемам, соответствующим первому, второму или третьему способам введения.

Результаты изучения особенностей распределения ТЭТД в организме теплокровных животных представлены на рис. 1.

Рис. 1. Распределение ТЭТД в организме теплокровных (крысы) (% к найденному в 100 г органов):

Ж - самостоятельное введение по первому способу 131 - самостоятельное введение по второму способу □ - введение третьим способом (вместе с этанолом)

Определено количественное содержание ТЭТД в «органах - мишенях» хронической алкогольной интоксикации и «органах - мишенях» основного метаболизма препарата в организме теплокровного животного (крысы). Как свидетельствуют полученные данные, при первом способе введения наибольшее количество препарата найдено в желудке, толстом кишечнике и поджелудочной железе; наименьшее - мышечной ткани, почках и головном мозге; при втором способе - максимальные количества найдены в тех же биологических объектах, но в немного больших количествах.

Исследованы особенности стабильности ТЭТД в биологическом материале (искусственных смесях с тканью печени или крови) при температурах от -15 до 36°С. Результаты представлены на рис. 2 и 3.

„ 100 ■ о4 и 80 £ * ¡а.

р X * - —*—15 град.С _л_Л тал Г.

\ > V * — * >- * Г" —а—10 град. С —X—20 град. С —•—36 град. С

к 60 о, 2 40 •х .-Л Ж. 3 Ч ч

о ° 20- ч \ X 'X V ♦

ч к X X ж Ц и, ч «1 ♦

о со 05 00 см сча ш 1Л в О Г- СО эемя, со С см утк И (С см о ** 1Л СО со см со со о> о см

Рис. 2. Результаты изучения сохраняемости ТЭТД в ткани трупного органа(печени)

120

время, сутки

Рис. 3. Количественное содержание ТЭТД в биологической жидкости (крови)

Как свидетельствуют данные, полученные при изучении стабильности рассматриваемого вещества в биологическом материале, 'ГЭТД в предлагаемых температурных режимах сохранения (0 - 36 °С) определяется в биологическом материале в течение 1-3,5 месяцев в печени и в течение как минимум десяти дней в крови. При температуре ниже 0°С (-15 °С) рассматриваемое соединение определяется в ткани трупного органа и в крови соответственно в течение 7 и 1,5 месяцев.

По результатам проведенных исследований нами предложены 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении ТЭТД, представленные на рис. 4 и 5.

Рис. 4. Общая схема исследования биологического материала при отравлении ТЭТД на основе изолирования этилацетатом и очистки методом колоночной хроматографии

Рис. 5. Общая схема исследования биологического материала при отравлении ТЭТД на основе изолирования этилацетатом и очистки методом тонкослойной хроматографии

Предлагаемые варианты схемы, представленные на рисунках 4 и 5, позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемое отравляющее вещество.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1.Установлены особенности поглощения тетраэтилтиурамдисульфидом УФ-излучения в различных растворителях. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Показана возможность идентификации рассматриваемого соединения методом электронной спектрофотометрии.

На основе способности к поглощению УФ-излучения тетраэтилтиурамдисульфидом в различных растворяющих средах (хлороформ, ацетонитрила и этилацетат) разработаны методики

количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида

спектрофотометрическим и хроматоспектрофотометрическим методами. Относительная ошибка среднего результата при определении данными методиками (п=5; Р=0,95) в различных случаях не превышает ±1,5%.

Установлена целесообразность использования для идентификации рассматриваемого соединения метода колебательной спектрофотометрии в диапазоне частот 4000-400 см"1.

2.Исследовано хроматографическое поведение тетраэтилтиурамдисульфида в присутствии ряда близких по структуре и свойствам веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием элюентов различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие особенности хроматографирования анализируемых соединений.

Установлено, что универсальной подвижной фазой для определения тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях широкопористого силикагеля на пластинках «8огЬШ» ПТСХ-АФ иУ-254 и аналитических колонках нормальнофазного сорбента «Силасорб-600» является система растворителей средней полярности гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1).

Разработана методика количественного определения рассматриваемого вещества методом нормальнофазовой ВЭЖХ.

Относительная ошибка среднего результата при определении тетраэтилтиурамдисульфида данным методом не превышает 1,6%.

3. Изучены особенности препаративного хроматографирования объекта исследования в макроколонках, заполненных силикагелем Ь 40/100ц. Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Определён уровень потерь анализируемого вещества при хроматографировании в тонких слоях и колонках различных сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки тетраэтилтиурамдисульфида от соэкстрактивных веществ методами хроматографии.

4. Проведено сравнительное изолирование тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала изолирующими агентами различной химической природы.

Установлено, что извлечение рассматриваемого вещества из биологического материала наиболее целесообразно проводить этилацетатом, обеспечивающим наибольшую степень извлечения анализируемого соединения. Оптимальные условия изолирования этилацетатом можно достичь уже при двукратном настаивании в случае, когда масса изолирующего агента как минимум в два раза превышает массу биоматериала, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 45 минут.

5. Разработаны методики определения тетраэтилтиурамдисульфида в тканях органов и биожидкосгях на основе изолирования этилацетатом, очистки методами колоночной и тонкослойной хроматографии с

последующим количественным определением методами спектрофотометрии и нормалыюфазовой ВЭЖХ.

6. При внесении тетраэтшггиурамдисульфида в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании этилацетатом, позволяют определять в ткани печени 91,44%, в крови 95,53%, в моче 94,44% анализируемого соединения.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 1,0 мг в 100 г трупного органа, 0,8 мг в 100 мл крови или 0,4 мг в 100 мл мочи.

7. Изучен характер распределения тетраэтилтиурамдисульфида в органах и биожидкостях теплокровных организмов (на примере крыс) при отравлениях, вызванных его самостоятельным введением и его введением вместе с этанолом.

Установлено, что после индивидуального введения отравляющего вещества наибольшее его количество найдено в желудке, толстом кишечнике и селезенке; наименьшее - в мочевом пузыре с мочой, почках и головном мозге. При отравлении тетраэтилтиурамдисульфидом на фоне введения этанола отмечено значительное увеличение содержания исследуемого вещества в крови, моче и ткани почек.

8. Изучена сохраняемость тетраэтилтиурамдисульфида в гнилостно разлагающемся биологическом материале (печень, кровь) в зависимости от температурного режима сохранения. Установлено, что при температурах от 0 до 36 °С тетраэтилтиурамдисульфид сохраняется в ткани трупного органа (печень), по крайней мере, в течение трёх месяцев, в биологической жидкости (кровь) - в течение десяти дней. При температуре ниже 0°С (-15 °С) рассматриваемое соединение определяется в ткани трупного органа и в крови соответственно в течение 7 и 1,5 месяцев.

9. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала (ткань трупного органа, биожидкости) при отравлении тетраэтилтиурамдисульфидом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение условий выделения антабуса из крови человека с использованием натрия фторида / В.К. Шорманов [и др.] // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : мат. Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящённый 45-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета. - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. - С. 294-296.

2. Изучение условий экстракции антабуса из крови человека / А.П. Просветова [и др.] // Каталог докладов IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» / Воронеж, гос. технол. акад. -Воронеж: Изд-во ВГТА, 2010. - С. 220.

3. Использование метода тонкослойной хроматографии при определении тетраэтилтиурамдисульфида в биологических жидкостях / А.П. Просветова [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. -Т. 10, вып. 4.-С. 556-561.

4. Определение карбаматов и амидов дитиоугольной кислоты в тонком слое нормальнофазового сорбента / Е.П. Дурицын [и др.] // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. трудов Всеросс. науч.-практ. конф. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - С. 127-129.

5. Определение тетраэтилтиурамдисульфида методом УФ-спектрофотометрии / Е.П. Дурицын [и др.] // Биомедицинская инженерия и биотехнология: сб. трудов Всеросс. науч.-практ. конф., посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета. - Курск: Изд-во КГМУ, 2008. - С. 160-162.

6. Особенности извлечения тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала / А.П. Просветова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Изд-во ПГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 446-448.

7. Особенности изолирования и определения тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале/ А.П. Просветова [и др.] // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация. - 2009. - № 2. - С. 44-49.

8. Особенности определения и изучения сохраняемости тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале / А.П. Просветова [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - № 6. - С. 31-34.

9. Особенности распределения антабуса в организме теплокровных животных/ А.П. Просветова [и др.] // Фармация. -2011.-№ З.-С. 42-45.

10.Пат. Российская Федерация № 2415425, МПКЯ С 1 G01N33/48; G01N30/02 / Способ определения тетрамегилгиурамдисульфида в биологическом материале / Шорманов В.К., Королев В.А., Иванов В.П., Ким A.B., Дурицын Е.П., Просветова А.П.; заявители и патентообладатели: В.К. Шорманов, В .А. Королев, В.П. Иванов, A.B. Ким. - № 2009147065;3аяв. 17.12.2009; Опуб. 27.03.2011 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2011. - № 9.-10 с.

11.Пат. Российская Федерация № 2417372, МПК51 С 1 G01N33/48; G01 N30/02 / Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови / Шорманов В.К., Горбачева H.A., Дурицын Е.П., Просветова А.П., Илюшина Т.Н., Королев В.А., Иванов В.П., Ким A.B.; заявители и патентообладатели: Шорманов В.К., Горбачева H.A., Дурицын Е.П., Просветова А.П. - № 2010101891; Заяв. 21.01.2010; Опуб. 27.04.2011 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2011. - № 12. - 6 с.

12.Просветова А.П. Изучение особенностей извлечения тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала (крови) / А.П. Просветова, Т.Н. Илюшина // Материалы IV Междунар. науч. конф. молодых

ученых-медиков 25-26 февраля 2010 года. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. -Том 3.- С. 69-72.

13.Химико-токсикологическая характеристика тетраэтилтиурамди-сульфида / В.К. Шорманов [и др.] // Теория и практика фармации: сб. науч. статей, посвященный 90-летию ВГМА им. H.H. Бурденко. - Воронеж, 2009. -С. 86-91.

Сдано в набор 30.12.2011 г. Подписано в печать 30.12.2011 г. Формат 60x84 1/16. Бумага Снегурочка. Объем 1,0 усл. печ. л. Гариитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 1221.

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Отпечатано: ПБОЮЛ Киселева О.В. ОГРН 304463202600213