Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Скриннинг гетероциклических азотосодержащих соединенийкак потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

04201451607

Наталия Александровна Шевкун

Скрининг гетероциклических азотсодержащих соединений как потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов

14.03.03 - патологическая физиология 03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Демуров Е.А. доктор биологических наук, профессор Сяткин С. П.

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................17

1.1 Метаболизм полиаминов как лекарственная мишень.......17

111 Химическое строение, функции и распространение полиаминов 17

112 Ферменты метаболизма и транспорт почиаминов 18

113 Метаболизм полиаминов при патологии 21

114 Подходы к направленному изменению метаболизма с помощью аналогов полиаминов 24

1.2 Компьютерное моделирование биологической активное ш27

12 1 Количественные корреляции структура-активность 27

12 2 Молекулярный докинг 33

1.3 Фотодинамическая терапия и фотосенсибилизаторы........47

13 1 Основные принципы фотодинамической терапии 47 13 2 Механизм действия и свойства ФС 50

13 3 Типы гибели клеток 56

1.4 Особенности транспорта микро- и макромолекул..............59

14 1 Распределение микро-молекул в клетке и организме 59 14 2 Механизмы транспорта макромолекул 60 14 3 Фармакокинетика макромолекул 66

1.5 Создание конструкций для направленной доставки..........69

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................77

2.1 Изучаемые соединения..............................................................77

2.2 Количественный анализ аминооксидазной активности в бесклеточной тест-системе........................................................................88

2.3 Количественный анализ пролиферации на клеточной модели .........................................................................................................92

2.4 Оценка мембранной проницаемости......................................95

2.5 Количественные корреляции структура-активность........97

2.6 Молекулярный докинг............................................................104

2.7 Тестирование системы направленной доставки молекул с помощью транспортеров.........................................................................106

2 7 1 11 о пучение транспортеров и их конъюгатов с бактериохлорином 106

2 7 2 Сравнение фотоцитотоксической активности in vitro 113

2 73 Опредечение типа гибели клеток 114

2 7 4 Регистрация процессов перекисного окисления липидов in vitro 115

2 7 5 Опредечение внутриклеточной локализации Тр-1 117

2 7 6 Фотодинамическая терапия меланомы B16-F1 у мышей C57/Black 120

2 77 Фотодинамическая терапия эпидермоидной карциномы человека А-431 у мышей 121

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................123

3.1 Прогнозирование биологической активности соединений123

3 11 Выбор веществ для тестирования 123 3 12 Молекулярный докинг с почиаминоксидазой 125

3.2 Влияние соединений на активность аминооксидаз in vitrol42

3.3 Построение классификационной модели по in sillico-in vitro

данным.......................................................................................................147

3.4 Определение мембранной проницаемости..........................148

3.5 Скрининг антипролиферативной активности...................151

3.6 Количественные корреляции структура-активность......157

3.7 Применение транспортеров для доставки лекарств.........159

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................167

ВЫВОДЫ.................................................................................................................................170

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................171

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................173

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................................................................194

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Полиамины (ПА) — это органические катионы. Они присутствуют практически во всех живых организмах и являются важнейшими регуляторами процессов клеточного роста, дифференцировки и апоптоза [144]. Нарушения в метаболизме этих молекул, приводящие к повышению уровня ПА и ускоренной пролиферации клеток, свойственны множеству патофизиологических состояний, в том числе раковым заболеваниям. Противоопухолевые агенты нормализуют обмен ПА в опухолевых клетках. Это доказывает важность обмена ПА как терапевтической мишени [104]. Возрастание количества ПА в клетке при канцерогенезе происходит преимущественно за счет снижения или практического подавления катаболизма ПА путем окислительного дезаминирования, а не в результате значительного возрастания [54]. Продукты окислительного дезаминирования ПА (аминоальдегиды и Н202) вызывают апоптоз и проявляют противораковое и антимикробное действие, ингибируют рост некоторых видов раковых клеток, бактерий и вирусов [68].

Одним из направлений в разработке противоопухолевых препаратов является поиск синтетических аналогов ПА, действующих на ключевые ферменты обмена таким образом, чтобы скорость распада превышала скорость синтеза, образовывались цитотоксические агенты и, в конечном итоге, замедлялась пролиферация.

Активные формы кислорода и свободные радикалы - основные поражающие клетку факторы катаболизма ПА - действуют в радиусе десятков им [31]. При этом лучшей мишенью для деструкции является ядерная ДНК [147]. Универсальность наличия ПА для всех клеток организма и локальность цитотоксической активности продуктов их распада диктуют необходимость направленной доставки молекул в раковые клетки.

При разработке новых лекарственных препаратов необходимо предварительно оценить свойства соединений по отношению к терапевтической мишени (рисунок 1), иметь возможность предсказать тип активности, исходя из структурных особенностей веществ, получить информацию для оптимизации заместителей и функциональных групп в рядах гетероциклических соединений [88]. Для этих целей широко применяются технологии биоинформатики и компьютерного моделирования, такие как количественные корреляции структура-активность (ККСА) и молекулярная стыковка т бШсо (докинг).

Методы молекулярного моделирования для предсказания свойств молекул

Механизм прямого действия на мишень

Эффективность Безопасность

Рисунок 1 - Схема проведения исследований при разработке лекарств.

Таким образом, поиск новых веществ-активаторов катаболизма ПА и специфическая доставка их в раковые клетки является актуальной и важной проблемой.

Цель работы

Цель исследования - провести скрининг синтетических гетероциклических азотсодержащих соединений как потенциальных модуляторов обмена полиаминов и противоопухолевых агентов, а также протестировать систему направленной доставки лекарств.

Задачи работы

1. In silico докинг тестируемых соединений с полиаминоксидазой.

2. Скрининг антипролиферативного действия изучаемых соединений на раковых клеточных линиях РС-3, MEL-7, MCF-7.

3. Разработка бесклеточной модельной системы из гомогената печени крыс для скрининга влияния тестируемых соединений на активность ди- и полиаминоксидаз.

4. Проведение расчета количественных корреляций структура-активность и определение наиболее значимых структурных дескрипторов.

5. Изучение влияния системы доставки фотосенсибилизаторов на механизм клеточной гибели in vitro.

6. Определение локализации транспортера в опухоли иммуногистохимическим методом.

7. Тестирование системы направленной доставки лекарственных веществ в ядра опухолевых клеток с помощью векторных транспортеров in vitro и in vivo.

Научная новизна работы Впервые проведено 3D компьютерное моделирование (докинг) связывания низкомолекулярных гетероциклических соединений оригинального синтеза с ферментом полиаминоксидазой, определены 5 ключевых аминокислотных остатков фермента, необходимых для встраивания лигандов. Впервые данные об активации и/или ингибированию распада ПА получены в системе из гомогената печени крыс для соединений группы азакраун-эфиров, бактериопурпурина и комплексов меди с производными анилина. Влияние производных анилина, диоксаборенинопиридина, азафлуорена на аминоксидазную активность подтверждено экспериментами в системе из гомогената печени крыс. Впервые проведены количественные корреляции топологических индексов с цитотоксическим действием для производных диоксаборенинопиридина, азафлуорена, азакраун-эфиров, бактериопурпурина и анилина, показана важность индекса Балабана для данного типа активности. Впервые с помощью фотодинамической терапии in vitro и in vivo была протестирована система направленной доставки лекарств в ядра опухолевых клеток с помощью векторных транспортеров, показана ее эффективность.

Практическая значимость работы

Внедрена в практику экспериментальных исследований для скрининга и адаптирована под 96-луночный формат плашек модификация методики тестирования соединений на активность ди- и полиаминоксидазы в бесклеточной модельной системе из гомогената печени крыс со спектрофотометрической детекцией. Внедрен алгоритм проведения компьютерного докинга лигандов с ПАО дрожжей в программе Molegro Virtual Docker, по результатам которого построена модель бинарного классификационного дерева, позволяющая предсказывать свойства соединений как потенциальных активаторов и ингибиторов ПАО. Полученные результаты исследований 5 различных химических классов формируют базу данных для совершенствования программного обеспечения расчетов ККСА при компьютерном моделировании химических структур с антипролиферативной активностью. Разработанные инструкции к компьютерным программам ChemDescript и Virtual Docker внедрены как пособия в учебный процесс на медицинском факультете Российского университета дружбы народов. Выявлены новые синтетические вещества с выраженной противоопухолевой активностью, которые рекомендованы для дальнейших доклинических исследований в области онкологии. На примере фотодинамической терапии показана эффективность подхода к разработке систем направленной доставки лекарств с помощью векторных транспортеров, которая повышает эффективность консервативной терапии в десятки раз. Результаты работы используются в лекции «Обмен полиаминов как терапевтическая мишень» в курсе «Медицинской энзимологии» для студентов по специальности «Лечебное дело».

Основные положения, выносимые на защиту 1. Эффективность системы направленной доставки терапевтических молекул подтверждена in vivo вследствие снижения вдвое скорости роста опухолей у мышей после фотодинамической терапии с применением векторных транспортеров.

2. а-МСГ-содержащий транспортер преимущественно локализуется в ядрах клеток меланомы после внутривенного введения мышам.

3. Включение ФС в состав конъюгата с транспортером изменяет преимущественный процесс гибели клеток с некротического на апоптотический.

4. Потенциальными противоопухолевыми агентами могут быть соединения: В1, В8; 2; Х9; Х13; Х14; Х17.

5. Ключевыми аминокислотными остатками для связывания гетероциклических азотсодержащих соединений с ПАО дрожжей, служат: His67, Tyr450, Hisl91, Trp 174, Gly487.

Связь исследований с научной программой Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и № 2.1.1./ 11377 «Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как системы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)".

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на 17 международных конгрессах и конференциях: VIII международная конференция "Научная индустрия европейского континента" (Чехия, 2013); VIII международная конференция "Достижения высшей школы" (Болгария, 2013); XV международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, РУДН 2013); V Международная научная конференция Science4Health (Москва, РУДН 2013); 38-ой Международный конгресс Федерации европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, Россия, 2013); XX Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта-Гурзуф,

Украина, 2012); IV Международная научная конференция Science4Health 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, РУДН, Россия, 2012); Congress on polyamines. Polyamines: biological and clinical perspectives. Istanbul, 2012); XIV Всемирный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, РУДН, Россия, 2012); 12-ый Международный конгресс по аминокислотам и белкам (Бейджинг, Китай, 2011); 2-ая Международная конференция по роли полиаминов и их аналогов в раковых и других заболеваниях (Рим-Тиволи, Италия, 2010); Международная конференция по полиаминам (Готемба, Япония, 2010); XVIII Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, Украина, 2010); конференция медицинского факультета РУДН "Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, Россия, 2010); Международная научно-практическая конференция "Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы" (Москва, Россия, 2010); X Международный конгресс «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, Россия, 2009); VII Международная научно-практическая конференция «Новейшие достижения европейской науки» (Болгария, 2011). На IV Международной научной конференции Science4Health (Москва, РУДН 2012) награждена дипломом за 1 -е место.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 38 печатные работы: 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 учебно-методических пособия и 32 публикаций в материалах международных и российских конференций.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК для размещения

материалов диссертации: 1. Сяткин С. П., Березов Т. Т., Неборак К. В., Федорончук Т. В., Шевкун Н. А., Левов А.Н., Сокуев Р. И., Сокуева Н. А. Прогнозирование антипролиферативных свойств производных анилинового ряда и диоксаборининопиридина путем оценки их влияния на скорость

окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 10. -С. 53- 56.

2. Сяткин С.П., Шевкун H.A., Свинарев В.И. Полиамины в аутопсийных образцах некоторых структур лимбической и ретикулярной формации мозга у больных шизофренией. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - М., 2010. -№1 - С. 36-41.

3. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун H.A., Сокуева H.A., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов полиаминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость синтеза полиаминов в тест-системах из тканей с повышенной пролиферацией. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. -М., 2010.-№3-С. 9-14.

4. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун H.A., Сокуева H.A., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на рост L-клеток в культуре ткани. // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - М., 2010. - №4 - С. 26-31.

Материалы международных конференций

(приравниваются к опубликованным работам, отражающим основные научные результаты диссертации, согласно постановлению Правительства РФ № 475 от 20.06.11)

5. Шевкун H.A., Сяткин С.П., Демуров Е.А. Цитотоксическое действие модуляторов катаболизма полиаминов на клетки рака простаты. // Тезисы VIII международной конференции "Научная индустрия европейского континента" 2013, 27 ноября - 5декабря. - Чехия. - в печати.

6. Шевкун H.A., Сяткин С.П., Демуров Е.А. Фотодинамическая терапия меланомы у мышей с применением векторного транспортера и фотосенсибилизатора бактериохлоринового ряда. // Тезисы VIII

международной конференции "Достижения высшей школы" 2013, 17 ноября - 25 ноября. - Болгария. - в печати.

7. Шевкун Н.А., Варламов А.В., Сяткин С.П., Кутяков С.В. Применение компьютерных методов для дизайна противоопухолевых аналогов полиаминов. // Тезисы международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке" 2013, Москва. РУДН - 2013. - Т.2 - С.215-216.

8. Шевкун Н.А., Варламов А.В., Сяткин С.П., Кутяков С.В. Структурные особенности активации полиаминоксидазы производными анилина и азафлуорена. // Материалы V Международной конференции "Наука и здоровье" 2013, Москва. РУДН - С. 199.

9. Syatkin S, Shevkun N, Khlebnikov A. Structural aspects of Poly amine oxidase activation by azofluorene and aniline derivatives. FEBS Letters Supplement. 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology" 2013. - P. 214

10.Syatkin S., Neborak E., Shevkun N., Sokueva N., Sokuev R., Golomazova K., Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the amine oxidases in vitro as useful tools for prediction of their carcinogenic and antiproliferative properties. // Abstacts from the International Congress on Polyamines: biological and clinical perspectives. 2nd-7th September 2012, Istanbul, Turkey. - P. 221-223.

11.Syatkin S., Fedoronchuk Т., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Shevkun N.. Antitumor activity of activators of polyamine oxidative deamination during hepatocarcinogenesis. // Abstacts from the International Congress on Polyamines: biological and clinical perspectives. 2nd-7th September 2012, Istanbul, Turkey. -P. 225-226.

12.Shevkun N., Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Golomazova K, Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for the