Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:О влиянии пробукола на противоопухолевую эффективность цитостатических средств при гепатопатии (экспериментальное исследование)

КИНЗИРСКАЯ ЮА

О ВЛИЯНИИ ПРОБУКОЛА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

ПРИ ГЕПАТОПАТИИ (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.14 - онкология

Москва 2005

На правахрукоп иси

КИНЗИРСКАЯ ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

О ВЛИЯНИИ ПРОБУКОЛА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ПРИ ГЕПАТОПАТИИ

(экспериментальное исследование)

14.0025 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в ММА им. ИМ. Сеченова и РОЩ им. НН. Блохина РАМН

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Фисенко Владимир Петрович

заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Богуш Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Булаев Валерий Михайлович доктор медицинских наук, профессор Борисов Василий Иванович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «Ю » сиОЯ'А. 2005 г. в на за-

седании диссертационного совета Д 208.040.13 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49)

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Архипов Владимир Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы достигнут определенный прогресс в создании лекарственных препаратов, применяемых для лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем, эффективность противоопухолевых средств остается весьма незначительной, что обусловлено рядом причин, к числу которых относят различную степень чувствительности клеток первичной опухоли и метастазов к противоопухолевым препаратам, способность последних индуцировать или усиливать лекарственную резистентность, подавлять иммунитет, вызывать другие побочные эффекты (нарушение кроветворения, диспепсия, желудочно-кишечные кровотечения, изменения функции сердца, почек и печени), нарушающие специфическую активность применяемых фармакологических веществ (Miyamoto Y., Miyamoto M., 2004, Orditura M., Quaglia R, Morgillo F. et al, 2004, Jefford M., Michael M., Rosenthal M.A. et al., 2004) Так, антиметаболиты (Morimoto S., Shono Y., Tsuji T. et al., 2003), алкилирующие агенты (Gullbo J., Wallinder C, Tullberg M. et al., 2003), L-аспарагиназа могут инициировать перекисное окисление липидов в гепатоцитах и вызывать токсическую гепатопатию (William M., Lee M.D., 2003, Zhang Y-T et al., 2004, Giannini E.G. et al., 2005). Повреждения печени, обусловленные применением противоопухолевых средств, существенно ограничивают возможности химиотерапии опухолей. В связи с этим, актуальность создания и изучения лекарственных препаратов, с помощью которых были бы созданы условия для предотвращения и/или устранения гепа-тотоксического действия химиотерапевтических средств, очевидна.

Большинство исследователей как в Российской Федерации (Курлянд-ский Б.А., Филов В.А., 2002), так и за рубежом (Lee W.M., 2003, Rashid M., Goldin R., Wright M., 2004, Sigala R, Kostopanagiotou G., Andreadou I. et al., 2004) считают, что перекисное окисление липидов в печени, «запускаемое» противоопухолевыми веществами, является, по-видимому, основной причиной развития токсической гепатопатии. Это обстоятельство позволяет предположить наличие способности у антиоксидантов ослаблять индуцированные

противоопухолевыми средствами токсические повреждения печени, что должно способствовать повышению эффективности химиотерапии опухолей. Среди лекарственных препаратов этой группы значительный интерес вызывает пробукол. Синтетический антиоксидант пробукол, являясь классическим примером пространственно-затрудненных фенолов, относится к мембраноак-тивным антиоксидантам и обладает более выраженной ингибирующей активностью в отношении перекисного окисления липидов, чем эндогенные антиоксиданты. Низкая токсичность пробукола способствовала его широкому клиническому применению для профилактики атеросклероза у людей с гиперхолестеринемией (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., 2001).

Таким образом, изучение способности пробукола повышать терапевтическую эффективность противоопухолевых средств в условиях экспериментальной гепатопатии должно расширить арсенал лекарственных средств, используемых в онкологической практике.

Цель исследования: Изучение противоопухолевой эффективности ци-тостатиков у экспериментальных животных с токсическим поражением печени и разработка фармакотерапевтических подходов к повышению эффективности лекарственного метода лечения опухолей.

Задачи исследования:

1. Создать модель токсической гепатопатии у экспериментальных животных.

2. Определить противоопухолевую эффективность рубомицина, цикло-фосфана и ифосфамида у животных с нормальной и нарушенной функцией печени.

3. Изучить характер спонтанного метастазирования карциномы легких Льюис в условиях токсической гепатопатии.

4. Исследовать влияние пробукола на параметры противоопухолевой и антиметастатической эффективности рубомицина, циклофосфана и ифосфа-мида при экспериментальной гепатопатии.

5. Оценить влияние противоопухолевых препаратов и пробукола на отдельные показатели перекисного окисления липидов.

6. Выявить влияние рубомицина, циклофосфана, ифосфамида на активность монооксигеназ печени экспериментальных животных.

Научно-практическая значимость работы:

1. Разработана модель токсической гепатопатии у экспериментальных животных со спонтанно метастазирующей карциномой легких Льюис (Lewis Lung Carcinoma - LLC).

2. Установлено снижение эффективности изученных противоопухолевых средств при токсическом поражении печени.

3. У экспериментальных животных с токсической гепатопатией выявлено увеличение представительства числа метастазов карциномы легких Льюис на единицу площади среза поврежденного органа.

4. Показана возможность использования антиоксиданта пробукола для коррекции побочных эффектов и повышения эффективности противоопухолевых препаратов в условия токсической гепатопатии.

5. В сравнительном плане изучено влияние рубомицина, циклофосфана и ифосфамида при раздельном и совместном применении с пробуколом на ряд показателей перекисного окисления липидов и на состояние монооксигеназ печени экспериментальных животных.

Внедрение результатов работы в практику

Выполненные экспериментальные исследования являются основанием для клинической апробации включения антиоксиданта пробукола в схемы комбинированной лекарственной терапии злокачественных опухолей с использованием рубомицина, ифосфамида и циклофосфана с целью снижения риска развития нежелательных побочных реакций и повышения эффективности этих цитостатических средств.

Положения, выносимые на защиту:

1. Противоопухолевые препараты - циклофосфан, ифосфамид, рубомицин, цитотоксическая активность которых обеспечивается за счет образования активных метаболитов, в условиях токсического поражения печени теряют свою специфическую эффективность.

2. При токсическом поражении печени тетрахлорметаном у мышей С57ВУ6 с карциномой легких Льюис увеличивается вероятность развития в поврежденной печени микрометастазов.

3. Антиоксидант пробукол обладает свойствами модификатора биологических реакций, использование этого препарата в схемах комбинированной химиотерапии опухолей целесообразно для коррекции побочных эффектов и повышения эффективности противоопухолевых средств. Апробация работы.

Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на:

1. VI Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 16-19 апреля 2002 г.;

2. Заседании кафедры онкологии ММА им. И.М. Сеченова, РОНЦ им. ЕН.Блохина РАМН, Москва, 25 апреля 2003 г.;

3. Совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней, онкологии ММА им. И.М. Сеченова и Проблемной лаборатории по разработке, изучению, внедрению, производству и маркетингу лекарственных средств РАМН, 1 марта 2005 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 научных публикациях.

Личное участие автора в получении результатов. Автором разработана и апробирована модель токсической гепатопатии для проведения исследований по изучению противоопухолевой эффективности цитостатиков. Диссертантом также лично получены показатели противоопухолевой и антиметастатической эффективности рубомицина, ифосфамида и циклофосфана.

Соискателем изучены отдельные показатели перекисного окисления липидов у экспериментальных животных при воздействии противоопухолевых препаратов и пробукола и оценено влияние противоопухолевых препаратов (рубомицина, циклофосфана, ифосфамида) на состояние монооксиге-наз печени экспериментальных животных.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования и 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 174 наименования, из них 121 отечественных и 53 зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 19 таблицами, 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Животные. Эксперименты проводились на мышах линий С57В1/6 и BDF1, аутбредных мышах. Все экспериментальные животные содержались в условиях вивария РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Препараты. Рубомицин («ЛЭНС-Фарм»- Россия) - порошок лиофили-зированный для инъекций 20 мг (1 флакон), циклофосфан («ЛЭНС-Фарм»-Россия) - порошок лиофилизированный для инъекций 100 мг (1 флакон), ифосфамид (Верофарм - Россия) - сухое вещество для инфузий 1 г (1 флакон) и субстанция пробукола, предоставленную проф. Л.Д.Смирновым (ИБФ им. Н.М. Эмануэля РАН).

Модели и методы исследования. Противоопухолевое действие препаратов и их антиметастатические свойства оценивали в соответствии с требованиями, изложенными в "Методических рекомендациях по изучению специфической активности противоопухолевых препаратов, предлагаемых для испытания в клинике" (1986) и "Методических рекомендациях по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать про-

цесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей" (1992).

Противоопухолевую активность препаратов изучали на сингенной опухолевой системе из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.КБлохина РАМН - карциноме легкого Льюис.

Противоопухолевый эффект оценивали по показателям индекса торможения роста опухоли (Софьина З.П., Сыркин А.Б. и др., 1980).

Антиметастатическое действие препаратов изучали на модели спонтанного метастазирования солидной опухоли карциномы лёгких Льюис.

О выраженности метастатического процесса судили по таким показателям как:

1. Частота метастазирования опухоли - процент животных с метастазами по отношению к общему количеству животных в группе;

2. Степень поражения легких метастазами карциномы легких Льюис;

3. Среднее число метастазов карциномы легких Льюис на одно животное;

4. Масса легких, пораженных метастазами карциномы легких Льюис.

Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле:

ИИМ = (Ак х ВК)-(А X В) / А«х В х 100%, где:

А* и А - частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп соответственно; Вк и В - среднее число метастазов в легких на одно животное в контрольной и опытной группах соответственно.

Количество метастазов в легких подсчитывали после фиксации их в растворе Боуэна (время экспозиции не менее 24 часов) с помощью бинокулярной лупы МБС-9 (увеличение 8x2).

Аутопсийный материал подвергался морфологическому изучению по общепринятой методике (Меркулов ГА, 1961).

Подсчет числа метастазов на 1 мм2 площади среза печени проводили планиметрическим методом (Автандилов Г.Г., 1990).

Модель токсической гепатопатии вызывали введением 2,5% масляного раствора тетрахлорметана (х.ч. "Реахим") мышам-самцам с массой тела 20-30 г в объеме 0,2 мл внутрижелудочно 2 раза в неделю в течение 2-х недель. Опухолевую ткань карциномы легких Льюис трансплантировали животным внутримышечно в ткани бедра левой задней лапы через 24 часа после второго введения тетрахлорметана. После трансплантации опухолевой ткани карциномы легких Льюис двукратно в течение недели вводили тетрахлорметан.

Суммарные липиды и общие фосфолипиды определяли в гомогенате печени экспериментальных животных по методу Фолча (Кейтс М., 1975).

Количественное определение липидных фракций осуществляли спек-трофотометрическим методом на «Спиколе-221».

Определение активности каталазы проводили по методу МАКоролюк с соавт. (1998).

Определение содержания малонового диальдегида выполняли по методу Конюховой С.Г. с соавт. (1989).

Определение содержания железа, индуцированного МДА по методу Конюховой С.Г. с соавт. (1989).

Антиоксидантную активность оценивали по вычислению расчетного показателя, представляющего собой разницу между показателями Fe-МДА и МДА у экспериментальных животных, позволяющего косвенно судить о состоянии антиоксидантной системы.

Для изучения влияния противоопухолевых препаратов на активность монооксигеназ печени мышей использован метод определения продолжительности сна, вызванного этаминалом-натрием (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

Статистическая обработка результатов. Все полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стью-дента считая достоверными различия с уровнем вероятности не ниже 95% (Лоллард Д., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Схема экспериментов по отработке модели токсической гепатопатии пред-

ставлена в таблице 1. Продолжительность опыта составила 24 дня.

Таблица 1. Схема экспериментов по моделированию токсической гепато-_патии у мышей самцов линии С57В1/6_

Экспериментальные группы Условное Обозначение Схема моделирования

I - интактный контроль (ИК)

П - токсическая гепато-патия (ТТЛ) 0,2 мл 2,5% масляный р-р тетрахлорметана внутриже-лудочно 2 раза в неделю в течение 2-х недель

Ш - карцинома легких Льюис (LLC) 1x106 клеток LLC внутримышечно

IV - карцинома легких Льюис + токсическая ге-патопатия (LLC+ТГП) Р-р тетрахлорметана так же, как и во II группе, 1x106 клеток LLC внутримышечно, через 24 часа после второго введения тетрахлорме-тана.

Биохимические исследования, выполненные на модели токсического

поражения печени тетрахлорметаном, позволили выявить значительные нарушения обмена липидов. В гомогенате печени наблюдали снижение содержания свободного холестерина (СХС) и увеличение - эфиров холестерина (ЭХС), что приводило к возрастанию коэффициента эстерификации в 2,6 раза у животных П группы и в 1,6 раз - у животных IV группы, по сравнению с контролем (I группа). Сама опухоль карциномы легких Льюис (Ш группа) не оказывала существенного влияния на содержание общего и свободного холестерина, а также эфиров холестерина в печени мышей линии С57В1/6.

Состав основных жирных кислот суммарной фракции липидов печени представлен четырьмя доминирующими кислотами - пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и арахидоновой. При определении содержания отдельных кислот отмечалось снижение уровня ненасыщенных кислот (олеиновой и

арахидоновой) во П, Ш и IV группах на фоне нарастания количества насыщенных жирных кислот (табл. 2).

Таблица 2. Жирнокислотный состав липидов печени мышей, получавших тетрахлорметан (% от суммы жирных кислот)

Примечание: *- Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001

Учитывая, что основным компонентом мембран являются фосфолипи-ды, нами проведены исследования фосфолипидного состава гомогената печени, которые позволили показать уменьшение относительного содержания фосфатидилхолина у мышей П и IV групп, по сравнению с контролем, и одновременное повышение уровня фосфатидилэтаноламина в печени животных с трансплантированной опухолью, получивших тетрахлорметан (IV группа). Во всех группах животных с токсической гепатопатией отмечалось накопление лизоформ фосфолипидов и фосфатидной кислоты (табл. 3).

Таблица 3. Фосфолипидный состав печени мышей после воздействия тет-_рахлорметаном (в % от общего количества фосфолипидов)_

Показатели

Группы животных

1-ИК 11-ТГП Ш-ЬЬС IV-LLC+ТГП

Фосфатидилсерин 3,5±0,4 3,3+0,8 3,2±0,4 2,5±0,3

Сфингомиелин 5,9±0,8 6,6±0,4 8,3±0,9 8,8±1,5

Фосфатидилхолин 45,9±0,9 36,2± 1,5*** 43,6±1,5 35,8±2,9***

Фосфатидилинозит 11,3±1,0 11,0±0,8 9,8±0,9 10,0±1,8

Фосфатидил- 25,7±1,0 28,2±1,0 26,7±1,0 31,7±0,4***

этаноламин

Лизофосфатидил- 6Д±0,7 8,7±0,6** 5,6±0,4 7,9±1,6

этаноламин

Фосфатидная ки- 1,6±0,2 6,0± 1,4*** 3,2±0,4*** ЗД±1,0*

Примечание: •- Р<0,05; ** - Р<0,01; *•* - Р<0,001

При гистологическом исследовании серийных срезов печени мышей линии С57В1/6, получивших тетрахлорметан, наблюдали увеличение просвета синусоидов, портальных капилляров. В гепатоцитах чаще обнаруживали яв-

ления жировой, чем белковой дистрофии, зоны некротически измененных клеток. Нередко встречались двудцерные гепатоциты, в строме появлялись лимфогистиоцитарные, гранулоцитарные инфильтраты.

Таким образом, введение тетрахлорметана мышам линии ^^/6 приводило к развитию токсической гепатопатии, которая проявлялась жировой дистрофией и нарушением образования липидов. Данная модель использовалась нами в последующих исследованиях для оценки модифицирующего влияния экспериментальной патологии печени на характер спонтанного ме-тастазирования карциномы легких Льюис и изучения эффективности ряда противоопухолевых препаратов при раздельном и совместном применении последних и антиоксиданта пробукола.

Рубомицин вводили в дозе 4 мг/кг внутрибрюшинно, начиная с 6-го дня после перевивки опухоли, 4 раза через день. Циклофосфан применяли в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно, начиная с 6-го дня после перевивки ткани карциномы легких Льюис, в течение 5 дней. Ифосфамид вводили в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно 2-х-кратно с перерывом в 4 дня, начиная с 6-го дня после имплантации опухолевой ткани. При совместном применении противоопухолевых препаратов и пробукола последний вводили в дозе 50 мг/кг внутриже-лудочно, начиная с 6-го дня после имплантации опухолевых клеток в течение 16 дней.

Необходимо отметить, что в условиях токсического поражения печени темпы роста первичной опухоли карциномы легких Льюис во всех трех сериях экспериментов снижены на 15 - 30%.

Число легочных колоний в условиях токсического поражения печени в двух сериях опытов (с циклофосфаном и рубомицином) практически не отличалось от таковых в контрольных группах, лишь в эксперименте с ифос-фамидом среднее число метастазов в легких было недостоверно (Р>0,05) снижено на 42%. Наиболее четкая закономерность в интенсивности процесса спонтанного метастазирования карциномы легких Льюис выявляется при определении среднего числа метастазов в печени экспериментальных живот-

ных. В условиях токсического поражения печени во всех экспериментальных группах прослеживается тенденция к усилению процесса метастазирования карциномы легких Льюис, проявляющаяся увеличением на 10% числа метастазов на единицу площади среза поврежденного органа Степень выраженности противоопухолевого эффекта в отношении ограничения роста первичной опухоли карциномы легких Льюис у исследованных препаратов в условиях токсического поражения печени была различна (Рис 1).

В условиях токсического поражения печени противоопухолевая эффек-

Рис. 1. Индекс торможения роста (ИТР) первичного опухолевого у зла карциномы легких Льюис при воздействии рубомицина, циклофосфана, ифосфамида при раздельном и сочетанном применении с пробуколом

ИТР%

РБ ССТ4+РБ ССМ+ПР+РБ ЦФ СС14+ЦФ СС14+ПР+ЦФ ИФ СС14+ИФ СС14+ПР+ИФ

тивность рубомицина снижается незначительно (на 9%). Противоопухолевая эффективность циклофосфана в отношении ограничения роста первичной опухоли в условиях токсической гепатопатии практически не проявляется. Индекс торможения роста опухоли при воздействии ифосфамидом снижается на 32%. Во всех опытных группах животных с токсической гепатопатией при сочетанном применении противоопухолевых препаратов с пробуколом зна-

чения индекса торможения роста первичного опухолевого узла становятся значительно выше, чем в группе животных не получавших пробукол

Анализ количества легочных колоний при воздействии изученных противоопухолевых препаратов показал, что в условиях токсической гепатопа-тии показатели их антиметастатической эффективности также снижаются (Рис 2) В большей степени это касалось циклофосфана, индекс ингибирова-

Рис 2 Показатели индекса ингибирования метастазирования (ИИМ) LLC при воздействии рубомицина, циклофосфана, ифосфамида при сочетанном и иим% раздельном применении с пробуколом

РБ ССИ+РБ СС14+ПР+РБ ЦФ ССИ+ЦФ СС14+ПР+ЦФ ИФ СС14+ИФ ССИЧПР+ИФ

ния метастазирования снижался на 42,8%, у рубомицина на 35,3% и у ифос-фамида на 32,8%

При совместном применении рубомицина и циклофосфана с пробуколом у животных с токсической гепатопатией, показатели индекса ингибирования местазирования превосходили аналогичные показатели при введении противоопухолевых препаратов животным без токсического поражения печени При совместном применении с пробуколом антиметастатический эффект ифосфамида увеличивается на 35%.

При анализе степени поражения метастазами карциномы легких Льюис поврежденной печени животных, получавших противоопухолевые препараты раздельно и совместно с пробуколом, нами установлено, что во всех случаях на фоне применения пробукола среднее число метастазов на 1 мм2 площади среза печени было снижено от 20% (циклофосфан) до 62% (рубомицин) (Рис. 3).

Рис. 3. Среднее число метастазов карциномы легких Льюис

в печени при совместном и раздельном применении цитостатиков с пробуколом в условиях токсической гепатопатии

Кол-во Mts

РБ ПР+РБ ЦФ ПР+ЦФ ИФ ПР+ИФ

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в условиях токсической гепатопатии снижаются показатели противоопухолевой и антиметастатической эффективности изученных препаратов Для интегральной количественной оценки степени снижения специфической фармакологической эффективности противоопухолевых средств нами предложен коэффициент КСТЭ (коэффициент снижения терапевтической эффективности), который рассчитывается по формуле:

КСТЭ = (ИИ01[)-(ИИ01) /ИИО, х 100%,где.

- индекс ингибирования роста опухолевой ткани цитостатиками у животных без токсического поражения печени (масса первичного опухолевого узла, масса метастазов в легких и печени); ИИОТ - индекс ингибирования

роста опухолевой ткани цитостатиками в условиях токсической гепатопатии. Показатели снижения в процентах эффективности изучаемых противоопухолевых препаратов в условиях токсического поражения печени представлены на рис. 4. По степени снижения противоопухолевой эффективности при токсическом повреждении печени изученные препараты можно распределить в следующем порядке: рубомицин -»ифосфамид—ЩИКЛофосфан.

Рис. 4. Снижение противоопухолевой эффективности рубомицина, циклофосфана, ифосфамида в условиях токсической гепатопатии

РБ ИФ ЦФ

При сочетанном применении этих препаратов с пробуколом в условиях токсического поражения печени, отдельные показатели противоопухолевой активности (Рис. 1-3) могут превышать аналогичные показатели для групп животных без токсического поражения печени.

В основе механизма реализации гепатотоксического действия тетра-хлорметана и самих противоопухолевых препаратов лежит их способность активировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) в гепатоцитах. В своих исследованиях нами использовались три противоопухолевых препарата - ру-бомицин, циклофосфан и ифосфамид, обладающие различным уровнем индукции ПОЛ в печени. Модификация фармакологической активности изученных препаратов в условиях токсической гепатопатии у мышей с карциномой легких Льюис, вероятно, обусловлена суммацией токсического эффекта тетрахлорметана и вводимого противоопухолевого препарата, что, в свою

очередь, приводило к ингибированию образования активных метаболитов изучаемых веществ, ответственных за проявление антибластомной активности. Для подтверждения этого предположения были изучены отдельные показатели ПОЛ при комбинированном и раздельном применении противоопухолевых препаратов с пробуколом. В условиях данного эксперимента у животных не индуцировали токсическую гепатопатию тетрахлорметаном и не производили перевивку ткани карциномы легких Льюис.

Исследование было выполнено на 46 аутбредных мышах самцах массой 20-25 г. Животным опытных групп противоопухолевые препараты вводили по схемам, описанным выше. Интактной контрольной группе животных (п=10) препараты не вводились. Животных контрольной и опытных групп (п=6) забивали на 8 сутки эксперимента. Результаты изучения отдельных показателей ПОЛ в экстракте печени подопытных животных сведены в табл. 4. Таблица 4. Показатели ПОЛ в экстракте печени при введении противоопухо-

левых препаратов и пробукола

Экспериментальные группы Показатель

МДА, мкМ Ре-МДА, мкМ АОА,мкМ

I - интактный контроль 10,83+1,43 19,03±1,15 8,45±0,61

П - циклофосфан 16,32+1,27 Ро<0,05 28,27+1ДЗ Ро<0,001 11,27±0,89 Ро<0,05

Ш - циклофосфан, пробукол 12,77+1,32 21,75+2,05 р<0,02 8,73±1,49

IV - ифосфамид 15,5±1,2 Ро<0,05 28,44±0,85 Ро<0,001 12,44±0,56 Ро<0,001

V - ифосфамид, пробукол 10,79±1,85 р<0,05 22,99±1,37 Ро<0,05 р<0,01 10,6+0,73 Ро<0,05

VI -рубомицин 13,46±1,21 25,76±0,97 Ро<0,001 11,8910,69 Ро<0,01

VII - рубомицин, пробукол 11,38±1,53 23,51±1,11 Ро<0,001 11,9110,82 Ро<0,01

Примечание: ро -достоверность различий по отношению к данным интакт-ных животных; р - по отношению к данным опытной группы, получавшей противоопухолевый препарат.

Как видно из представленной таблицы, у животных опытных групп, получавших цитостатики, увеличивается содержание малонового диальдегида и Ре-МДА в экстракте печени. Максимальное значение этого увеличения для МДА составило - 51,1%, Ре-МДА - 48,5% при воздействии циклофосфаном. При введении ифосфамида регистрируемые показатели достоверно отличались от аналогичных в контрольной группе, но в абсолютном значении были менее выражены, чем в группе с циклофосфаном. В группе с рубомицином содержание МДА и Ре-МДА практически не отличалось от контрольной. Повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов в экстрактах печени экспериментальных животных, получавших противоопухолевые препараты, свидетельствует об интенсивности ПОЛ на фоне применения ци-тостатиков и повышения функциональной активности других компонентов антиоксидантной системы (АОС).

При совместном применении противоопухолевых препаратов с пробуко-лом (Ш, V, VII группы) содержание МДА в экстракте печени экспериментальных животных соответствовало уровню МДА в печени интактных животных. Тем не менее, значения Ре-МДА в экстракте печени животных опытных группах оставались на высокомуровне.

Нами проводилось определение содержания МДА и Ре-МДА в крови (в плазме и эритроцитах) экспериментальных животных. Результаты изучения отдельных показателей ПОЛ в плазме крови подопытных животных приведены в табл. 5.

Из представленной таблицы видно, что у животных опытных групп, получавших цитостатики, регистрируется увеличение содержания малонового диальдегида в плазме крови, но достоверно значимые различия регистрировались только при применении циклофосфана. Максимальное значение этого увеличения для МДА составило 39%. При введении ифосфамида регистрируемые показатели достоверно отличались от тех, которые получены на животных контрольной группы, но в абсолютном значении были менее выражены, чем при введении циклофосфана.

Таблица 5. Показатели ПОЛ в плазме крови экспериментальных животных _после введении противоопухолевых препаратов и пробукола_

Экспериментальные группы

Показатель

МДА,мкМ

Fe-МДА, мкМ

АОА, мкМ

I - интактный контроль

3,09+0,49

14,83+0,4

10,4510,61

II- циклофосфан

4,32+0,37 р<0,05

15,27+0,38

11,27+0,48

III - циклофосфан, про-букол

3,77+0,32

14,75+0,55

9,73+0,49

IV - ифосфамид

3,95+О,61

14,44+0,85

12,4410,56

V - ифосфамид, пробу-

3,49+0,85

14,99+0,37

10,7110,73

VI -рубомицин

3,29+0,65

13,69+0,48

9,64Ю,61

VII - рубомицин, пробу-

3,19+0,53

13,18+0,42

9,14+0,54

Применение ифосфамида и рубомицина не сопровождалось изменениями содержания МДА и Fe-МДА. Повышение концентрации продуктов ПОЛ в плазме крови экспериментальных животных, получавших циклофосфан, свидетельствует о значительном усилении процессов ПОЛ именно при воздействии этого противоопухолевого средства, по сравнению с ифосфамидом и рубомицином. При совместном применении противоопухолевых препаратов с пробуколом (III, V, VII группы) содержание МДА и Fe-МДА в плазме крови экспериментальных животных соответствовало уровню этих показателей у интактных животных.

При определении МДА и Fe-МДА в эритроцитах нам не удалось выявить существенных различий в содержании МДА и Fe-МДА у животных контрольной и опытных групп.

Изучение активности каталазы в печени, плазме и эритроцитах экспериментальных животных позволило выявить снижение активности этого фермента в печени и плазме крови, но статистически значимые различия установлены только для плазмы крови.

Одной из особенностей противоопухолевых препаратов является способность большинства из них ингибировать монооксигеназы печени (Buck M.L., 1997, Meyer J.M., Rodnold KA, 1996), которые играют важную роль в реализации гепатотоксического действия противоопухолевых средств.

Для оценки влияния изучаемых противоопухолевых препаратов на активность монооксигеназ печени у мышей использован метод определения продолжительности этаминал натриевого сна (ЭНС), который служит интегральным показателем активности этой ферментной системы. С этой целью нами в экспериментах на аутбредных мышах регистрировалась продолжительность ЭНС (доза этаминала натрия 40 мг/кг, внутрибрюшинно) на фоне применения трех противоопухолевых препаратов по схеме и в дозах, применяемых нами (табл.6).

Табл. 6. Схема экспериментов по определению продолжительности этаминал

натриевого сна у мыш Экспериментальные группы ей, получавши Кол-во животных в группе х противоопухолевые препараты Схема введения препаратов

I - интактный контроль 6 Этаминал натрия 40 мг/кг внутри-брюшинно на 3 и 7 сутки.

П-рубомицин (РБ) 6 Рубомицин 4 мг/кг внутрибрюшин-но, 4-х-кратно через день. Этаминал натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно на 3 и 7 сутки.

III - циклофосфан (ЦФ) 6 Циклофосфан 20 мг/кг ежедневно в течение 5 дней. Этаминал натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно на 3 и 7 сутки.

IV - ифосфамид (ИФ) 6 Ифосфамид 100 мг/кг 2-х-кратно через 4 дня. Этаминал натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно на 3 и 7 сутки.

При внутрибрюшинном введении рубомицина в дозе 4 мг/кг продолжи-

тельность этаминал натриевого сна на 3 сутки эксперимента (после 2-х-кратного применения) увеличивалась на 12,9% по сравнению с контролем. На 7 сутки опыта продолжительность этаминал натриевого сна у животных II гр. возросла до 23%, но эти показатели не были статистически достоверны.

Следует отметить, что гипнотический эффект этаминала натрия в опытной группе на 7 сутки наблюдался в 100% случаев, а в контроле в 50% (табл.8).

У животных, получавших ифосфамид, на 3 сутки эксперимента (через 48 часов после однократного введения ифосфамида в дозе 100 мг/кг) этаминал натриевый сон наблюдался у всех животных, но выраженность его статистически недостоверна. Достоверная значимость регистрировалась на 7 сутки эксперимента (через 72 часа после 2-го введения ифосфамида) и была в достаточной степени выражена, продолжительность этаминал натриевого сна увеличилась почти в 2,5 раза (табл.8).

У мышей Ш опытной группы, которые получали циклофосфан, наркотический эффект этаминала натрия регистрировался в 100% случаев и во все сроки наблюдения. На 3 сутки эксперимента после 3-х-кратного внутрибрю-шинного введения циклофосфана в дозе 20 мг/кг, продолжительность этами-нал натриевого сна увеличивалась на 32%.

Таблица 8. Влияние противоопухолевых препаратов на продолжитель-

ность этаминал натриевого сна

Сроки наблюдения (сутки) Продолжительность сна (мин) (% эффекта) Отношение опыт/кон- % увеличения продолжительности ЭНС

Опыт Контроль троль)

РУБОМШ1 №

3 2б,4±3,4 (83,3) 23,4±3,0 (83,3) 1,12 12,8

7 30,1±2,2 (100) 24,3±6,6 (50) 1,23 23,8

ИФОСФАМИД

3 29,8±2,8 (100) 23,4±3,0 (83,3) 1,27 27,3

7 57,3+9,4** (100) 24,3+6,6 (50) 2,35 135,8

ЦИКЛОФОСФАН

3 30,9±4,7 (100) 23,4±3,0 (83,3) 1,32 32,0

7 24,б±3,9 (100) 24,3±6,б (50) 1,01 1,2

Примечание: **- при значении р<0,02;

После 2-х-дневного восстановительного периода (на 7 сутки эксперимента), продолжительность этаминал натриевого сна практически не отличалась от контроля.

На основании полученных данных можно предположить наличие способности у изученных противоопухолевых препаратов ингибировать моноокси-геназы печени. Регистрируемый нами гипнотический эффект этаминала натрия на фоне вводимых цитостатиков отмечали в 100% случаев.

Результаты исследований свидетельствуют о сопряженности двух процессов, протекающих в гепатоцитах при воздействии противоопухолевых препаратов: активации ПОЛ и ингибировании микросомных ферментов. Эти дополнительные факторы также снижают уровень метаболических превращений цитостатиков с образованием активных метаболитов в печени, что в конечном итоге приводит к потере их терапевтической эффективности. Использование антиоксиданта пробукола совместно с цитостатиками, с целью коррекции индуцированных токсических гепатопатий, повышает эффективность химиотерапевтического метода лечения опухолей. Выводы:

1. Показателями, характеризующими степень токсического поражения печени, вызванного тетрахлорметаном, могут служить уровни содержания свободного холестерина, насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, лизоформ фосфолипидов и фосфатидной кислоты в гомогенате печени экспериментальных животных.

2. У рубомицина, ифосфамида, циклофосфана снижаются показатели индекса ингибирования роста первичной опухоли в условиях токсической гепатопатий от 10 до 30% соответственно.

3. Показатели антиметастатической эффективности рубомицина, ифосфа-мида, циклофосфана в отношении легочных метастазов при токсической гепатопатий снижаются на 30-45%.

4. В условиях токсической гепатопатии увеличивается представительство числа метастазов в печень карциномы легких Льюис на единицу площади среза поврежденного органа.

5. Рубомицин, ифосфамид, циклофосфан повышают содержание продуктов перекисного окисления липидов в экстракте печени экспериментальных животных и обладают способностью ингибировать монооксигеназы печени.

6. При совместном применении рубомицина, ифосфамида и циклофосфана с пробуколом у животных при токсической гепатопатии, по ряду показателей противоопухолевой эффективности изученные препараты превосходили аналогичные показатели, регистрируемые при раздельном введении цитостатических средств животным без токсического поражения печени.

7. Выполненные исследования показали целесообразность фармакологической коррекции гепатопатии антиоксидантом пробуколом при проведении химиотерапии неопластических процессов и повышения терапевтической эффективности данного метода лечения.

Практические рекомендации Результаты работы позволяют рекомендовать изучение функционального состояния печени при планировании и проведении химиотерапии злокачественных опухолей с использованием рубомицина, ифосфамида и циклофос-фана. Обоснована целесообразность использования антиоксиданта пробукола с целью защиты организма от метастазирования злокачественных опухолей и повышения терапевтической эффективности изученных противоопухолевых средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Волкова О.В., Кинзирская Ю.А. Применение пробукола в качестве средства для "снятия" побочных эффектов при химиотерапии опухолей в экспериментальной онкологии. // VI Межд.конф. "Биоантиоксидант"Тез. докл. -Москва. - 2002. - С.265-267.

2. Кинзирская Ю.А, Богуш Т.А., Остапчук Н.В., Фисенко В П. Гепатотокси-ческое действие лекарственных препаратов некоторых фармакологических групп. // Клиническая медицина. - 2003. - №10. - С.11-15.

3. Кинзирская Ю.А. Изучение эффективности химиотерапии злокачественных опухолей при экспериментальной гепатопатии. // Анналы ФПНПК. -2003.-Т.У.-С.24.

4. Кинзирская Ю.А. Фармакотерапевтические подходы к повышению эффективности химиотерапии злокачественных опухолей в условиях токсической гепатопатии. // Анналы ФПНПК. - 2004. - т.УШ. - С.66-67.

15 ВТ 2X5

Актуальность темы. В последние годы достигнут определенный прогресс в создании лекарственных препаратов, применяемых для лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем, эффективность противоопухолевых средств остается весьма незначительной, что обусловлено рядом причин, к числу которых относят различную степень чувствительности клеток первичной опухоли и метастазов к противоопухолевым препаратам, способность последних индуцировать или усиливать лекарственную резистентность, подавлять иммунитет, вызывать другие побочные эффекты (нарушение кроветворения, диспепсия, желудочно-кишечные кровотечения, изменения функции сердца, почек и печени), нарушающие специфическую активность применяемых фармакологических веществ (Miyamoto Y., Miyamoto М., 2004, Orditura М., Quaglia F., Morgillo F. et al., 2004, Jefford M., Michael M., Rosenthal M.A. et al., 2004). Так, антиметаболиты (Morimoto S., Shono Y., Tsuji T. et al., 2003), алкилирующие агенты (Gullbo J., Wallinder C., Tullberg M. et al., 2003), L-аспарагиназа могут инициировать перекисное окисление липидов в гепатоцитах и вызывать токсическую гепатопатию (William М., Lee M.D., 2003, Zhang Y.T. et al., 2004, Giannini E.G. et al., 2005). Повреждения печени, обусловленные применением противоопухолевых средств, существенно ограничивают возможности химиотерапии опухолей. В связи с этим, актуальность создания и изучения лекарственных препаратов, с помощью которых были бы созданы условия для предотвращения и/или устранения гепатотоксического действия химиотерапевтических средств, очевидна.

Большинство исследователей как в Российской Федерации (Курлянд-ский Б.А., Филов В.А., 2002), так и за рубежом (Lee W.M., 2003, Rashid М., Goldin R., Wright M., 2004, Sigala F., Kostopanagiotou G., Andreadou I. et al., 2004) считают, что перекисное окисление липидов в печени, «запускаемое» противоопухолевыми веществами, является, по-видимому, основной причиной развития токсической гепатопатии. Это обстоятельство позволяет предположить наличие способности у антиоксидантов ослаблять индуцированные противоопухолевыми средствами токсические повреждения печени, что должно способствовать повышению эффективности химиотерапии опухолей. Среди лекарственных препаратов этой группы значительный интерес вызывает пробукол. Синтетический антиоксидант пробукол, являясь классическим примером пространственно-затрудненных фенолов, относится к мембраноактивным антиоксидантам и обладает более выраженной ингибирующей активностью в отношении перекисного окисления липидов, чем эндогенные антиоксиданты. Низкая токсичность пробукола способствовала его широкому клиническому применению для профилактики атеросклероза у людей с гиперхолестеринемией (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б., 2001).

Таким образом, изучение способности пробукола повышать терапевтическую эффективность противоопухолевых средств в условиях экспериментальной гепатопатии должно расширить арсенал лекарственных средств, используемых в онкологической практике.

Цель исследования: Изучение противоопухолевой эффективности цитостатиков у экспериментальных животных с токсическим поражением печени и разработка фармакотерапевтических подходов к повышению эффективности лекарственного метода лечения опухолей.

Задачи исследования:

1. Создать модель токсической гепатопатии у экспериментальных животных.

2. Определить противоопухолевую эффективность рубомицина, цик-лофосфана и ифосфамида у животных с нормальной и нарушенной функцией печени.

3. Изучить характер спонтанного метастазирования карциномы легких Льюис в условиях токсической гепатопатии.

4. Исследовать влияние пробукола на параметры противоопухолевой и антиметастатической эффективности рубомицина, циклофосфана и ифосфамида при экспериментальной гепатопатии.

5. Оценить влияние противоопухолевых препаратов и пробукола на отдельные показатели перекисного окисления липидов.

6. Выявить влияние рубомицина, циклофосфана, ифосфамида на активность монооксигеназ печени экспериментальных животных.

Научно-практическая значимость работы:

1. Разработана модель токсической гепатопатии у экспериментальных животных со спонтанно метастазирующёй карциномой легких Льюис (Lewis Lung Carcinoma - LLC).

2. Установлено снижение эффективности изученных противоопухолевых средств при токсическом поражении печени.

3. У экспериментальных животных с токсической гепатопатией выявлено увеличение представительства числа метастазов карциномы легких Льюис на единицу площади среза поврежденного органа.

4. Показана возможность использования антиоксиданта пробукола для коррекции побочных эффектов и повышения эффективности противоопухолевых препаратов в условиях токсической гепатопатии.

5. В сравнительном плане изучено влияние рубомицина, циклофосфана и ифосфамида при раздельном и совместном применении с пробуколом на ряд показателей перекисного окисления липидов и на состояние монооксигеназ печени экспериментальных животных.

Внедрение результатов работы в практику

Выполненные экспериментальные исследования являются основанием для клинической апробации включения антиоксиданта пробукола в схемы комбинированной лекарственной терапии злокачественных опухолей с использованием рубомицина, ифосфамида и циклофосфана с целью снижения риска развития нежелательных побочных реакций и повышения эффективности этих цитостатических средств. Положения, выносимые на защиту:

1. Противоопухолевые препараты - циклофосфан, ифосфамид, рубоми-цин, цитотоксическая активность которых обеспечивается за счет образования активных метаболитов, в условиях токсического поражения печени теряют свою специфическую эффективность.

2. При токсическом поражении печени тетрахлорметаном у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюис увеличивается вероятность развития в поврежденной печени микрометастазов.

3. Антиоксидант пробу кол обладает свойствами модификатора биологических реакций, использование этого препарата в схемах комбинированной химиотерапии опухолей целесообразно для коррекции побочных эффектов и повышения эффективности противоопухолевых средств. Апробация работы.

Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на:

1. VI Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 16-19 апреля 2002;

2. Заседании кафедры онкологии ММА им. И.М. Сеченова, РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, 25 апреля 2003;

3. Совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней, онкологии ММА им. И.М.Сеченова и Проблемной лаборатории по разработке, изучению, внедрению, производству и маркетингу лекарственных средств РАМН, 1 марта 2005 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 научных публикациях.

Личное участие автора в получении результатов. Автором разработана и апробирована модель токсической гепатопатии для проведения исследований по изучению противоопухолевой эффективности цитостати-ков. Диссертантом также лично получены показатели противоопухолевой и антиметастатической эффективности рубомицина, ифосфамида и цикло-фосфана.

Соискателем изучены отдельные показатели перекисного окисления липидов у экспериментальных животных при воздействии противоопухолевых препаратов и пробукола и оценено влияние противоопухолевых препаратов (рубомицина, циклофосфана, ифосфамида) на состояние моно-оксигеназ печени экспериментальных животных.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования и 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 174 наименования, из них 121 отечественных и 53 зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 19 таблицами, 23 рисунками.

Результаты работы позволяют рекомендовать изучение функционального состояния печени при планировании и проведении химиотерапии злокачественных опухолей с использованием рубомицина, ифосфамида и циклофосфана. Обоснована целесообразность использования антиоксиданта пробукола с целью защиты организма от метастазирования злокачественных опухолей и повышения терапевтической эффективности изученных противоопухолевых средств.

Практические рекомендации