Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта

На правах рукописи

о 5.

Панкратов Андрей Александрович

Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта (экспериментальное исследование).

14.00.14-онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. ПАГерцена МЗ России (директор - академик РАМН, профессор В.И.Чиссов)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Р.И.Якубовская доктор биологических наук Л.М.Михайлова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И.Борисов доктор медицинских наук А.М.Козлов

Ведущая организация: '

Российский Научный Центр рентгенорадиологии МЗ РФ.

Защита состоится 24 мая 2002 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при МНИОИ им. П.А.Герцена

по адресу: 125284, г. Москва, 2-ой Боткинский проезд, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИОИ им. ПАГерцена

Автореферат разослан 19 апреля 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор ИАМаксимов

Сокращения и условные обозначения, используемые в тексте.

Ак - аскорбиновая кислота АФК - активные формы кислорода Блм - блеомицин

БКТ - бинарная каталитическая терапия

БКС - бинарная каталитическая система

ВТД - высокая токсическая доза

ВНТД - высокая нетоксическая доза

в/б - внутрибрюшинно

в/в - внутривенно

в/м - внутримышечно

ДДП - цисплатин

Др - доксорубицин

Ипк - ипрокол

Мк - металлокомплекс

НТД - низкая токсическая доза

Ок- оксикобаламин

Ок-лио - оксикобаламин-лио

п/к - подкожно

СР - свободные радикалы

ТРО - торможение роста опухоли

ТВ - терапевтический выигрыш

Тф - терафтал

УПЖ - увеличение продолжительности жизни ФУ - 5-фторурацил ЦФ - циклофосфан

Актуальность проблемы. Одним из ведущих методов в комплексном лечении злокачественных новообразований является химиотерапия. Новая стратегия в лекарственной терапии опухолей предполагает использование оригинальных, нетрадиционных подходов.

В последние годы в терапии злокачественных опухолей интенсивно развивается новое направление, получившее название «бинарная каталитическая терапия». Этот метод противоопухолевой терапии основан на образовании в клетке-мишени высоко реакционноспособных активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов различной химической структуры (CP) при взаимодействии двух химических соединений, одно из которых является катализатором, а другое субстратом окисления и восстановителем.

В России с конца восьмидесятых годов в ИНЭОС РАН и ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» проводятся исследования каталитических свойств широкого круга комплексов переходных металлов (Со, Fe, Мп и др.) в реакциях окисления природных восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиолов и др.). Эти исследования позволили выявить ряя комплексов кобальта с макроциклическими и хелатирующими лигандами и комплексов органокобальта с тридентантными основаниями Шиффа, которые эффективно ка тализировали окисление различных биогенных восстановителей и, в частности, ас корбиновой кислоты с образованием АФК и CP [Вольпин М.Е. и соавт., 1996; Voi'pirr е al., 1996; Калия О.Л. и соавт., 1998,2001].

Поскольку.одним из механизмов цитотоксического и цитостатического действи? таких методов консервативной противоопухолевой терапии, как лучевая терапия [Эй дус Л.Х., 1979, Ярмоненко С.П., 1988], фотодинамическая терапия [Красновский А.А. 1990] и химиотерапия при использовании ряда препаратов (блеомицин, антрацикли новые антибиотики) [Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998] является поражение струк турных элементов опухолевой ткани АФК и CP, то бинарные каталитические системь «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота» были исследованы в бесклеточных хи мических системах на способность вызывать деструкцию различных биомолеку. (ДНК, РНК, Сахаров и др) и апробированы в системе in vitro на опухолевых клетка человека в качестве цитотоксических агентов. В этих тест-системах было показанс что бинарные каталитические системы «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота* вызывают деградацию ДНК, РНК, углеводов и других биомолекул [Белков В.М., 1996 и обладают цитотоксическими свойствами. Выявленная in vitro высокая цитотоксичс екая активность бинарных каталитических систем свидетельствовала о целесообра; ности всестороннего изучения их противоопухолевых свойств in vivo на животных опухолями в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

Цели и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение прот воопухолевых и токсических свойств бинарных каталитических систем на основе koi плексов кобальта и аскорбиновой кислоты на экспериментальных моделях in vivo.

2

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Провести скрининг бинарных каталитических систем «металлокомплекс + аскорбиновая кислота» in v/Vo;

2. Разработать методические подходы к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo: на мышах с перевиваемыми опухолями изучить зависимость противоопухолевой эффективности бинарных каталитических систем "Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота" от дозы металлокомплекса, молярного соотношения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения животным металлокомплекса и аскорбиновой кислоты;

3. Провести доклиническое изучение бинарной каталитической системы «Ок-сикобаламин + Аскорбиновая кислота»:

« изучить противоопухолевую эффективность бинарной каталитической системы на основе оксикобаламина на животных с перевиваемыми опухолями различного гистогенеза и с различной формой опухолевого роста в монорежиме и схемах полихимиотерапии;

• изучить общетоксическое действие (безвредность) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах («острую» токсичность и «хроническую» токсичность).

Научная новизна исследования. В результате проведенных исследований по-азано, что бинарные каталитические системы на основе комплексов кобальта с фта-юцианиновыми лигандами, корриновыми лигандами, тридентантными основаниями ииффа в сочетании с аскорбиновой кислотой -обладают выраженной противоопухо-1евой активностью in vivo.

Впервые, на животных с асцитной (АОЭ) и солидной (Са-755) опухолях на призере двух бинарных каталитических систем: «Оксикобаламин + Аскорбиновая кисло-а» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» разработаны методические подходы к изучению 1ротивоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo. Показано, что |ротивоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем «Металлоком-1лекс + Восстановитель» зависит от дозы металлокомплекса и дозы восстановителя, IX молярного соотношения, временного интервала между введением металлоком-текса и восстановителя, последовательности их применения, а также от пути и длительности введения бинарной каталитической системы животным.

На мышах и крысах с перевиваемыми опухолями - Р-388, L-1210, АОЭ, Са-755, .LC, В-16 и Рс-1 изучена противоопухолевая эффективность бинарной каталитиче-:кой системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в монорежиме и схемах по-1ихимиотерапии:

-определены терапевтические дозы и схемы применения бинарной каталитической системы для лечения животных с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами;

-определен спектр опухолей, чувствительных к лечению бинарной каталитической системой;

-установлено, что бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» обладает химиомодифицирующими свойствами, усиливая противоопухолевую эффективность препарата цисплатин.

Проведено доклиническое изучение общетоксического действия (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах:

-дана количественная и качественная характеристика токсического и побочного действия препарата оксикобаламин-лио и бинарной каталитической системы на ere основе при однократном и многократном применении животным;

-установлена зависимость токсического действия бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио от дозы и пути введения животным;

-выявлен наиболее чувствительный вид животных к токсическому действию бинарной каталитической системы и препарата оксикобаламин-лио;

-установлено токсическое и побочное действие бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» на периферическую кровь, почки, сосудистую систему и ЦНС животных;

-на основании данных по количественной токсичности бинарной каталитическом системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» рекомендована безопасная («стартовая») доза бинарной каталитической системы для человека при ее клиническом изучении по I фазе.

Научно-практическая значимость. Научно-практическая значимость работь заключается в методическом совершенствовании подходов к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем «Металлокомплекс + Восстановитель» in vivo.

Проведено полное доклиническое изучение бинарной каталитической системь на основе препарата оксикобаламин-лио. На основании данных, полученных при изучении противоопухолевых и общетоксических свойств (безвредности), бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» была рекомендована для проведения клинических испытаний. Полученные в работе данные вошли е отчеты по специфической противоопухолевой активности и общетоксическому дейст вию (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскор биновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио», представленные в ФК МЗ РФ

4

целью получения разрешения на I фазу клинического изучения указанных лекарственных средств. В настоящее время проводится клиническое изучение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» по II фазе.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им. П.А.Герцена, XVI Менделеевском съезде в Санкт-Петербурге (1998); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» в Москве (1999); Ninth International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris (1999) и V Всероссийском съезде онкологов в Казани (2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ среди них -два патента на изобретение № 2114623 и № 2000110353, в которых изложены основные положения проведенного исследования.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 разделов и 6 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает источника. Работа иллюстрирована 20 рисунками, 20 таблицами и 1 схемой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Компоненты бинарных каталитических систем (БКС).

Катализаторы: Оксикобаламин (Ок) - Соа - [а - (5,6 - диметилбензимидазолил)]

- Сор - оксикобамида гидрохлорид (АО «Синтез», РФ); Оксикобаламин-лио (Ок-лио) оксикобаламин в лекарственной форме (МНИОИ им. П.А.Герцена, РФ); Ипрокол (Ипк)

- изо-пропил-мер-[Ы-(2-аминоэтил)-ацетил ацетилидениминато] кобальт{+1) бромид (ИНЭОС РАН, РФ); Терафтал (Тф) - натриевая соль - окта - 4,5 - карбоксифталоциа-нина кобальта (ГНЦ «НИОПИК», РФ); ЭТФ - пропиленгликолевый эфир окта - 4,5 -гарбоновой кислоты фталоцианина кобальта (ГНЦ «НИОПИК», РФ).

Восстановитель: Аскорбиновая кислота (Ак) - 5 % либо 10% раствор в ампулах ю 1 мл, официнальный препарат (АО «АЙ СИ ЭН Октябрь», РФ).

Противоопухолевые препараты.

Цисплатин (ДЦП) (EBEWE, Австрия); Доксорубицин (Др) (EBEWE, Австрия); 5 -йторурацил (Фу) (EBEWE, Австрия); Циклофосфан (Цф) (ОАО «Биохимик», РФ).

В экспериментах использовали стерильные водные растворы препаратов и ;убстанций, приготовленные ex tempore. В качестве растворителя использовали изотонический (0,9%) раствор хлористого натрия. Препарат «Ок-лио», в зависимости от

используемой концентрации, растворяли только в воде для инъекций или в воде для инъекций и 0,9 % растворе хлористого натрия.

Объекты исследования.

В работе использовано 3000 мышей-самцов и мышей-самок линий Cs7BL/6j, СВА, DBA, Balb/c, гибридов Ft (СВА х C57BI/6J) и нелинейных мышей SHK, массой 20 -25 г и 700 неинбредных крыс-самок и крыс-самцов, массой 150 - 250 г, полученных из питомника «Столбовая».

Изучение противоопухолевой эффективности.

Опухолевые модели. Исследования по изучению противоопухолевой эффективности БКС были проведены на мышах и крысах с перевиваемыми опухолями - Р-388, L-1210, АОЭ, Са-755, LLC, В-16 и Рс-1, которые были получены из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Оценка противоопухолевого эффекта.

Противоопухолевую эффективность БКС оценивали по общепринятым крите риям - торможению роста опухоли (ТРО, %), средней продолжительности жизим (СПЖ, сутки) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %). Минимальный кри терий активности тестируемых лекарственных средств по показателю ТРО - 50%, г по показателю УПЖ - 25 % [Софьина З.П., Сыркин А.Б и др., 1980; Трещалина Е.М. v соавт, 2000].

Эффективность сочетанното применения традиционных противоопухолевы; препаратов и БКС оценивали по следующим критериям: ТРО (%), УПЖ (%); излече нию от опухоли (%) и терапевтическому выигрышу (ТВ, %). ТВ - критерий, показы вающий, насколько повышается противоопухолевая эффективность цитостатика i схеме полихимиотерапии, который вычисляли по формуле:

ТВ = [(СПЖ2 - СПЖ,)/СПЖ,] х 100 %, где:

СПЖ1 - средняя продолжительность жизни (сутки) животных, по лучавших лечение традиционным противоопухолевым препаратом;

СПЖг - средняя продолжительность жизни (сутки) животных, пс лучавших комбинированное лечение традиционным противоопухолевым препарата и БКС или отдельными ее компонентами.

Изучение общетоксического действия БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио».

Изучение общетоксического действия БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио

были проведены на грызунах - мышах и крысах в соответствии с методическими ре комендациями по изучению общетоксического действия противоопухолевых фармг кологических средств [Михайлова Л.М. и соавт., 2000 г].

Исследовали «острую» токсичность и «хроническую» токсичность БКС «Ок-ли + Ак» и препарата «Ок-лио».

При изучении «острой» токсичности на мышах и крысах определяли летальные л токсические дозы БКС «Ок-лио + Ак» (по Ок) и Ок-лио при однократном введении животным: LDio (МПД), LDis, LD50 и LD84, которые устанавливали по методу Литчфил-ца и Уилкоксона [Litchfield, Wilcoxon, 1949]. Продолжительность наблюдения за животными составляла 30 суток.

При изучении «хронической» токсичности на крысах определяли уровни токсических доз БКС «Ок-лио + Ак» (по Ок-лио) и Ок-лио, характеризующие их токсическое действие на органы и ткани при многократном применении: ЛД (летальная доза); ВТД (МПД, высокая токсическая доза); НТД (низкая токсическая доза) и ВНТД (высокая не-гоксическая доза). Продолжительность наблюдения за животными составляла 60 суток.

Оценивали действие* исследуемых лекарственных средств на ЦНС (по изменению поведенческих реакций животных), периферическую кровь, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек, желудочно-кишечного тракта по общепринятым методикам [Тиц Н., 1997; Михайлова Л.М. и соавт., 2000 ].

Дозы и режимы введения компонентов БКС указаны и описаны в результатах исследования.

Статистическая обработка результатов исследований.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методам вариационной и альтернативной статистики и методу Стьюдента-Фишера с использованием статистической программы "STATISTICA" при р s 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

РАЗДЕЛ I. ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА БИНАРНЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МЕТАПЛОКОМПЛЕКСОВ КОБАЛЬТА И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

Глава 1. Скрининг бинарных каталитических систем на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты in vivo.

Пятнадцать БКС «Металлокомплекс(Мк) + Аскорбиновая кислота(Ак)» на основе комплексов кобальта и железа с макроциклическими лигандами, хелатирующими лигандами и тридентантными основаниями Шиффа, обладающих высокой цитотокси-ческой активностью in vitro, были изучены в скрининговой тест-системе in vivo в РОНЦ им. Н.Н.Блохина и МНИОИ им. П.А.Герцена. В нашей работе были исследованы четыре БКС: на основе терафтала (Тф), ЭТФ, оксикобаламина (Ок) и ипрокола (Ипк) (рис.1).

Исследования проведены на мышах с АОЭ.

Рис. 1. Структурные формулы металлокомплексов

A) натриевая соль окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта (терафтал);

Б) пропиленгликолевый эфир окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта (ЭТФ);

B) Соа-[а-(5,б-диметилбензимидазолил)]-СоР-оксикобамида гидрохлорид (оксикоЕ ламин);

Г) изо-пропил-мер-[Н-(2аминоэтил)-ацетил-ацетилидениминато] кобальт(+1) бром (ипрокол).

Металлокомплексы (Тф, ЭТФ, Ок и Ипк) вне БКС в широком диапазоне доз (от 1/100 максимально переносимой дозы (МИД) до LDso) не оказывали противоопухолевого действия (величина УПЖ мышей с АОЭ не превысила 25%), в то время как БКС «Тф + Ак», «ЭТФ + Ак» и «Ок + Ак» оказывали дозозависимое противоопухолевое действие, статистически достоверно увеличивая продолжительность жизни животных с опухолью. Повышение дозы БКС от % МПД до МПД (по Мк) увеличивало эффективность этих БКС »в 2-4 раза, при этом, выявленный противоопухолевый эффект БКС «Тф + Ак», «ЭТФ + Ак» и «Ок + Ак» был сопоставим с таковым для традиционного противоопухолевого препарата цисплатин (рис. 2).

Внутрибрюшинное применение БКС «Ипк + Ак» мышам с АОЭ в исследованных дозах (1/2 МПД и МПД) оказалось неэффективным (величина УПЖ мышей с АОЭ не превысила 12%) (рис. 2).

Результаты проведенных исследований in vitro и in vivo подтвердили идею о возможности использования БКС на основе комплексов переходных металлов в консервативной терапии злокачественных опухолей. Для дальнейшего изучения противоопухолевых свойств на экспериментальных моделях in vivo были отобраны три БКС на основе терафтала, ЭТФ и оксикобаламина.

Рис. 2. Влияние БКС «Тф + Ак», «ЭТФ + Ак», «Ок + Ак», «Ипк + Ак» п препарата

цпеплатнп на продолжительность жизни мышей с АОЭ. Мыши БНК, самкн. Клетки АОЭ привиты в брюшную полость. Компоненты БКС и препарат цисплатин вводили однократно внутрибрюшинно. Цисплатин использовали в дозе, равной 8 мг/кг (МПД). * - СПЖ мышей в опытной группе достоверно отличается от СПЖ мышей в контрольной группе при р<0,05. Опытная группа состояла нз 10 мышей, контрольная - нз 12.

Доклиническое изучение противоопухолевых и токсических свойств БКС «Тф + Ак» проведено в РОНЦ им. Н.Н.Блохина. Нами проведено доклиническое изучение противоопухолевых и токсических (совместно с РОНЦ им. Н.Н.Блохина) свойств БКС «Ок + Ак». Третья, эффективная в противоопухолевом отношении, БКС «ЭТФ + Ак» находится на стадии разработки стандартной субстанции и лекарственного препарата на ее основе в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и МНИОИ им. П.А.Герцена.

Глава 2. Разработка методических подходов к изучению противоопухолевой эффективности бинарных каталитических систем /л vivo.

Поскольку в экспериментальной онкологии бинарные каталитические системы изучается впервые, то первоочередной задачей являлась разработка методических подходов к изучению противоопухолевых свойств БКС «Мк + Ак» in vivo.

На мышах с АОЭ при внутрибрюшинном введении компонентов БКС установлено, что противоопухолевая эффективность БКС «Ок + Ак» возрастала при увеличении дозы Ок от 50 мг/кг до 100 мг/кг (при фиксированном молярном соотношении Ок:Ак) и молярного соотношения Ок:Ак от 1:10 до 1:30 (при фиксированной дозе Ок), и резко снижалась при увеличении временного интервала между введениями Ок и Ак с 15 минут до 1 часа (рис. ЗА и ЗБ). Максимальный противоопухолевый эффект БКС «Ок + Ак» был достигнут только при одной последовательности введения компонентов БКС: Ок, затем Ак (рис. ЗВ).

Противоопухолевая активность другой БКС - «ЭТФ + Ак» имела подобную зависимость от дозы металлокомплекса и восстановителя и режима их введения животным с АОЭ (рис. 4).

Противоопухолевая эффективность БКС «Ок + Ак» при внутривенном введеник Ок и Ак также зависела от дозы катализатора и восстановителя (молярного соотно шения) (табл. 1). Максимальный противоопухолевый эффект у мышей с Са-755 бы; достигнут только при следующем режиме введения компонентов БКС: Ок, 60 минут -5 Ак.

Таким образом, на мышах с АОЭ и Са-755 установлены оптимальные режимь введения компонентов БКС «ОК + Ак» для лечения животных с асцитными и солид ными опухолями, соответственно:

Ок, 15 минут -»Ак, молярное соотношение Ок:Ак -1:30;

Ок, 60 минут Ак, молярное соотношение Ок:Ак- 1:10; 1:30.

Молярное соотношение О к Л*

КШ 1 ю

1553 1 30

Доза Б КС "Ок * Ак* (по Ок)

С

19мин 1«ае 2часа Зчас» «часов 24чвса 72час» Временной интервал между введением Ок и Ак

о« ♦ А* А* » о«

Последовательность введения Ок и Ак

Рис. 3. Влияние БКС "Ок +Ак" на продолжительность жизни мышей с АОЭ в зависимости от дозы оксикобаламлна в составе ВКС и молярного соотношения Ок:Ак (А), временного интервала между введением Ок и Ак (Б) и последовательности введения Ок и Ак (В).

Мыши БНК, самки. Клетки АОЭ Привиты в брюшную полость. * - СПЖ мышей в опытной группе достоверно отличается от СГИС мышей в контрольной группе. Опытная группа состояла из 10 животных, контрольная - га 12. (А)-временной интервал между введением Ок и Ак-15 минут; (Б) -доза Ок - 75 мг/кг, молярное соотношение Ок:Ах ~ 1:30; (В) - доза Ок - 75 мг/кг, молярное соотношение 01САх -1:30; временной интервал между введением Ок и Ак -15 минут.

150

121

100

*

те

*

п

> м

13

А)

Доза БКС "ЭТФ ♦ Ак* (по ЭТф) С^Л Малярное сооп»ош*яме ЭТФ А». 1:30

С

Б)

Молярное соотношение ЭТФ:Ак ЕЗ Доза екс • 230 мг/м (по ЭТФ)

1Ы-

12$-

юа ■

75 •

I 50-

>

Л-

В)

Временной интервал мееду введениями ЭТФ И Ах Е-З Дои БКС - 250 мг/кг (по ЭТФ)

Рис. 4. Влияние БКС «ЭТФ + Ак» на продолжительность жизни мышей с АОЭ в зависимости от дозы ЭТФ (А), молярного соотношения ЭТФ:Ак (Б) и временного интервала между введениями ЭТФ и Ак (В).

Мыши БНК, самки. [Слетки АОЭ привиты в брюшную полость. * - СПЖ мышей в опытной группе достоверно отличается от СПЖ мышей в контроле при р<0,05. Опытная группа состояла из 10 мышей, контрольная - аз 12.

Таблица 1.

Влияние БКС «Ок + Л к» при внутривенном применении на динамику роста опухоли и продолжительность жизни мышей с Са-755 в зависимости от дозы Ок и молярного соотношения Ок:Ак.

Доза Ок, мг/кг Молярное соотношение Ок:Ак Средний объем опухоли, сутки после лечения, Уср. ± т СПЖ, сутки УПЖ,%

4 7 11 14 18

Контроль 1 0,215± 0,039 0,505± 0,112 1,107± 0,453 2,408± 0,622 5,098± 1,106 31,7±5,4 -

25 1:10 0,107± 0,058 0,326± 0,177 0,973± 0,305 2,295± 0,933 4,877± 2,301 33,4±2,6 5

ТРО, % 50 р<0,05 35 12 5 4

25 1:30 0,112± 0,61 0,277± 0,035- 0,878± 0,204 1,685± 0,772 4,566± 0,941 29,2±7,4 -8

ТРО, % 48 45 р<0,05 21 30 10

50 1:10 0.077± 0,068 0,215± 0,184 0,882± 0,335 1,750± 0,662 3,954± 1,108 35,8+3,4 13

ТРО, % 64 р<0,05 57 20 27 23

50 1:30 0,059± 0,042 0,193± 0,105 0,254± 0,166 0,561± 0,307 2,166± 1,006 33,6±5,8 6

ТРО, % 72 р<0,05 61 р<0,05 77 р<0,05 77 р<0,05 58 р<0,05

Контроль 2 - 0,295± 0,107 0,844± 0,511 2,097± 0,644 3,422± 1,005 28,8±4,4 -

100 1:10 - 0,083± 0,068 0,328± 0,115 0,728± 0,256 1,793± 0,844 30,0±6,1 10

ТРО, % - 72 р<0,05 61 65 р<0,05 48 р<0,05

100 1:20 - 0,090± 0,061 0,124± 0,055 0,557± 0,422 1,649± 0,773 28,8±5,1 5

ТРО, % - 70 р<0,05 85 р<0,05 73 р<0,05 52

100 1:30 0,005 большой разброс 0,139± 0,103 0,317± 0,255 1,311± 1,142 33,4±8,3 22

ТРО, % - 98 83 р<0,05 85 р<0,05 62

Мыши гибриды 1Юр1, самки. Опухолевая ткань Са-755 привита под кожу. Ок вводили однократно внутривенно. Ак вводили внутрнбрюшинно однократно через 60 минут после введении Ок. Опытная группа состояла из 10 животных, контрольная - из 12.

Глава 3. Противоопухолевая эффективность БКС «Ок-лио + Ак»

в монорежиме.

Доклиническое изучение противоопухолевых свойств БКС «Ок + Ак» проведено на широком спектре перевиваемых опухолей мышей и крыс - Р-388, 1-1210, АОЭ, Са-755, НС, В-16 и Рс-1.

В задачи исследования входило:

1. Определение диапазона терапевтических доз БКС «Ок + Ак» для лечения животных с асцитными и солидными опухолями;

2. Поиск оптимальной терапевтической схемы применения БКС «Ок + Ак» для лечения животных с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами;

3. Определение спектра перевиваемых опухолей животных , чувствительных к терапии БКС «Ок + Ак».

На мышах с асцитной (АОЭ) и солидной (Са-755) опухолями определен диапазон терапевтических доз БКС «Ок + Ак» при внутрибрюшинном и внутривенном, соответственно, применении БКС. Изучена зависимость противоопухолевого и токсического эффектов этой БКС от дозы Ок при фиксированном молярном соотношении Ок:Ак, равном 1:30 (АОЭ, Са-755) или 1:10 (Са-755) и временном интервале между введением Ок и Ак, равном 15 минутам (АОЭ) и 1 часу (Са-755). Диапазон терапевтических доз БКС «Ок + Ак» при внутрибрюшинном и внутривенном ее применении животным с асцитной и солидной опухолями, соответственно, составил:

- от 50 мг/кг до 100 мг/кг (по Ок, Ок:Ак-1:30);

- от 30 мг/кг до 150 мг/кг (по Ок, Ок:Ак - 1:10) и от 30 мг/кг до 50 мг/кг (по Ок, Ок:Ак- 1:30).

На следующем этапе исследований на мышах и крысах с перевиваемыми опухолями изучена противоопухолевая эффективность БКС «Ок + Ак» в зависимости от схемы ее применения (табл. 2).

Оптимальной терапевтической схемой применения БКС «Ок + Ак» в монорежиме мышам с опухолями, привитыми в брюшную полость (АОЭ, Р-388 и 1-1210), оказалось 3-х кратное внутрибрюшинное применение БКС в разовой дозе, равной 75 мг/кг (по Ок; Ок:Ак- 1:30). Применение БКС по этой схеме приводило к статистически достоверному увеличению продолжительности жизни мышей с АОЭ на 102+25%, а с Р-388 - на 25±5%. Лимфолейкоз Ь-1210 оказался опухолью, резистентной к данному виду лечения (табл.3).

При лечении животных с солидными опухолями трехкратное внутривенное применение БКС «Ок + Ак» также оказалось оптимальным. В зависимости от опухоли ТРО на уровне 80% - 50% сохранялось в течение 10-21 дня после лечения (рис. 6).

Таблица 2.

Схемы лечения животных с перевиваемыми опухолями БКС «Ок + Ак».

Внутрнбрюшннное применение БКС «Ок + Ак» (мыши с опухолями, привитыми в брюшную полость: АОЭ, Р-388,1^1210)

Схема 1. Однократно (1 сутки) Схема 2. Ежеденевно в течение 3-х дней (1.2,3 сутки) Схема 3. Ежедневно в течение 5-и дней (1.2.3.4.5 сутки) Разовая доза Ок - 75 мг/кг; Разовая доза Ак - 287 мг/кг; Молярное соотношение Ок:Ак- 1:30; Режим введения Ок и Ак - Ок, 15 мин + Ак

Внутривенное применение БКС «Ок + Ак» (мыши и крысы с солидными опухолями: Р-388, Са-755, LLC, В-16, Рс-1)

Схема 1. Однократно (1 сутки) Схема 2. Ежеденевно в течение 3-х дней (1.2.3 сутки) Схема 3. Ежедневно в течение 5-и дней (1.2.3.4.5 сутки) Разовая доза Ок - 50 мг/кг; Разовая доза Ак - 64 мг/кг; Молярное соотношение Ок:Ак- 1:10; Режим введения Ок и Ак - Ок, 60 мин + Ак

Схема 4. Однократно (1 сутки) Схема 5. Ежеденевно в течение 3-х дней (1.2.3 сутки) Схема 6. Ежедневно в течение 5-и дней (1,2,3,4,5 сутки) Разовая доза Ок - 50 мг/кг; Разовая доза Ак - 191 мг/кг; Молярное соотношение Ок:Ак- 1:30; Режим введения Ок и Ак - Ок, 60 мин + Ак

День первого введения БКС «Ок + Ак» животным являлся 1 сутками лечения.

Ок и Ак вне БКС в широком диапазоне доз (от 50 мг/кг до 375 мг/кг) не оказывали влияния на развитие опухолевого процесса у животных с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами. Только 3-х и 5-и кратное внутривенное введение Ок мышам с лимфолейкозом Р-388, привитым под кожу, приводило к статистически достоверному ингибированию роста опухоли на уровне >50% в течение 10 дней после введения субстанции (рис. 6). Противоопухолевая активность Ок в отношении солидной формы лимфолейкоза Р-388 может быть связана с повышенной тропностью субстанции к этим опухолевым клеткам.

В результате изучения противоопухолевой эффективности БКС «Ок + Ак» на указанных выше экспериментальных опухолевых моделях установлено, что эта БКС имеет широкий спектр противоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффективность. Чувствительность перевиваемых опухолей мышей и крыс к БКС «Ок + Ак» убывает в следующей последовательности: АОЭ > Р-388 (привитый под кожу) > Р-388 (привитый в брюшную полость) > Са-755 > LLC = Рс-1 » В-16 = L-1210 (привитый в брюшную полость). У мышей с АОЭ, лимфолейкозом Р-388, привитым под кожу, и Са-755 противоопухолевая эффективность БКС «Ок + Ак» была сопоставима с таковой для препарата цисплатин.

и

Таблица 3.

Противоопухолевая эффективность и токсичность схем мопотерапни БКС «Ок + Ак» при виутрибрюшшшом введении животным с АОЭ, Р-388 и Ь-1210, привитых в брюшную полость.

№ Разовая Суммар- Гибель СПЖ, УПЖ,

схемы Схемы лечения доза, мг/кг2> ная доза, мг/кг2' от токсичности, % Сутки %

Мыши с АОЭ

1 1 сутки БКС «Ок + Ак» 75 0 28,3313,96° 60

2 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 75 225 0 35,8312,65" 102

3 1,2,3,4,5 сутки БКС «Ок + Ак» 375 30 37,66+0,33° 112

4 1 сутки Ок 75 0 16,40+0,87 -7

5 1,2,3 сутки Ок 75 225 0 19,55±1,82 10

б 1,2,3,4,5 сутки Ок 375 0 18,02+2,54 2

7 1 сутки Ак 287 287 0 17,50±1,14 -1

8 1,2,3,4,5 сутки Ак 1435 0 20,45+3,44 16

9 0,9% №С1 (контроль) - - - 17,70+0,36 -

Мыши с лпмфолейкозом Р-388

1 1 сутки БКС «Ок + Ак» 75 0 15,60±0,33 17

2 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 75 225 0 16,65+0,151' 25

3 1,2,3,4,5 сутки БКС «Ок + Ак» 375 50 15,80±0,33 19

4 1 сутки Ок 75 0 13,00+0,01 -2

5 1,2,3 сутки Ок 75 225 0 15,20+0,66 14

б 1,2,3,4,5 сутки Ок 375 0 14,55+0,47 9

7 1 сутки Ак 287 287 0 13,00+0,01 -2

8 1,2,3,4,5 сутки Ак 1435 0 14,25±0,25 7

9 0,9% ЫаС1 (контроль) - - - 13,30±0,25 -

Мыши с лпмфолейкозом Р-388

1 1 сутки БКС «Ок + Ак» 75 0 6,00+0,16 0

2 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 75 225 0 6,33+0,23 6

3 1,2,3,4,5 сутки БКС «Ок + Ак» 375 30 6,50+0,17 8

4 1 сутки Ок 75 0 6,33±0,23 6

5 1,2,3 сутки Ок 75 225 0 6,00+0,16 0

6 1,2,3,4,5 сутки Ок 375 0 6,00±0,16 0

7 1 сутки Ак 287 287 0 6,33+0,33 6

8 1,2,3,4,5 сутки Ак 1435 0 6,50+0,17 8

9 0,9% ЫаС1 (контроль) - - - 6,00+0,13 -

Мыши БНК (АОЭ); 1ШР1 (Р-388 и И210), самки. Опухолевые клетки АОЭ, Р-388 и Ь-1210 привиты в брюшную полость. Начало лечения через 48 часов после инокуляции опухолевого материала (1 сутки лечения). " - отличия от контроля достоверны при р<0,05.21 - Доза БКС «Ок + Ак» указана по Ок (молярное соотношение Ок:Ак - 1:30, временной интервал между введением Ок и Ак - 15 минут). Опытная группа состояла из 8 мышей, контрольная -из 10.

ioo P-388

БКС "Ок* Ак"

75

25-

О а. I-

5 6 7 8 9 Сутки после лечения

О о.

100

75

25

LLC

БКС"0К + АК"

12

14

16

18

I

20

24

Сутки после лечения

100-.Са-755

75 -

50-

25-

0

Б КС "Ок+ Ах"

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Сутки после лечения

100 Л

75 50250-

-25

Рс-1

БКС "Ок +Ак"

12 14 16 18 20 22 Сутки после лечения

24

Рис. 6. Влияние БКС при внутривенном введении на динамику роста лимфолейкоза Р-388, привитого под кожу,

Са-755, LLC и Рс-1

Мыши гибриды BDF1, самки (Р-388, Са-755, LLC); крысы неинбрвдные, самцы (Рс-1). БКС «Ок + Ак» вводили внутривенно ежедневно в течение трех дней в разовой дозе, равной 50 мг/кг (по Ок, молярное соотношение ОкгАк - 1:10, временной интервал между введением Ок и Ак - 60 минут). Ок вне БКС вводили внутривенно в течение трех дней в разовой дозе, равной 50 мг/кг, а Ак - внутрибрюшинно ежедневно в течение пяти дней в разовой дозе, равной 64 мг/кг. * объем опухолей у мышей в опытной группе достоверно отличаются от объема опухолей у мышей в контрольной группе при р<0,05. Опытная группа состояла из 8 мышей, контрольная - из 10.

4

50-

0

22

Глава 4. Противоопухолевая эффективность бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в схемах полихимиотерапии.

Современная химиотерапия злокачественных новообразований- это интенсивный вид лечения, сочетающий применение нескольких противоопухолевых препаратов одновременно или в различной последовательности, что приводит к повышению эффективности проводимого лечения.

Для повышения эффективности БКС «Ок + Ак» в монорежиме была изучена ее противоопухолевая эффективность в сочетании с официнальными противоопухолевыми препаратами - цисплатином (ДДП), доксорубицином (Др), циклофосфаном (Цф) и 5-фторурацилом (Фу) по схеме «БКС + цитостатик». Исследования были проведены на двух опухолевых моделях - мышах с АОЭ и Са-755.

Наиболее эффективным у мышей с АОЭ было комбинированное применение БКС «Ок + Ак» и препарата «Цисплатин» по схемам 9 и 10 (табл. 4). Их применение приводило к статистически достоверному УПЖ мышей с АОЭ на 340±17% (ТВ( -268+20%) и 310±22% (ТВ) - 291±35%), соответственно, и полному излечению от опухоли 17+4% и 30+10% животных, соответственно, что свидетельствует о синергиче-ском эффекте сочетанного применения этих цитостатических средств.

Противоопухолевая эффективность комбинированного применения БКС «Ок + Ак» и препарата «Циклофосфан», а также БКС «Ок + Ак» и препарата «5-Фторурацил» не превысила эффективности этих цитостатиков, используемых в монотерапии (табл.4).

Ок вне БКС у мышей с АОЭ оказывал влияние только на противоопухолевую эффективность препарата цисплатин, повышая его эффективность на 22+5%.

Комбинированное применение БКС «Ок + Ак» и цисплатина, а также БКС «Ок + Ак» и 5-фторурацила мышам с Са-755 по схемам 5 и 4, соответственно, повышало эффективность проводимого лечения на 22±3% и 17±5% (по СПЖ), соответственно, по сравнению с эффективностью этих противоопухолевых средств, используемых в монотерапии.

Включение БКС «Ок + Ак» в схему лечения мышей с Са-755 препаратом «Циклофосфан» не увеличило эффективность проводимого лечения (табл. 5).

Доксорубицин, вводимый после 3-х кратного введения БКС «Ок + Ак», приводил к отмене противоопухолевого эффекта БКС (схема 4; табл. 5).

Ок не оказывал влияния на терапевтический и токсический эффекты цисплатина, доксорубицина, цикпофосфана и 5-фторурацила у мышей с Са-755.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что включение БКС «Ок + Ак» в схему лечения такими противоопухолевыми препаратами как цисплатин и 5-фторурацил приводило к повышению эффективности проводимого лечения. Наилучшие результаты лечения мышей как с АОЭ, так и с Са-755 были получены при комбинированном применении БКС и препарата «Цисплатин», что дает

основание предположить наличие у БКС «Ок + Ак» химиомодифицирующих свойств в отношении противоопухолевой эффективности этого цитостатика.

Таблица 4.

Влияние комбинированного применения БКС и цитостатиков на продолжительность жизни мышеи с АОЭ.

Л! Гибель УПЖ, ТВ./ГВД Излече-

С1С Схема лечения от ток- % % ние, %

стн, %

БКС «Ок+Ак» + «Цисплатин»

1 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 0 92 ' - 0

2 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 0 10 - 0

3 10,11,12 сутки БКС «Ок + Ак» 0 0 - 0

4 1 сутки «ДЦП» 0 130" - 0

5 8 сутки «ДЦП» 0 19" 0

6 12 сутки «ДЦП» 0 4 - 0

7 1 сутки «ДЦП»; 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 50 356" 98/328 0

8 1 сутки «ДЦП»; 10,11,12 сутки БКС «Ок + Ак» 0 234" 46/234 0

9 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 8 сутки «ДЦП» 0 340" 268/129 17

10 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 12 сутки «ДДП» 0 3102) 291/113 30

БКС «Ок+Ак» + «Циклофосфан »

1 1 сутки «Цф» 0 15" - 0

2 8 сутки «Цф» 0 21" - 0

3 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 0 87" - 0

4 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 0 2 - 0

5 1 сутки «Цф»; 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 0 10 0/0 0

б 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 8 сутки «Цф» 0 106 72/11 0

БКС «Ок+Ак» + «Фторурацил»

1 1 сутки «Фу» 0 3 - 0

2 8 сутки «Фу» 0 1 - 0

3 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 0 98и> - 0

4 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 0 10 - 0

5 1 сутки «Фу»; 6,7,8 сутки БКС «Ок + Ак» 0 3 0/0 0

6 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 8 сутки «Фу» 0 83^ 80/0 0

Мышн БНК, самки. Опухолевые клетки АОЭ привиты в брюшную полость. Цитостатики применяли внутрибрюшинно в дозах, равных для ДЦП - 8 мг/кг; Фу и Цф - 80 мг/кг. БКС «Ок + Ак» вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение трех дней в разовой дозе, равной 50 мг/кг (по Ок, молярное соотношение Ок:Ак - 1:30) Лечение начинали через 24 часа после инокуляции опухолевого материала (1 сутки лечения). "ТВ|/ТВ2 - терапевтические выигрыши в эффективности комбинации «цитостатик + БКС» (по СПЖ) по отношению к эффективности цитостатика и БКС «Ок + Ак», соответственно, используемых в монорежиме.2) - СПЖ мышей в опытной группе достоверно отличается от СПЖ мышей в контрольной группе при р<0,05. Опытная группа состояла из 8 животных, контрольная - из 10.

Таблица 5.

Влияние комбинированного применения БКС и цитосгатнков на динамику роста опухоли и продолжительность жизни мышей с Са-755.

№ схемы Схема лечения Гибель от токсичности, % ТРО на день после воздействия, % УПЖ,% ТВ11', %

10 | 13 1 16 1 20 1 23

БКС «Ок +Ак» + Цисплатин

1 1 сутки Цп 0 953) 92-» 893> 78* 69 252) -

2 4 сутки Цп 0 88-" 53з; 79« 73 70 19 -

3 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак» 0 91-" 82-» 55 60 52 18-" -

4 1 сутки Цп; 2,3,4 сутки БКС «Ок + Ак» 0 юо-" 1003) 1003) 95 803' 28 2

5 1,2,3 сутки БКС «Ок+Ак»; 4 сутки Цп 0 1003> 903) 913) 85* 72 46*> 22

БКС «Ок+Ак» +Доксорубицин

1 1 сутки Др 0 96' 703) 633) 37 272) _

2 4 сутки Др 0 873> 51 24 30 -

3 1 сутки Др; 2,3,4 сутки БКС «Ок+Ак» 0 1003) 923> 65« 53* _ 34^ 6

4 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 4 сутки Др 0 69» 633> 35 14 _ 1 0

БКС «Ок+Ак» + Фторурацил

1 1 сутки Фу 0 1003) 873> 713) 56* 23» 19 _

2 4 сутки Фу 0 81-» 673> 47 13 1 5 _

3 1 сутки Фу; 2,3,4 сутки БКС «Ок + Ак» 0 1003) 933> 88* 693> 573' ЗЗ2' 11

4 1,2,3 сутки БКС «Ок+Ак»; 4 сутки Фу 0 943) 93-» 773) 64* 423> 232) 17

БКС «Ок +Ак» + Циклофосфан

1 1 сутки Цф 0 72 ' 55 38 42 10 16« -

2 4 сутки Цф 0 75 48 21 39 25 2

3 1 сутки Цф; 2,3,4 сутки БКС «Ок + Ак» 0 803) 823> 71* 62* 48* 21ч 4

4 1,2,3 сутки БКС «Ок + Ак»; 4 сутки Дф 0 703> 753) 51* 43 17 0 0

Мыши гибриды Р1, самки. Опухолевая ткань Са-755 привита под кожу. Цитостатики применяли внутрибрюшинно в дозах, равных для ДЦП - 8 мг/кг; Фу и Цф - 80 мг/кг. БКС «Ок + Ак» вводили внутривенно ежедневно в течение трех дней в разовой дозе, равной 50 мг,кг (по Ок, молярное соотношение Ок:Ак -1:10). Начало лечения через 48 часов после инокуляции опухолевого материала (1 сутки лечения). 1ТВ, - терапевтический выигрыш в эффективности комбинации «цитостатик + БКС» (по СПЖ) по отношению к эффективности цитостатика, используемого в монсгтерапии.2> - СПЖ мышей в опытной группе достоверно отличается от СПЖ мышей в контрольной группе при р<0,05.31 - объем опухолей у мышей в опытной группе достоверно отличается от объема опухолей у мышей в контрольной группе при р<0,05.

РАЗДЛ II. ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИНАРНОЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ОКСИКОБАЛАМИНА И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Основными задачами доклинического изучения общетоксического действия (безвредности) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» были:

1. Изучение токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» при однократном применении мышам и крысам («острая» токсичность);

2. Изучение токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» при многократном применении животным («хроническая» токсичность);

3. Исследование кумулятивных свойств БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» и обратимости их токсических эффектов;

4. Определение начальной («стартовой») безопасной дозы БКС «Ок-лио -t Ак» для человека при ее клиническом изучении по I фазе у больных сс злокачественными новообразованиями.

Глава 1. Токсичность бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио при однократном применении («острая» токсичность).

В результате изучения «острой» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и препарате «Ок-лио» определена их количественная токсичность на мышах и крысах при внутри-брюшинном и внутривенном применении по критериям расчетных доз: LDm (МПД) LD|6, LDso и LDb4 (табл. 6).

При анализе данных по количественной токсичности БКС «Ок-лио + Ак» опре делены значительная широта токсического и смертельного действия БКС. БКС «Ок лио + Ак» при внутрибрюшинном применении более токсична, чем при внутривенном Установлено отсутствие зависимости токсичности БКС от пола животных. Наиболее чувствительным видом животных к токсическому действию БКС «Ок-лио + Ак» оказа лись мыши.

Учитывая широту токсического и смертельного действия и индекс широты те рапевтического действия (LD50/Tfl), БКС «Ок-лио + Ак» по степени опасности острогс токсического действия можно классифицировать как умеренно опасное лекарствен ное средство.

В отличие от БКС, препарат «Ок-лио» по степени опасности острого токсическо1 го действия относится к малоопасным лекарственным средствам.

Данные клинической картины интоксикации и результаты аутопсии павших жи вотных позволили установить причину смерти грызунов при однократном применени БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» в летальных дозах - сердечно-сосудиста недостаточность.

Таблица 6.

Дозы, характеризующие токсичность БКС «Ок-лно + Ак» и препарата «Ок-лпо» при однократном введении мышам и крысам.

Вид и Путь Характеристика доз* Р=0,05

Пол животного вве- мг/кг мг/м2

дения 1Х>10 (МВД) ш50 ЬО,о 1Л350

БКС "Ок-лио +Ак"

Мыши в/б 97,0 (78,2-4-120,3) 245,0(197,6+303,8) 291 735

Самцы, самкн в/в 200,0(175,4-5-228,0) 350,0 (307,0+399,0) 600 1050

Крысы-самцы в/б 81,0 (55,9+117,5) 189,0(130,3+247,1) 486 1134

в/в 275,0 (250,0+302,5) 336,0 (305,5+369,6) 1650 2016

Крысы-самки в/б 126 (95,5+166,3) 215 (162,9+283,8) 756 1290

в/в 255 (229,7+283,1) 329 (296,4+365,2) 1530 1974

Препарат Ок-лио

Мыши в/б »1500 >1500 »4500 >4500

Самцы, самки в/в

Крысы-самцы в/б 131,0(100,8+170,3) 230,0(176,9+299,0) 786 1380

в/в 170,0(138,2+209,1) 289,0 (234,9+355,5) 1020 1734

Крысы-самки в/б 155,0(126,0+190,7) 227,0(184,6+279,2) 930 1362

в/в 185,0(148,0+231,3) 278,0 (222,4+347,5) 1110 1668

1/6 - вн)трибрюшинно; в/в - внутривенно; * - доза БКС «Ок-лио + Ак» указана по Ок-лио

Глава 2. Токсичность бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио при многократном применении («хроническая» токсичность).

В результате проведенных исследований было установлено 3 уровня токсиче-;ких доз для БКС «Ок-лио + Ак» и 2 уровня - для препарата «Ок-лио» (табл.6).

Как видно из приведенных в табл.7 данных, БКС «Ок-лио + Ак» при многократном применении токсичнее препарата «Ок-лио» примерно в 2 раза.

Полученные данные по «хронической» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» на кры-зах позволили сопоставить их с данными по «острой» токсичности на крысах и определить индекс кумуляции (1к) БКС «Ок-лио + Ак», который составил величину, равную -7%, что свидетельствует об отсутствии кумулятивных свойств у БКС и обратимости ее токсических эффектов. Индекс кумуляции для препарата «Ок-лио» установить не удалось ввиду его низкой токсичности при многократном применении (табл.7).

Данные по "хронической" токсичности БКС "Ок-лио + Ак" и препарата «Ок-лио» позволяют отнести их по степени опасности хронического токсического действия к малоопасным лекарственным средствам.

Таблица 7

Дозы, характеризующие токсичность БКС "Ок-лно + Ак" при ее многократном применении.

Доза Ок-лно, мг/кг Разовая сумма рная Доза Ак, мг/кг разовая суммарная. Характеристика уровня доз

БКС «Ок-лио +Ак»

18 270 23 343 Высокая нетоксическая доза - ВНТД

36 540 46 686 Низкая токсическая доза - НТД

72 1080 91 1372 Высокая токсическая доза - ВТД (МПД)

Препарат «Ок-лио»

Доза Ок-лио, мг/кг Характеристика уровня доз

Разовая Суммарная

18 270 Высокая нетоксическая доза - ВНТД

36 540 Высокая нетоксическая доза - ВНТД

72 1080 Низкая токсическая доза - НТД

Крысы неинбредные, самцы. БКС «Ок-лио + Ак» и препарат «Ок-ли» вводили ежедневно в течение 1 дней.

Влияние БКС "Ок-лио + А к" и препарата «Ок-лио» на периферическую кровь.

БКС «Ок-лио + Ак» при многократном применении крысам в дозах, равных ВТ; и НТД, оказывала токсическое действие на периферическую кровь, вызывая у живо1 ных эритропению, тромбоцитопению, снижение количества гемоглобина и увеличени (в пределах физиологической нормы) общего числа лейкоцитов, (табл.8). В отличи от БКС «Ок-лио + Ак», препарат «Ок-лио» в адекватных по токсичности дозах оказь вал стимулирующее влияние на гемопоэз (табл.9).

Влияние БКС "Ок-лио + Ак" и препарата «Ок-лио» на функции печени.

Многократное применение БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» в исследс ванных дозах (ВНТД, НТД и ВТД) не приводило к нарушению функций печени, о че1 свидетельствуют данные биохимического исследования сыворотки крови крыс, за и< ключением незначительного усиления белоксинтезирующей функции печени. Зафи! сировано увеличение общего белка в сыворотке крови животных в 1,6 раза при и( пользовании БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» дозах, равных ВТД и НТД, с( ответственно (табл.10).

Влияние БКС "Ок-пио + Ак" и препарата «Ок-лио» на функции почек.

На 3 сутки после многократного применения БКС «Ок-лио + Ак» в дозе, равной -1ТД, у животных отмечали увеличение в сыворотке крови количества мочевины в 1,6 >аза, а в дозе, равной ВТД - увеличение количества мочевины и креатинина в 1,8 >аза и 1,7 раза, соответственно (табл. 10).

При исследовании суточного диуреза крыс, получавших БКС «Ок-лио + Ак» в 5ТД, на 30 сутки после ее применения отмечали достоверное увеличение суточного (иуреза в 2,5 раза (развитие полиурии).

Препарат «Ок-лио» при многократном применении в исследованных дозах не жазывал токсического действия на почки.

Влияние БКС "Ок-лио + Ак" и препарата «Ок-лио» на функции сердца.

БКС «Ок-лио + Ак» и препарат «Ок-лио» при многократном применении в ис-¡ледованных дозах не вызывали функциональных изменений со стороны сердца.

Применение БКС «Ок-лио + Ак» в дозе, равной ВТД, приводило к сосудистым крушениям - расширению периферических сосудов, увеличению их проницаемости 1 развитию геморрагического синдрома.

Влияние БКС "Ок-лио + Ак" и препарата «Ок-лио» на центральную нервную систему (UHC).

Однократное и многократное применение БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-1ио» в летальных и высоких токсических дозах (МПД) оказывало дозозависимое ток-¡ическое действие на ЦНС. У животных наблюдали вялость, адинамию, гиподинамию, лиорелаксацию, потерю болевой чувствительности задних конечностей, атаксию и :аталепсию (I и III степени). Наблюдаемые изменения в поведенческих реакциях жи-зотных могут свидетельствовать об угнетающем влиянии БКС «Ок-лио + Ак» и препа-зата «Ок-лио» на ЦНС животных.

Все установленные токсические и побочные эффекты БКС «Ок-лио + Ак» и 1репарата «Ок-лио» были выявлены только при введении этих лекарственных зредств животным в высоких и низких токсических дозах, имели дозозависимый и об-затимый характер. Функциональная обратимость токсических и побочных эффектов зоставляла 15-60 дней.

На основании данных по количественой токсичности БКС «Ок-лио + Ак» опре-}елена начальная безопасная («стартовая») доза БКС для человека при ее клиниче-зком изучении по I фазе у больных со злокачественными новообразованиями [Gries-iaber С.К, Marsoni S., 1986 г.]: для интраперитонеального применения - 33 мг/м2 (по Эк-лио; Ок-лио:Ак - 1:30); для внутривенного применения - 59 мг/м2. (по Ок-лио; Ок-1ио:Ак - 1:10), с последующей эскалацией доз по модифицированному методу Fibonacci [Collins J.M. et al., 1986 г.].

Таблица 8.

Влняпие БКС «Ок-лио + Ак» на показатели периферической крови крыс при многократном виутрибрюшчнном применении.

Разовая доза** (мг/кг) До введения БКС Срок наблюдения, сутки после применеия БКС

3 7 15 21 30 60

Общее число лейкоцитов (тыс/мм3)

18 12,8+0,6 14,9±0,9 11,9±0,5 10,1 ±0,7 12,6+0,9 11,7±0,9 11,5±0,8

36 11,6±0,3 15,7+0,5 2М±0,5* 10,3±0,2 12,9±0,5 11,1±1,3 13,4±0,8

72 11,1 ±0,8 14,4+0,3 16,2±Р,9 13,6±1,3 12,7±0,2 11,4±1,2 11,5±1,6

Контроль 12,4±1,2 15,1±1,0 13,2±0,3 9,6±0,6 13,4±0,6 12,6±0,7 14,3±1,3

Число эритроцитов (млн/мм3)

18 6,75±0,55 6,66±0,32 6,75±0,49 7,14±0,10 6,71 ±0,31 5,48±0,49 5,80±0,32

36 6,37+0,32 7,07±0,52 5,73±0,35 5,93±0,66 7,29±0,55 6,42±0,б5 5,89±1,01

72 6,54+0,99 7,55±0,60 3,65±0,50» 3)54±0,44* 2,84±0,бЗ» 5,76±0,55 5,84±0,23

Контроль 6,26±0,41 7,66±0,46 6,16±0,88 6,57±0,43 6,90±0,74 6,07±0,60 6,60±0,33

Количество гемоглобина (г/л)

18 177+2 211+5 204±6 204±3 201±12 197±2 204+6

36 169±10 195+3 198±12 214+5 207±9 200±3 202±9

72 180+6 208±4 161*8* 163*10* 14912* 201 ±8 204±7

Контроль 184±9 210±10 210±8 205±7 201±3 200±8 202±6

Число тромбоцитов (тыс/мм3)

18 455+25 531 ±47 517±88 487±25 546±45 484±66 427±40

36 473±39 550+16 455±47 463±42 513±35 439±71 380±100

72 421±44 507±53 446±55 256±23* 280±31* 248±34* 477±28

Контроль 465±63 534±82 486±66 508±71 492±16 478±34 393±63

Крысы неинбредные самцы. БКС «Ок-лио + Ак» вводили ежедневно в течение 15 дней.. * - отличия контроля достоверны при р<0,05. ** - доза БКС указана по препарату «Ок-лио».

Таблица 9.

Влияние препарата «Ок-лно» на показатели периферической крови крыс при многократном внутрнбрюшиипом применении.

Разовая доза (мг/кг) До введения Ок-лио Срок наблюдения, сутки после прнменсил препарата

3 7 15 21 30 60

Общее число лейкоцитов (тыс/мм3)

18 11,5+0,6 16,2+0,8 11,6±0,7 10,310,6 11,710,8 11,610,7 11,110,4

36 11,0+1,3 17,9+1,5 21)710,3* 10,510,8 12,510,6 11,910,3 12,210,5

72 11,3+0,9 24,411,5 23,510,4*. 19.410,7* 21,210,5* 12,010,6 10,811,9

Контроль 12,4+0,8 15,1 ±0,8 13,2±0,2 9,6+0,9 13,411,3 12,611,5 14,310,8

Число эритроцитов (млн/мм3)

18 6,21+0,71 5,92+0,68 5,75+0,49 6,9210,51 7,3210,55 6,6510,65 6,2910,55

36 7,00+0,53 7,62+0,23 9,2010,63* 9,1010.36« 6,7010,51 6,2310,49 6,4410,40

72 6,95+0,42 5,47+0,33 9,25+0,56» 9.7810.5!» 9,72+0,60 9,7010,94« 6,4010,49

Контроль 6,26±0,68 7,6610,32 6,16+0,32 6,5710,34 6,9010,63 6,0710,51 6,6010,23

Количество гемоглобина (г/л)

18 188+10 199+12 20713 21212 20617 209+7 20716

36 178+9 201+2 238110 239112 22218 20118 19715

72 184+7 202+3 248В 25218» . 24614* . 244И2» 20614

Контроль 184+7 210+6 21019 20512 201113 20012 202110

Число тромбоцитов (тыс/мм3)

18 469+55 584+99 480166 469182 503182 496164 432115

36 469±28 490±25 558+89 489+44 470144 475135 550155

72 419±42 513+53 .700145* ,702167*. * 786123» 506176 446121

Контроль 465+76 534+31 486166 508171 4921101 478116 393160

Крысы неинбредные самцы. Препарат «Ок-лио» вводили ежедневно в течение 15 дней. * - отличия от контроля достоверны при р<0,05.

Таблица 10.

Влияние БКС «Ок-лио + Л к» на биохимические показатели крови крыс при многократном внутрибрюшинном применении.

Разовая доза** (мг/кг) Показатель Срок наблюдения, сутки после применеия БКС

3 30 60

18 Глюкоза (ммоль/л) 18,0±0,8 11,3*1,2 9,2±1,2

36 15,4±0,3 9,4+0,8 10,0*0,9

72 19,0±1,2 10,7*1,3 12,7*0,8

Контроль 16,5±0,б 10,4*0,3 10,8*0,1

18 Мочевина (ммоль/л) 1,54±0,14 2,07±0,1б 2,00±0,15

36 2j24i;0,07" i: 1,99*0,10 2,04+0,27

72 : 2,53*0,12* 2,00*0,21 1,59+0,13

Контроль 1,40±0,12 2,25±0,13 1,70±0,25

18 Креатншш (мкмоль/л) 84,3±0,2 77,9±0,9 68,2*0,3

36 100,4±0,6 97,1±1,4 105,0*2,3

72 162,8*0,4*: П5,0±0,4 79,4±5,3

Контроль 95,4±0,7 100,0*1,2 89,3+0,6

18 Холестерин (ммоль/л) 1,95±0,51 2,00±0,75 1,25±0,83

36 2,15±0,20 1,83±0,20 1,68±0,47

72 2,43+0,53 2,02*0,15 1,53±0,20

Контроль 2,30±0,53 1,79*0,29 1,6б±0,15

18 Белок общин (г/л) 59,9±3,4 63,4±7,0 79,4*2,3

36 85,4±8,4 75,9±5,4 82,4*10,0

72 ; 102,0*10,5*: 60,1±2,8 69,8±4,7

Контроль 65,8±2,4 58,0±3,4 72,1±б,б

18 Щелочная Фосфлтаза (нмоль/(с*л) 1002±150 1000+170 930*100

36 1115±55 970±40 1025+150

72 1270±140 1150±150 840*170

Контроль 1220*250 860+240 1156*180

18 АЛТ (ммоль/(ч»л) 0,19+0,04 0,42±0,12 0,30*0,04

36 0,25*0,01 0,39±0,02 0,25+0,03

72 0,17±0,03 0,27+0,01 0,32±0,08

Контроль 0,21 ±0,01 0,3510,04 0,29±0,01

18 ACT (ммоль/(ч«л) 0,42+0,03 0,68*0,02 0,29*0,03

36 0,37±0,01 0,83*0,05 0,72*0,02

72 0,44±0,02 0,32±0,01 0,66*0,04

Контроль 0,55*0,07 0,72±0,03 0,54+0,02

Крысы неинбредные самцы. БКС «Ок-лио + Ак» вводили ежедневно в течение 15 дней. * - отличия от контроля достоверны при р<0,05. ** - доза БКС указана по препарату «Ок-лио».

Таким образом, в работе экспериментально обоснована возможность использования БКС на основе металлокомплексов переходных металлов в качестве потенциальных противоопухолевых средств для лечения больных со злокачественными эпухолями.

Разработаны методические подходы к изучению противоопухолевых свойств 5КС «Мк + Ак» в эксперименте. Проведено полное доклиническое изучение БКС на эснове препарата «Ок-лио» включающее изучение специфической противоопухолевой эффективности на мышах и крысах с перевиваемыми опухолями и токсичности [безвредности) на грызунах (мышах и крысах). Полученные в работе данные вошли в этчеты по специфической противоопухолевой активности и общетоксическому действию (безвредности) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио», представленные в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на клинические испытания этих лекарственных :редств у онкологических больных.

ВЫВОДЫ

1. Бинарные каталитические системы (БКС) «Металлокомплекс(Мк) + Аскорбиновая кислота(Ак)» на основе терафтала (Тф), пропиленгликолевого эфира терафтала (ЭТФ), оксикобаламина (Ок) и ипрокола (Ипк) in vivo обладают противоопухолевой активностью, убывающей в следующем ряду: «Ок + Ак» > «ЭТФ + Ак» > «Тф + Ак» » «Ипк + Ак». Металлокомплексы и аскорбиновая кислота вне бинарной каталитической системы не оказывают противоопухолевого действия.

2. Противоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем зависит от дозы металлокомплекса, дозы аскорбиновой кислоты, молярного соотношения ме-таллокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты.

3. Оптимальными режимами введения компонентов БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» являются:

Мк, 1 -15 минут ->Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:30) - для лечения животных с асцитными опухолями;

Мк, 60 минут ->Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:10 и 1:30) - для лечения

животных с солидными опухолями.

4. Оптимальными схемами применения бинарной каталитической системы «Оксико-баламин-лио + Аскорбиновая кислота» в монорежиме при лечении животных с различными опухолями являются:

а) внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по окси-кобаламину), равной 75 мг/кг, при молярном соотношении оксикобаламина и аскорбиновой кислоты - 1:30, и временном интервале между их введением, соответствующем 15 минутам (АОЭ и Р-388, асцитный вариант);

27

б) внутривенно ежедневно s течение 3-х дней в разовой дозе (по оксикоба-ламину), равной 50 мг/кг, при молярном соотношении оксикобаламина и аскорбиновой кислоты - 1:10, и временном интервале между их введением, соответствующем 1 часу (Са-755, LLC, Рс-1 и Р-388, солидный вариант).

5. Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» имеет широкий спектр противоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффективность. Чувствительность перевиваемых опухолей мышей и крыс к этой бинарной каталитической системе убывает в следующем ряду: АОЭ > Р-388 (привитый под кожу) > Р-388 (привитый в брюшную полость) > Са-755 > LLC = Рс-1 » В-16 = L-1210.

6. Включение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбинова? кислота» в схемы традиционной противоопухолевой терапии повышает эффек тивность лечения мышей с опухолями по показателю средней продолжительное жизни (СПЖ) при АОЭ на 280±39% (БКС + «Цисллатин»); при Са-755 на 22+3°/ (БКС + «Цисплатин») и на 17±5% (БКС + «5-Фторурацил»),

7. На основе количественных и качественных характеристик токсического и побочно го действия препарата «Оксикобаламин-лио» (Ок-лио) и бинарной каталитичесш системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» при однократном и много кратном применении животным определены их индексы кумуляции и обратимост токсического эффекта, коэффициенты видовой чувствительности, и степень опас ности. БКС «Ок-лио + Ак» классифицирована как умеренно опасное (острое tokcv ческое действие) и малоопасное (хроническое токсическое действие) лекарствек ное средство; препарат «Ок-лио» по степени опасности относится к малоопасны! лекарственным средствам независимо от характера токсического действия.

8. Сферами избирательной токсичности бинарной каталитической системы «Оксию баламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио» при v применении в токсических дозах являются эритроциты, тромбоциты, почки, со с; дистая система и центральная нервная система.

9. Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислоте не вызывает токсической лейкопении и гранулоцитопении. Отсутствует интесл нальная токсичность и анорексия.

10.Определена начальная безопасная («стартовая») доза бинарной каталитаческс системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» для человека при пров дении I фазы клинического изучения: J

а) для интраперитонеального применения - 33 мг/м2 (по Ок-лио; С лио:Ак -1:30; Ок-лио, 15 минут + Ак)

б) для внутривенного применения - 59 мг/м2 (по Ок-лио; Ок-лио:Ак -1:-Ок-лио, 60 минут + Ак).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

, Способ подавления опухолевого роста (соавт. Р.И.Якубовская, В.И.Чиссов, Е.Р.Немцова, В.К.Оганезов, Г.Н.Ворожцов, О.J1.Калия, С.Г.Кузьмин, Е.А.Лукьянец)// Патент РФ 2114623, 1996 г.;

. Соединения ряда В12 в сочетании с аскорбиновой кислотой как потенциальные противоопухолевые агенты (соавт. В.И.Чиссов, Р.И.Якубовская, М.Е.Вольпин, Н.Ю.Крайнова, И.Я.Левитин, З.Я.Митяева, Г.Н.Новодарова, В.К.Огонезов)// Российский химический журнал, № 5,1998 г., с.116;

. Комплексы кобальта с основаниями Шиффа как потенциальные противоопухолевые агенты и модификаторы терапии рака (соавт. Р.И.Якубовская, М.Е.Вольпин, Л.Н.Бубновская, И.И.Ганусевич, И.Я.Левитин, В.К.Оганезов, С.П.Осинский, А.Л.Сиган, В.В.Сургай, М.В.Цикалова)// Российский химический журнал, № 5, 1998 г., с.128;

. Терафтал - новый препарат для бинарной каталитической терапии злокачественных опухолей (соавт. Р.И.Якубовская, Л.М.Михайлова, А.Б.Сыркин, Г.К.Герасимова, О.С.Жукова, Е.М.Трещалина, Б.С.Кикоть, Л.Г.Гатинская, Н.И.Зимакова, Е.Ю.Колесникова, Н.А.Оборотова, А.П.Полозкова, Н.Н.Трапезников, Г.Н.Ворожцов, О.Л.Калия, С.Г.Кузьмин, Е.А.Лукьянец) II Российский химический журнал, № 5, 1998 г., с.140;

. In vivo study of Binary Catalitic Systems (R.Yakubovskaya, E. Nemtsova et al.)//10,h NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, 1998, p. 545;

. Бинарные каталитические системы на основе металлокомплексов кобальта как новые противоопухолевые средства (А. А. Панкратову/Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии (материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых), 1999 г., с.31;

. Бинарные каталитические системы как новые противоопухолевые средства (соавт. Р.И.Якубовская, В.И.Чиссов, Т.А.Кармакова, Н.Н.Трапезников, Г.К.Герасимова, Е.М.Трещалина, О.С.Жукова, Г.Н.Ворожцов, О.Л.Калия, Е.А.Лукьянец, И.Я.Левитин)// Российский онкологический журнал, № 6, 2000 г., с. 23;

i. Бинарные каталитические системы как новые противоопухолевые средства (соавт. Р.И.Якубовская, Л.М.Михайлова, В.И.Чиссов, Е.Р.Немцова, Т.В.Сергеева, Г.К.Герасимова, Е.М.Трещалина, Г.Н.Ворожцов, О.Л.Калия, Е.А.Лукьянец, М.Е.Вольпин, И.Я.Левитин, М.В.Цикалова)//Высокие технологии в онкологии (материалы V Всероссийского съезда онколог); Казань; том 1, 2000 г., с. 234;

i. Эфиры окта-4,5-карбоновой кислоты фталоцианина кобальта их комплексы включения с пропиленгликолевым эфиром бета-циклодекстрина и способ подавления опухолевого роста (соавт. Р.И.Якубовская, Г.Н.Ворожцов, А.Н.Калиниченко, Ю.М.Лужков, В.И.Чиссов, О.Л.Калия, Т.А.Кармакова, Е.А.Лукьянец, З.В.Морозова, Н.В.Теплякова)// Патент РФ 2000110353,2000 г.

Участок множительной техникн POHU им. Н.Н. Блохина РАМН

Заказ 77

Тираж 100 экз.

1. Актуальность проблемы.

Одним из ведущих методов в комплексном лечении злокачественных новообразований является химиотерапия.

К настоящему моменту в клинической практике используется более 50 1 противоопухолевых лекарственных средств. Это препараты платины (цис-платин, карбоплатин, цикл оплатам и другие), акилирующие агенты (цикло-фосфан, сарколизин, эмбихин тиофосфамид и другие), антиметаболиты ( ме-тотрексат, 5-фторурацил, меркаптопурин и другие), антибиотики (адриами-цин, блеомицин, дактиномицин и другие), вещества растительного происхождения и ферменты (винбластин, винкристин, виндезин, кампто и другие), гормональные препараты (тамоксифен и другие), а также синтетические ци-тостатики относящиеся к различным классам (дакарбазин, натулан, милтекс, спиробромин и другие ) [67].

Принято считать, что в настоящее время нет оснований надеяться открыть препарат против рака, который был бы эффективен при всех видах злокачественных опухолей. Действительно, существует более 200 типов злокачественных опухолей человека и между опухолями даже одного органа имеются различия в гистологическом строении, в особенностях роста, во взаимодействии с организмом и т.д. Как правило, спектр действия того или иного цитостатика ограничивается несколькими, а иногда только одной опухолью или ее морфологическим вариантом. В то же время в современной химиотерапии можно усмотреть тенденцию к созданию противоопухолевых препаратов имеющих широкий спектр противоопухолевого действия.

Применение химиотерапии лимитировано высокой токсичностью противоопухолевых препаратов, которое обуславливает поражение не только ткани опухоли, но и поражение нормальных тканей, и, прежде всего тканей, обладающих высокой пролиферативной активностью : костного мозга, желудочно-кишечного тракта, лимфатической системы, тканей репродуктивных органов [13, 242].

Разработка путей повышения эффективности химиотерапии опухолей развивается по разным направлениям. Главными из них является создание новых, более избирательно действующих на опухолевые клетки препаратов, разработка комбинированного применения двух и более цитостатиков (полихимиотерапия), оптимизация методик применения противоопухолевых агентов, совершенствование химиотерапии, как звена или этапа комплексного и комбинированного лечения больных со злокачественными опухолями, применение других фармакологических средств с целью уменьшения побочного действия противоопухолевых препаратов и т.д. Большое внимание уделяется изучению механизмов действия цитостатиков, их фармакокинетике и фарма-кодинамике. На основе полученных данных разрабатываются рациональные методы использования известных противоопухолевых лекарственных средств и определяются пути создания новых эффективных противоопухолевых препаратов.

Новая стратегия в терапии опухолей предполагает использование оригинальных, нетрадиционных подходов. Одним из таких подходов является бинарная терапия опухолей, включающая два компонента, необходимых для получения терапевтического эффекта, каждый из которых в отдельности не проявляет противоопухолевого действия. К этому виду лечения относится фото динамическая терапия, сочетающая применение фотосенсибилизатора с местным лазерным облучением [69]. Данный метод противоопухолевой терапии основан на образовании высокореактивных продуктов (активных форм кислорода (АФК) и других свободных радикалов (СР), обладающих цитоток-сическими и цитостатическими свойствами), при взаимодействии фотосенсибилизатора с лазерным излучением определенных длин волн [35]. Этот метод лечения проходит клиническую апробацию во всем мире.

Новое направление в бинарной терапии опухолей было предложено в 1995 г академиком М.Е.Вольпиным, член-кореспондентом РАН Г.Н.Воржцовым и мэром г. Москва Ю.М.Лужковым. Этими учеными-химиками в качестве потенциальных противоопухолевых агентов были предложены бинарные каталитические системы (БКС), которые эффективно генерировали АФК и СР при взаимодействии двух химических соединений, одно из которых является катализатором (металлокомплексы (Мк) переходных металлов), а другое восстановителем [21]. В дальнейшем этот потенциальный метод противоопухолевой терапии получил название - бинарная каталитическая терапия (БКТ). Теоретически этому виду терапии могут быть доступны опухоли любой локализации.

Разработка этого метода противоопухолевого лечения проводится, кооперированно рядом научно-исследовательских институтов : ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», ИНЭОС РАН, МНИОИ им. П.А.Герцена, РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и других.

В России, в ИНЭОС РАН и ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» на протяжении последних двадцати лет ведутся исследования каталитических свойств широкого круга комплексов переходных металлов в реакциях окисления природных восстановителей (аскорбиновая кислота, тиолы и др.) с целью поиска новых комплексов переходных металлов (кобальта, железа, марганца и других), проявляющих активность в биологических системах. Эти исследования позволили выявить новые источники АФК и СР среди комплексов кобальта и железа с макроциклическими и хелатирующими лигандами и комплексов ор-ганокобальта с тридентантными основаниями Шиффа [12, 16, 57, 244].

Поскольку одним из механизмов цитотоксического и цитостатического действия таких методов консервативной противоопухолевой терапии, как лучевая терапия [41, 73, 77], фотодинамическая терапия [35, 37] и химиотерапия при использовании ряда препаратов (блеомицин, антрациклиновые антибиотики) [25, 29], является поражение структурных элементов опухолевой ткани АФК и CP, то бинарные каталитические системы «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота» были исследованы в бесклеточных химических системах на способность вызывать деструкцию различных биомолекул (ДНК, РНК, Сахаров и др) и апробированы в системе in vitro на опухолевых клетках человека в качестве цитотоксических агентов. В этих тест-системах было показано, что бинарные каталитические системы «Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота» вызывают деградацию ДНК, РНК, углеводов и других биомолекул [12] и обладают цитотоксическими свойствами. Выявленная in vitro высокая цитотоксическая активность бинарных каталитических систем свидетельствовала о целесообразности всестороннего изучения их противоопухолевых свойств in vivo на животных с опухолями в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

2. Цель исследования.

Целью исследования являлось изучение противоопухолевых и токсических свойств бинарных каталитических систем на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты на экспериментальных моделях in vivo.

3. Задачи исследования. Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. провести скрининг бинарных каталитических систем «металлокомплекс + аскорбиновая кислота» in vivo;

2. разработать методические подходы к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo: на мышах с перевиваемыми опухолями изучить зависимость противоопухолевой эффективности бинарных каталитических систем "Металлокомплекс + Аскорбиновая кислота" от дозы металлокомплекса, молярного соотношения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения животным металлокомплекса и аскорбиновой кислоты; 3. провести доклиническое изучение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота»: изучить противоопухолевую эффективность бинарной каталитической системы на основе оксикобаламина на животных с перевиваемыми опухолями различного гистогенеза и с различной формой опухолевого роста в монорежиме и схемах полихимиотерапии; изучить общетоксическое действие (безвредность) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах («острую» токсичность и «хроническую» токсичность).

• ч • i

3. Научная новизна исследования.

В результате проведенных исследований показано, что бинарные каталитические системы на основе комплексов кобальта с фталоцианиновыми лигандами, корриновыми лигандами, тридентантными основаниями Шиффа в сочетании с аскорбиновой кислотой обладают выраженной противоопухолевой активностью in vivo.

Впервые на животных с асцитной (АОЭ) и солидной (Са-755) опухолях на примере двух бинарных каталитических систем: «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» разработаны методические подходы к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем in vivo. Показано, что противоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем «Металлокомплекс + Восстановитель» зависит от дозы металлокомплекса и дозы восстановителя, их молярного соотношения, временного интервала между введением, металлокомплекса и восстановителя, последовательности их применения, а также от пути и длительности введения бинарной каталитической системы животным.

На мышах и крысах с перевиваемыми опухолями - Р-388, L-1210, АОЭ, Са-755, LLC, В-16 и Рс-1 изучена противоопухолевая эффективность бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в монорежиме и схемах полихимиотерапии:

-определены терапевтические дозы и схемы применения бинарной каталитической системы для лечения животных с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами;

-определен спектр опухолей, чувствительных к лечению бинарной каталитической системой;

-установлено, что бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» обладает химиомодифицирующими свойствами, усиливая противоопухолевую эффективность препарата цисплатин.

Проведено доклиническое изучение общетоксического действия (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио на мелких лабораторных животных - мышах и крысах:

-дана количественная и качественная характеристика токсического и побочного действия препарата оксикобаламин-лио и бинарной каталитической системы на его основе при однократном и многократном применений животным;

-установлена зависимость токсического действия бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата оксикобаламин-лио от дозы и пути введения животным;

-выявлен наиболее чувствительный вид животных к токсическому действию бинарной каталитической системы и препарата оксикобаламин-лио;

-установлено токсическое и побочное действие бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» на периферическую кровь, почки», сосудистую систему и ЦНС животных;

-на основании данных по количественной токсичности бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» рекомендована безопасная («стартовая») доза бинарной каталитической системы для человека при ее клиническом изучении по I фазе.

4. Научно-практическая значимость. Научно-практическая значимость работы заключается в методическом совершенствовании подходов к изучению противоопухолевых свойств бинарных каталитических систем «Металлокомплекс + Восстановитель» ш vivo.' ' .

Проведено полное доклиническое изучение бинарной каталитической системы на основе препарата оксикобаламин-лио. На основании данных, полученных при изучении противоопухолевых и общетоксических свойств (безвредности), бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» была рекомендована для проведения клинических испытаний. Полученные в работе данные вошли в отчеты по специфической противоопухолевой активности и общетоксическому действию (безвредности) бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбино-. 'i вая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио», представленные в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на I фазу клинического изучения указанных лекарственных средств. В настоящее время проводится клиническое изучение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» по II фазе.

5. Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им.

П.А.Герцена, XVI Менделеевском съезде в Санкт-Петербурге (1998); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» в Москве (1999); Ninth International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris (1999) и V Всероссийском съезде онкологов в Казани (2000). • ч б.Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ среди них - два патента на изобретение № 2114623 и № 2000110353, в которых изложены основные положения проведенного исследования.

7. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 разделов и 6 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, , выводов и списка литературы. Список литературы включает 244 источника. Работа иллюстрирована 23 рисунками, 20 таблицами и 2 схемами.

выводы Бинарные каталитические системы (БКС) «Металлокомплекс(Мк) + Аскорбиновая кислота(Ак)» на основе терафтала (Тф), пропиленгликолевого эфира терафтала (ЭТФ), оксйкобаламина (Ок) и ипрокола (Ипк) in vivo обладают противоопухолевой активностью, убывающей в следующем ряду: «Ок + Ак» > «ЭТФ + Ак» > «Тф + Ак» » «Ипк + Ак». Металлокомплексы и аскорбиновая кислота вне бинарной каталитической системы не оказывают противоопухолевого действия. Противоопухолевая эффективность бинарных каталитических систем зависит от дозы металлокомплекса, дозы аскорбиновой кислоты, молярного соотношения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты, временного интервала между их применением, а также последовательности введения металлокомплекса и аскорбиновой кислоты. Оптимальными режимами введения компонентов БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» и «ЭТФ + Аскорбиновая кислота» являются:

Мк, 1 -15 минут -*Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:30) - для легния животных с асцитными опухолями;

Мк, 60 минут -»Ак (молярное соотношение Мк:Ак — 1:10 и 1:30) — для лечения животных с солидными опухолями. Оптимальными схемами применения бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» в монорежиме при лечении животных с различными опухолями являются: а) внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по оксикобаламину), равной 75 мг/кг, при молярном соотношении окси-кобаламина и аскорбиновой кислоты - 1:30, и временном интервале между их введением, соответствующем 15 минутам (АОЭ и Р-388, асцитный вариант); б) внутривенно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по оксикобаламину), равной 50 мг/кг, при молярном соотношении оксикобала-мина и аскорбиновой кислоты - 1:10, и временном интервале между их введением, соответствующем 1 часу (Са-755, LLC, Рс-1 и Р-388, солидный вариант). Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» имеет широкий спектр противоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффективность. Чувствительность перевиваемых опухолей мышей и крыс к этой бинарной каталитической системе убывает в следующем ряду: АОЭ > Р-388 (привитый под кожу) > Р-388 (привитый в брюшную полость) > Са-755 > LLC = Рс-1 » В-16 = L-1210. Включение бинарной каталитической системы «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» в схемы традиционной противоопухолевой терапии повышает эффективность лечения мышей с опухолями по показателю средней продолжительности жизни (СПЖ) при АОЭ на 280±39% (БКС + «Цисплатин»); при Са-755 на 22±3% (БКС + «Цисплатин») и на 17+5% (БКС + «5-Фторурацил»), , На основе количественных и качественных характеристик токсического и побочного действия препарата «Оксикобаламин-лио» (Ок-лио) и бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» при однократном и многократном применении животным определены их индексы кумуляции, обратимость токсического эффекта, коэффициенты видовой чуствительности и степень опасности. БКС «Ок-лио + Ак» классифицирована как умеренно опасное (острое токсическое действие) и малоопасное (хроническое токсическое действие) лекарственное средство; препарат «Ок-лио» по степени опасности относится к малоопасным лекарственным средствам, независимо от характера токсического действия. Сферами избирательной токсичности бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» и препарата «Оксикобаламин-лио» при Их применении в токсических дозах являются эритроцит ты, тромбоциты, почки, сосудистая система и центральная нервная система.

Бинарная каталитическая система «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» не вызывает токсической лейкопении- и гранулоцитопении. Отсутствует интестинальная токсичность и анорексия. ). Определена начальная безопасная («стартовая») доза бинарной каталитической системы «Оксикобаламин-лио + Аскорбиновая кислота» для человека при проведении I фазы клинического изучения: а) для интраперитонеального применения - 33 мг/м (по Ок-лио;

Ок-лио:Ак - 1:30; Ок-лио, 15 минут + Ак) л б) для внутривенного применения - 59 мг/м (по Ок-лио; Оклио :Ак - 1:10; Ок-лио, 60 минут + Ак).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена экспериментальному изучению противоопухолевых г токсических свойств бинарных каталитических систем на основе комплек-;ов кобальта и аскорбиновой кислоты - источников активных форм кислоро-са (АФК) и других свободных радикалов (СР).

Являясь высоко реакционными частицами, АФК и СР обладают высо-:им цитотоксическйм потенциалом - вступая во взаимодействие с различными биологическими субстратами в клетке (белками, нуклеиновыми кисло-ами, липидами, углеводами) АФК и СР приводят к структурным и биохими-[еским изменениям в клетке и в большинстве случаев к ее гибели. В силу ;ысочайшей реакционной способности эти химические частицы не могут >ыть получены и использованы как обычные лекарственные средства. Для [ечения больных со злокачественными новообразованиями разработаны и [спользуются методы генерации АФК и других высокоактивных окислите-[ей непосредственно в опухолевой ткани - лучевая и фото динамическая те->апия. Однако эти методы консервативной противоопухолевой терапии ис-юльзуются только для локального или л око-регионарного лечения.

АФК и СР участвуют также и в реализации цитотоксического и цито-татического действия ряда противоопухолевых препаратов и, в частности, нтрациклиновых антибиотиков (доксорубицин, фарморубицин, дауноруби-[ина и других) и антибиотиков относящихся к классу флеомицинов (блеоми-рин, блеомицитин). Однако в отличии от лучевой терапии и фотодинамиче-кой терапии выброс АФК и СР в зоне опухоли при использовании этих хи-[иотерапевтических препаратов не столь мощный.

В 1987 г появилась работа Полинга с соавт в которой авторы изучали ротивоопухолевые свойства каталитических систем на основе комплексов ереходных металлов и Ак, генерирующих АФК и СР. Однако разработать акую систему применительно к терапии рака не удалось по причине того, то выбранные Мк были неустойчивы в физиологических условиях, а про

• 'i укты их распада оказались очень токсичными для организма животных.

В России эти исследования были начаты в конце восьмидесятых годов ЮД руководством академика М.Е.Вольпина [21] и продолжены в последую-цем как в ИНЭОСе, так и ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» под руководством чл-:ор. РАНГ.Н.Ворожцовым [16, 57$ЦЧ].

В ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и ИНЭОС РАН было синтезировано более 10 комплексов кобальта и железа с макроциклическими и хелатирующими [игандами, а также комплексов органокобальта с тридентантными основаиями Шиффа, которые в сочетании с восстановителем - Ак эффективно ге

• 'i ерировали АФК и СР.

Наиболее активные в катализе Мк, а их оказалось более 40, были пересаны в МНИОИ им. П.А.Герцена и РОНЦ им. Н.Н.Блохина для изучения их [ротивоопухолевых свойств в составе БКС «Мк + Ак» в скрининговой тест-истеме in vitro.

Основными критериями при отборе субстанций Мк для дальнейшего вучения их противоопухолевых свойств в составе БКС в скрининговой тест-истеме in vivo являлись высокая цитотоксическая активность БКС in vitro и (тсутствие таковой для отдельных ее компонентов. Кроме того, учитывались шзико-химические свойства Мк, которые в той или иной степени определя-эт его биосовместимость (растворимость, стабильность в водных растворах [ хидких средах организма), а также технологичность получения.

Исходя из вышесказанного пятнадцать БКС «Мк + Ак» на основе ком-шексов кобальта и железа с фталоцианиновым лигандом, корриновым ли-андом и тридентантными основаниями Шиффа были отобраны для даль-[ейшего изучения противоопухолевых свойств.

В нашей работе были исследованы четыре БКС на основе натриевой оли окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта (терафтала), его производного пропиленгликолевого эфира окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта

ЭТФ); Coa - [a - (5,6 - диметилбензимидазолил)] - CoP - оксикобамида гид-юхлорида (оксикобаламина) и изо-пропил-мер-|К-(2-аминоэтил)-ацетил аце-илидениминато] кобальт(+1) бромида (ипрокола).

На мышах с АОЭ установлено, что тестируемые Мк и Ак вне БКС не (бладают собственной противоопухолевой активностью. В то время как БКС Тф + Ак", "ЭТФ + Ак" и "Ок + Ак" оказывали выраженное противоопу-:олевой действие значительно увеличивая продолжительность жизини швотных с опухолью. Причем противоопухолевая активность этих БКС бы-ia сопоставима с таковой для официнального препарата цисплатин. БКС на юнове ипрокола в этой биологической системе оказалась менее ффективной.

Проведенные исследования (in vitro и in vivo) подтвердил идею, выска-анную академиком'М.Е.Вольпиным, о возможности использования БКС на юнове Мк переходных металлов в качестве потенциальных противоопухоле-,ых средств. На основании полученных данных для доклинического изучения противоопухолевых свойств на экспериментальных моделях in vivo были »тобраны три БКС: «Тф + Ак», «ЭТФ + Ак» и «Ок + Ак».

Первые два комплекса кобальта являются производными окта-4,5-:арбоновой кислоты фталоцианина кобальта - терафтал является ее натриевой солью, а ЭТФ - ее пропиленгликолевым эфиром. Наличие восьми карбоксильных групп в молекуле терафтала придает этому соединению ряд не-[0CTáTK0B, среди которых особо следует отметить агрегацию молекул тераф-ала в водных растворах и жидких средах организма (что приводит к сниже-[ию его каталитической активности) и способность связывать ионы 2-х ва-¡ентных металлов и, в первую очередь, ионы кальция и магния (что может [риводить к нежелательным побочным токсическим эффектам при введении того соединения животным). В отличие от терафтала, ЭТФ является эфиром. )тсутствие активных гидроксильных групп придает этому соединению ряд [риимуществ по сравнению с терафталом. Так, молекулы ЭТФ не агрегирузт в водных растворах и жидких средах орагнизма и не являются комплек-онами. Однако субстанция ЭТФ предстовляет собой смесевой продукт следствие различного количества оксиэтильных групп в эфирной компонен-е молекулы (рис .4 Б), что создает определенные трудности при создании тандартной субстанции.

Третий комплекс кобальта - оксикобаламин (ОН-СЫ, Ок) относится к - 'i риродным корринам. Наряду с цианкобаламином," метилкобаламином и аде-[озинкобаламинамином, оксикобаламин входит в группу структурно и био-югически родственных соединений - кобаламинов. В отличии от фталоциа-[иновых комплексов кобальта - терафтала и ЭТФ, кобаламины являются эн-[обиотиками и относятся к витаминным препаратам группы В12, которые интезируются в организме человека и животных микрофлорой кишечника и аироко представлены в тканях человека и животных.

Следует отметить, что клетки различных тканей имеют различную экс-[рессию рецепторов к транскобаламину II. Наибольшее количество этих ре-[епторов находится на клетках интенсивно пролиферирующих тканей, в том меле и на опухолевых, что обуславливает определенную исбирательность »пухолевых клеток для кобаламинов [79,100,186].

В связи с тем, что БКС «Металлокомплекс + Восстановитель» в каче-;тве противоопухолевых средств изучаются впервые, то первоочередной задачей являлось разработка методических подходов к изучению их противо-»пухолевых свойств ш vivo на животных с перевиваемыми опухолями.

Поскольку цитотоксические и цитостатические АФК и CP образуются фи взаимо действии двух химических соединений - катализатора (комплек-;а кобальта) и субстрата окисления (восстановителя, Ак) необходимо было юдобрать оптимальные режимы введения катализатора и востановителя животным с опухолью при которых, терапевтическая эффективность БКС была )ы максимальной.

В связи с этим, на двух экспериментальных опухолевых моделях - мо-,ели асцитной опухоли (мыша АОЭ) и модели солидной опухоли (мыши с ✓а-755) изучена зависимость противоопухолевого эффекта двух БКС - «Ок + ис» и «ЭТФ + Ак» от дозы Мк, молярного (дозового) соотношения Мк и Ак, ременного интервала между их применением, а также последовательности ведения Мк и Ак животным. Установлено, что эффективность исследуемых ¡КС как при внутрибрюшинном (мышам с АОЭ), так и при внутривенном мышам с Са-755) применении повышалась с увеличением дозы Мк при фик-ированом молярном соотношении Мк и Ак и молярного соотношения Мк и ус при фиксированной дозе Мк.

Противоопухолевая эффективность исследуемых БКС при внутри-рюшинном применении мышам с АОЭ в большей степени зависит от мо-ярного соотношения Мк и Ак, чем от дозы Мк. Максимальная эффектив-юсть БКС «Ок + Ак» и «ЭТФ + Ак» при внутрибрюшинном введении ком-тентов БКС была отмечена при их молярном соотношении, равном 1:30 щс'^Щ. При внутривенном применении БКС на основе оксикобаламина мы-1ам с Са-755 ее противоопухолевая эффективность в равной степени зависи-а как от дозы Ок, тйк и от молярного соотношения Ок и Ак (табл. 2).

Очень важным для реализации противоопухолевого эффекта БКС ока-ался временной интервал между введением катализатора и восстановителя, ак, внутрибрюшинное введение мышам с АОЭ Мк с последующим, через 1 15 минут, введением Ак было наиболее эффективным. Увеличение времен-:ого интервала между введениями Ок или ЭТФ и Ак с 30 минут до 1 часа ффективность этих БКС резко снижалась и увеличивалась их токсичность рис. ). При внутривенном применении БКС «Ок + Ак» мышам с Са-755 аблюдали обратную зависимость терапевтического и токсического эффек-ов этой БКС от временного интервала между введением ее компонентов, ак, последовательное применение Ок и Ак с временным интервалом между х введением от 1 минуты до 15 минут было не эффективным и токсичным.

Максимальный противоопухолевый эффект БКС на основе Ок при внутри-енном применении животным был достигнут только при временном интер-але между введением Ок и Ак, равным 1 часу (рис$).

Установленная зависимость противоопухолевого эффекта БКС «Ок + ус» и «ЭТФ + Ак» от интервала времени между введением катализатора и осстановителя связана с различиями в биодоступности и фармакокинетике )к, ЭТФ и Ак при внутрибрюшинном и внутривенном путях их введения.

При изучении противоопухолевой эффективности БКС «Ок + Ак» и ЭТФ + Ак» в зависимости от последовательности введения животным ме-аллокомплекса и восстановителя эффективным оказался только один режим: начале введение металлокомплекса, затем восстановителя.

В результате этих исследований определены оптимальные режимы нутрибрюшинного и внутривенного введения Мк (Ок и ЭТФ) и Ак для ле-ения животных с асцитными и солидными опухолями, соответственно:

Мк, 0-15 минут-»Ак (молярное соотношение Мк:Ак-1:30);

Мк, 60 минут ->Ак (молярное соотношение Мк:Ак - 1:10 и 1:30).

Высокая противоопухолевая активность БКС «Мк + Ак» выявленная в крининговой тест-системе in vivo послужила основанием для принятия решения о проведении полного доклинического изучения БКС на основе Тф, )ТФ и Ок в качестве, оригинальных противоопухолевых средств.

Доклиническое изучение противоопухолевых и токсических свойств ¡КС «Тф + Ак» проведено в РОНЦ им. Н.Н.Блохина. Другая, эффективная в [ротивоопухолевом отношении БКС «ЭТФ + Ак» находится на стадии разработки стандартной субстанции и лекарственного препарата на ее основе в [>ГУП «ГНЦ «НИОПИК» и МНИОИ им. П.А.Герцена. В нашей лаборатории ¡ыло проведено доклиническое изучение противоопухолевых и токсических совместно с РОНЦ им. Н.Н.Блохина) свойств БКС на основе Ок.

Доклиническое изучение противоопухолевой эффективности БКС «Ок - Ак» в монотерапии было проведено на мышах и крысах с перевиваемыми

Пухолями различного гистогенеза и формой опухолевого роста - АОЭ, Р-88, L-1210, Са-755, LLC, В-16 и Рс-1.

На первом этапе этих исследований на двух опухолевых моделях - мо-;ели асцитной опухоли (мыши с АОЭ) и модели солидной опухоли (мыши с "а-755) определен диапазон терапевтических доз БКС «Ок + Ак» при внут-ибрюшинном и внутривенном, соответственно, введении оксикобаламина и скорбиновой кислоты для лечения животных с асцитными и солидными пухолями(рис.13 и W).

Далее на мышах и крысах с асцитными и солидными опухолями, а акже гемобластозами была изучена противоопухолевая эффективность БКС Ок + Ак» в режиме монотерапии в зависимости от количества ее введений сивотным. Показано, что с увеличением количества введений животным IKC увеличивается не только ее противоопухолевая эффективность но и ток-ичность. В результате проведенных исследований были установлены тера-евтические дозы и схемы применения БКС «Ок + Ак» для лечения живот-:ых с асцитными опухолями, солидными опухолями и гемобластозами:

- внутрибрюшинно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по Ок), равной 75 мг/кг (суммарная доза 225 мг/кг) при молярном соотношении Ок и Ак, равном 1:30 - для лечения животных с опухолями, привитыми в брюшную полость (асцитные опухоли и гемобластозы привитые в брюшную полость);

- внутривенно ежедневно в течение 3-х дней в разовой дозе (по Ок), равной 50 мг/кг (суммарная доза 150 мг/кг) при молярном соотношении Ок и Ак, равном 1:10 - для лечения животных с солидными опухолями и гемобластозами привитыми под кожу.

Используя оптимальные терапевтические дозы и режимы введения Ок Ак определен спектр перевиваемых опухолей мышей и крыс чувствитель-ых к лечению БКС «Ок + Ак». Показано, что эта БКС оказывала выражен-ое противоопухолевое действие в отношении 5 из 7 изученных опухолей сивотных. Наиболее чувствительными опухолями к терапии БКС на основе к были АОЭ (УПЖ - 102%) и лимфолейкоз Р-388, привитый под кожу (ТРО а уровне 85% - 57% сохранялось в течение 10 дней после лечения); сред-юю чувствительность имели лимфолейкоз Р-388, привитый в брюшную по-ость (УПЖ - 25%) и солидные опухоли Са-755, LLC и Рс-1 (ТРО на уровне 7% - 51% сохранялось в течение 19 - 21 дня после лечения); лимфолейкоз L-210, привитый в брюшную полость и солидная меланома В-16 оказались пухолямй не чувствительными к лечению БКС «Ок + Ак». Полученные анные свидетельствуют о том, что БКС «Ок + Ак» имеет широкий спектр ротивоопухолевого действия и среднюю противоопухолевую эффектив-ость. Следует отметить, что эффективность этой бинарной каталитической истемы у мышей с АОЭ и лимфолейкозом Р-388, привитым под кожу сопос-авима с эффективностью препарата цисплатин.

Широкий спектр противоопухолевого действия БКС на основе Ок сви-етельствует об отсутствии избирательности ее специфического действия.

В отличие от БКС, Ок и Ак не обладают противоопухолевой активно-тью в отношении большинства использованных в исследовании опухолевых ггаммов. Только лймфолейкоз Р-388, привитый под кожу оказалася опухо-ью, чувствительной к Ок. Так, многократное применение Ок в суммарных озах, равных 150 мг/кг и 250 мг/кг, приводило к статистически достоверно-[у ингибированию роста опухоли на 76% - 50%. Противоопухолевая актив-ость Ок в отношении лимфолейкоза Р-388, привитого под кожу, может быть бусловлена рядом обстоятельств. Так, клетки лимфолекоза Р-388 могут экс-рессировать относительно высокий (по сравнению с другими опухолями :ивотных) уровень рецепторов к транскобаламину II, что способствует акоплению Ок в этих опухолевых клетках. Кроме того, известно, что ргацизм мышей способен синтезировать эндогенную Ак. В результате чего )к может катализировать окисление Ак непосредственно в клетках опухоли образованием цитотоксических количеств АФК и СР. Помимо этого, можно редположить, что в клетках лимфолейкоза Р-388 недостаточна активность ндогенных антиоксидантов элиминирующих АФК и CP, что также способтвует накоплению - цитотоксических количеств АФК и других активных кислителей, образующихся в результате каталитического окисления эндо-енной Ак в клетках лимфолейкоза Р-388.

Современная химиотерапия - интенсивный вид противоопухолевого ечения, сочетающий применение нескольких противоопухолевых препара-ов одновременно или в различной последовательности, что приводит к по-ышению эффективности проводимого лечения.

Для повышения результатов лечения животных с опухолями БКС «Ок Ак» была изучена ее противоопухолевая эффективность в сочетании с тра-иционными цитостатическими препаратами по схеме «БКС + Цитостатик». ^следования были проведены на двух экспериментальных опухолевых мо-елях - асцитной опухоли (мыши с АОЭ) и солидной опухоли (мыши с Са-55). Наиболее эффективным оказалось внутрибрюшинное комбинированное рименение БКС «Ок + Ак» и препарата цисплатин мышам с АОЭ. Так, со-етанное применение БКС и цисплатина приводило к увеличению продолжи-ельности жизни мышей с этой опухолью на 234% - 340% и полному излече-ию от опухоли 17% - 30% животных.

Внутривенное комбинированное применение БКС «Ок + Ак» и циспла-ина, а также БКС и 5-фторурацила мышам с Са-755 повышало эффектив-ость лечения на 22% и 17%, соответственно, по сравнению с эффективно-тью этих противоопухолевых препаратов используемых в монотерапии.

Ярко выраженный синергизм противоопухолевого действия комбини-ованного применения БКС «Ок + Ак» и препарата цисплатин позволяет редположить наличие у этой БКС химиомодйфицирующих свойств в отно-1ении противоопухолевой активности этого цитостатика.

Ок вне БКС как при внутрибрюшинном, так и при внутривенном вве-ении мышам с АОЭ и Са-755, соответственно, не оказывал влияния на тера-евтическую эффективность доксорубицина, циклофосфана и 5-»торурацила. Однако комбинированное применение Ок и цисплатина у мы

1ей с АОЭ повышало эффективность проводимого лечения на 22 % по срав-ению с эффективностью этого цитостатика, используемого в монотерапии.

В настоящее время нами проводятся исследования по изучению хи-[иомодифицирующих свойств БКС «Ок + Ак», направленные на снижение оз высокотоксичных противоопухолевых препаратов. По предварительным анным включение этой БКС в схему лечения животных с опухолями препа-атом цисплатин позволяет снизить дозу высокотоксичного цитостатика в 2 -раза без снижения эффективности проводимого лечения. Химиомодифици-ующие свойства в отношении противоопухолевой активности цисплатина ыли выявлены и у других БКС - «Тф + Ак» и «ЭТФ + Ак».

Свободнорадикальный механизм противоопухолевого действия БКС, а акже синергизм противоопухолевого действия БКС на основе Ок, Тф и ЭТФ цисплатина послужили основанием к изучению этих лекарственных редств в качестве модификаторов лучевой терапии поскольку поиск эффек-ивных радиомодификаторов также является одной из актуальнейших про-лем клинической онкологии. Эти исследования проводятся совмесно с [ТЭБ РАН в рамках Московской Программы «Борьба со злокачественными овообразованиями». Предварительные данные, полученные в ИТЭБ РАН видетельствуют о синергизме противоопухолевого действия БКС на основе ф и Ок и лучевой терапии. Установлено, что эти БКС в сочетании с лучевой грапией значительно увеличивают выживаемость мышей с опухолями, в то ремя как лучевая терапия или БКС в отдельности практически не оказывали ечебного действия.

Широкий спектр противоопухолевого действия, а также синергизм ротивоопухолевого действия БКС «Ок + Ак» и традиционных цитостатиче-ких препаратов и, прежде всего, препарата цисплатин свидетельствовали о елесообразности апробации этой БКС в клинике. В связи с этим было пройдено доклиническое изучение общетоксического действия (безвредности) КС «Ок + Ак». Предклинические токсикологические исследования БКС «Ок Ак» были проведены с использованием новой лекарственной формы Ок репарата оксикобаламин-лио (Ок-лио), который был разработан в МНИОИ м. П.А.Герцена.

Параллельно с изучением общетоксического действия (безвредности) КС «Ок-лио + Ак» была изучена безвредность препарата «Ок-лио» в новой екарственной форме - оксикобаламина лиофилизированного предназначен-ого для парентерального применения в высоких дозах.

При предклиническом токсикологическом изучении БКС «Ок-лио + ло> строго учитывались рекомендуемые в клинику способ и режим введения >к-лио и Ак:

-в брюшную полость, ежедневно в течение 3-х дней; Ок-лио, 15 минут Ак, Ок-лио: Ак - 1:30;

-внутривенно, ежедневно в течение 3-х дней; Ок-лио, 60 минут + Ак, >к-лио:Ак- 1:10.

В нашей работе было изучено общетоксическое действие (безвред-ость) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» на мелких лабораторных квотных - мышах и крысах («острая» токсичность и «хроническая» ток-нчность). Исследования на крупных животных - кроликах и собаках, а так-:е изучение местно-раздражающего действия и аллергогенности БКС «Окно + Ак» и препарата «Ок-лио» были проведены в РОНЦ им. Н.Н.Блохина в аборатории фармакологии и токсикологии лекарств [28].

В результате изучения «острой» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и репарата «Ок-лио» на мелких лабораторных животных (мыши, крысы) дана эличественная оценка токсичности этих лекарственных средств при одно-ратном внутрибрюшинном и внутривенном применении по критериям рас-зтных доз: ЬБ10 (МПД), IX»)6,1Ю50 и (табл. 10 -12 ).

При анализе данных по количественной токсичности БКС «Ок-лио + к» определены «широкая» широта токсического и смертельного действия КС. Показано, что БКС «Ок-лио + Ак» при внутрибрюшинном применение элее токсична, чем при внутривенном. Установлено отсутствие зависимости жсичности БКС «Ок-лио + Ак» от пола животных.

Сопоставляя данные по количественной токсичности БКС «Ок-лио + ,к» на грызунах, установлено, что наиболее чувствительным видом из мел-их грызунов к токсическому действию БКС при внутривенном применении дозах, расчитанных как на массу тела, так и на поверхность тела, являются ыши. При внутрибрюшинном применении БКС «Ок-лио + Ак» в дозах, рас-итанных на массу тела мыши и крысы, одинаково чувствительны к токсиче-кому действию бинарной каталитической системы, а в дозах, расчитанных а поверхность тела, мыши являются более чувствительным видом живот-ых, чем крысы. В' лаборатории фармакологии и токсикологии лекарств ОНЦ им. Н.Н.Блохина при изучении «острой» токсичности на собаках было становлено, что собаки более чувствительны к БКС при ее внутривенном рименении, чем мыши в дозах, расчитанных на массу тела, и менее чувствй-зльны, чем мыши и крысы при применении в дозах, расчитанных на по-зрхность тела (ВТД (МПД) - 150 мг/кг или 3000 мг/м2).

При сопоставлении данных по количественной токсичности, на разных [ивотных (мышах, крысах, и собаках) определен коэффициент видовой чув-гвительности (КВЧ) БКС «Ок-лио + Ак». Коэффициент видовой чувстви-гльности БКС «Окглио + Ак» определен как отношение 1ЛЗю для крыс к ТД (МПД) для собак при однократном внутривенном применении и соста-нл величину, равную 1,8 (из расчета на массу тела животных), что соответ-гвует невыраженным различиям в видовой чувствительности животных к КС «Ок-лио + Ак». КВЧ бинарной каталитической системы «Ок-лио + Ак» ри ее внутривенном применении животным в дозах, расчитанных на по-зрхность тела, составил величину, равную 5 (отношение ЫЗю для мышей к ТД (МПД) для собак), что соответствует средневыраженным различиям в адовой чувствительности животных к БКС. Полученные данные дают осно-ание полагать, что ожидать особую видовую чувствительность человека к КС «Ок-лио + Ак» нет оснований.

В результате проведенных исследований установлена причина смерти эызунов от однократного внутрибрюшинного и внутривенного применения

КС «Ок-лио + Ак» в летальных дозах. Данные клинической картины инток-икации и результату патологоанатомического исследования погибших жи-отных свидетельствуют о том, что причиной смерти грызунов (мышей и рыс) от однократного применения БКС «Ок-лио + Ак» в летальных дозах вляется сердечно-сосудистая недостаточность. Летальные дозы БКС «Окно + Ак» для собак установлены не были.

Учитывая широту токсического и смертельного действия и индекс ши-оты терапевтического действия (1Х)50/ТД) БКС «Ок + Ак» по степени опас-ости острого токсического действия можно классифицировать как умеренно пасное лекарственное средство.

В отличие от БКС «Ок-лио + Ак», препарат «Ок-лио» вне БКС по сте-ени опасности острого токсического действия относится к малоопасным ле-арственным средствам. При изучении «острой» токсичности препарата «Окно» на различных видах животных (мышах, крысах, кроликах и собаках) аиболее чувствительными оказались крысы (табл. 12).

При изучении «хронической» токсичности БКС «Ок-лио + Ак» и пре-арата «Ок-лио» на крысах установлено токсическое и побочное действие гих лекарственных средств на органы и системы организма животных при ногократном применении (ежедневно в течение 15 дней). Определены три ровня токсических доз для БКС «Ок-лио + Ак» (ВТД = МПД, НТД и ВНТД) два уровня токсических доз для Ок-лио (НТД и ВНТД), характеризующих жсичность БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-лио» при многократном рименении (табл. 13 и 18).

В результате проведенных исследований установлено, что сферами из-нрательной токсичности БКС «Ок-лио + Ак» при однократном и многоратном применении крысам являются: эритроциты, тромбоциты, почки, тсуды и ЦНС. В связи с этим выявлены специфические токсические и по-эчные осложнения у животных при применении БКС «Ок-лио + Ак», кото-ые имели дозозависимый и обратимый характер. Это прежде всего токсиче-сое действие БКС на сосудистую систему, которое проявлялось расширеним периферических сосудов, нарушением проницаемости сосудистой стенки, азвитием гемморрагического синдрома (кровоизлияния в паренхиму легких почек). Отмечено неблагоприятное влияние БКС «Ок-лио + Ак» на почки.

Нефротоксическое действие БКС возможно обусловлено специфиче-ким повреждением'активными формами кислорода и свободными радика-ами структурно-функциональной единицы почек - нефрона. К клиническим роявлениям нефротоксичности относились увеличение суточного диуреза эазвитие полиурии) и увеличение количества мочевины и креатинина в сы-оротке крови животных.

Отмечено токсическое действие БКС «Ок-лио + Ак» на перифериче-кую кровь, связанное с высокой тропностью оксикобаламина к эритроцитам тромбоцитам. Влияние БКС «Ок-лио + Ак» на периферическую кровь ха-актеризуется снижением числа эритроцитов, количества гемоглобина и воз-икновением ранней тромбоцитопении. Зафиксирована также тенденция к величению общего числа лейкоцитов за счет увеличения абсолютного и от-осительного числа нейтрофилов (нейтрофилез) и кратковременной абсо-ютной и относительной лимфоцитопении.

Установлено токсическое влияние БКС «Ок-лио + Ак» в высоких ток-ических дозах при однократном и многократном применении на централь-ую нервную систему (ЦНС) животных, которое проявлялось развитием у их гиподинамии, адинамии, миорелаксации, атаксии с креном влево и катаепсии различной степени выраженности (I или III степени), потерю болевой

-. ' > увствительности задних конечностей, что позволяет предположить угне-ающее влияние БКС на ЦНС.

Все вышеописанные токсические и побочные эффекты БКС «Ок-лио + 1К» были выявлены только при введении БКС «Ок-лио + Ак» животным в етальных, высоких токсических и низких токсических дозах. Функциональ-ая обратимость токсических и побочных эффектов после однократного и ногократного применения БКС «Ок-лио + Ак» составляла 15-60 дней.

Применение БКС «Ок-лио + Ак» в высоких нетоксических дозах не вы-ывало токсических эффектов у животных. '

Проведенные исследования безвредности БКС «Ок-лио + Ак» позволи-и констатировать отсутствие пневмотоксичности, гатроинтестинальной ток-нчности и кардиотоксичности.

Полученные данные по «хронической» токсичности БКС «Ок-лио + .к» на крысах позволили сопоставить их с данными по «острой» токсично-ги на крысах и расчитать индекс кумуляции (1к) БКС «Ок-лио + Ак»: 1к - [(МПД! - МПДП) / ((п-1) х (МПДП))] х 100% где, МПД - максимальнопереносимая доза при однократном и п-кратном ведении.

1к = [(81 - 1080) / (14 х 1080)] х 100% = -7.

Расчитанная величина 1к (-7) свидетельствует об отсутствии кумуля-явных свойств у БКС и обратимости ее токсических эффектов. Учитывая дозовый уровень токсического действия, индекс кумуляции обратимость токсических и побочных эффектов, БКС «Ок-лио + Ак» по гепени опасности «хронического» токсического действия можно классифи-ировать как малоопасное лекарственное средство.

Анализ данных по предклиническому изучению токсичности БКС «Окно + Ак» на различных видах животных (мыши, крысы, кролики, собаки) ыявил отсутствие повреждающего действия этой БКС на нормальные ткани выраженной пролиферативной активностью. За исключением небольшого эличества, все противоопухолевые цитостатики, используемые в клинике, ызывают угнетение гемопоэза и диспепсический синдром. БКС «Ок-лио + .к» не вызывала токсической лейкопении, гранулоцитопении, лимфоцито-ении. Отсутствовала также интестинальная токсичность и анорексия.

Данные по количественной токсичности препарата «Ок-лио» на крысах оказали, что препарат «Ок-лио» при многократном применении менее ток-нчен, чем БКС на его основе примерно в 2 раза.

Применение препарата «Ок-лио» в низкой токсической дозе приводило усилению белоксинтезирующей функции печени; увеличинению числа гйкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и количества гемоглобина в перифе-ической крови животных.

Однократное и многократное применение препарата «Ок-лио» в ле-эльных и максимально переносимых оказывало токсическое действие на |НС животных преимущественно угнетающего характера (вялость, адина-ия, гиподинамия, миорелаксация, атаксия, каталепсия). В лаборатории фар-акологии и токсикологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина установлено, что препа-ат «Ок-лио» при внутривенном введении крысам оказывает дозозависимое пияние на артериальное давление животных, вызывая умеренное гипотен-звное действие. Функциональная обратимость токсических и побочных эф-екгов после однократного и многократного применения препарата «Окно» составляла 15-60 дней.

Применение этого препарата не оказывало токсического действия на ункции сердца, почек, печени и желудочно-кишечного тракта.

Применение Ок-лио в высоких нетоксических дозах не вызывло токси-зских и побочных эффектов у животных.

На основании данных по количественной токсичности БКС «Ок-лио + .к», расчитана начальная безопасная (стартовая) доза для человека при ее циническом изучении по I фазе у больных со злокачественными новообра-званиями (схема 2)[123]: для интраперитонеального применения - 33 мг/м2 ю Ок-лио; Ок-лио:Ак - 1:30); для внутривенного применения - 59 мг/м2.(по 'к-лио; Ок-лио :Ак - 1:10), с последующей эскалацией доз по модифициро-шному методу Fibonacci [101].

СХЕМА УСТАНОВЛЕНИЯ НАЧАЛЬНОЙ (СТАРТОВОЙ) БЕЗОПАСНОЙ ДОЗЫ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА на I фазу клинических испытаний [123 ].

Мыши

Собаки

Эквивалентная доза

Эквивалентная 1Л)10, (МЕЫ)ю V

1/10 МЕЬБю мг/м2

Эквивалентная доза

Человек

I фаза: стартовая доза 1/10 МЕЬБ10

Начальная (стартовая) безопасная доза препарата «Оксикобаламин-лио» в составе БКС при I фазе клинических испытаний составляет: -дляинтраперптонеайьногоприменения - 33 мг/м (по Ок-лио; Ок-лио: Ак - 1:30; Ок, 15 минут —> Ак); -для внутривеноого применения - 59 мг/м2 (по 0Эк-лио; Ок-лио :Ак- 1:10; Ок, 60 минут .-> Ак).

Таким образом, в работе экспериментально обоснована возможность ^пользования БКС на основе Мк переходных металлов в качестве потенци-1ьных противоопухолевых средств для лечения больных со злокачествен->ши опухолями.

Разработаны методические подходы к изучению противоопухолевой ¡зфективности БКС «Мк + Ак» в эксперименте. Совместно с РОНЦ им. .Н.Блохина проведено полное доклиническое изучение БКС на основе пре-зрата «Ок-лио», включающее изучение специфической противоопухолевой [)фективности на животных (мышах и крысах) с перевиваемыми опухолями токсичности (безвредности) на различных видах животных (мышах, кры-IX, морских свинках, кроликах и собаках). Полученные в работе данные воли в отчеты по специфической противоопухолевой активности и общеток-иескому действию (безвредности) БКС «Ок-лио + Ак» и препарата «Ок-ю», представленные в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на клини-;ские испытания по I фазе этих лекарственных средств у онкологических шьных.