Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Ронколейкин и поликомпонентная вакцина "Пневмо-23" в коррекции иммунных нарушений и бактериальных осложнений у детей с атопической бронхиальной астмой

На правах рукописи

ГУЩИНА ЯНИНА СЕРГЕЕВНА

РОНКОЛЕЙКИН И ПОЛИКОМПОНЕНТНАЯ ВАКЦИНА «ПНЕВМО-23» В КОРРЕКЦИИ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ДЕТЕЙ С АТОНИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.00.36 аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО Владивостокском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Маркелова Елена Владимировна - доктор медицинских наук; Научный консультант:

Ицкович Александра Иосифовна- доктор медицинских наук, профессор. Официальные оппоненты:

Потапов Владимир Николаевич—доктор медицинских наук, профессор; Шаркова Валентина Александровна - кандидат медицинских наук, доцент.

Ведущая организация:

ГУ ГНЦ «Институт иммунологии» МЗ РФ (г.Москва)

Защита диссертации состоится С*^' -¿¿С?<4 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.02 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690950, Г.Владивосток, проспект Острякова,2, главный корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по тому же адресу (корпус 3).

ь да/и^ 2004

г.

Ученый секретарь Диссертационного Со] кандидат медицинских наук, доцент:

Р.Н.Диго

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В настоящее время регистрируется неуклонный рост аллергопатологии у детей с поражением бронхолегочной системы (Балаболкин И.И., 1992; Лусс Л.В. с соавт., 2000; Мачарадзе Д.Ш. с соавт., 2000). По данным мировой статистики за последние 30 лет произошло удвоение случаев бронхиальной астмы (БА) у детей (Дрожжев М.Е. с соавт, 2002; Hast A. etal.,1998). В Приморском крае с 1988 по 1998 годы заболеваемость БА среди детей возросла в 1,7 раза (Просекова Е.В., 2000). Известно также, что среди детей с БА наибольший процент частоболеющих бронхолегочными заболеваниями, а наиболее частыми возбудителями инфекционного поражения верхних и нижних отделов дыхательных путей при бронхиальной астме являются различные виды респираторных вирусов, а из бактерий - S.pneumoniae и H.influenzae. (Балкарова Е.О. с соавт., 1998; Чучалин А.Г.,1997; D'AmatoG. etai., 2002). Установлено, что во время обострений БА у 67% обследуемых обнаружена вирусная и /или бактериальная инфекция в бронхо-легочном аппарате (Федосеев Г.Б., 2001). Комплексное микробиологическое и иммунологическое обследование больных в фазе обострения БА, проведенное Л.А. Вишняковой (1990), позволило выявить инфекционно-воспалительный процесс почти исключительно пневмококковой этиологии, протекающий в клинически выраженной, стертой или бессимптомной формах (у 37% больных) при легком течении атопической БА. При этом, зафиксировано, что частота бактериальных инфекций резко увеличивается (до 86%) при тяжелом течении заболевания.

По данным многих российских и зарубежных исследований, пневмококковая инфекция занимает первое место в этиологии внебольничной пневмонии (Нонников В.Е., 2001; Сидоренко СВ. 2002; Шабалов Н.П. 2002; Caputo G.M. et al., 1993). Установлено, что пневмококк ответственней за 35-76% из диагностированных случаев. В Дальневосточном регионе в период с 2000 по 2003 годы А.В. Мартыновой было проведено исследование этиологической структуры внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах, при этом выявлено, что на долю S.pneumoniae приходится 56% случаев внебольничной пневмонии. Таким образом, пневмококк относится к одному из наиболее распространенных возбудителей инфекций дыхательной системы человека.

Необходимо отметить, что пневмококковая инфекция регистрируется в различных клинических формах, от отита, фарингита до бронхопневмонии. Существуют и другие, более редкие, иногда тяжелые формы этой инфекции (Baquero F. et al., 1998).

Неповрежденные кожные покровы и слизистые оболочки играют роль основных барьеров, предохраняющих организм от поступления извне экзогенных антигенов (Насонова Т.А. с соавт., 1993, Федосеев Г.Б., 2001). Нарушение барьерной функции слизистых оболочек в результате как прямого микробного повреждения, так и местного воспаления в ответ на инфекцию, может облегчать процесс проникновения аллергенов в организм (Казначеева Л.Ф. с соавт., 2001). Особенно серьезное значение этот феномен приобретает, вероятно, при бактериальных инфекциях респираторного тракта. Такие широко распространенные возбудители респираторных инфекции, как S.pneumonia, H.influenzae, Kl.pneumonia, Br.catarrhalis и др. обладают набором факторов вирулентности, которые ведут к ослаблению муко-цилиарного клиренса, участвуют в повреждении бронхо-легочного эпителия и нарушении его проницаемости, потенцируют местную воспалительную реакцию, которая, в свою очередь, усиливает повреждение (Федосеев Г.Б., 2001). По мнению Л АВишняковой (1990) это способствуют колонизации слизистой оболочки дыхательных путей и возникновению инфекционного процесса, облегчающего проникновение и накопление аллергенов. С одной стороны, происходит нарушение регуляции бронхо-моторного тонуса и нормальных процессов очищения слизистой, что увеличивает длительность присутствия аллергена на поверхности слизистой» оболочки, а с другой, обеспечивается облегчение доступа аллергенов к иммуннокомпетентным клеткам за счет увеличения проницаемости слизистой (Богатырев А.Ф. с соавт., 2001; Пыцкий В.И. с соавт.,1999).

Таким образом, атопические заболевания респираторного тракта, в частности бронхиальная астма, способствуют развитию вторичных бактериальных инфекций и, по типу обратной связи, бактериальное воспаление поддерживает атопический процесс. Такие дети, чаще подвержены респираторным инфекциям с дальнейшим развитием бактериальных осложнений. Становится очевидным, что без повышения иммунологической реактивности трудно добиться хорошего клинического эффекта при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях на фоне аллергопатологии. Несмотря на это, атопическая бронхиальная астма и бактериальные инфекции бронхо-легочной системы, как правило, с иммунологической точки зрения, рассматриваются независимо друг от друга. Отсутствие полного представления о состоянии местного иммунитета на уровне дыхательной системы, об иммунологических механизмах развития острого бактериального воспаления на фоне атопического процесса у детей с БА и определило интерес комплексного изучения > некоторых иммунологических аспектов у таких пациентов. Поиски новых возможностей в регуляции иммунного дисбаланса, предотвращения развития тяжелых бактериальных осложнений в условиях аллергического

воспаления, диктуют необходимость дальнейших исследований в этом направлении. Разработке этих вопросов и посвящена данная работа.

Цель исследования: Обосновать способы коррекции иммунных нарушений и предупреждения бактериальных осложнений у детей с атопической БА.

Задачи исследования.

1. Изучить цитокиновый статус (IL-2, IL-4, IL-8, IFN у и TNF а) и особенности его нарушений у детей с атопической бронхиальной астмой и острой внебольничной пневмонией.

2. Определить уровень локальной секреции оппозиционных цитокинов IL-4 и IFN-y в конденсате выдыхаемого воздуха удетей с атопической БА.

3. Исследовать конденсат выдыхаемого воздуха и жидкость назального лаважа на содержание секреторного IgA, метаболитов N0 и а ,-КГП при БА разной степени тяжести

4. Оценить возможность применения иммунотропного рекомбинантного цитокинового препарата IL-2- ронколейкина в ком плексной терапии атопической бронхиальной астмы у детей и провести клинико-иммунологический анализ его эффективности.

5. Оценить безопасность и клинико-иммунологическую эффективность проведения вакцинации поликомпонентной пневмококковой вакциной «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) у детей, страдающих атопической бронхиальной астмой.

Научная новизна.

•В результате выполненных исследований впервые в условиях г.Владивостока изучены особенности иммунитета у детей с острой внебольничной пневмонией на фоне аллергопатологии, дана комплексная оценка содержания цитокинов: IL-2, IL-4, IL-8, IFNу hTNFcx в сыворотке крови обследуемых. Показано, что у детей, страдающих бронхиальной астмой, при присоединении острой бактериальной пневмонии нарушения в цитокиновом статусе характеризуются усугублением системной гиперпродукции провоспапительных цитокинов IL-8 и TNF а и дефицитом IFN у.

Впервые проведены исследования конденсата выдыхаемого воздуха на содержание оппозиционных цитокинов (IL-4 и IFN у) и получены дополнительные доказательства превалирования ТН2-иммунных реакций при атопической бронхиальной астме. Исследован секреторный IgA в КВВ и выявлена обратная корреляционная зависимость с уровнем IL-4 в конденсате. Впервые у детей с БА в Приморском крае выявлены закономерности динамики биохимические маркеров воспаления (NO, оц-КГП) в жидкости назального лаважа при БА разной степени тяжести.

Использование иммунологических и клинико-лабораторных методов позволило обосновать целесообразность включения ронколейкина в комплексную терапию детей с атопической БА. Разработан новый способ лечения больных с бронхолегочной патологией. Получен патент на изобретение: «Способ лечения больных с бронхолегочной патологией» №2205659 от 10.06.2003.

Впервые дана комплексная оценка влияния вакцинации «Пневмо-23» на цитокиновый статус, уровень IgE и уровень специфических антител против разных серотипов пневмококка у детей с аллергопатологией, показана эффективность и безопасность ее применения у данной категории больных.

Практическая ценность работы:

1. Изучены некоторые иммунные механизмы воздействия патогенной бактериальной флоры на атопический процесс, что предопределяет необходимость предупреждения инфекционных осложнений у детей с атопической БА. Установлены дифференциально-диагностические критерии в цитокиновом спектре сыворотки крови у детей с БА и острой внебольничной пневмонией. Выявлен системный дефицит IFN у и гиперпродукция про воспалительных цитокинов IL-8 и TNFa. Величины, превышающие 43,63 пг/мл для IL-8 и 24,31 пг/мл для TNFa в сыворотке крови свидетельствуют о наличии острого бактериального воспаления.

2. Оценено состояние местных факторов защиты у детей с БА, показано преобладание ТН2 иммунных механизмов в респираторной системе. Полученные результаты исследования конденсата выдыхаемого воздуха на содержание цитокинов, определяют возможность дальнейших научных поисков в этом направлении.

3. Дана характеристика биохимических маркеров воспаления (NO, 61 -КГП) и секреторного IgA в КВВ и жидкости назального лаважа. Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания NO в этих биологических жидкостях при БА разной степени тяжести, что дает возможность проводить забор материала неинвазивным методом и использовать мониторинг метаболитов NO в КВВ и ЖНЛ в качестве диагностического критерия повреждения в оценке степени тяжести аллергического воспаления.

4. Обоснована целесообразность включения иммунокоррегирующей терапии рекомбинантным IL-2 (ронколейкином) у частоболеющих детей, страдающих бронхиальной астмой, что позволяет увеличить продолжительность ремиссии, снизить тяжесть и частоту обострений, уменьшить вероятность бактериальных осложнений.

5. Определена возможность безопасного и эффективного применения поликомпонентной вакцины «Пневмо-23» у детей с БА для профилактики пневмококковой инфекции.

Материалы по изучению клинико-иммунологической эффективности включения иммунокоррегирующего препарата ронколейкина в терапию часто болеющих детей с БА и опыт применения поликомпонентной вакцины «Пневмо-23» для профилактики бактериальных осложнений у таких детей вошли в методические рекомендации: «Клинико-иммунологические аспекты применения цитокинового препарата - ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у часто болеющих детей» и «Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» у детей с атопической бронхиальной астмой», утвержденные ВГМУ и департаментом здравоохранения Приморского фая (г.Владивосток, 2004). Данные методические рекомендации внедрены в практическое здравоохранение г.Владивостока, Приморского и Хабаровского края.

Апробация материалов диссертации:

Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня: III, V Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2002, 2004); VI, VII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СПб, 2002, 2003); Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины.Воспаление.Иммунитет» (СПб, 2002); V, VII Конгрессах РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002,2003); X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003); XIII Национальном конгресс по болезням органов дыхания (Москва, 2003); XVII Всемирном конгрессе по астме (СПб, 2003); I Всероссийской конференции по иммунотерапии (Сочи, 2003).

Публикации.

Основные результаты исследований изложены в 19 публикациях, в том числе 2 в международной печати и 1 патенте на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 152 листах машинописного текста, состоит из 5 глав, содержит введение, обзор литературы, описания материалов, методов исследования и лечения, результаты исследования, выводы, практические рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику, список использованной литературы, содержащий 293 источника (из них 180 отечественных авторов и 113 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 16 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У детей, страдающих бронхиальной астмой, при присоединении острой бактериальной пневмонии нарушения в цитокиновом статусе характеризуются усугублением системной гиперпродукции провоспалительных цитокинов 11_-8, ТЫРа и дефицитом 1РЫу.

2. Установлено превалирование ТН2 иммунных реакций в

респираторной системе детей с атопической БА и дефицит секреторного ДО

3. Применения 1Ь-2 - ронколейкина в терапии часто болеющих детей с БА в период ремиссии позволяет улучшить клинико-иммунологический статус пациентов и увеличить ее продолжительность.

4. Вакцинация пневмококковой вакциной «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) детей с БА, предотвращает развитие пневмококковой инфекции, способствует профилактике бактериальных осложнений, не обостряет атопический процесс.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ.

Контингент.

Исходя из цели и задач работы, был обследован 151 ребенок в возрасте от 4 до 16 лет. В это число вошло 34 больных атопической бронхиальной астмой (БА), 42 ребенка с БА, перенесших внебольничную пневмонию, 12 пациентов с БА и острой внебольничной пневмонией, 33 ребенка с острой внебольничной пневмонией и 30 практически здоровых детей этого же возраста. Работа выполнена на базе Городского аллерго-респираторного центра МУЗ поликлиники №4 г.Владивостока, Городской детской клинической больницы, детской больницы №4 г.Владивостока в период с 2000 по 2003 годы.

Диагноз атопической бронхиальной астмы выставляли согласно рекомендациям, изложенным в Глобальной стратегии по бронхиальной астме (1996), клинически диагноз острой пневмонии был установлен согласно классификации клинических форм бронхо-легочных заболеваний МЗ РФ (1995).

В качестве клинических критериев при проведении иммунотерапии учитывались: среднее число дней с явлениями бронхообструкции (по дневникам самоконтроля), среднее количество обострений БА, продолжительность одного обострения, частота заболеваний ОРВИ и обострений хронических очагов инфекции.

Основным материалом исследования служила кровь больных детей, конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ), жидкость назального лаважа (ЖНЛ). Исследования иммуно-биохимических показателей и клинико-лабораторных данных проводили до и через 1 мес. после иммуноориентированной терапии.

Все материалы и направления исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Направления, методы и объем исследований.

№ Направление исследования Методы исследования Объем работ

1 2 3 4

1 Клинико- лабораторные исследования 1. Анкетирование пациентов. 2. Комплексное клинико-лабораторное обследование больных и лиц контрольной группы в динамике. 121 анкета 151 человек

2 Характеристика цитокинового статуса 3. Количественна* оценка 11.-2, 11,-4, 11.-8, ТЫРа в. сыворотке крови определялись методом сэндвич-варианта твердофазного иммуио-ферментного анализа.. 4. Количественная оценка 11.-4 и 1РЫу в конденсате выдыхаемой влаги определялись методом сэндвич-варианта твердофазного иммуно-ферментного анализа. 680 проб 120 проб

3 Оценка состояния местного иммунитета 1. Определение содержания секреторного ^А в КВВ и назальных смывах иммуноферментным методом. 2. Определение метаболитов оксида азота в КВВ и ЖНЛ МО-колориметрическим методом. 3. Определение а1-кислого гликопротеина в КВВ и ЖНЛ иммуноферментным методом 80 проб 151/212 чел/проб 151/212 чел/проб

4 Оценка гуморального иммунитета 4. Определение общего ^Е в сыворотке крови 5. Определение АТ (1§М и ^й) к Э-рлеитотае в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа 120 проб 50/500 чел/проб

5 Статистическая обработка материала 6. Математическая обработка полученных показателей проводилась методами, вариационной статистики с использованием критериев Стъюдента, дисперсионного анализа на персональном компьютере с использованием программы "8Ш1$1|са 5" Все показатели

Цитокиновый профиль у детей с бронхиальной астмой и внебольничной пневмонией.

В результате проведенного исследования было установлено, что в сыворотке крови пациентов с атопической БА отмечаются достоверно высокие уровни 11_-4, 11_-8 и Т^а и дефицит 1РЫу (табл.2.).

Таблица2.

Содержание цитокинов в сыворотке крови детей, страдающих атопической бронхиальной астмой разной степени тяжести.

исследуемые цитокины содержание цитокинов м±ш (пг/мл)

ба (средний уровень) п=76 ба легкая (р.) п=41 ба ср.тяж (рО п=26 батяж (рз) п=9 контр, ф. п=30

1ь2 2,72±0,45 3,46±0,59 2,69±1,02 р2-р,>0,05 2,73*0,91 рз-р2>0,05 3,32±0,92

1ь4 7,87±1,64 * 6,52±1,92 9,22±2,62 р2-р1>0,05 4,54±0,12 рз-рг>0,05 4,23±0,53

1ь-8 30,80±3,51 ♦«« 19,27±2,77 37,58±7,45«* * р2-р1<0,05 13,99±5,42 Рз-Р2<0,05 9,99±1,09

1шу 2,47±0,47 «»* 1,98±0,09 »»» 2,82±0,76 *** р2-р1>0,05 1,94±0,34 *»* р,-рг>0,05 15,54±2,14

тота 16,48±2,07 ♦ »* 14,19±2,52 *** 22,04±2,06 **« р2-р1<0,05 19,16±4,09 »»» Рз-Р2>0,05 4,27±1,23

Примечание: статистическая достоверность различий (р): с контрольной группой * - р<0,05 ** - р<0,01, ***- р<0,001; в группах по тяжести БА, где р,— БА легкой степени, р2— БА средней степени, р3—тяжелая БА.

Наши данные подтверждают результаты большинства исследований и отражают наличие хронического иммунноопосредованного воспаления. При рассматрении полученных данных по степени тяжести атопического процесса, установлена тенденция к росту показателей цитокинов при среднетяжелых формах БА, по сравнению с легкими формами заболевания.

Однако, достоверное увеличение регистрируется по уровню 11_-8 (с 19,27±2,77 пг/мл до 37,58±7,45 пг/мл, р<0,05) и ТМРа (с 14,19±2,52 пг/мл до 22,04±2,06 пг/мл, р<0,05 пг/мл). При тяжелой астме содержание цитокинов в крови несколько снижается, достоверное снижение зафиксировано нами только И_-8 (р<0,05). Такая тенденция, на наш взгляд,

указывает на истощение резервных возможностей иммунокомпетентных клеток вследствие подавления их активности в результате длительной противовоспалительной гормональной терапии.

Одним из основных направлений нашего исследования была оценка цитокинового статуса у детей с бронхиальной астмой в сочетании с острой пневмонией, то есть исследовались некоторые механизмы межклеточных взаимодействий при аллергическом и бактериальном воспалении. Для достижения поставленной задачи, мы распределили обследуемых детей на 3 группы: 1 группа -дети с атопической бронхиальной астмой, 2 группа -дети с острой внебольничной пневмонией на фоне бронхиальной астмы и 3 группа -дети с острой внебольничной пневмонией (табл.3.).

Таблица 3.

Содержание цитокинов в сыворотке крови детей с атопической бронхиальной астмой и острой внебольничной пневмонией.

Исследуемые Содержание цитокинов М±т (пг/мл)

цитокины БА БА+о пневм. О.пневм Контр, гр.

(Р.) ы (Рз) п=30

п=76 п=12 п=33

1Ь-2 2,72±0,45 4,44±1,76 7,92±1,49 3,32±0,92

р2-р,>0,05 РЗ-Р2>0,05

1Ь-4 7,87±],64 3,80±0,99 5,24±0,85 4,23±0,53

р2-р|<0,05 Р,-Р2>0,05

1Ь8 30,80±3,51 40,92±3,87 52,44±9,84 9,99±1,09

*** *»*

р2-р,<0.05 Рз-Р2>0,05

1РЫу 2,47±0,47 2,77±0.97 72,63±20,64 15,54±2,14

»«« ** *

р2-р,>0.05 Рз-Р2<0,001

ЮТа 16,48±2,07 22,15^1,34 26.48±3,39 4.26±1.33

**• ***

р2-р|<0.05 РЗ-Р2>0.05

Примечание: статистическая достоверность различий (р): с контрольной группой * - р<0,05 ** - р<0,01, ***- р<0,001; между группами, где р,— БА, р2— БА+острая пневмония, р3—острая внебольничная пневмония.

Анализируя полученные результаты установлено, что при присоединении к атопическому процессу острого бактериального воспаления, регистрируется достоверное увеличение содержания двух провоспалительных цитокинов !Ь8 (с 30,80±3,51 пг/мл до 40,92±3,87 пг/

мл, р<0,05) и TNFа (с 16,48±2,07 пг/мл до 22,15±1,34 пг/мл, р<0.05). При этом, уровень противовоспалительного цитокина IL-4, напротив, достоверно снижался (с 7,87±1,64 пг/мл до 3,80±0,99 пг/мл, р<0,05).

С одной стороны, снижение сывороточного IL-4 у детей с БА можно расценить как положительный факт, так как подавление секреции одного из ведущих цитокинов аллергического воспаления, возможно, способствует переориентации иммунного ответа в сторону ТН1 типа. Однако, повышенная продукция мощных провоспалительных цитокинов TNF6 и IL-8 наряду с другими медиаторами воспаления, обеспечивают приток в очаг инфекции и активацию иммунокомпетентных клеток (в частности, нейтрофилов и макрофагов), необходимых для успешной борьбы с возбудителем заболевания (Федосеев Г.Б., 2001), которые, в свою очередь, способствуют формированию хронического аллергического воспаления (Фрейдлин И.С, Тотолян А.А., 2001). Кроме того, такие широко распространенные возбудители респираторных инфекций, как S. pneumoniae, К. pneumoniae и другие, повреждая бронхо-легочный эпителий и нарушая его проницаемость, регуляцию бронхомоторного тонуса, потенцируют местную воспалительную реакцию, усиливая повреждение и облегчая доступ причинно значимых аллергенов к иммунокомпетентным клеткам. Содержание IL-2 и IFNу в сыворотке крови у детей при присоединении к аллергическому процессу острого бактериального воспаления достоверно не изменялось. Однако, необходимо отметить, что был зарегистрирован достоверный (р<0,01) дефицит IFN у у таких пациентов, тогда как в группе детей с острой пневмонией (без БА) зафиксировано существенное увеличение IFNy всывороткекрови(р<0,05).

Таким образом, исходя из полученных результатов, мы считаем, иммунологически обосновано утяжеление воспалительного процесса при сочетании атопической бронхиальной астмы и острой внебольничной пневмонии.

Состояние местных факторов защиты у детей с бронхиальной астмой.

При исследовании состояние местных факторов защиты у детей с атопической бронхиальной астмой, представляла интерес локальная продукция цитокинов и секреторного IgA на уровне бронхо-легочной системы. В литературных источниках есть данные определения цитокинов локального характера в секрете ротовой полости (Абаджиди М.А. с соавт, 2001), жидкости назального лаважа (Benson M. et al., 2000), в мокроте (Шапорова Н.Л. с соавт., 2001). Наши исследования оппозиционных цитокинов IL-4 и IFNy были проведены в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) совместно с Т.Н.Суровенко и являлись пионерскими. Источниками

цитокинов в выдыхаемой влаге могут являться альвеолярные макрофаги, тучные клетки и лимфоциты БАЛТ верхних дыхательных путей и бронхов (Фрейдлин И.С, 2001; Черешнев В.А. с соавт., 2002). Также источником цитокинов может быть сывороточный транссудат в альвеолярных отделах дыхательного тракта, усиливающийся при воспалении.

У здоровых детей нами зарегистрирован исходно высокий уровень локальной секреции !РЫу и, наоборот, низкий, практически "пороговый" уровень !Ь4, по сравнению с показателями в сыворотке крови (табл.4).

Таблица 4.

Содержание оппозиционных цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и сыворотке крови у детей с атонической бронхиальной астмой

Исслед. ЦИТОКИНЬ!4^, Содержание цитокинов М±т пг/мл

КВВ контр гр. (р.) п=18 КВВ при БА (Ра) п=26 Сыворотка крови контр гр (рО п=30 Сыворотка крови при Б А (р<) п=76

1Ь-4 1,34±0,06 5,64±1,58 р2-р,<0,05 4,23 ±0,53 Рз - Р| <0,001 7,87±1,64 Р4 - Рг>0,05

№N7 11,99±1,01 10,34±1,83 р2-р,>0,05 15,54±2,14 Рз - р,>0.05 2,47±0,47 р4 - р2<0,001

Примечание: статистическая достоверность различий (р): р1- показатели в КВВ у здоровых детей, р2- показатели в КВВ у детей с БА, р3 -показатели в сыворотке крови у здоровых детей, р4 - показатели в сыворотке крови у детей с БА.

По нашему мнению, этот факт свидетельствует об активности клеточно-опосредованного механизма иммунной защиты непосредственно на уровне дыхательной системы, которая является "входными воротами" для патогенных микроорганизмов. У детей, страдающих атопической бронхиальной астмой, содержание !Ь4 в КВВ было достоверно выше, чем у здоровых сверстников (5,64±1,58 пг/мл против 1,34±0,06 пг/мл, р<0,05). При этом, уровень 1РЫ у в конденсате при астме, практически не изменялся (10,34±1,83 пг/мл против 11,99±1,01 пг/мл, р>0,05) и был достоверно выше, по сравнению с показателями в сыворотке крови у таких детей (р<0,001).

Мы оценили соотношение этих оппозиционных цитокинов в КВВ у детей с БА и получили интересные результаты. Если у здоровых детей соотношение 11_-4/ 1РЫ у в КВВ было 1/10, то у детей с БА доля И_-4 в конденсате значительно увеличивалась и соотношение составляло 1/2 (рис.1).

Рис. 1. Соотношение IL-4/IFNzв конденсате выдыхаемого воздуха у детей с атопической Б А в сравнении с контрольной группой.

При исследовании секреторного IgA в КВВ и жидкости назального лаважа (ЖНЛ), нами зарегистрировано достоверное снижение содержания этого иммуноглобулина в назальных смывах у детей с БА в отличие от здоровых сверстников (4,78±1, 15 мг/л, против 10,58±0,64 мг/л, при р<0,001). Подобная тенденция наблюдалась и в КВВ (р>0,05), где была выявлена обратная корреляционная зависимость с содержанием IL-4 (r= -0,56, р<0,05). Учитывая то, что slgA в составе секретов слизистых, обеспечивает местный иммунитет, препятствуя процессам адгезии и адсорбции патогенных бактерий и вирусов (Ляшенко В.А., 2003; Brendzaeg В. et al., 1997), наши исследования объясняют подверженность детей с атопической БА частым респираторным заболеваниям.

В последние годы многие исследователи использовали определение метаболитов оксида азота в КВВ и ЖНЛ для определения степени аллергического воспаления при бронхиальной астме и аллергическом рините (Невзорова В.А., 1997; Просекова Е.В., 2000; Ganas К. et al., 2001). В наших исследованиях мы подтвердили данные ряда авторов, что при атопичесокй БА у детей уровень метаболитов NO в конденсате выдыхаемой влаги и жидкости назального лаважа достоверно превышает их содержание у здоровых детей (7,73±0,40 мМ/мл против 2,81 ±0,32 мМ/мл, р<0,001 и 7,14±0,29 мМ/мл против 1,95±0,23 мМ/мл, р<0,001, соответственно). Оценивая полученные результаты у детей с разной степенью тяжести атопического заболевания, нами выявлена достоверная разница в показателях активных метаболитов NO в КВВ при легкой и среднетяжелой астме (р<0,05). Отмечалась тенденция к повышению NO в КВВ и при тяжелом течении заболевания (р>0,05) (рис.2).

I-1А I—1 В С КЕЗО

Примечание. 1 - КВВ, 2 - ЖНЛ.

А - контрольная группа В - БА легкой степени С - БА средней тяжести й - БА тяжелая

Рис.2. Уровень метаболитов N0 у детей с атопической БА в КВВ и ЖНЛ.

Таким образом в проведенных нами исследованиях, мы согласны с мнением Е.В.Просековой (2000) и ТН.Шестовской (2001) в том, что содержание метаболитов оксида азота увеличивается при утяжелении атопического процесса в бронхо-легочной системе и, на наш взгляд, отражает нарастание респираторных нарушений.

В результате исследований уровня метаболитов азота в ЖНЛ при БА по тяжести атопического заболевания, нами выявлена прямая коррелятивная связь с данными в КВВ (г=0,76, р<0,05). Это дает возможность проводить забор материала неинвазивным методом и использовать мониторинг метаболитов N0 в ЖНЛ в качестве диагностического критерия повреждения в оценке степени тяжести данного заболевания.

Проводя мониторинг уровня а,- кислого гликопротеина (а, - КГП) в КВВ выявлено (рис.3), что содержание этого острофазного протеина у детей с атопической БА достоверно превышает показатели контрольной группы (26,26±4,19 нг/мл против 6,89±0,80 нг/мл, при р<0,05) и возрастает при среднетяжелых формах заболевания (с 17,32±4,21 нг/мл до 34,75±5,91 нг/ мл, при р<0,05). Однако, зафиксирована обратная динамика этого показателя при тяжелой астме (15,60±0,42 нг/мл, р<0,001).

I IА | п р С тзшз О

Примечание. 1 - КВВ, 2 - ЖНЛ

А- контрольная группа В - БА легкой степени С - БА средней степени D - БА тяжелая

Рис.3, Содержаниеа 1 - КГП в КВВ и ЖНЛ у детей с атонической бронхиальнойастмой разной степени тяжести.

Выявленные различия, по нашему мнению, в большей мере связаны с высокой васкуляризацией слизистой оболочки носовых путей и повышенной сосудистой проницаемостью, в том числе для белковых молекул. С другой стороны, различия можно связать с особенностями материала исследования, так как в парах выдыхаемой влаги вероятность определения белковых молекул ниже, чем в назальных смывах. Однако, несмотря на выявленные различия вуровне а, - КГП в данных биологический жидкостях, динамика его содержания у детей с БА разной степени тяжести была идентичной, что свидетельствует о вовлечении всего эпителия дыхательных путей в процесс аллергического воспаления и согласуется с современными представлениями по проблеме взаимосвязи БА и аллергического ринита.

Клинико-иммунологическая оценка эффективности иммунотропной терапии в лечении атопической бронхиальной астмы.

Цель проведения иммунотерапии при БА заключается в восстановлении факторов естественной защиты дыхательных путей, выработке специфического иммунитета против возбудителей наиболее распространенных бактериальных инфекций, респираторных вирусных

агентов и коррекция иммунных нарушений (Чучалин А.Г, 1997.; Егорова Н.Б. с соавт., 2000; Зайцева О.В. с соавт.,2001; Просекова Е.В., 2001.) В этом аспекте мы выбрали два разных подхода. Одной группе пациентов (20 часто болеющих детей с атопической бронхиальной астмой, имеющих хронические очаги инфекции, частые ОРВИ, острые бронхиты, пневмонии в анамнезе) был применен цитокиновый препарат IL-2 ронколейкин. Другой группе детей (42 человека) с БА и перенесенной острой внебольничной пневмонией была проведена однократная вакцинация поликомпонентной пневмококковой вакциной "Пневмо-23" (Авентис Пастер, Франция) с целью подавления колонизации дыхательных путей наиболее распространенным патогеном S.pneumoniae, для устранения риска развития рецидивов пневмококковой инфекции и снижения частоты обострений атопического заболевания.

Препараты применялись в период ремиссии, на фоне стандартной базисной терапии под контролем антигистаминных препаратов.

По применению рекомбинантного IL-2, нами было впервые предложено и защищено патентом на изобретение («Способ лечения больных с бронхо-легочной патологией» №2205659 от 10.06.2003г.) комбинированное: подкожное и ингаляционное введение ронколейкина через небулайзер. Предложенная нами схема предусматривала подкожное введение препарата в дозе 125 тыс. ЕД в сочетании с ингаляционным введением в той же дозе, разведенной в 5 мл физиологического раствора, через небулайзер. Введение препарата проводили трехкратно с интервалами 48-72 часа. Такой способ позволяет препарату оказывать прямое воздействие на иммунокомпетентные клетки главного органа-мишени -легких.

а). Эффективность ронколейкина в терапии детей с БА.

В результате проведенной иммунотерапии мы подтвердили свои предположения и данные А.Т. Перадзе с соавт (2000) по улучшению прогноза клинического течения заболевания, что отмечалось в достоверном снижении средней частоты обострений с 8,83±1,23 до 5,24± 0,89 в год (р<0,05), уменьшении их продолжительности с 7,82±0,84 до 5,29±0,21 дней (р<0,01). Это увеличило сроки ремиссии, сократило частоту и объем оказываемой медицинской помощи. Значительно (на 43%) снизилось число острых респираторных заболеваний и (на 40%) уменьшился удельный вес обострений хронических очагов инфекции.

При проведении мониторинга содержания цитокинов зафиксировано достоверное повышение уровня IL-2 (с 2,13±0,45 пг/мл до 3,80±0,52, при р<0,05), уровня IFNy (с 2,47±0,47 пг/мл до 8,49±0,24 пг/мл, при р<0,001) и снижение содержания IL-8 (с 32,08±4,07 пг/мл до 18,33±3,20 пг/мл, при р<0,05) в сыворотке крови у наших пациентов после применения ронколейкина (табл.5).

Таблица 5.

Уровень исследуемых цитожинов в сыворотке крови у детей с атопической БАпри терапии ронколейкином.

Исследуемые цитокины Содержание цитокинов М±ш пг/мл

До терапии п=20 После терапии п=20 Контр.ф. п=30

I 2 3

¡1-2 2,13±0,45 3,80±0,52 р2-р,<0,05 3,32±0,92

1Ь-4 7,95±1,91 * 5,71=4.73 р2-р,>0,05 4,23*0,53

1Ь-8 32.08±4,07 18,33*3,20 * РгР^О.ОЗ • 9,99*1,09

2,47±0,47 »«« 8,49*0,24 «** Р2-Р1<0,001 15,54±2,14 '

Т№а 14,52±3,12 12,78*3,27 * Р2-Р1>0,05 4,27*1,23

Примечание: статистическая достоверность различий (р) с контрольной группой: * - р<0,05**- р<0,01, ***- р<0,001; р2-р, -достоверностьразличий мееду группами.

При этом повышение уровня И^Ыу нами отмечено как в системном кровотоке, так и непосредственно на уровне бронхо-легочной системы, в конденсате выдыхаемого воздуха (8,99±1,52 пг/мл до 14,47±1,12 пг/мл, при рх0.01).

Ронколейкин, как оказалось, способствовал снижению уровня сывороточного 1дЕ (с 318,75±37,24 МЕ/мл до 209,64±39,49 МЕ/мл (р<0,05), что согласуется с данными ТВ. Суздалыдевой с соавт (2002), а также, уменьшению уровня N0 в выдыхаемом воздухе, о чем свидетельствует снижение содержания метаболитов N0 в КВВ с 6,86±0,42 мМ/мл до 4,55±0,20 мМ/мл после иммунотерапии.

Формула рейтингового алгоритма иммуно-биохимических нарушений выглядела следующим образом: 3", И-83+, ТЫРа.,*, 1дЕ2*, N0/, И-4,*, что наглядно отражает дефект клеточно-опосредованного звена при атопической БА и наличие воспалительного процесса. После проведения терапии ронколейкином происходят изменения степени иммунных расстройств, тенденция кнормализации иммунного дисбаланса. Формула иммунных расстройств становится следующей: 1Р^2-,ТМРаг*, И-8/, 1дЕ,*, N0,*, 1Ь-40. Выявленные сдвиги и обеспечивают положительную клиническую динамику.

Таким образом, в целом, установлено, что при включении рекомбинантного цитокинового препарата ронколейкина в комплексную терапию атопической БА у детей, происходят определенные сдвиги в иммунной системе на уровне дифференцировки Т-лимфоцитов, преимущественно за счет активации ТН1, что создает предпосылки не только к увеличению напряженности фагоцитарного звена, но и уменьшению

дисбаланса иммунных нарушений при атопическом заболевании, где ведущая роль принадлежит ТН2. Ронколейкин способствует уменьшению воспалительного процесса на уровне бронхо-легочного тракта и положительной клинической динамики в течении БА у детей. б). Эффективность применения пневмококковой вакцины у детей с БА. Оценивая степень влияния пневмококковой вакцины «Пневмо-23» на клинические признаки течения БА, мы отметили достоверное снижение в году количества дней с явлениями бронхообструкции с 57,59±4,24 до 41,13±2,27 (р<0,001). Выявлена тенденция к снижению среднего количества обострений в год (р>0,05). За время наблюдения уменьшилась (на 40%) частота острых респираторных заболеваний и (на 52%) частота обострений хронический очагов инфекции. Не было зарегистрировано повторных случаев заболевания пневмонией.

При оценке влияния вакцинации «Пневмо-23» на иммунный ответ у детей на фоне атопической БА, мы не выявили повышения продукции ^у, как при терапии ронколейкином, но и не отметили усиления секреции ^-4, что является, на наш взгляд, важным фактом при анализе влияния полисахаридной вакцины на атопический процесс. Уровень TNFa в сыворотке крови достоверно не изменился после вакцинации, а содержание 1Ь8 значительно снизилось (с 29,64±3,27 пг/мл до 18,62±4,02 пг/мл, при р<0,05), что является критерием уменьшения степени бактериального воспаления ^=7,1±0,2, p<0,05) (табл.6).

Таблица 6.

Уровень исследуемых цитокинов в сыворотке крови у детей с атопи-ческой бронхиальной астмой в результате вакцинации «Пневмо-23».

Исследуемые цитокины Содержание цитокинов М±га пг/мл

До вакцинации п=42 После вакцинации п=42 Контр гр п=30

1 2 3

11.-2 2,27±0,52 | 2,68«,54 Р2-Р|>0,05 3,32*0,92

1Л-4 9,37±0,15 ••• * - . 9,12±0,18 • ♦ р2-р|>0,05 4,23±0,53

11.-8 , 29,64±3,2Г ' «** 18,62±4,02 * Р2-Р1<0,05 9,99±1,09

2,05±0,22 *»♦ 2,34±0,43 »»« Р2-Р1>0,05 15,54±2,14

ТЖа 15,98±3,49 *»* 14,19±4,35 * рг-Р|>0,05 4,27*1,23

Примечание: статистическая достоверность различий (р) с контрольной группой: * - р<0,05 ** - р<0,01, ***- р<0,001; р2-р, -достоверность различий между группами.

Мы не выявили существенной динамики общего сывороточного IgE, содержания оппозиционных цитокинов IFN у и IL-4 в КВВ, однако, интересным фактом, на наш взгляд, была установленная тенденция к нарастанию уровня метаболитов азота в КВВ (с 5,18±0,30 мМ/мл до 7,03±0,99 мМ/мл, при р>0,05), что расценено нами как результат процесса активации антибактериальных защитных механизмов

При сопоставлении формулы иммунных расстройств до и после вакцинации "Пневмо-23" нами не отмечено выраженных изменений по большинству показателей До вакцинации она имела следующий вид IFNy 3", IL-83+, IL-4j*, TN Fa j*, 1дЕг*, N0/. Однако, под действием бактериальной липополисахаридной вакцины зарегистрирована тенденция к нарастанию содержания метаболитов N0 в КВВ, тогда как, напротив, выявлены положительные сдвиги в сыворотке крови в сторону существенного снижения уровня нейтрофильного хемоаттрактанта - IL-8, что отражает уменьшение степени бактериального воспаления. Сохранился дефицитаму , а активность IL-4 и TN Fa в сыворотке крови не изменилась Это отразилось на формуле IFNy3", IL-42\ IL-82\ TNF6/, N0/, IgE/.

При анализе иммунологической эффективности вакцинации по уровню специфических антител выявлен достоверный прирост после вакцинации содержания IgM и IgG против комплекса полисахаридов, входящих в состав вакцины "Пневмо-23" и отдельных серотипов S pneumoniae (ТЗ, 6В, 9N, 23F) (рис. 4).

Рис.4. Динамика уровней специфическихантител против S.pneumoniae в сыворотке крови у детей с атопической бронхиальной астмой в результате вакцинации «Пневмо-23».

□до вариации ■ после вакцинации

Таким образом, выявленная динамика специфических антител против S.pneumoniae является доказательством успешного иммунного ответа на введение вакцины с формированием специфического поствакцинального иммунитета.

Выводы.

1. У детей при атопической бронхиальной астме в период ремиссии в сыворотке крови регистрируются высокие уровни IL-4, IL-8 и TNF а и дефицит IFN у . Это указывает на дисбаланс в системе цитокинов с преобладанием ТН2-ответа и на наличие хронического иммуноопосредованного воспаления в дыхательной системе.

2. При присоединении к атопической БА острой внебольничной пневмонии, на фоне сохраняющегося дефицита IFN у, в сыворотке крови больных детей нарастает гиперпродукция провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa.

3. У здоровых детей, зарегистрирован исходно высокий уровень локальной секреции IFN у и, наоборот, низкий уровень IL-4. При атопической БА соотношение IL-4 и IFNy в КВВ значительно смещается в сторону преобладания IL-4, что отражает активацию ТН2 в БАЛТ с развитием аллергического lgE-опосредованного воспаления.

4. У детей с БА, в период ремиссии, регистрируется повышенное содержание метаболитов N0 и а ,-КГП и снижение уровня секреторного IgA в конденсате выдыхаемого воздуха и в жидкости назального лаважа, что свидетельствует о взаимосвязи верхних и нижних отделов дыхательной системы в процессе аллергического воспаления при БА.

5. Включение рекомбинантного IL-2 - ронколейкина в терапию атопической БА у детей способствует коррекции иммунных нарушений на уровне дифференцировки Т-лимфоцитов преимущественно в ТН1, за счет активации системного синтеза IL-2, IFNy , снижения секреции IL-8 и увеличения локального уровня IFNy, на фоне положительной клинической динамики в течении заболевания.

6. Применение поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) у детей с атопической БА после перенесенной внебольничной пневмонии, не утяжеляет течение атопического процесса, приводит к снижению уровня IL-8 и способствует профилактике частых респираторных заболеваний и обострений БА.

7. У провакцинированных детей выявлен достоверный прирост содержания специфических антител IgM и IgG против комплекса полисахаридов, входящих в состав вакцины "Пневмо-23" и отдельных серотипов S.pneumoniae (ТЗ, 6В, 9N, 23F). Это является доказательством формирования специфического поствакцинального иммунитета и высокой иммунологической эффективности проведенной вакцинации у детей с БА.

Рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практику.

1. Принимая во внимание актуальность оценки состояния локальной продукции медиаторов при заболеваниях дыхательной системы, безопасный и достаточно простой способ сбора материала для исследований, полученные результаты исследования цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха определяют возможность и перспективность дальнейших научных поисков в этом направлении,.

2. Анализ секреторного 1дА и биохимических показателей (метаболитов N0 и а^-КГП) в конденсате выдыхаемой влаги и жидкости назального лаважа позволяет рекомендовать использование этих маркеров в качестве дополнительных диагностических критериев в оценке состояния местных факторов защиты при атопической БА. Однонаправленные изменения содержания метаболитов 1\10и с^-КГП при астме разной степени тяжести, дает возможность применять для мониторинга степени тяжести данного заболевания оценку этих показателей лишь в одной из данных биологическихжидкостей.

3. Выявленные иммунные нарушения, характеризующиеся дисбалансом системного и локального уровня цитокинов у детей с атопической БА и позитивные сдвиги, достигнутые под влиянием ронколейкина, определяют возможность использования его в комплексной терапии часто болеющих детей с БА, путем сочетания подкожных инъекций по 125 тыс.ЕД с ингаляционным его введением в той же дозе 3-х кратно (с интервалом 48-72 часа) на фоне Н,-гистаминоблокаторов, для коррекции клинико-иммуннологическога статуса у данной категории больных.

4. Доказана эффективность и безопасность проведения однократной вакцинации «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) в комплексе иммунокоррекции у детей с атопической БА. Это позволяет рекомендовать применение данной вакцины для предупреждения обострения БА и бактериальных воспалительных осложнений, в том числе и пневмококковой инфекции.

5. Рекомендовать внедрение методических рекомендаций: «Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» у детей с аллергопатологией» и «Клинико-иммунологические аспекты применения цитокинового препарата -ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у часто болеющих детей» в клиническую практику врачей аллергологов-иммунологов, пульмонологов, педиатров, инфекционистов, клиницистов других специальностей, в учебный процесс медицинских вузов и системы факультетов повышения квалификации.

Список работ, опубл икованных по теме диссертации:

1. Шелудько Я.С.* Особенности иммунного статуса у детей с аллергопатологией // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Тезисы докладов III Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (25 апреля 2002). Владивосток. - 2002. -С.45

2. Шелудько Я.С, Маркелова Е.В., Суровенко Т.Н. IL-4 в оценке воспалительного процесса у детей с атопическими заболеваниями дыхательной системы // Медицинская иммунология. - 2002.- №2.Т4. - С.187

3. Суровенко Т.Н., Шелудько Я.С., ОвчинниковаО.В., Маркелова Е.В., Гельцер Б.И. Прогностическое значение исследования IL-4, IFN у и IgE в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме // Цитокины и воспаление. - 2002,- №4. Т1.- С.38-42.

4. Шелудько Я.С., СуровенкоТ.Н., Турмова Е.П. Местный и системный уровень ИЛ-2 у детей с бронхиальной астмой // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 5-й Конгресс (12-14 ноября 2002). Москва, - 2002. -Т2. - С.612.

5. Шелудько Я.С, Маркелоза Е.В., Суровенко Т.Н. Взаимосвязь IL-8 и клеточного состава назального секрета у детей с аллергопатологией. //. Цитокины и воспаление. - 2002. - №2. Т.1. - С.104-105.

6. Суровенко Т.Н., Шелудько Я.С., Боровская Т.Ф., Маркелова Е.В. Интерлейкин 2 в сыворотке крови и конденсате влаги выдыхаемого воздуха и эффекторные клетки индуцированной мокроты у детей с клещевой бронхиальной астмой // Цитокины и воспаление. - 2002. - №2. Т. 1. —С. 101102.

7. Шелудько Я.С., Маркелова Е.В., Суровенко Т.Н. Динамика уровней ИФНг и ИЛ-4 удетей с атопической бронхиальной астмой на фоне терапии ронколейкином // Тезисы XVII Всемирного конгресса по астме (5-8 июля 2003). СПб. - 2003. - №1. Т.4 - С.93.

- 8. Шелудько Я.С., Маркелова Е.В., Чикаловец И.В., Касснер Л.Н., СуровенкоТ.Н. Сравнительные показатели содержания IL-4, IFNy nTNFct у детей с атопической бронхиальной астмой и острой пневмонией на фоне бронхиальной астмы // Медицинская иммунология. - 2003.- №3-4.Т5. -С.447.

9. Шелудько Я.С., Маркелова Е.В., СуровенкоТ.Н., Чикаловец И.В., КасснерЛ.Н., Динамика изменения уровня ИЛ-8 у детей с атопической бронхиальной астмой при терапии ронколейкином // Тезисы докладов. X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (7-11 апреля 2003). Москва, - 2003. - С.560-561.

'Шелудько Я.С. - Гущина Я.С. - аатор работы.

10. Sourovenko T.N., Shelud'ko Ya.S., Markelova E. V. lnterleukin-2 in blood serum (BS), expired air condensate (EAC) and nazal lavage fluid (NLF) in children with bronchial asthma (BA) // Eur Respir J (Abstracts of 13 annual ERS congress, September 27- October 1 2003) Vienna 2003.- CV.22, suppl. 45.- P. 398.

11. Гущина Я.С., Маркелова Е.В., Суровенко Т.Н. Динамика уровней ИФНу в конденсате выдыхаемой влаги и сыворотке крови у детей с атопической бронхиальной астмой на фоне вакцинации «Пневмо-23» // International Journal on Immunorehabilitation. - 2003. - №2. T.5 - C.320.

12. Гущина Я.С., Маркелова Е.В., Суровенко Т.Н. Динамика уровня TNFct у детей с атопической бронхиальной астмой на фоне иммунокоррекции // Медицинская иммунология. -2003.- №3-4.Т5. - С.450.

13. Гущина Я.С., Касснер Л.Н., Маркелова Е.В., Бабко СВ. Уровень IL-8 как отражение тяжести воспалительного процесса при бронхолегочной патологии // Пульмонология. Сборник резюме XIII Национального конгресса по болезням органов дыхания (10-12 ноября 2003). -СПб. -2003. -С. 122.

14. Гущина Я.С., Маркелова Е.В., Костинов М.П., Касснер Л.Н. Опыт применения комплексной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) у детей с атопической бронхиальной астмой // Бюллетень «Вакцинация», «Бронхо-легочные заболевания» 2004. - №2. - С. 12-18.

15. Бондарь Н.С., Гущина Я.С. Роль иммунотропных препаратов в лечении бронхиальной астмы у детей.// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Тезисы докладов V Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (22 апреля 2004). Владивосток. - 2004. - С.23.

16. Гущина Я.С, Маркелова Е.В., Костинов М.П., Журавлева Н.В. Клинико-иммунологические аспекты эффективности вакцинации «Пневмо-23» у детей с атопической бронхиальной астмой // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунологии. - принята к печати в №1 2005г.

17. Гущина Я.С, Маркелова Е.В., Суровенко Т.Н. Клинико-иммунологические аспекты применения цитокинового препарата -ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у часто болеющих детей. // Методические рекомендации.- Владивосток. -2004.-16 с.

18. Маркелова Е.В., Гущина Я.С., Костинов М.П., Касснер Л.Н. Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной вакцины «Пневмо-23» у детей с атопической бронхиальной астмой.// Методические рекомендации.- Владивосток. - 2004. -21с.

19. Маркелова Е.В, Костюшко А.В, Просекова Е.В, Суровенко Т.Н., Корявченко И.В., Шелудько Я.С, Турмова Е.П. Способ лечения больных с бронхолегочной патологией-(патент на изобретение №2205659 от10.06.2003).

ГУЩИНА ЯНИНА СЕРГЕЕВНА

РОНКОЛЕЙКИН И ПОЛИКОМПОНЕНТНАЯ ВАКЦИНА «ПНЕВМО-23» В КОРРЕКЦИИ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ДЕТЕЙ С АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.00.36 аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 22.04.2004 г. Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ № 0612

Отпечатано в типографии ООО "Альт" г. Владивосток, ул. Харьковская, 2 тел.: (4232) 28-34-01

»-86 1 6

В настоящее время регистрируется неуклонный рост аллергопатологии у детей с поражением бронхолегочной системы [4,26,79,87,185,205 и др.]. Так, по данным мировой статистики, за последние 30 лет произошло удвоение случаев бронхиальной астмы у детей, что диктует необходимость особого внимания к этой патологии [5,21]. Подобная тенденция роста распространенности этого заболевания выявлена в Приморском крае, где с 1988 по 1998 год заболеваемость БА среди детей возросла в 1,7 раза [117]. Известно, среди детей-атопиков наибольший процент часто болеющих бронхолегочными заболеваниями, развитие которых, тяжесть течения, исход, зависят от многочисленных факторов, включая климато-географические, социальные факторы, влияние окружающей среды и т.д [11,13,170,212,258 и др.] По данным Г.Б.Федосеева с соавт. (2001), установлено, что во время обострений бронхиальной астмы (БА) у 67% обследуемых обнаружена персистирующая вирусная и /или бактериальная инфекция в бронхо-легочном аппарате [153].

Показано, что наиболее частыми возбудителями инфекционного поражения верхних и нижних отделов дыхательных путей при бронхиальной астме являются различные виды респираторных вирусов, а из бактерий - S.pneumoniae и H.influenzae [6,78,153,247]. Комплексное микробиологическое и иммунологическое обследование больных в фазе обострения БА, проведенное Л.А.Вишняковой (1990), позволило выявить инфекционно-воспалительный процесс, почти исключительно пневмококковой этиологии, протекающий в клинически выраженной, стертой или бессимптомной формах у 37% больных, даже при легком течении атопической БА, причем частота бактериальных инфекций резко увеличивается (до 86%) при тяжелом течении заболевания [19].

В некоторых исследованиях показано, что на фоне ОРВИ пневмококк был выделен у 55,8% больных острым бронхитом, а частота его находок при бронхиальной астме без вирусных инфекций еще выше и равна 72,7% [14]. По данным многих российских и зарубежных исследований, пневмококковая инфекция занимает первое место в этиологии внебольничной пневмонии. Пневмококк ответственней за 35-76% из диагностированных случаев [20,86,120,136,253 и др]. Таким образом, пневмококк относится к одному из наиболее распространенных возбудителей инфекций дыхательной системы человека. Необходимо отметить, что пневмококковая инфекция регистрируется в различных клинических формах, от отита, фарингита до бронхопневмонии [108,120,228,253]. Существуют и другие, более редкие формы пневмококковой инфекции [222,247,283].

При бронхиальной астме на определенных этапах течения болезни признаки иммунологической недостаточности присоединяются за счет дисбаланса в системе цитокинов, снижения неспецифической резистентности слизистых оболочек бронхо-легочного аппарата, вследствии хронического воспаления, колонизации патогенными микроорганизмами [11,19,59,117,153 и др.].

Таким образом, дети с бронхиальной астмой чаще подвержены респираторным инфекциям с дальнейшим развитием бактериальных осложнений. Становится очевидным, что без повышения иммунологической реактивности трудно добиться хорошего клинического эффекта при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях на фоне аллергопатологии.

Цель исследования.

Обосновать способы коррекции иммунных нарушений и предупреждения бактериальных осложнений у детей с атопической БА.

Задачи исследования.

1. Изучить цитокиновый статус (IL-2, IL-4, IL-8, IFNy и TNFa) и особенности его нарушений у детей с атопической бронхиальной астмой и острой внебольничной пневмонией.

2. Определить уровень локальной секреции оппозиционных цитокинов IL-4 и IFN-y в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с атопической БА.

3. Исследовать конденсат выдыхаемого воздуха и жидкость назального лаважа на содержание секреторного IgA, метаболитов N0 и сц-КТП при БА разной степени тяжести.

4. Оценить возможность применения иммунотропного рекомбинантного цитокинового препарата IL-2- ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у детей и провести клинико-иммунологический анализ его эффективности.

5. Оценить безопасность и клинико-иммунологическую эффективность проведения вакцинации поликомпонентной пневмококковой вакциной «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) у детей, страдающих бронхиальной астмой.

Научная новизна исследований.

В результате выполненных исследований впервые в условиях г.Владивостока изучены особенности иммунитета у детей с острой внебольничной пневмонией на фоне аллергопатологии, дана комплексная оценка содержания цитокинов: IL-2, IL-4, IL-8, IFNy и TNFa в сыворотке крови обследуемых. Показано, что у детей, страдающих бронхиальной астмой, при присоединении острой бактериальной пневмонии нарушения в цитокиновом статусе характеризуются усугублением системной гиперпродукции провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa и дефицитом IFNy.

Впервые проведены исследования конденсата выдыхаемого воздуха на содержание оппозиционных цитокинов (IL-4 и IFNy) и получены дополнительные доказательства превалирования ТН2-иммунных реакций при атопической бронхиальной астме. Исследован секреторный IgA в КВВ и выявлена обратная корреляционная зависимость с уровнем IL-4 в конденсате. Впервые у детей с БА в Приморском крае выявлены закономерности динамики биохимические маркеров воспаления (NO, al-КГП) в жидкости назального лаважа при БА разной степени тяжести.

Использование иммунологических и клинико-лабораторных методов позволило обосновать целесообразность включения ронколейкина в комплексную терапию детей с атопической БА. Разработан новый способ лечения больных с бронхолегочной патологией. Получен патент на изобретение: «Способ лечения больных с бронхолегочной патологией» №2205659 от 10.06.2003.

Впервые дана комплексная оценка влияния вакцинации «Пневмо-23» на цитокиновый статус, уровень IgE и уровень специфических антител против разных серотипов пневмококка у детей с аллергопатологией, показана эффективность и безопасность ее применения у данной категории больных.

Положения выносимые на защиту.

1. У детей, страдающих бронхиальной астмой, при присоединении острой бактериальной пневмонии нарушения в цитокиновом статусе характеризуются усугублением системной гиперпродукции провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa и дефицитом IFNy.

2. Установлено превалирование ТН2 иммунных реакций в респираторной системе детей с атопической БА и дефицит секреторного IgA.

3. Применения IL-2 - ронколейкина в терапии часто болеющих детей с БА в период ремиссии позволяет улучшить клинико-иммунологический статус пациентов и увеличить ее продолжительность.

4. Вакцинация пневмококковой вакциной «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) детей с БА, предотвращает развитие пневмококковой инфекции, способствует профилактике бактериальных осложнений, не обостряет атопический процесс.

Практическая ценность работы:

1. Изучены некоторые иммунные механизмы воздействия патогенной бактериальной флоры на атопический процесс, что предопределяет необходимость предупреждения инфекционных осложнений у детей с атопической БА. Установлены дифференциально-диагностические критерии в цитокиновом спектре сыворотки крови у детей с БА и острой внебольничной пневмонией. Выявлен системный дефицит IFNy и гиперпродукция провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa. Величины, превышающие

43,63 пг/мл для IL-8 и 24,31 пг/мл для TNFa в сыворотке крови свидетельствуют о наличии острого бактериального воспаления.

2. Оценено состояние местных факторов защиты у детей с БА, показано преобладание ТН2 иммунных механизмов в респираторной системе. Полученные результаты исследования конденсата выдыхаемого воздуха на содержание цитокинов, определяют возможность дальнейших научных поисков в этом направлении.

3. Дана характеристика биохимических маркеров воспаления (NO, al-КГП) и секреторного IgA в КВВ и жидкости назального лаважа. Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания NO в этих биологических жидкостях при БА разной степени тяжести, что дает возможность проводить забор материала неинвазивным методом и использовать мониторинг метаболитов NO в КВВ и ЖНЛ в качестве диагностического критерия повреждения в оценке степени тяжести аллергического воспаления.

4. Обоснована целесообразность включения иммунокоррегирующей терапии рекомбинантным IL-2 (ронколейкином) у часто болеющих детей, страдающих бронхиальной астмой, что позволяет увеличить продолжительность ремиссии, снизить тяжесть и частоту обострений, уменьшить вероятность бактериальных осложнений.

5. Определена возможность безопасного и эффективного применения поликомпонентной вакцины «Пневмо-23» у детей с БА для профилактики пневмококковой инфекции.

Материалы по изучению клинико-иммунологической эффективности включения иммунокоррегирующего препарата ронколейкина в комплексную терапию часто болеющих детей с БА и опыт применения поликомпонентной вакцины «Пневмо-23» для профилактики бактериальных осложнений у таких детей, вошли в методические рекомендации: «Клинико-имму но логические аспекты применения цитокинового препарата - ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у часто болеющих детей» и «Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» у детей с атопической бронхиальной астмой», утвержденные ВГМУ и департаментом здравоохранения Приморского края (г.Владивостока, 2004). Данные методические рекомендации внедрены в практическое здравоохранение г.Владивостока, Приморского и Хабаровского края.

Апробация материалов работы:

Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах регионального, российского и международного уровня: III Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2002); VI, VII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СПб, 2002, 2003); Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины.Воспаление.Иммунитет» (СПб, 2002); V, VII Конгрессах РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002, 2003); X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003); XIII Национальном конгресс по болезням органов дыхания (Москва, 2003); XVII Всемирном конгрессе по астме (СПб, 2003); I Всероссийской конференции по иммунотерапии (Сочи, 2003).

Публикации.

Основные результаты исследований изложены в 19 публикациях, в том числе 2 в международной печати и 1 патенте на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 152 листах машинописного текста, состоит из 5 глав, содержит введение, обзор литературы, описания материалов, методов исследования и лечения, результаты исследования, выводы, практические рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику, спискок использованной литературы, содержащий 293 источника (из них 180 отечественных авторов и 113 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 16 рисунками.

Выводы:

1. У детей при атопической бронхиальной астме в период ремиссии в сыворотке крови регистрируются высокие уровни IL-4, IL-8 и TNFa и дефицит IFNy. Это указывает на дисбаланс в системе цитокинов с преобладанием ТН2-ответа" и на наличие хронического иммуноопосредованного воспаления в дыхательной системе.

2. При присоединении к атопической БА острой внебольничной пневмонии, на фоне сохраняющегося дефицита IFNy, в сыворотке крови больных детей нарастает гиперпродукция провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa.

3. У здоровых детей, зарегистрирован исходно высокий уровень локальной секреции IFNy и, наоборот, низкий уровень IL-4. При атопической БА соотношение IL-4 и IFNy в КВВ значительно смещается в сторону преобладания IL-4, что отражает активацию ТН2 в БАЛТ с развитием аллергического IgE-опосредованного воспаления.

4. У детей с БА, в период ремиссии, регистрируется повышенное содержание метаболитов N0 и агКГП и снижение уровня секреторного IgA в конденсате выдыхаемого воздуха и в жидкости назального лаважа, что свидетельствует о взаимосвязи верхних и нижних отделов дыхательной системы в процессе аллергического воспаления при БА.

5. Включение рекомбинантного IL-2 — ронколейкина в терапию атопической БА у детей способствует коррекции иммунных нарушений на уровне дифференцировки Т-лимфоцитов преимущественно в ТН1, за счет активации системного синтеза IL-2, IFNy, снижения секреции IL-8 и увеличения локального уровня IFNy, на фоне положительной клинической динамики в течении заболевания.

6. Применение поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) у детей с атопической БА после перенесенной внебольничной пневмонии, не утяжеляет течение атопического процесса, приводит к снижению уровня IL-8 и способствует профилактике частых респираторных заболеваний и обострений БА.

7. У провакцинированных детей выявлен достоверный прирост содержания специфических антител IgM и IgG к комплексу полисахаридов, входящих в состав вакцины "Пневмо-23" и к отдельным серотипам S.pneumoniae (ТЗ, 6В, 9N, 23F). Это является доказательством формирования специфического поствакцинального иммунитета и высокой иммунологической эффективности проведенной вакцинации у детей с БА.

Рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практику.

1. Принимая во внимание актуальность оценки состояния локальной продукции медиаторов при заболеваниях дыхательной системы, безопасный и достаточно простой способ сбора материала для исследований, полученные результаты исследования цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха определяют возможность и перспективность дальнейших научных поисков в этом направлении,.

2. Анализ секреторного IgA и биохимических показателей (метаболитов NO и ai-КГП) в конденсате выдыхаемой влаги и жидкости назального лаважа позволяет рекомендовать использование этих маркеров в качестве дополнительных диагностических критериев в оценке состояния местных факторов защиты при атопической БА. Однонаправленные изменения содержания метаболитов NO и агКГП при астме разной степени тяжести, дает возможность применять для мониторинга степени тяжести данного заболевания оценку этих показателей лишь в одной из данных биологических жидкостей.

3. Выявленные иммунные нарушения, характеризующиеся дисбалансом системного и локального уровня цитокинов у детей с атопической БА и позитивные сдвиги, достигнутые под влиянием ронколейкина, определяют возможность использования его в комплексной терапии часто болеющих детей с БА, путем сочетания подкожных инъекций по 125 тыс.ЕД с ингаляционным его введением в той же дозе 3-х кратно (с интервалом 48-72 часа) на фоне Нггистаминоблокаторов, для коррекции клинико-иммуннологического статуса у данной категории больных.

4. Доказана эффективность и безопасность проведения однократной вакцинации «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция) в комплексе иммунокоррекции у детей с атопической БА. Это позволяет рекомендовать применение данной вакцины для предупреждения обострения БА и бактериальных воспалительных осложнений, в том числе и пневмококковой инфекции.

5. Рекомендовать внедрение методических рекомендаций: «Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» у детей с аллергопатологией» и «Клинико-иммунологические аспекты применения цитокинового препарата - ронколейкина в комплексной терапии атопической бронхиальной астмы у часто болеющих детей» в клиническую практику врачей аллергологов-иммунологов, пульмонологов, педиатров, инфекционистов, клиницистов других специальностей, в учебный процесс медицинских вузов и системы факультетов повышения квалификации.

Заключение

По данным официальной статистики, в последние годы, в нашей стране значительно увеличилось число детей, больных атопической бронхиальной астмой [9,34,79,87,205]. Подобная тенденция роста распространенности этого заболевания выявлена в Приморском крае, где с 1988 по 1998 год заболеваемость БА среди детей возросла в 1,7 раза [117]. Бронхиальная астма относится к хроническим процессам, механизмы развития которых кроются в иммунологических нарушениях. Длительное персистирование аллергического воспаления снижает неспецифическую резистентность слизистых оболочек в бронхо-легочной системе, способствует колонизации патогенной флорой, развитию иммунологической недостаточности с рецидивами респираторных инфекций. Вероятность развития у таких детей бактериальных осложнений достаточно высока.

Мы согласны с мнением Е.В.Просековой (2000), что почти в трети случаев обострения БА у детей в Приморье провоцируется ОРВИ, что, вероятно, определяется климатическими особенностями региона. Однако, при ослаблении муко-цилиарного клиренса, индуцированного вирусной инфекцией, возбудители бактериальных инфекций, такие как S.pneumoniae, потенцируют местную воспалительную реакцию, которая в свою очередь усиливает повреждение [11,19,153,223]. Следствием этого, с одной стороны является развитие бактериального воспаления, с другой, обеспечивается облегчение доступа аллергенов к иммунокомпетентным клеткам, что приводит к увеличению длительности и тяжести обострения астмы. Таким образом, атопические заболевания респираторного тракта, в частности бронхиальная астма, способствуют развитию вторичных бактериальных инфекций и, по типу обратной связи, бактериальное воспаление поддерживает атопический процесс. Повышая резистентность организма к респираторным инфекциям, снижается вероятность рецидивов обострения и утяжеления течения астмы. Поэтому актуальным является дальнейшее изучение иммунологических механизмов при данной патологии, оценка состояния местных факторов защиты у детей с атопической бронхиальной астмой и разработка новых подходов к терапии с учетом возможной коррекции иммунных нарушений и снижением триггерности бактериальных инфекций.

Как известно, механизмы развития воспаления, в том числе и аллергического характера, координируют цитокины, регулирующие миграцию клеток, их активацию, межклеточные взаимодействия [31,91,159]. Дисбаланс в выработке цитокинов может нарушить существующие в локальной системе взаимосвязи, что в конечном итоге ведет к развитию патологии. С иммунологической точки зрения, в основе развития атопической бронхиальной астмы лежит дисбаланс иммунорегуляции с преобладанием ТН2-клеток и продуцируемых ими цитокинов. В то же время, нарушение продукции цитокинов приводит к глубоким дефектам антиинфекционной защиты и усугубляет прямое повреждающее действие микроорганизиов и их токсинов на легочную ткань [83].

Несмотря на то, что дети, страдающие атопической бронхиальной астмой чаще подвержены развитию бактериальных инфекций бронхо-легочной системы, как правило, эти заболевания, с иммунологической точки зрения, рассматриваются независимо друг от друга. Отсутствие полного представления об иммунологических механизмах развития острого бактериального воспаления на фоне атопического процесса у детей с БА определила интерес комплексного изучения места и роли цитокинов в развитии сочетанного воспаления.

В результате проведенного нами исследования, было установлено, что у пациентов с атопической БА отмечаются достоверно высокие уровни IL-4, IL-8 и TNFa и дефицит IFNy в сыворотке крови. Наши данные подтверждают результаты многих исследований и отражают наличие хронического иммунноопосредованного воспаления [41,117,134,172]. Установлено, что при среднетяжелых формах БА содержание этих цитокинов значительно возрастает, но имеет тенденцию к снижению при тяжелой астме, что, на наш взгляд, с одной стороны отражает ятрогенное влияние, а с другой, указывает на истощение резервных возможностей иммунокомпетентных клеток.

При острой внебольничной пневмонии на фоне атопической бронхиальной астмы регистрируется гиперцитокинемия провоспалительных TNFa и IL-8 и дефицит IFNy. Однако, при сочетании аллергического и бактериального воспаления, отмечается тенденция к нарастанию этих цитокинов и достоверное снижение уровня IL-4 — основного цитокина атопического процесса. С одной стороны, снижение сывороточного IL-4 у атопиков можно расценить как положительный факт, так как подавление секреции одного из ведущих цитокинов аллергического воспаления, возможно, способствует переориентации иммунного ответа в сторону ТН1 типа и устранению дисбаланса ТН1/ТН2. Однако, повышенная продукция мощных провоспалительных цитокинов TNFa и IL-8, наряду с другими медиаторами воспаления, обеспечивают приток в очаг инфекции и активацию иммунокомпетентных клеток (в частности, нейтрофилов и макрофагов), необходимых для успешной борьбы с возбудителем заболевания [153,159], которые, в свою очередь, способствуют формированию хронического аллергического воспаления. Кроме того, S. pneumoniae и другие распространенные возбудители респираторных инфекций, повреждая бронхо-легочный эпителий и нарушая его проницаемость, потенцируют местную воспалительную реакцию, усиливая структурно-функциональные нарушения и облегчая доступ причинно значимых аллергенов к иммунокомпетентным клеткам. Таким образом, исходя из полученных результатов, мы считаем, иммунологически обосновано утяжеление воспалительного процесса при сочетании атопической бронхиальной астмы и острой внебольничной пневмонии.

Исследуя состояние местных факторов защиты у детей с атопической бронхиальной астмой, представляла интерес локальная продукция цитокинов на уровне бронхо-легочной системы. В литературных источниках есть данные определения цитокинов локального характера в секрете ротовой полости [1], жидкости назального лаважа [196], в мокроте [172]. Наши исследования оппозиционных цитокинов IL-4 и IFNy были проведены в конденсате выдыхаемого воздуха совместно с Т.Н.Суровенко и являлись пионерскими. Источниками цитокинов в выдыхаемой влаге могут являться альвеолярные макрофаги, тучные клетки и лимфоциты БАЛТ верхних дыхательных путей и бронхов. Также источником цитокинов может быть сывороточный транссудат в альвеолярных отделах дыхательного тракта, усиливающийся при воспалении [169,273]. У здоровых детей нами зарегистрирован исходно высокий уровень локальной секреции IFNy и, наоборот, низкий, практически "пороговый" уровень IL-4, по сравнению с показателями в сыворотке крови. По нашему мнению, этот факт свидетельствует об активности клеточно-опосредованного механизма иммунной защиты, опережающего гуморальный антительный ответ, непосредственно на уровне дыхательной системы, которая является "входными воротами" для патогенных микроорганизмов.

По результатам наших исследований, у детей с БА содержание IL-4 в КВВ достоверно возрастало (р<0,05), что подтверждает данные о нарастании уровня этого цитокина в секрете ротовой полости и ЖНЛ у детей с БА и аллергическим ринитом [1,196]. Мы оценили соотношение этих оппозиционных цитокинов в КВВ у детей с БА и получили интересные результаты. Если у здоровых детей соотношение IL-4/ IFNy в КВВ было 1/10, то у детей-астматиков доля IL-4 в конденсате значительно увеличивалась и соотношение составляло 1/2. Таким образом, повышение продукции IL-4 как в системном кровотоке, так и локально на уровне бронхолегочной системы, отражает активацию ТН2 с развитием аллергического воспаления.

Параллельно, мы определили содержание секреторного IgA в конденсате выдыхаемого воздуха и жидкости назального лаважа у таких детей. Нами было зафиксировано достоверное снижение этого иммуноглобулина в назальных смывах до 4,78±1,15 мг/л, тогда как его уровень в контрольной группе составлял 10,58±0,64 мг/л (р<0,001). Известно, что slgA в составе секретов слизистых, обеспечивает местный иммунитет, препятствуя процессам адгезии и адсорбции патогенных бактерий и вирусов [82,159,200]. Таким образом, наши исследования объясняют подверженность детей с атопической БА частым респираторным заболеваниям.

Макрофаги продуцируют цитокины, вовлекающие и другие клеточные структуры в активное образование медиаторов воспаления [150,177], что приводит, в частности, к экспрессии индуцибельной NOS и обеспечивает прогрессирование патологического процесса [256]. В качестве индукторов iNOS выступают бактериальные ' ЛПС, провоспалительные цитокины (в основном IL-1, IL-6, TNFa) и лиганды некоторых поверхностных рецепторов макрофагов (СД23) [256].

Противовоспалительные цитокины (TGF(3, IL-10) и глюкокортикостероиды ингибируют продукцию нитроксидных радикалов [150]. Установлено, что индукция NO является частью локальных и системных воспалительных реакций [83,96,101,188,256]. Продуцируемая в результате активации iNOS окись азота прежде всего предназначена для неспецифической защиты организма и имеет антимикробную активность против широкого спектра патогенных факторов. В то же время, повышенный синтез NO эпителием бронхов, способен избирательно ингибировать ТН1 типа, угнетать продукцию IL-2 и IFNy, повышая активность ТН2 и продукцию IL-4, супрессирующего ТН1 [47,101,189]. Развитие такого иммунорегуляторного дисбаланса может усугублять аллергическое воспаление. Нельзя не учитывать и тот факт, что избыточное количество NO взаимодействует с супероксидным анионом с образованием пероксинитрита, повреждающего клетки [231]. В связи с этим, наиболее патогенным будет действие высоких концентраций NO при одновременном повышении уровня IL-8, мощного хеммоаттрактанта для нейтрофилов, вырабатывающих перекисные соединения кислорода.

В последние годы многие исследователи использовали определение метаболитов оксида азота в КВВ и ЖНЛ для определения степени аллергического воспаления при бронхиальной астме и аллергическом рините [101,117,146,173]. Мы подтвердили данные этих авторов, что при атопичесокй БА у детей уровень метаболитов NO в конденсате выдыхаемой влаги и жидкости назального лаважа достоверно превышает содержание у здоровых детей (р<0,001). Мы согласны с мнением Е.В.Просековой (2000) и Т.Н.Шестовской (2001), что содержание метаболитов NO в КВВ нарастает при утяжелении атопического процесса при БА и способствует нарастанию респираторных нарушений при тяжелой астме. Это дает возможность проводить забор материала неинвазивным методом и использовать мониторинг метаболитов NO в КВВ и ЖНЛ в качестве диагностического критерия повреждения в оценке степени тяжести данного заболевания.

Цитокины, как известно, способны индуцировать синтез реактантов острой фазы. Экспрессирующиеся на самых ранних этапах воспалительной реакции под воздействием провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNFa и синтезируемые преимущественно гепатоцитами, эти белки,как оказалось, сами принимают активное участие в процессах неспецифической резистентности и иммунорегуляции, обладают прямым антитоксическим действием в отношении грамположительных микроорганизмов [97,121]. Учитывая, что альвеолоциты 2 типа имеют индуцибельные гены агКГП и способны продуцировать этот острофазный протеин, нами был проведен анализ содержания ai-КГП в КВВ и ЖНЛ у детей, страдающих атопической бронхиальной астмой.

Проводя мониторинг уровня ai - КГП в КВВ выявлено, что содержание этого острофазного протеина у детей с атопической БА достоверно превышает показатели здоровых детей (26,26±4,19 нг/мл против 6,89±0,80 нг/мл, при р<0,05) и возрастает при среднетяжелых формах заболевания (с 17,32±4,21 нг/мл до 34,75±5,91 нг/мл, при р<0,001). Однако, зафиксирована обратная динамика этого показателя при тяжелой астме (15,60±0,42 нг/мл). Считают, что а\ — КГП принимает участие в ограничении воспалительного процесса, усилении репаративных механизмов [83,142], поэтому, возможно, полученные нами данные указывает на перенапряжение одного из общих неспецифических механизмов защиты при тяжелом течении аллергического воспаления. При анализе содержания aj - КГП в ЖНЛ, нами был зафиксирован интересный факт, оказалось, что уровень его в назальном лаваже значительно превышает показатели в КВВ. Выявленные различия, на наш взгляд, в большей мере связаны с высокой васкуляризацией слизистой оболочки носовых путей и повышенной сосудистой проницаемостью, в том числе для белковых молекул. С другой стороны, различия можно связать с особенностями материала исследования, так как в парах выдыхаемой влаги вероятность определения белковых молекул ниже, чем в назальных смывах [168]. Однако, несмотря на выявленные различия в уровне он - КГП в данных биологический жидкостях, динамика его содержания у детей с БА разной степени тяжести была идентичной, что свидетельствует о вовлечении всего эпителия дыхательных путей в процесс аллергического воспаления и согласуется с современными представлениями по проблеме взаимосвязи БА и аллергического ринита [38,208].

Таким образом, несмотря на то, что пациенты находились в ремиссии, проведенные нами исследования выявили у них изменения цитокинового профиля, характеризующиеся не только сдвигом иммунного ответа в сторону ТН2 типа, но и повышением активности провоспалительных цитокинов, таких как IL-8 и TNFa, что приводит к увеличению продукции биомаркеров воспаления (метаболитов NO и aj -КГП) непосредственно на уровне бронхо-легочной системы, где регистрируется дефицит секреторного IgA. Нами установлено, что у детей, страдающих атопической бронхиальной астмой и находящихся в состоянии персистирующего аллергического воспаления, при присоединении острой бактериальной инфекции регистрируется усугубление течения основного заболевания. Вышеизложенное предопределило необходимость применения иммунокоррегирующей терапии в комплексном лечении этих больных с целью коррекции иммунных нарушений и снижения вероятности присоединения острых инфекционных заболеваний дыхательных путей. В этом аспекте, мы выбрали два разных подхода. Одной группе пациентов был применен цитокиновый препарат IL-2 ронколейкин для периориентации преимущественно ТН2 - ответа на ТН1 и устранения дисбаланса ТН1/ТН2. Другой группе детей с БА и перенесенной острой внебольничной пневмонией была проведена вакцинации поликомпонентной пневмококковой вакциной "Пневмо-23" (Авентис Пастер, Франция) с целью подавления колонизации дыхательных путей наиболее распространенным патогеном S.pneumoniae, для устранения риска развития рецидивов пневмококковой инфекции и снижения частоты обострений атопического заболевания.

Цитокины широко применяются для коррекции иммунного статуса [2,13,37,43,56,83]. В Приморском крае Е.В.Просековой (2000) описан опыт применения комплексного цитокинового препарата - лейкинферона у детей с БА. Есть данные применения у детей с БА рекомбинантного а2Ьинтерферона (Виферона) [43]. В литературе удалось найти немногочисленные сведения о положительном эффекте применении рекомбинантного IL-2- ронколейкина у взрослых, больных атопической БА [112,145]. Р.М.Хайруллиной с соавт. (1999), Л.А.Никулиным с соавт. (2001), опубликованы материалы по применению ронколейкина в детской хирургической практике и у детей с врожденными бактериальными пневмониями. Известно, что IL-2 является Т-клеточным ростовым фактором, а также продуцируется субпопуляцией ТН1 в ответ на антигенную стимуляцию [8,32,37,140 и др.]. Кроме того, IL-2 активирует пролиферацию Т-клеток и их дифференцировку их в ТН1 лимфоциты, которые продуцируют IFN-y и таким образом, угнетают ТН2 клетки [54,65,112,159]. IL-2 в синергизме с TNFa усиливает продукцию Т-клетками IFNy [195], стумулируя фагоцитарную систему. Нами была разработана и запатентована новая методика ингаляционного введения препарата через небулайзер (патент на изобретение №2205659 от 10.06.2003), которая применялась одновременно с парентеральным подкожным введением препарата. Мы, безусловно, не использовали этот препарат в качестве монотерапии. Он применялся наряду с традиционной базисной терапией, соответствующей степени тяжести астмы. Решающим в обосновании его клинического применения у частоболеющих детей с БА явилась возможная активация пролиферации Т-клеток и их дифференцировка в ТН1, стимуляция синтеза IFN-y, переключение иммунного ответа с преимущественно гуморального (антительного, IgE-зависимого) на адекватный клеточно-опосредованный с активацией фагоцитарной системы, что, как известно, создают предпосылки для снижения развития острых респираторных заболеваний и частоты обострений бронхиальной астмы.

В результате проведенной иммунотерапии мы подтвердили свои предположения и данные А.Т. Перадзе с соавт (2000) по улучшению прогноза клинического течения заболевания, что отмечалось в снижении средней частоты обострений (р<0,05), уменьшении их продолжительности (р<0,01). Это увеличило сроки ремиссии, сократило частоту и объем оказываемой медицинской помощи. Значительно (на 43%) снизилось число острых респираторных заболеваний и (на 40%) уменьшился удельный вес обострений хронических очагов инфекции. Однако, мы не полностью согласны с мнением этих авторов. Нами не выявлено повышения продукции TNFa в сыворотке крови после применения ронколейкина. Вероятно, это связано с различиями биологических объектов исследования. В отличии от наших исследований, А.Т.Перадзе с соавт (2000) изучали спонтанную и индуцированную ЛПС продукцию TNFa in vitro в культурах цельной крови у больных БА, получавших ронколейкин, и зафиксировали прирост этого цитокина в исследуемом материале. Мы предполагаем, что полученые различия определяются возможностью связывания TNFa с его рецепторами в органах-мишенях. К положительным критериям можно отнести полученные нами результаты достоверного повышения уровня IFNy (с 2,47±0,47 пг/мл до 8,49±0,24 пг/мл, при р<0,001) и снижение содержания IL-8 (с 32,08±4,07 пг/мл до 18,33±3,20 пг/мл, при р<0,05) в сыворотке крови у наших пациентов после применения ронколейкина. При этом повышение уровня IFNy нами отмечено как в системном кровотоке, так и непосредственно на уровне бронхо-легочной системы, в конденсате выдыхаемого воздуха (8,99±1,52 пг/мл до 14,47±1,12 пг/мл, при р<0,001). Тем самым мы подтвердили данные Ch.Biron с соавт (1995), что в синергизме с TNFa IL-2 усиливает продукцию Т-клетками IFNy, а IFNy в сочетании с IL-10 способен снижать стимулирующее влияние TNFa на синтез IL-8 [141]. Ронколейкин, как оказалось, способствовал снижению сывороточного IgE (с 318,75±37,24 МЕ/мл до 209,64±39,49 МЕ/мл (р<0,05), что согласуется с данными Т.В. Суздальцевой с соавт (2002), а также, уровню. N0 в выдыхаемом воздухе, о чем свидетельствует снижение содержания метаболитов N0 в КВВ с 6,86±0,42 цМУмл до 4,55±0,20 цМУмл после иммунотерапии. Учитывая двойственную роль этого медиатора при воспалительном процессе, мы расценили полученные результаты как благоприятные, способствующие уменьшению неспецифического воспаления в дыхательной системе при БА.

Выявленные изменения в цитокиновом статусе, динамике биохимических маркеров воспаления у пациентов с атопической БА на фоне иммунотропной терапии оценена нами с помощью рейтингового алгоритма иммуно-биохимических нарушений [44,60]. У пациентов, получавших в комплексной терапии БА ронколейкин до введения препарата наиболее значимые изменения регистрировались по уровню цитокинов IFNy и IL-8, которые имели абсолютно противоположную направленность и , наибольшую степень отклонений от нормальных величин. Формула алгоритма выглядела следующим образом: IFNy3~, IL-83+, TNFoi2+, IgE2+, N02+, IL-4]+, что наглядно отражает нарушения клеточно-опосредованного звена при атопической БА и наличие воспалительного процесса. После проведения терапии ронколейкином, происходит изменение степени иммунных расстройств, тенденция к нормализации иммунного дисбаланса и формула иммунных расстройств становится следующей: IFNy2", TNFa2+, IL-82+, IgEi+, NOi+, IL-4o. По нашему мнению, выявленные изменения и обеспечивают положительную клиническую динамику.

Оценивая результаты в целом, установлено, что при включении рекомбинантного цитокинового препарата ронколейкина в комплексную терапию атопической БА у часто болеющих детей, происходят определенные сдвиги в иммунной системе на уровне дифференцировки Т-лимфоцитов, преимущественно за счет активации ТН1, что создает предпосылки не только к увеличению напряженности фагоцитарного звена, но и уменьшению дисбаланса иммунного ответа при атопическом заболевании, где ведущая роль принадлежит ТН2. Ронколейкин способствует уменьшению воспалительного процесса на уровне бронхо-легочного тракта и положительной клинической динамики в течении БА у детей, что обеспечивает снижение частоты и объема медицинской помощи по поводу лечения данного заболевания.

В последнее время все больше встречается данных о применении терапевтических вакцин с целью иммунокоррекции в комплексной терапии аллергических заболеваний. В этом аспекте нами была проведена вакцинация детей с атопической БА и перенесенной внебольничной пневмонией в периоде ремиссии, поликомпонентной пневмококковой вакциной "Пневмо23", в составе которой очищенные капсульные полисахариды 23 серотипов пневмококков. Как известно, пневмококковая инфекция занимает первое место в этиологии внебольничных пневмоний и S.pneumoniae является наиболее частым возбудителем поражения верхних и нижних отделов дыхательных путей при БА [86,108,120136,176,228 и др.]. Так как существует противоречивые мнения по влиянию ЛПС на процессы цитокиновых взаимодействий, нам представлялось интересным оценить степень влияния данной вакцины на иммунный ответ у детей на фоне атопической БА. Мы не выявили повышения продукции IFNy, как при терапии ронколейкином, но и не отметили усилиния секреции IL-4, что является, на наш взгляд, важным фактом при анализе влияния полисахаридной вакцины на атопический процесс. Уровень TNFa в сыворотке крови достоверно не изменился после вакцинации, а содержание IL-8 значительно снизилось (с 29,64±3,27 пг/мл до 18,62±4,02 пг/мл, при р<0,05). Такие результаты можно расценивать как прогностически благоприятный признак, указывающий на снижение активности нейтрофилов, роль которых в развитии хронического воспаления при БА бесспорна [141,158,159,187]. Противоречия с данными наших соотечественников Е.Г. Исаченко с соавт. (1995), которые описали повышенный стимулированный ЛПС (E.coli) синтез TNFa и IL-8 в цельной крови ex vivo у больных с атопическим синдромом в период ремиссии, возможно, связаны с используемым материалом и не подтверждены нашими исследованиями [49]. Интересным фактом, на наш взгляд, была установленная тенденция к нарастанию уровня метаболитов азота в КВВ (с 5,18±0,30 рМ/мл до

7,03±0,99 (iM/мл, при р>0,05), которая отражает процесс активации антибактериальных защитных механизмов после введения бактериальной вакцины. Мы согласны с мнением В.Б. Гервазиева с соавт (1994) , что применение полисахаридной вакцины не влияет на уровень IgE, так как нами не было выявлено достоверных изменений его содержания и других клинико-лабораторных показателей [23]. При составлении формулы иммунных расстройств до и после вакцинации "Пневмо-23", нами не отмечено столь наглядных изменений по большинству показателей. До вакцинации она имела следующий вид: IFNy3", IL-834", 1Ь-4г+, TNFa2+, IgE2+, NOi+. Под действием бактериальной липополисахаридной вакцины выявлены положительные сдвиги в сторону существенного снижения уровня нейтрофильного хемоаттрактанта - IL-8 в сыворотке крови, при этом сохранился дефицит IFNy, а активность IL-4 и TNFa. не изменилась. На этом фоне зарегистрирована тенденция к нарастанию содержания метаболитов N0 в КВВ. Это отразилось на формуле: IFNy3", IL-42+, TNFa2+, IL-8i+, NC>2+, IgE2+.

Зарегистрирована хорошая клиническая эффективность проведенной вакцинации, что согласуется с мнением ряда авторов, которые имели опыт применения данной вакцины у детей с атопической БА, ХОБЛ, инфицированных микобактериями туберкулеза [68,77,78]. Анализируя иммунологическую эффективность вакцинации по уровню специфических антител, выявлен достоверный прирост после вакцинации содержания IgM и IgG не только к комплексу полисахаридов, входящих в состав вакцины "Пневмо-23", но и к отдельным серотипам S.pneumoniae (ТЗ, 6В, 9N, 23F), что является доказательством успешного иммунного ответа на введение вакцины с формированием специфического поствакцинального иммунитета. Таким образом, применение поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо-23» у детей с бронхиальной астмой не утяжеляет течение атопического процесса, а, наоборот, способствует профилактике частых респираторных заболеваний и обострений БА, ввиду своей иммунологической эффективности и безопасности.